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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD Escuela de Ciencias Agrcolas, Pecuarias y del Medio Ambiente
Protocolo de prcticas de BM versin 2014
UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA
ESCUELA DE CIENCIAS AGRICOLA, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE
ECAPMA
PROTOCOLO DE PRCTICAS PARA LA ESCUELA
BIOQUMICA METABLICA
Cdigo: 352001
Director Nacional
JAIRO ENRIQUE GRANADOS MORENO., MSc.
2014
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I ACTIVIDADES PARA EL ESTUDIANTE
PRACTICAS DE LABORATORIO
1. IDENTIFICACION DE LA PRCTICA
Nombre de curso Bioqumica metablica
Cdigo de curso 352001
Valor de esta actividad prctica Se asignar un valor en puntos segn la rbrica de evaluacin
Nombre del director de curso Jairo Enrique Granados Moreno
CEAD al que pertenece
Sede Nacional Jos Celestino Mutis
Contacto del director de curso
Tel:3443700-Ext: 374. Cel.3202280647
Espacio donde se debe desarrollar la
prctica
Laboratorios DE Bioqumica y Nutricin Sede Nacional JCM,
Laboratorios de Nutricin sede Valledupar
Laboratorios de investigacin Centro Agroecolgico Valslice
CEAD instituciones en convenio que dispongan de la infraestructura para el desarrollo de los protocolos
Objetivos de la prctica
Reconocer y cuantificar Biomolculas presentes en el metabolismo de plantas y animales
Justificacin de la prctica
Bioqumica Metablica es la ciencia que estudia todo lo
relacionado con la estructura y actividad de las diversas
biomolculas, en sus respectivas vas metablicas, que forman
parte de la dinmica celular de organismos animales y vegetales,
presentes en todo tipo de agro ecosistemas; por ende, permite
comprender la estructura y cintica de los compuestos que
intervienen en las diversas reacciones bioqumicas metablicas
aerbicas y anaerbicas. As mismo, teniendo en cuenta que es
una ciencia terico experimental que posee conceptos, leyes,
principios y teoras cientficas, se constituye en un pilar
fundamental para la interpretacin significativa de las mltiples
mailto:[email protected]:3443700-Ext3
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reacciones biomoleculares que gobiernan los diferentes
procesos exergnicos y endergnicos, enfocados a mantener las
funciones vitales de sistemas auttrofos y hetertrofos, los
cuales interaccionan permanentemente con el fin de garantizar la
bioactividad de nuestro planeta. En consecuencia, la
intencionalidad del curso se centra en el estudio de la bioqumica
estructural, biotermodinmica, actividad molecular y bioqumica
metablica aplicada, importantes en lo bioactividad de los
sistemas biolgicos, de tal forma que puedan ser
interrrelacionados e incorporados por los estudiantes en su
dimensin cognitiva, para lograr un verdadero aprendizaje
significativo autnomo de la bioqumica metablica.
Competencias a desarrollar
El estudiante comprende los elementos conceptuales,
procedimentales y metodolgicos que estn involucrados en la
identificacin y cuantificacin de molculas con bioactividad en
plantas y animales
Duracin de la prctica.
12 horas
Mecanismo mediante el cual se evaluar la
prctica:
A travs de la rbrica de evaluacin la cual va adjunta al final de del presente protocolo (la misma que est en el aula virtual)
2. METODOLOGIA
I. ACTIVIDAD URESICA EN MUESTRAS DE ORIGEN BIOLGICO
Objetivos
Producir la hidrlisis de la urea por medio de la enzima amidohidrolosa
denominada ureasa.
Cuantificar la actividad uresica (AU) en muestras de origen biolgico
, mediante la tcnica volumtrica de Berthelot
Conceptos Previos
Ou significan los siguientes trminos:
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Biocatalizador; protena; Enzima; Cintica qumica; Velocidad de reaccin;
ureasa ; actividad uresica ; Energa de activacin; Sustrato; Hidrlisis;
Incubacin; pH; Solucin buffer; Tilulacin; lnhibidores enzimticos?
1. Fundamento Terico
La ureasa es una enzima amidohidrolosa de peso molecular: 480.kD, punto
isoelctrico: 5.0 y pH ptimo entre 6 y 7, cataliza la hidrlisis de la urea
produciendo gas carbnico, hidrxido de amonio, seqn la reaccin
H2N-CO-NH2 + 3H2O 2NH4OH + CO2
En presencia de una solucin buffer de_fosfatos con pH = 7.0 y a una temperatura de
incubacin de 25C, la ureasa presenta una constante de Michaelis de 10,5 mmol/L. Los
principales inhibidores de su actividad enzimtica son los iones metlicos pesados tales
corno la plata (Ag+1) el mercurio (Hg+2) e igualmente el cido hidroxmico y la tiourea
La ureasa, se encuentra en varios tejidos vegetales como en el haba de soya, lo cual
implica que pueda ser usada en anlisis de alimentos para determinar urea, ya sea por el
mtodo de Kjeldhal o por titulacin del amonio liberado. De esta forma, al titular el
hidrxido de amonio producido por la hidrlisis, se puede calcular la cantidad de urea
hidrolizada, utilizando el mtodo estequiomtrico, puesto que se producen 2 moles de
NH4OH por cada mol de urea desdoblada. Por lo tanto, esta reaccin puede utilizarse con
xito en la determinacin de urea en sangre, orina, suelos y otros materiales orgnicos.
2. Metodologa
Lista de Materiales:Tubos de ensayo con gradilla, pinzas para bureta, erlenmeyer de
125mL , pipetas de 5 y 10mL, matraz aforado de 100mL , bao termostatado , beaker de
400mL ,bureta de 25mL , soporte universal.
Lista de Reactivos:Ureasa al 0,1 % en buffer fosfato de pH = 7.0, Urea
0,25M , HgCl2 al 1% , HCl 0,1N , indicador de Tashiro
3. Procedimiento
Ureasa pH=7.0 ; T=37C
Ureasa
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3.1 Extraccin y solubilizacin de ureasa en harinas, suelos forraje (mtodo
salting out)
En el caso de suelo, se rotula :ESAU: Extracto de suelo para actividad uresica y para
forraje :EFAU:Extracto de forraje para actividad uresica
4 .CUANTIFICACIN DE LA AU.
4.1 Mezcla de reactivos
Reactivos (mL) /
Tubos B St 1 2 3
Urea 0,25M 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Buffer fosfatos pH=7,0 5,0 4,5 4,5 4,5 4,5
HgCl2 (Gotas)* 4 - - - -
Ureasa 0,5% - 0,5 - - -
+/-1,0 g de
Harina ,
forraje
suelo
10 mL de
NaCl 1%
Tubo de
centrfuga
Agitar
5min
3 minutos
Centrifugar
3500 rpm, por
5 min
t= 5 min Se obtiene
Sobrenadante
,(ureasa)
Fase lquida Precipitado(fi
bras, grasas,
grasas y
minerales
Fase slida
Se descarta
V
ss
ss
medir
Filtrar
V
s
medir
probeta
Tubo de ensayo
ROTULAR
EHAU Indica
EXTRACTO DE HARINA
PARA ACTIVIDAD URESICA
Wm
Vf=Vs
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4.2 Titulacin
Alistar el montaje de titulacin: lavar, purgar ,cargar y enrasar la bureta con HCl
0,1N
Pasar la solucin del tubo blanco a un Erlenmeyer beaker y adicionar 3 gotas de
indicador de color Tashiro, un color azul-verdoso, es prueba positiva para el in
Amonio (NH4+)
Colocar el erlenmeyer que contiene la solucin blanco, debajo la bureta y adicionar
lentamente el HCl, hasta que aparezca y permanezca un color rosado-violceo.
Esto indica que los equivalentes-gramo del hidrxido de amonio fueron
neutralizados por los equivalentes-gramo del cido clorhdrico.
Registrar en su tabla de datos, los mL de HCl gastados en la titulacin del blanco.
Repetir el procedimiento anterior, con el tubo Stndar y anotar los mL empleados
de HCl
Continuar el proceso con los tubos 1, 2 y 3, que contienen los extractos de suelo,
harina y forraje; registrar los mL gastados de HCl en la tabla de datos.
4.3 Tabla de Datos
EHAU (mL) - - 0,5 - -
ESAU(mL) - - - 0,5 -
:EFAU(mL) - - - - 0,5
Agitar los tubos (10 seg), dejar en bao de mara a 37C, durante 20
min, al final adicionar
HgCl2 (Gotas) - 4 4 4 4
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Tabla 1.Datos obtenidos para actividad uresica de suelos, forrajes harinas
Muestras / tubos Indicadores
Wm (g) Vf (mL) V HCl (mL)
Suelo
Harina
Forraje
Stndar
Blanco
Tipo de muestras analizadas
Origen, ubicacin geogrfica, regin, agroclimatologa
5.Clculos
5.1 Actividad Uresica en el tubo estndar
AU=
5.2. Actividad Uresica de la harina
AU=
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5.3 Actividad Uresica en el suelo (tubo 2)
AU=
5.4 Actividad Uresica del forraje
AU=
5.5 Actividad Uresica en el suelo (tubo 4)
AU=
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II. CARBONO ORGNICO, MATERIA ORGNICA Y CAPACIDAD AMORTIGUADORA
( DE SUELOS
Objetivos
Realizar un balance de materia orgnica en muestras de suelo, a partir de la determinacin del carbono orgnico por mtodo de titulacin volumtrica y tcnica espectrofotomtrica
Cuantificar la capacidad amortiguadora de muestras de suelos mediante tcnicas
potenciomtricas y de titulacin volumtrica , en presencia de los indicadores
adecuados
1. Revisin de literatura
El suelo es un mezcla heterognea constituda por componentes orgnicos e inorgnicos, presentes en fases lquida, slida y gaseosa; dichos componentes estn en permanente bioactividad para generarle caractersticas fisicoqumicas y bioqumicas especficas, lo cual determina su utilizacin en el sector agrcola y pecuario; As mismo, la dinmica de los procesos bioqumicos en el suelo, est relacionada con la presencia de microorganismos, los cuales, a travs de reacciones bioqumicas enzimticas (RBE) dadas en su metabolismo, se encargan de generar humus, huminas y cidos hmicos, como constituyentes bsicos de la materia orgnica.
El siguiente mapa resume los componentes qumicos del suelo:
Figura 1: Componentes qumicos del suelo
Fuente: Granados., J (2012)
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En la figura anterior, se aprecia que el suelo contiene sustancias inorgnicas(SI), las cuales incluyen las denominadas bases intercambiables(BI), tales como los minerales: sodio, potasio, magnesio, calcio y el catin amonio (NH4
+), que determinan la capacidad de intercambio catinico (CIC); Adicionalmente, la materia orgnica contiene todas las biomolculas derivadas del carbono orgnico(CO), Nitrgeno total (NT), oxgeno e hidrgeno, includas en los reconocidos grupos funcionales de la qumica orgnica( hidrocarburos, hidroxilos, carbonilos, carboxilos, aminas y amidas, entre otros)
Para la cuantificacin del CO, se utilizan dos mtodos principales: el volumtrico de Walkey Black y el espectrofotomtrico; en tales procedimientos, el suelo es oxidado completamente, por medio del calor generado en la reaccin exotrmica del dicromato de potasio 1N con el cido sulfrico concentrado H2SO4, finalmente, se realiza una titulacin con solucin de sulfato ferroso, en presencia del indicador llamado difenilamina,
La capacidad amortiguadora, se refiere al potencial qumico que tienen los sistemas edficos para regular y controlar su pH, cuando son sometidos a procesos de acidificacin alcalinizacin; dicha regulacin se da por la presencia de sistemas amortiguadores biolgicos, existentes en la materia orgnica e inorgnica del suelo.
Para ampliar este tema, por favor Consultar y explicar los siguientes conceptos, posteriormente, utilizando conectores adecuados, elaborar mentefacto y mapa conceptual respectivamente:
Suelo, cido dbil, base dbil, pKa, electrolitos , disociacin electroltica, materia orgnica, carbono orgnico, humus, huminas, cidos hmicos, bases intercambiables, amonio, capacidad de intercambio catinico, microorganismos, ecuacin de Henderson-Hasselbach, soluciones Buffer, Clulas, Homestasis, Equilibrio cido base, Metabolismo, respiracin, Fotosntesis, ATP, Bicarbonato, Fosfatos, Aminocidos, Protenas, Hemoglobina, capacidad Amortiguadora, potencial amortiguador
2. Materiales y mtodos
2.1. Materiales y equipos
Erlenmeyer de 125mL , pipetas graduadas de 10mL , esptula metlica , agitador de vidrio, probeta graduada de 100mL , bureta de 25mL , soporte universal , beaker de 250mL , Potencimetro, equipo de titulacin, balanza analtica, espectrofotmetro, celdas espectrofotomtricas, embudos, papel filtro, muestras de suelo
2.2. Reactivos
H2SO4 concentrado, K2Cr2O7 1N, H3PO4, Difenilamina, FeSO4 1N, NaOH 0,1N, HCl 0,1N, Fenolftalena, agua destilada y solucin buffer fosfato
2.3. Procedimiento:
2.3.1 Carbono Orgnico (CO), Mtodo de titulacin volumtrica
Muestrear suelos acorde a las recomendaciones indicadas
Recolectar informacin pertinente sobre el origen de las muestras
Secar las muestras y tamizar sobre tamiz de 2mm
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Pesar +0.40g de muestra, registrar el valor como Wm y colocar en Beaker de
200ml.
Adicionar 10 mL de dicromato de potacin 1N, agitar con varilla de vidrio por 1minuto
En la cabina de extraccin de gases, agregar cuidadosamente 10mL cido sulfrico concentrado, agitar con varilla de vidrio dos minutos y dejar enfriar 15 minutos
Adicionar agua destilada hasta completar 100 mL , agitar cuidadosamente 1 minuto y dejar en reposo 1 hora
Al cabo del este tiempo, alistar montaje de filtracin y filtrar la solucin de suelo sobre papel filtro, hasta obtener 20 mL de filtrado
Tomar 10 mL deL filtrado anterior, depositarlo en un erlenmeyer beaker y aforar hasta 100 mL con agua destilada, agitar por 1 minuto
Agregar 5 mL de cido fosfrico concentrado, agitar por 1minuto y reposar 5 minutos
Agregar 30 gotas de difenilamina, agitar suavemente 30 segundos
Alistar montaje de titulacin( lavar, purgar y cargar la bureta con la solucin titulante: Sulfato ferroso 1N)
Colocar el Erlenmeyer beaker que contiene la solucin diluda de suelo debajo de la bureta y Titular lentamente, adicionanando el sulfato sobre la solucin hasta que aparezca y permanezca un color verde esmeralda brillnate
Registrar el volumen de sulfato ferroso gastado en la titulacin: VFeSO4 Titule un blanco de reactivo y registre el volumen: B
2.3.2 Carbono Orgnico (CO), Mtodo Espectrofotomtrico
Alistar el espectrofotmetro a una longitud de onda () de 590 nanmetros (nm) Calibrar el aparato con agua destilada, ajustando a cero la Absorbancia (A)
Colocar 5 ml del filtrado anterior en la celda espectrofotomtrica, depositarla en el
espectrofotmetro y leer la absorbancia (Am), a la longitud de onda mencionada. Registrar todos los valores obtenidos en la tabla de datos 1
2.3.2 Capacidad amortiguadora (, Mtodo Potenciomtrico
Alistar 4 beakers erlenmeyers y rotularlos del 1 al 4
Al primer frasco y segundo frasco, adicionar +/- 20 gramos ( Wm ) de suelo
tamizado y 40 mL de agua destilada , agitar con varilla de vidrio en agitador magntico por 5min, introducir el electrodo del potencimetro, esperar 60 segundos y observar el pH, registrar como pH1 .
Posteriormente , agregar 5 mL de NaOH 0,1N , agitar de nuevo por un minuto y volver a medir el pH2
En el tercer y cuarto beakers, adicionar 20mL de agua destilada y 20 mL de solucin buffer pH 7,0, respectivamente, introducir el electrodo del potencimetro esperar 60 segundos y observar el pH, registrar como pH1 .
Posteriormente , agregar 5 mL de NaOH 0,1N , agitar de nuevo por un minuto y volver a medir el pH2
Registrar todos los valores en la tabla de datos 2.
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3. Tabla de Datos
Tabla 2. Datos para determinacin de carbono orgnico, mtodos volumtrico y espectrofotomtrico
Muestras Peso (Wm) VFeSO4 (mL) Absorbancia (A)
M1
M2
Blanco (B)
Tabla 3..Datos potenciomtricos para capacidad amortiguadora de Suelos
Muestras Peso (Wm) Volumen (mL) pH1 . pH2
Suelo 1
Suelo 2
Agua destilada
Solucin Buffer
4. Clculos
4.1%Carbono Orgnico, Mtodo de titulacin volumtrica
%CO =
Dnde:
%CO= porcentaje de carbono orgnico
VFeSO4= Volumen(mL) de sulfato ferroso
B = Volumen del sulfato ferroso gastado en el blanco
N = normalidad del sulfato ferroso
0.003= peso miliequivalente del carbono en gramos
Wm= peso de la muestra en gramo
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4.2 Carbono Orgnico (CO), Mtodo Espectrofotomtrico
Ver ecuacin curva de calibracin de sacarosa
4.3 Materia Orgnica (%MO)
%MO= %CO 1,724
Dnde:
%MO = Materia orgnica
%CO= porcentaje de carbono orgnico
1,724= constante de Van Bemmelen
4.4 Nitrgeno Total (%NT)
%NT= %MO/20 Donde:
%NT= Nitrgeno total
%MO = Materia orgnica
4.5 Capacidad amortiguadora (, Mtodo Potenciomtrico
Capacidad Amortiguadora Con respecto a NaOH, para muestras de suelos:
Capacidad Amortiguadora Con respecto a NaOH, para muestras de agua y
solucin buffer
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5. Tabla de Resultados
Tabla 4. Valores de carbono orgnico, materia orgnica y Nitrgeno total en las muestras
estudiadas
Muestras
Mtodo Volumtrico Mtodo espectrofotomtrico
%CO % MO %NT %CO %MO %NT
Suelo 1
Suelo 2
Tabla 5. Valores de capacidad y potencial amortiguador para las muestras analizadas
Muestras pH Capacidad Amortiguadora (%mEq NaOH)
Suelo 1
Suelo 2
Agua destilada
Solucin Buffer
6. Grficas (diagramas de Barras, representando los resultados obtenidos)
7. Discusin e interpretacin de los resultados
8. Diagrama UVE heurstico del experimento
9. Conclusiones (mnimo 5)
10. Bibliografa, cibergrafa e infografa, mnimo 8, con normas APA
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III. DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS NO ESTRUCTURALES (CNE), EN
FORRAJES, POR EL MTODO DE FENOL-CIDO SULFRICO:
Este mtodo determina la cantidad de carbohidratos totales No estructurales, basndose
en su contenido de almidones hidrolizables y azcares solubles.
1.PROCEDIMIENTO
1.1 Extraccin:
Pesar +/- 2.0g de muestra en balanza analtica y registrar como: (Wm),
depositarla luego en un vaso de precipitado y agregar 50 mL de solucin
de HCl 0,6N. Agitar constantemente con la varilla de vidrio durante 3
minutos.
Llevar el beaker con la solucin al bao termostatado y calentar a
90C,durante 20 min
Dejar enfriar por 5 min y filtrar sobre papel filtro. Medir el volumen del
filtrado(Vf) y pasar 5mL a un tubo de ensayo, adicionar a ste 5mL de
NaOH 0,6N, agitar por 15 segundos, tapar y rotular as: FFCNE: Filtrado de
forraje para carbohidratos no estructurales.
1.2 Cuantificacin:
1.2.1. Mezcla Reactiva
Alistar 3 tubos de ensayo, rotularlos as: B=blanco; St=Estndar; m =muestra y
adicionarles cuidadosamente, los siguientes reactivos en el orden indicado:
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Reactivos (mL)
Tubos de ensayo
B St m
Agua destilada 2,0 0,0 0,0
Glucosa 1% 0,0 2,0 0,0
FFCNE 0,0 0,0 2,0
Fenol 5% 1,0 1,0 1,0
H2SO4
Concentrado 5,0 5,0 5,0
H2O destilada 2,0 2,0 2,0
Agitar cuidadosamente 20 seg, incubar a 90C, por 10min, sacar los tubos,
agitar nuevamente 10 seg y dejarlos enfriar completamente
1.2.2. Lectura espectrofotomtrica
Alistar el espectrofotmetro a una , calibrar el aparato con el tubo
blanco, ajustando a 100% de Transmitancia (%T) y 0,000 de Absorbancia (A)
Leer la Absorbancia (A) de los tubos st y m; registrar en su tabla de datos
** En caso de que no se pueda determinar directamente la absorbancia, debido al modelo
de espectrofotmetro utilizado, entonces, Leer el % de Transmitancia (%T),de los tubos st
y m, convertir estos valores a Absorbancia (A), mediante la ecuacin : A =2- Log%T ,
trabajar con 3 cifras decimales, ejemplo:0,023**
2.Tabla de datos
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Completar la siguiente tabla:
Tabla 6.Datos para la cuantificacin de CNE
Indicadores Descripcin Valor
Wm Peso de la muestra
Vf Volumen del filtrado
Ast Absorbancia del estndar
Am Absorbancia del tubo que contena el
FFCNE
3.Clculos
%CNE=
Fd
IV. ACTIVIDAD CATALTICA DE LA CATALASA (ACAT)
OBJETIVOS
Determinar la actividad de la catalasa por mtodo permanganomtrico (Ulrich.,1980)
Cuantificar la actividad enzimtica de la catalasa en muestras de origen vegetal y animal
INTRODUCCIN
La catalasa como biocatalizador de origen proteco, es una enzima xido-reductasa que
participa en la degradacin del perxido de hidrgeno (H2O2), hasta Oxgeno molecular
(O2) y agua(H2O).
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La reaccin bioqumica enzimtica (RBE) que cataliza es la siguiente:
1H2O2 1 H2O + O2
Dicha biomolcula , est presente en peroxisomas y mitocondrias de clulas animales y
vegetales , protegindolas de la toxicidad de los radicales libres perxido ,impidiendo su
acumulacin y beneficiando el metabolismo celular .Tambin, tiene una participacin
activa en los procesos de foto-respiracin vegetal ,promoviendo la oxidacin del glicolato
generado a nvel del estroma del cloroplasto en una etapa posterior al ciclo de Calvn de
la fotosntesis , hasta el aminocido glicina (cido-2-aminoetanoco), el cual es oxidado
finalmente en la mitocondria- por medio de reacciones de desaminacin oxidativa-hasta
CO2 , NH3 y H2O. En las clulas animales y vegetales ,el perxido hidrgeno H2O2 se
produce durante la oxidacin de las coenzimas FAD y FMN, biomolculas importantes en
la oxidacin de sustratos a partir del oxgeno molecular. Tambin se genera por la
oxidacin de cidos grasos(AG) en los peroxisomas. Molecularmente, la catalasa est
codificada como EC 1.11.1.6 por la: enzyme comisin numbers y se clasifica como
perxido de hidrgeno xidorreductasa, conformada espacialmente en su estructura
cuaternaria como una protena homotetramrica de peso molecular que oscila entre 210 a
280 Kilodaltons (kD) con 4 subunidades idnticas, constitudas por un grupo prosttico
de protoporfirina y el grupo hemo (Fe- III), representando estos, un 1,1 % y 0,09 %
respectivamente del peso molecular total de la enzima. En esta prctica, la actividad de
catalasa se determinar por el mtodo permanganomtrico, en el cual se titula el perxido
residual, es decir , el que no particip en la RBE, con una solucin de permanganato de
potasio (KMnO4) de concentracin conocida
METODOLOGA
Materiales
Montaje de titulacin (soporte universal, bureta, pinzas, erlenmeyer ), pipeta graduada,
probeta graduada, beaker de 400mL; tubos de ensayo con gradilla;
Reactivos:
H2O2 0,05M, H2SO4 2N, KMnO4 0,01M; Extractos de catalasa (ECAT)
PROCEDIMIENTO
Catalasa
pH= 6,8 ;T=30C
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1. Extraccin
Frutas , verduras, suelos concentrados
Pesar ms o menos 2g de muestra picada pulverizada, registrar el valor como: Wm y
colocarla en un tubo de centrifuga, luego adicionar 10mL de solucin fra de buffer fosfato
0,05M, pH=6,8-7,0, agitar, con agitador de vidrio (3min) y centrifugar a 2500rpm durante
5min. Sacar el sobrenadante, filtrar y medir su volumen, registrarlo como: Vf y tomar 5 mL
de ste para depositarlo en un tubo de ensayo, taparlo, rotularlo como: EVCAT(extracto
de verdura para catalasa ) EFCAT(extracto de fruta para catalasa), ECCAT (extracto
de concentrado para catalasa), ESCAT, colocarlos inmediatamente en bao de hielo.
Sangre: En un tubo de ensayo, colocar 0,2 mL de sangre y 10 mL de buffer fosfato fro,
agitar vigorosamente hasta obtener mezcla completa, tapar, rotular: SSCAT (Solucin
sangunea para catalasa) y guardar en refrigeracin bao de hielo.
2. Cuantificacin
2.1 Mezcla Reactiva
Alistar 7 tubos de ensayo y rotularlos as: B, 1, 2, 3, 4, 5 ,6, colocarlos en bao de hielo y
adicionar los siguientes reactivos en el orden dado:
REACTIVOS
(mL)
Tubos de ensayo
B 1 2 3 5 6
H2O2 0,03M 4 4 4 4 4 4
Buffer fosfato 5 4 4 4 4 4
H2SO4 2N 1 0 0 0 0 0
EVCAT 0 1 0 0 0 0
EFCAT 0 0 1 0 0 0
ECCAT 0 0 0 1 0 0
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2.2 Titulacin permanganomtrica REDOX
Alistar el montaje de titulacin, colocar el erlenmeyer debajo de la bureta y titular
adicionando lentamente el KMnO4, agitando , hasta que aparezca y permanezca un color
rosado violeta plido, por 30 segundos, en la solucin reactiva, registrar los mL de
permanganato gastados en este proceso.
2.3 Repetir el procedimiento con los tubos restantes, registrar volmenes de KMnO4, en la
tabla de datos
3. TABLA DE DATOS
Tabla 7. Datos para actividad cataltica de catalasa (ACAT)
Muestras / tubos Indicadores
Wm (g) Vf (mL) VKMnO4 (mL)
Suelo
Harina
Forraje
Verdura
Blanco
Tipo de muestras analizadas
Origen, ubicacin geogrfica, regin, agroclimatologa
SSCAT 0 0 0 0 1 0
ESCAT 0 0 0 0 0 1
Agitar vigorosamente los tubos por 30 segundos, colocarlos nuevamente
en el bao de hielo y dejarlos en reposo durante 5min, para que se
desarrolle la RBE
H2SO4 2N 0 1 1 1 1 1
Agitar los tubos, con cuidado, por 15 segundos, hasta mezclarlos
completamente, sacar la solucin del tubo blanco y pasarla a un
erlenmeyer beaker
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4. CLCULOS
Suelo;
ACAT=
Continuar el clculo para las dems muestras
V. CUANTIFICACIN DE NITRGENO NO PROTEICO (NNP) (Fraccin A de Van
Soest )
OBJETIVOS
Cuantificar el nitrgeno no proteco (NNP) ,tambin denominado fraccin A de Van
Soest , mediante el reactivo especfico : cido Tricloroactico (ATA)
Aplicar tcnicas instrumentales analticas de Kjeldhal y espectrofotomtricas para
determinar el contenido de NNP y Protena verdadera (PV) en forrajes y
concentrados.
1.REVISIN DE LITERATURA
Cerca del 90 % del nitrgeno total (NT) presente en el contenido del lquido ruminal, se
encuentra en forma insoluble. El 10 % de ste corresponde a nitrgeno amoniacal (NNP),
y el restante, es una mezcla entre aminocidos libres y pptidos. El amonaco (NH3) se
encuentra en una concentracin que oscila entre 2 y 50 mg /dL, dependiendo de la racin
y del tiempo transcurrido desde la ingesta y es mxima generalmente unas dos horas
despus de la ingesta de los alimentos que aportan protena. El NH3 es el principal
nutriente nitrogenado para las bacterias del rumen; stas lo utilizan si existen adecuadas
fuentes de energa, principalmente carbohidratos, para biosintetizar aminocidos
necesarios con el fin de cubrir sus propias necesidades proteicas. Otras fuentes de NNP
para el rumen, aparte de la protena ingerida y degradada, lo constituye la urea (H2N-CO-
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NH2), la cual es degradada por la enzima bacteriana denominada ureasa clasificada
como amidohidrolasa, en presencia del agua , hasta producir: amonaco y gas
carbnico(CO2)
El amonaco producido en el rumen por encima de la capacidad de los microorganismos
para asimilarlo, se absorbe y por sangre, es transportado al hgado y convertido en urea.
Parte del amonaco libre existente en el rumen se absorbe directamente a travs del
epitelio del rumen, hasta la sangre; el resto (en la mayora de los casos, la mayor parte),
pasa con los alimentos digeridos hasta el intestino donde es absorbido, llega a la sangre y
luego al hgado. La mayor parte de la urea formada en el hgado se excreta a travs de la
orina; una parte (hasta el 20 %) es reciclada al rumen con la saliva o por difusin directa
desde la sangre a travs de la pared del rumen (A. Bondi, 1988).
En el laboratorio, el nitrgeno no proteico (NNP), que est includo en: rea, amonaco y
pptidos, es tradicionalmente aquel que pasa en el filtrado despus de la precipitacin
con un reactivo especfico para protena.
Krishnamoorthy et al. (1982) utiliz cido tricloroactico (ATA) como reactivo especfico,
para separar el nitrgeno insoluble del soluble (NNP), esto se realiza mediante la lisis de
polipptidos, hasta pptidos der menor peso molecular, de tal forma que son
metablicamente ms cercanos a la protena soluble(PS). Muchas bacterias ruminales
(en particular las celulolticas) no consumen solo aminocidos, tambin requieren
pptidos, para su mantenimiento metablico.
2. Materiales y Mtodos
2.1Reactivos:
Acido Tricloroactico (ATA) al 10% ( Cl3-C-COOH )
Agua destilada
2.2 Procedimiento:
2.2.1 Extraccin con cido Tricloroactico (ATA)
Pesar +/- 2,0 g de muestra (Suelo, forraje) (picada pulverizada) , en balanza
analtica y registrar como ( y colocar en vaso de precipitado
Adicionar 20 mL de agua destilada fra, agitar por 1min
Dejar reposar la mezcla por 15 min
Adicionar 30 mL de solucin de ATA, agitar por 1min
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Reposar a Temperatura ambiente por 20 min
Filtrar sobre papel filtro en probeta
Medir el volumen del filtrado(Vf)
Recolectar 5 mL del filtrado, colocarlos en un tubo de ensayo y rotularlo: FFNNP:
filtrado de forraje para nitrgeno no proteco FSNNP (Filtrado de suelo para
nitrgeno no proteco
Tapar los tubos y guardar en nevera a refrigeracin, hasta ser utilizados en la
mezcla reactiva
2.2.2 Cuantificacin
Cuantificar el Nitrgeno en el filtrado, por mtodo espectrofotomtrico de Biuret-
Lowry
a) Mezcla de reactivos
Alistar 4 tubos de ensayo, rotularlos as: B:blanco; st :estndar; m-1 y m-2
Adicionar los siguientes reactivos en el orden dado, segn el cuadro:
Reactivos (mL)
Tubos de ensayo
B st m-1 m-2
Agua destilada 2 0 0 0
Albmina
0,5% 0 2 0 0
FFNNP 0 0 2 0
FSNNP 0 0 0 2
Reactivo de
Biuret 3 3 3 3
Agitar vigorosamente por 30 segundos y dejar reposar de 5 a 10 min,
a temperatura ambiente.
b) Lectura espectrofotomtrica
c) Alistar el espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nanmetros
(nm) y calibrarlo configurarlo con la solucin del tubo blanco.
d) Leer la Absorbancia(A) de las dems soluciones : st, m-1 y m2
Registrar estos valores en la tabla de datos
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3.Tabla de datos
Tabla 8:Datos para Nitrgeno no proteco (NNP)
Muestras / tubos Indicadores
Wm (g) Vf (mL) Absorbancia (A)
Suelo
Forraje
Stndar
Tipo de muestras analizadas
Origen, ubicacin geogrfica, regin, agroclimatologa
4.Clculos
4.1% de Nitrgeno No Proteco (NNP)
%NNP=
Donde:
Am: es la Absorbancia de la muestra
Ast: Absorbancia del estndar de albmina
: volumen del filtrado en mL
: Peso de la muestra en gramos
Desarrollar clculo para muestra de suelo y forraje.
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Opcional
CAPACIDAD AMORTIGUADORA ( Y POTENCIAL AMORTIGUADOR (p ( ) DE
MUESTRAS BIOLGICAS
Objetivos
Cuantificar la capacidad amortiguadora de muestras biolgicas mediante tcnicas
potenciomtricas y de titulacin volumtrica , en presencia de los indicadores
adecuados
Realizar un anlisis comparativo del potencial bufferante de muestras de origen
biolgico ,como: leche, sangre, orina , concentrado y forrajes
1. Revisin de literatura
Con base en el artculo anexo, consultar Explicar los siguientes conceptos y elaborar
mentefacto y mapa conceptual
cido dbil, base dbil, pKa , electrolitos , disociacin electroltica , tampones fisiolgicos ,
ecuacin de Henderson-Hasselbach , soluciones Buffer , Clulas , Homestasis ,
Equilibrio cido base , animales , vegetales , Metabolismo, respiracin , Fotosntesis ,
ATP , Bicarbonato , Fosfatos, Aminocidos , Protenas, Hemoglobina .capacidad
Amortiguadora , potencial amortiguador
2. Materiales y mtodos
2.1. Materiales y equipos
Erlenmeyer de 125mL , pipetas graduadas de 10mL , esptula metlica , agitador de
vidrio, probeta graduada de 100mL , bureta de 25mL , soporte universal , beaker de
250mL , Potencimetro, equipo de titulacin, balanza digital, muestras biolgicas
(concentrado ,orina , sangre y forraje )
2.2. Reactivos
NaOH 0,1N, HCl 0,1N , Fenolftalena , rojo de metilo, agua destilada y solucin buffer
fosfato
2.3. Procedimiento:
2.3.1 Mtodo de titulacin volumtrica
Alistar 3 beaker erlenmeyer pequeos y rotular as: 1, 2, 3.
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Adicionar al erlenmeyer uno , 20mL de agua destilada , al dos , 20mL de solucin
buffer y al tercero, 20 mL de leche.
Colocar en cada frasco 2 gotas de fenolftalena y agitar por 10 segundos
Alistar el montaje de titulacin y cargar la bureta con solucin de NaOH 0,1N
Colocar el primer frasco bajo la bureta y titular la solucin acuosa, adicionando el
NaOH hasta que aparezca y permanezca un color rosado plido, registrar el
volumen gastado en su tabla de datos.
Repetir la titulacin anterior con las dems soluciones , buffer y leche. Registrar
volmenes en tabla de datos.
Tabla 1..Datos volumtricos para capacidad amortigudora de muestras biolgicas
Muestras Vm (mL) V NaOH 0,1N (mL)
Agua destilada 20
Buffer fosfato
Leche
2.3.2 Tcnica potenciomtrica
Alistar 5 beakers erlenmeyers y rotularlos del 1 al 5
Al primer frasco , adicionar +/-5 gramos (Wm ) de concentrado pulverizado y 100
mL de agua destilada , agitar con varillad de vidrio en agitador magntico por
5min ,filtrar y medir el pH de este filtrado ,registrar como pH1 . Posteriormente ,
agregar 5 mL de HCl 0,1N , agitar de nuevo por un minuto y volver a medir el pH2
En el segundo y tercer beakers , repetir el procedimiento con las muestras de
harina y forraje picado , respectivamente.
En el cuarto vaso, Agregar 1mL de sangre y 19 mL de agua destilada , agitar por
30 segundos y medir pH1 , luego, adicionar 5mL de NaOH 0,1N , agitar por un
minuto y volver a observar el pH final (pH2)
En el quinto frasco, colocar 20mL de orina junto con 20mL de agua destilada,
agitar por 30 segundos y registrar el pH1 , luego , adicionar 5mL de NaOH 0,1N ,
agitar nuevamente por 1min y evaluar el pH final (pH2)
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3. Tabla de datos
Tabla 2.Datos potenciomtricos para capacidad amortiguadora de muestras biolgicas
Muestras
Valores evaluados
Wm (g) Vm (mL) pH1
pH2
Concentrado
Harina
Forraje
Sangre
Orina
4. Clculos
4.1 Mtodo de titulacin volumtrica
Capacidad Amortiguadora
Potencial Amortiguador
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4.2 Tcnica potenciomtrica Capacidad Amortiguadora Con respecto a HCl
Potencial Amortiguador Con respecto a HCl
Capacidad Amortiguadora Con respecto a NaOH
Potencial Amortiguador Con respecto a NaOH
Calcular la capacidad Amortiguadora y Potencial Amortiguador de
todas las muestras biolgicas estudiadas (con respecto a HCl y NaOH)
5. Tabla de Resultados
Tabla 3. Valores de capacidad y potencial amortiguador para las muestras analizadas
Muestras (mEq HCl
/pH)
(mEqNaOH
/pH) HCl NaOH
Concentrado
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Harina
Forraje
Sangre
Orina
6. Grficas (diagramas de Barras, representando los resultados obtenidos)
7. Discusin e interpretacin de los resultados
8. Diagrama UVE heurstico del experimento
9. Conclusiones (mnimo 5)
10. Bibliografa mnimo 6, con normas ICONTEC
A. Elementos necesarios para la prctica
Protocolos gua de la actividad, Preinformes impresos, Bata blanca , cinta de enmascarar, bayetilla roja, vidriolap, muestras de origen biolgico recolectadas y empacadas segn la gua didctica, libreta de anotaciones, lpiz, cmara fotogrfica.
B. Productos a entregar
Trabajo prctico en equipo: En este espacio, los integrantes del grupo, ejecutarn los
respectivos procedimientos instrumentales y analticos, para determinar los componentes qumicos en cada muestra, registrando cuidadosamente los datos en las tablas, de tal forma que al final de cada sesin debern entregarse al docente responsable de la prctica. Trabajo intelectual del equipo: En esta etapa, los estudiantes efectuarn la discusin y aportes individuales para la construccin del informe modelo. artculo cientfico, como producto final, el cual se elaborar de acuerdo al formato anexo a este documento. ACTIVIDAD: En el grupo colaborativo, deben diligenciar el formato de informe final, generando un producto de trabajo colaborativo, con base en lo establecido all y con las siguientes caractersticas:
Mrgenes de 3cm, letra arial 12 (para ttulos y subttulos); 11(texto y contenidos) y 10, para: Resumen, subndices y superndices
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Interlineado 1cm,para el resumen y 1,5cm para el texto.
Portada, donde se indique : Ttulo de la prctica, Integrantes del grupo , cdigo, correo electrnico, Nombre tutor de plataforma y su correo, CEAD de origen, programa , ECAPMA, UNAD, fecha de entrega.
El contenido deber inclur: 1. Resumen (mximo 6 lneas); palabras claves (5). 2. Introduccin (14 lneas). 3. Fundamentacin Terica (Revisin de literatura) 3.1 Mapa conceptual 3.2 Mentefacto conceptual 4. Materiales y Mtodos. 4.1 Lista de equipos utilizados 4.2 Lista de reactivos utilizados 4.3 Procedimientos (diagrama de flujo) 4.3.1 Video fotos del trabajo en el laboratorio 5. Resultados y discusin. 5.1 Tabla de datos 5.2 Ecuaciones de clculo 5.3 Tablas de resultados 5.4 Grficas estadsticas (diagramas de barras) 5.5 Discusin e interpretacin de los resultados 6. Conclusiones (cinco) 7. Bibliografa consultada (mnimo 5 referencias) (Normas APA.) 8. Anexos 8.1 Diagrama UVE heurstico de la prctica.
II ACTIVIDADES PARA EL TUTOR El tutor de prctica, debe entrar en contacto desde el inicio del perodo acadmico con el director de curso, con el objetivo de conformar la red de tutores, la cual se trabajar desde los correos institucionales
Logstica y desarrollo de la prctica
Seleccin del sitio donde se desarrollar la prctica
Aseguramiento logstico para desarrollo de la prctica
Entrega de la gua a los estudiantes y seguimiento de la prctica: Su rol debe ser de orientador y facilitador en el desarrollo de las actividades.
Conclusiones de la prctica. Establecer un mecanismo que permita el intercambio de ideas, aclaracin de dudas y planteamiento de conclusiones de manera conjunta.
Evaluacin. El tutor realizar la evaluacin de la prctica de acuerdo con la rbrica.
1. Informe de Actividades
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El tutor de prcticas deber elaborar un informe sobre el desarrollo de las actividades del componente prctico el cual debe ser entregado al director de curso. Dicho informe estar compuesto por los siguientes formatos diligenciados:
Formato 1: Datos generales de la prctica
CONTROL Y SEGUIMIENTO AL DESARROLLO DEL COMPONENTE PRCTICO
Nombre del tutor
CEAD donde se encuentra el tutor
Curso
Ttulo de la prctica
Fecha de realizacin Dia:________________ Mes_______________ Ao:_________
Lugar donde se desarroll la prctica
Lugar: ________________________________________ Municipio:________________ Departamento:_______________
Temas abordados en la prctica
Materiales y equipos empleados en la prctica
Observaciones
Costo aproximado
Transporte:___________________________________ Materiales y equipos:____________________________
Formato 2: registro de asistencia de los estudiantes a las actividades prcticas
REGISTRO DE ASISTENCIA DE ESTUDIANTES A LAS ACTIVIDADES PRCTICAS
No NOMBRES APELLIDOS CODIGO FIRMA 1 2 3 4 5 6 7 8 9
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10 11 12
Datos del tutor
Nombre: _________________________________________ Cdula: ____________ Firma: ________________________ Correo___________________________________________ Telfonos _______________ Celular __________________
Anexos Evidencias del desarrollo de la prctica (Fotografas, videos, etc).
Formato 3: Reporte de calificaciones obtenidas por los estudiantes
REPORTE DE CALIFICACIONES Curso: _______________________________ Cdigo:_______________________________ Ttulo de la prctica: ____________________ _____________________________________
CEAD:_______________________________ Fecha:_______________________________ Tutor: _______________________________ Firma:_______________ Cdula:_________
No Apellidos y Nombres Cdigo Participacin (mx. x puntos)
Competencias desarrolladas
Informe (mx. x puntos)
Total 40% en puntos
1
2
3
4
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