Analisi del linkage (concatenazione)

Corso di Genetica per la Facoltà di Medicina e Chirurgia dell’Università di Torino

Alberto Piazza

Ibridi cellulari somatici

Analisi di ibridi cellulari somatici

La rodopsina è un gene il cui difetto può causare la Retinite Pigmentosa (RP), una malattia genetica eterogenea (30% X, 25%AD, 45%AR, causa maggiore di cecità: 1/4000). Sulla base di questa analisi, quale è il cromosoma umano su cui è localizzato il gene?

Crossing-over singoli e doppi

L’effetto della ricombinazione

Crossing-over tra cromosomi omologhi

nella meiosi

Distribuzione dei ricombinanti tra due loci per diverse distanze tra i loci

D e M molto lontani D e M molto vicini D e M abbastanza lontani

Linkage tra il gene per una forma autosomica dominante di retinite pigmentosa, RP9, e due geni marcatori

A e B sul cromosoma 7

Analisi della concatenazione (o “linkage”)Analisi della concatenazione (o “linkage”)

Concatenazione – si evidenzia quando due loci (geni) sono localizzati sullo stesso cromosoma sufficientemente vicini così che la loro frequenza di ricombinazione è minore del 50%

Frequenza di ricombinazione (%) la probabilità di ricombinazione tra due loci

Frequenza di ricombinazione 50% è come se i geni fossero localizzati su cromosomi diversi

Frequenza di ricombinazione di 1% = 1centiMorgan

centiMorgan (cM) – unità di misura genetica della frequenza di ricombinazione tra due loci, di lunghezza approssimativamente costante (la distribuzione dei crossing-over varia in misura minima a seconda del cromosoma e se si tratta di meiosi maschili o femminili), equivalente alla distanza fisica di circa 2 x 106 bp (paia di basi)

Analisi del linkageAnalisi del linkage

Richiede famiglie di grandi dimensioni in cui siano presenti più persone affette e non affette

Qual è la frequenza di ricombinazione tra l’emofilia e la cecità ai colori se i geni che controllano tali caratteri distano 10 cM sul

cromosoma X?

10%: dopo la meiosi i due caratteri si troveranno su cromosomi diversi nel 10% dei casi, mentre nel 90% dei casi si troveranno

insieme sullo stesso cromosoma

Distanza fisica = (2 x 106 bp/cM) x 10 cM = 2 x 107 bp

La distanza tra il gene che causa la malattiagene che causa la malattia e il marcatore RFLPmarcatore RFLP è 14 cM: 1 R, 6NR -> 1/7

Ricombinante

Alberi genealogici di due famiglie con neurofibromatosi 1 (NF1) malattia

autosomica dominante

Fase ignota Fase nota

Della madre affetta non si conosce se D è sullo stesso cromosoma di 1 o 2

Linkage sul cromosoma X

Il gene per l’emofilia (recessivo X-linked) ha gli alleli H, h

Il gene MARCATORE ha gli alleli A,a

Tra il gene dell’emofilia e il gene marcatore vi è una distanza genetica di 3 cM

Con quale probabilità sarà affetto ?

?

Analisi del linkage due loci sono concatenati ad una frazione di ricombinazione=Likelihood ratio = ------------------------------------------------------------------------------------------- due loci NON sono concatenati (frazione di ricombinazione=0.5)(simile ad una probabilità)

LOD score – Logaritmo10 della ODDS (= likelihood) ratio

LOD score > 3.0 evidenza di linkage: 1.000 volte più probabile che due loci siano concatenati piuttosto che non concatenati.

LOD score < - 2.0 evidenza di NON linkage con una probabilità di 100 contro 1.

Analisi del linkage tra NF1 e un gene marcatore mediante il Lod

score = percentuale di ricombinazione

Likelihood = ½ (1 - )3 + ½ 3

ODDS = Likelihood / (1/2) 3

LOD score = Log (ODDS)

Curve di lod scores

In ordinata il lod score, in ascissa la frequenza di ricombinazione (da un’analisi di linkage ipotetica)

Curva 1: evidenza di linkage (Z>3) con nessun caso ricombinante

Curva 2: evidenza di linkage (Z>3) con una frazione di ricombinanti stimata di 0.23

Curva 3: linkage escluso (Z<-2) per frazioni di ricombinazione minori di 0.12, linkage indecidibile per valori maggiori

Curva 4: linkage indecidibile per tutti i valori della frazione di ricombinazione

La funzione di mappa di Haldane

La determinazione dell’ordine dei loci nell’analisi di più di

due loci

Analisi di linkage a molti punti

Uso dei dati di linkage nella diagnosi di NF1 sul cromosoma 17

L’uso della mappa genetica del cromosoma 17 per una diagnosi della NF1. Senza conoscere la posizione del gene NF1 rispetto agli altri marcatori non

sarebbe possibile la diagnosi del feto maschio che in questo caso èaffetto

Genotipizzazione ad alta densità e linkage disequilibrium (LD) nel genoma umano

(da Current Opinion in Chemical Biology 6,1( February) 2002, 24-30)

Il linkage disequilbrium (LD, in italiano “associazione gametica preferenziale”) cambia nel tempo.

(a) La croce rossa indica la posizione nella quale nel DNA di un cromosoma è avvenuta una nuova mutazione X. Si crea perciò un altro allele (polimorfismo) strettamente associato (in completo LD) agli altri alleli marcatori 1–6 sullo stesso cromosoma.

(b,c) Col passare delle generazioni l’estensione della regione di associazione (LD) diminuisce a causa della ricombinazione. La ricombinazione rimescola gli alleli marcatori che tendono a diminuire la loro associazione con l’allele mutato X.

(d) Il LD tra la mutazione (X) e i marcatori vicini si osserva solo in una regione ristretta attorno alla mutazione.

Il LD misura l’associazione tra alleli nei cromosomi degli individui di una popolazione. Diminuisce dal momento in cui è avvenuta la

mutazione, tanto più quanto maggiore è la ricombinazione. Non sono necessari nuclei famigliariNon sono necessari nuclei famigliari

X

X

X

Mappa ad alta risoluzione di un gene-malattia

Parametri citogenetici, fisici e genetici nel Genoma Umano

Riferimento Citogenetico

Dimensioni fisiche

Distanza genetica

Numero di geni

Genoma aploide(23 cromosomi)

3x109 np 4300 cM 30.000 60.000

Un cromosoma (in media)

1,5x108 np ~ 200 cM ~ 2200

Una banda cromosomica

35x106 np ~ 5 cM ~ 50

Metodi usati nella mappatura fisica del gene

Metodo Scopo Risoluzione (in np)

Ibrido cellulare uomo-topo Assegnazione del cromosoma

50 250x106

FISH Localizzazione entro una banda cromosomica

5 20x106

Mappatura mediante enzimi di restrizione

Mappatura fine di una regione del gene

105 106

Clonaggio in cromosomi artificiali (YAC)

Clonaggio del gene (frammenti lunghi)

105 106

Clonaggio in batteri (BAC) Clonaggio del gene (frammenti medi e corti)

103 105

PCR Clonaggio del gene (frammenti corti)

102 104

Sequenziamento del DNA Identificazione del nucleotide

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