Post on 02-May-2015
Biologia, estrazione e utilità farmacologica delle
Saponine
DS - 2010
Glicosidi di origine vegetale
Le saponine: origine
Saponaria officinalis Hedera helix Aesculus hippocastanum
Solanum tuberosumImmagini: internet
Non ancora precisamente definito
Protezione contro erbivori (mammiferi, insetti), batteri e funghi
• Hanno un caratteristico gusto amaro e possono causere tossicità a lungo termine negli animali
• Permeabilizzano le pareti cellulari di animali e funghi• Meccanismo battericida poco chiaro• Riducono la digestione delle proteine• Danneggiano la flora intestinale
Le saponine: ruolo ecologico nei vegetali
© TIBIO Sagl 2009
© TIBIO Sagl 2009
Formata da un aglicone (sapogenina) e residui zuccherini (1-11)
Le saponine: struttura chimica
CH3
CH3
O
O
R = Tiglic acid or Angelic acid
O
R
CH3
O
H3C
OH
OHOH
O
COOH
OH
O
OO
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
CH3H3C
Major glycosides of Escin
CH2OH
CH2OH
CH3
Escina (maggiore glicoside presente nel composto)
Gruppo triterpenico
In un pallone di vetro inserire:
Droga polverizzata
Soluzione etanolica 60%
solvente per estrarre le saponine
Pietra pomice
permette un ebolilizione graduale
del
liquido, grazie all’aria che fuoriesce
dai loro pori (ebollitori)
Le saponine: protocollo d’estrazione
Immagini: internet / Servier Medical Art
CH3
CH3
O
O
R = Tiglic acid or Angelic acid
O
R
CH3
O
H3C
OH
OHOH
O
COOH
OH
O
OO
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
CH3H3C
Major glycosides of Escin
CH2OH
CH2OH
CH3
Solubilità delle saponine?
Ruolo dell’etanolo 60%?
Le saponine: protocollo d’estrazione
Sistema di estrazione:
Le saponine: protocollo d’estrazione
Pallone con soluzione alcolica e droga
Fonte di calore
Refrigerante a serpentina
Immagini: Servier Medical Art
Estrazione dalla droga
Condensazione
Molecole in soluzione
Immagini: Servier Medical Art
Trasferire in una provetta e centrifugare:
Le saponine: protocollo d’estrazione
Immagini: Servier Medical Art
Sopranatante
Precipitato
Saponine in soluzione
Droga esaurita
Immagini: Servier Medical Art
Soluzione di eritrociti stabilizzata con EDTA:
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Immagini: Servier Medical Art
HOOC NN COOH
COOH
HOOC
EDTA
Chelatore
Lega il calcio (Ca2+)
Impedisce la coagulazione
Tampone fosfato 0.2 M pH 7.4 (250 mL)
Scopo: creare una soluzione isosmotica a pH fisiologico
Materiale:
- Fosfato di sodio: NaH2PO4 (sale dell’acido)
MM: 120 g/mol – pKa2: 6.82
- NaOH: base forte
MM: 39.9 g/mol
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Tampone fosfato 0.2 M pH 7.4 (250 mL)
Massa di NaH2PO4 :
0.2 M * 120 g/mol = 24 g/L = 6 g/250 mL
Aggiungo un volume d’acqua minore di 250 mL
Aggiusto il pH a 7.4 utilizzando NaOH 5 M
5 M * 39.9 g/moL = 199.5 g/L
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Tampone fosfato 0.2 M pH 7.4 (250 mL)
Perché isotonico?
Medesima pressione osmotica dei liquidi extracellulari e
intracellulari (uguale [cationi] e [anioni])
Se liquido ipertonico?
Se liquido ipotonico?
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Immagini: Servier Medical Art
La membrana cellulare
D.L. Nelson and M.M. Cox. Lehninger principles of biochemistry. Worth, New York, 5th edition, 2008.
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Composizione della membrana cellulare
Fosfolipidi e trigliceridi
D.L. Nelson and M.M. Cox. Lehninger principles of biochemistry. Worth, New York, 5th edition, 2008.
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Saponificazione della membrana
Rottura dei legami idrofobi tra trigliceridi
Formazione di micelle lipidiche (soluzione colloidale)
CH3
CH3
O
O
R = Tiglic acid or Angelic acid
O
R
CH3
O
H3C
OH
OHOH
O
COOH
OH
O
OO
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
CH3H3C
Major glycosides of Escin
CH2OH
CH2OH
CH3
D.L. Nelson and M.M. Cox. Lehninger principles of biochemistry. Worth, New York, 5th edition, 2008.
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Saponificazione della membrana, perché?
CH3
CH3
O
O
R = Tiglic acid or Angelic acid
O
R
CH3
O
H3C
OH
OHOH
O
COOH
OH
O
OO
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
CH3H3C
Major glycosides of Escin
CH2OH
CH2OH
CH3
Parte polare
Parte apolare
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Affinità con il colesterolo
Il colesterolo è un componente importante delle membrane animali, che da rigidità alla struttura della membrana
CH3
CH3
O
O
R = Tiglic acid or Angelic acid
O
R
CH3
O
H3C
OH
OHOH
O
COOH
OH
O
OO
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
CH3H3C
Major glycosides of Escin
CH2OH
CH2OH
CH3
CH3
CH3
H3C CH3
CH3
H
HH
HO
H
ColesteroloGruppo triterpenico della saponina (escina)
Le saponine hanno una forte azione tensioattiva, solubilizzando i lipidi e danno origine a soluzioni colloidali di grassi in acqua
Permeabilizzano le membrane degli eritrociti (pori di 40-50 Å)
Permeabilizzano in generale le membrane lipidiche contenenti colesterolo
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Qualche definizione:
Emolisi: lisi totale o parziale della membrana dei globuli rossi, con conseguente passaggio nel plasma dei componenti intracellulari
Potere emolitico: capacità di una sostanza di lisare la membrana degli eritrociti (per rapporto ad uno standard, di solito un detergente)
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Protocollo sperimentale – diluzioni seriali:
• Saponina 0.1 g/L
• Escina 0.1 g/L
• Estratto idroalcolico di A. hippocastanum ? g/L diluito 1:2
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
CH3
CH3
O
O
R = Tiglic acid or Angelic acid
O
R
CH3
O
H3C
OH
OHOH
O
COOH
OH
O
OO
OH
OH
HO
O
OH
OH
HO
CH3H3C
Major glycosides of Escin
CH2OH
CH2OH
CH3
Protocollo sperimentale – diluzioni seriali:
• Contenuto in g/L di saponina (0.1 g/L) e escina (0.1 g/L)?
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Sol.1 Sol.2 Sol.3 Sol.4 Sol.5 Sol.11 Sol. 14
Standard 0.01 mL 0.05 mL 0.10 mL 0.15 mL 0.20 mL 0.70 mL 1.00 mL
Tampone fosfato
0.99 mL 0.95 mL 0.90 mL 0.85 mL 0.80 mL 0.30 mL 0.00 mL
Eritrociti 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL
Volume finale?
Standard in g ?
Sol.1 Sol.2 Sol.3 Sol.4 Sol.5 Sol.11 Sol. 14
Standard 0.01 mL 0.05 mL 0.10 mL 0.15 mL 0.20 mL 0.70 mL 1.00 mL
Tampone fosfato
0.99 mL 0.95 mL 0.90 mL 0.85 mL 0.80 mL 0.30 mL 0.00 mL
Eritrociti 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL
Volume finale?
2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL
Standard in g ?
Sol.1 : g di saponina?
(0.01 mL / 1000 mL/L)*0.1 g/L = 1*10-6 g
Sol.1 Sol.2 Sol.3 Sol.4 Sol.5 Sol.11 Sol. 14
Standard 0.01 mL 0.05 mL 0.10 mL 0.15 mL 0.20 mL 0.70 mL 1.00 mL
Tampone fosfato
0.99 mL 0.95 mL 0.90 mL 0.85 mL 0.80 mL 0.30 mL 0.00 mL
Eritrociti 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL 1.00 mL
Volume finale?
2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL 2.0 mL
Standard in g ?
1*10-6 5*10-6 1*10-5 1.5*10-5 2*10-5 7*10-5 1*10-4
Protocollo sperimentale – attività emolitica:
• 1000 * (a/b) = attività emolitica per rapporto all’attività della saponina
1000 = attività emolitica della saponina a = quantità della saponina che provoca emolisi completa b = quantità della droga che provoca emolisi completa
Come determinare l’emolisi?
Le saponine: determinazione dell’attività emolitica
Controllo
Nessna emolisi
Emolisi parziale
Emolisi completa
Le saponine: interesse farmacologico
Interesse farmacologico?
Le saponine sono state studiate per i loro effetti emolitici, con
l’idea di essere utilizzate in caso di turbe cardiocircolatorie
Non sono stati sviluppati medicamenti a base di saponine, a
causa della troppo elevata tossicità
Le saponine: interesse farmacologico
Al loro posto si usano le cumarine (corso A. Borsari)
Dicumarina (Melilotus officinalis)
Acenocumarolo (Sintrom ® Novartis Pharma)
Fenprocumone (Marcoumar ® Meda Pharma)
O O
OH OH
O O
O O
CH3
NO2
OH
O
O O
O O
OHCH3
Grazie per l’attenzione