Clonaggio funzionale (Functional cloning)

Clonaggio posizionale (Positional cloning)

Identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua funzione

Identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua posizione

MALATTIA MALATTIA

FUNZIONE (proteina)

GENE

MAPPATURA

FISICA

GENETICA

MAPPATURA

CLONAZIONE

GENE

FUNZIONE

Functional cloning

L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza della posizione sul genoma:

sulla base del prodotto proteico

strategia utilizzata per la clonazione del gene del fattore VIII della coagulazione, responsabile dell’emofilia A

Functional cloning

L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza della posizione sul genoma:

mediante l’uso di anticorpi specifici

sulla base del prodotto proteico

oppure

trascrizione in vitro

mRNA

proteine nascenti

anticorpi specifici

immunoprecipitazione del complesso polisomiale

purificazione dell’mRNA specifico

reverse-transcription per produrre il cDNA specifico

utilizzo del cDNA per selezionare cloni specifici da cDNA libraries

estrazione mRNA totale

Functional cloning

L’identificazione avviene indipendentemente dalla conoscenza della posizione sul genoma:

mediante l’uso di anticorpi specifici

sulla base del prodotto proteico

oppure

mediante la sua similitudine a un gene umano paralogo o un gene ortologo di altre specie

oppure

Positional cloning

Identificazione e clonazione di un gene attraverso la sua posizione

Il primo stadio consiste nel restringere il più possibile (<2Mb) la regione candidata.

Raccogliere numerose famiglie affette dalla stessa malattia (possibilità di errore può essere l’eterogeneità genetica)

Analizzare molti marcatori informativi ben mappati sul genoma

La penetranza della malattia deve essere ben conosciuta. Se la malattia ha penetranza completa sono informative anche le ricombinazioni trovate negli individui sani, altrimenti sono utili solo quelle trovate negli individui affetti

7 5 4 6 6 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 5 2 6 2 2

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

7 5 4 6 6 2

6 5 2 6 2 2

6 5 2 6 2 2

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 2 1

7 5 4 6 6 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 5 2 6 2 2

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

6 5 2 6 2 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

7 5 4 6 6 2

6 5 2 6 2 2

6 5 2 6 2 2

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 2 1

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

7 5 4 6 6 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 5 2 6 2 2

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

6 5 2 6 2 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

7 5 4 6 6 2

6 5 2 6 2 2

6 5 2 6 2 2

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 2 1

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

2

7 5 4 6 6 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 5 2 6 2 2

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

6 5 2 6 2 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

7 5 4 6 6 2

6 5 2 6 2 2

6 5 2 6 2 2

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 2 1

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

2

7 5 4 6 6 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

2 5 2 6 2 2

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2

5 2

6 5 2 6 2 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

7 5 4 6 6 2

6 5 2 6 2 2

6 5 2 6 2 2

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 2 1

7 5 4 6 6 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

7 5 4 6 6 2

6 5 2 6 2 2

6 5 2 6 2 2

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 2 1

2 5 2 6 2 2

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2

5 2

7 5 4 6 6 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2 5 2 5 5 5

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

8 6 3 2 1 8

6 5 2 6 2 2

7 5 4 6 6 2

6 5 2 6 2 2

6 5 2 6 2 2

3 6 5 5 7 8

7 4 4 2 5 4

2 2 1

8 3 8 2 7 9

9 4 6 4 1 6

8 3 8 2 7 9

9 3 2 3 5 8

8 3 8 2 7 9

5 3 5 3 1 7

8 3 8 4 2 3

9 3 2 3 5 8

4 2 3

2 5 2 6 2 2

1 4 1 3 7 5

6 5 2 6 2 2

2 2 1 9 5 5

2

5 2

Raccolte numerose famiglie si stima la verosimiglianza della mappatura mediante il calcolo del LOD SCORE (logaritmo della probabilità relativa di linkage)

I

II

III

1 2

1

1

2

2

3

3 4

A1 A1

B1 B1

A2 A2

B2 B2

A1 A2

B1 B2

A2 A2

B2 B2

A1 A2

B1 B2

A1 A2

B2 B2

A2 A2

B2 B2

A2 A2

B2 B2

A1 A2

B1 B2

1a famiglia

I

II

III

1 2

1

1

2

2

3

3 4

A1 A1

B1 B1

A2 A2

B2 B2

A1 A2

B1 B2

A2 A2

B2 B2

A1 A2

B1 B2

A1 A2

B2 B2

A2 A2

B2 B2

A2 A2

B2 B2

A1 A2

B1 B2

cr. parentali 3

cr. ricombinanti 1

1a famiglia

I

II

III

1 2

2

1

3

2

4

3 4

A1 A1

B2 B2

A2 A2

B1 B1

A1 A2

B2 B1

A1 A1

B2 B2

A1 A2

B2 B1

5

A1 A1

B2 B2

A1 A1

B2 B2

A2 A1

B1 B2

A1 A1

B2 B2

A2 A1

B1 B2

1

A1 A2

B2 B1

cr. parentali 5

cr. ricombinanti 0

2a famiglia

I

II

III

1 2

1

1

2

2

3

3 4

A2 A2

B2 B2

A1 A1

B1 B1

A1 A2

B1 B2

A1 A1

B1 B1

A1 A2

B1 B2

3a famiglia

5 6

A1 A1

B1 B1

A2 A1

B2 B1

A1 A1

B1 B1

A1 A1

B1 B1

A2 A1

B2 B1

A2 A1

B2 B1

cr. parentali 6

cr. ricombinanti 0

I

II

III

1 2

2

6

3

7

4

8 9

A2 A2

B1 B1

A1 A1

B2 B2

A2 A1

B1 B2

A2 A2

B1 B1

A1 A2

B2 B1

A2 A2

B1 B1

A2 A2

B1 B1

A1 A2

B2 B1

A1 A1

B2 B2

1 2 3 4 5

A1 A1

B2 B2

A2 A1

B1 B2

A2 A1

B1 B2

A2 A1

B2 B2 A1 A1

B2 B2

1

A2 A1

B1 B2

4a e 5a famiglia

I

II

III

1 2

2

6

3

7

4

8 9

A2 A2

B1 B1

A1 A1

B2 B2

A2 A1

B1 B2

A2 A2

B1 B1

A1 A2

B2 B1

A2 A2

B1 B1

A2 A2

B1 B1

A1 A2

B2 B1

A1 A1

B2 B2

4a e 5a famiglia

1 2 3 4

A1 A1

B2 B2

A2 A1

B1 B2

A2 A1

B1 B2

A2 A1

B2 B2

5

A1 A1

B2 B2

1

A2 A1

B1 B2

cr. parentali 4+4 = 8

cr. ricombinanti 1+0 = 1

IN TOTALE

5 famiglie - 24 meiosi ricombinanti 2

parentali 22

secondo l’ipotesi dell’indipendenza ricombinanti 12

parentali 12

invece

Riassumendo

1a famiglia 4 meiosi = 3 cr. parentali + 1 cr. ricombinante

3a famiglia 6 meiosi = 6 cr. parentali + 0 cr. ricombinanti 4a famiglia 5 meiosi = 4 cr. parentali + 1 cr. ricombinante 5a famiglia 4 meiosi = 4 cr. parentali + 0 cr. ricombinanti

2a famiglia 5 meiosi = 5 cr. parentali + 0 cr. ricombinanti