Ibridazione degli acidi
nucleici L’ibridazione consiste nel porre a contatto acidi nucleici a singolo
filamento provenienti da fonti diverse:
Sonda – di solito una popolazione omogenea di molecole note.
Bersaglio – di solito una miscela complessa ed eterogenea di acidi nucleici.
Se sonda e bersaglio sono molecole a doppio filamento è necessario provvedere alla loro denaturazione mediante trattamento termico o alcalino.
I parametri che determinano la temperatura di fusione (Melting) della doppia elica, cioè il passaggio da una struttura a doppia elica a quella a singolo filamento sono:
Lunghezza del filamento.
Composizione di basi (%GC).
Ambiente chimico – cationi ionici monovalenti (Na+) stabilizzano la doppia elica mentre denaturanti chimici (formammide, urea) la destabilizzano.
Il DNA genomico di mammifero (GC circa 40%) si denatura a Tm 87°C.
Come favorire la formazione di
heteroduplex sonda-bersaglio
La cinetica di riassociazione descrive la velocità con cui una sequenza a singolo filamento è capace di trovare il filamento complementare.
Concentrazione di partenza della specifica sequenza (Co).
Durata della reazione in secondi (T).
CoT è un unità che utilmente descrive la reazione d’ibridazione
I parametri che entrano i gioco sono:
Temperatura (in genere Tm della sonda – 20°C)
Forza ionica del mezzo (concentrazione salina)
Presenza di agenti chimici denaturanti
Variando opportunamente i diversi parametri è possibile modificare la stringenza delle condizioni d’ibridazione.
Normalmente l’acido nucleico bersaglio è presente in largo eccesso rispetto alla sonda.
Standard assays Labeled probe in solution Unlabeled target bound to solid support
Dot-blot (Figure 5.11)Any labeled DNA or RNA but often an
oligonucleotide
Complex DNA or RNA population; not size-fractionated,
but spotted directly onto membrane
Southern blot (Figures
5.12, 5.16)Any
Often complex genomic DNA (but may be individual DNA
clones); digested with restriction nuclease and size
fractionated, then transferred to membrane
Northern blot (Figure
5.13)Any
Complex RNA population (e.g. total cellular RNA or poly
A+ RNA) which has been size-fractionated, then
transferred to membrane
Chromosome in situ
hybridization (Section
5.3.4; Figure 10.5)
Usually a labeled genomic cloneDNA within chromosomes (often metaphase) of lysed
cells on a microscope slide
Tissue in situ
hybridization (Figure
5.17)
Usually a labeled antisense riboprobe
or oligonucleotide
RNA within cells of fixed tissue sections on a microscope
slide
Colony blot (Figure
5.18)Any
Cell colonies separated after plating out on agar then
transferred to membrane
Plaque lift (Section
5.4.1)Any
Phage-infected bacterial colonies separated after plating
out on agar and transferred to membrane
Gridded clone
hybridization assay
(Figure 5.19)
AnyClones robotically spotted onto membrane in geometric
arrays
Reverse assays Labeled target in solution Unlabeled probes bound to solid support
Reverse dot-blot Complex DNA Oligonucleotides spotted onto membrane
DNA microarray
(Figures 5.20A and
20.6A)
Complex DNA DNA clones robotically spotted onto microscope slide
Oligonucleotide
microarray (Figures
5.20B and 20.6B)
Complex DNA Oligonucleotides synthesized on glass
Saggi d’ibridazione degli
acidi nucleici
Dot Blot con sonde ASO (Allele
Specific Oligonucleotide)
Southern Blot
Southern blot per identificare
mutazioni che modificano un
sito per un enzima di restrizione
ZOO Blot
Northern Blot
Ibridazione in situ dei
cromosomi (FISH)
Una sonda opportunamente marcata, in genere con un fluoroforo, può essere utilizzata per ibridare direttamente i cromosomi.
Si utilizzano linee cellulari linfoblastoidi ottenute da sangue periferico o altri tipi cellulari (amniociti in diagnosi prenatale).
Le cellule sono bloccate in metafase mediante trattamento con colchicina.
Il trattamento con RNasi e proteinchinasi K consente di ottenere DNA cromosomico parzialmente purificato, denaturato poi con formammide.
Il vetrino è poi ibridato con la sonda specifica, lavato nelle opportune condizioni di stringenza e analizzato al microscopio.
Parziale trisomia del Chr 2
A. Cariotipo con tecnica
classica
B. M-FISH
C. Rx-FISH
Ibridazione in situ dei tessuti
Una sonda opportunamente marcata, in genere una sonda a RNA (ribosonda), può essere utilizzata per ibridare direttamente sezioni di tessuti od organi al fine di valutare l’espressione di un determinato gene.
La sonda deve essere complementare all’mRNA, si utilizza quindi una sonda antisenso.
In genere la sonda senso viene comunque utilizzata come controllo negativo (non dà segnale d’ibridazione).
Le sezioni di tessuto sono opportunamente trattate per stabilizzare l’mRNA e denaturarlo.
Il vetrino è poi ibridato con la sonda specifica, lavato nelle opportune condizioni di stringenza e analizzato al microscopio.
Embrione di topo (13d)
Sonda b-miosina
Forte espressione nei ventricoli cardiaci
Screening di librerie e
Colony Lift Assay
DNA microarray
I DNA microarray (DNA chip) rappresentano l’ultima innovazione nell’ambito delle tecniche d’ibridazione.
Microarray di cloni di DNA, in cui cloni di DNA noti sono micropipettati sulla superficie del vetrino.
Microarray di oligonucleotidi, in cui specifiche sequenze oligonucleotidiche vengono fissate o sintetizzate (Affimetrix) sulla superficie del vetrino
In questo caso si tratta di tecniche d’ibridazione inversa in cui la sonda, non marcata, è legata al supporto ed è la mistura complessa di molecole di DNA ad essere marcata ed ibridata al supporto.
I campi applicativi sono molteplici ed aumentano in funzione della sempre maggiore miniaturizzazione (Chip di 1.28X1.28 cm possono contenere fino a 300.000 oligonucleotidi).
Analisi d’espressione
Analisi genomica (array-CGH)
SNPs genotyping
Array-based Comparative
Genomic Hybridization (array-
CGH) Delezioni e duplicazioni submicroscopiche (~100 Kb
-10 Mb) costituiscono più del 15% delle mutazioni
osservate per malattie monogeniche.
L’array-CGH consente di analizzare efficientemente
questo tipo di alterazioni cromosomiche.
Rispetto al CGH convenzionale su cromosomi
metafasici, i principali vantaggi sono:
Più alta risoluzione (~100 Kb)
La possibilità di ricondurre immediatamente
l’alterazione osservata ad una precisa
regione/sequenza del cromosoma.
Polymerase chain reaction
(PCR)
La reazione a catena della polimerasi
(PCR) ha di fatto rivoluzionato la genetica
molecolare, con la possibilità di
analizzare e clonare velocemente il DNA.
E’ un metodo in vitro molto versatile per
amplificare determinate sequenze
bersaglio presenti in campioni di DNA.
Sono necessarie informazioni sulla
sequenza del DNA bersaglio, almeno per
consentire il disegno della coppia di
primers specifica da utilizzare nella
reazione di amplificazione.
Kary B. Mullis (USA)
Nobel Prize in 1993 for his
invention of the
polymerase chain reaction
(PCR) method
Cosa ha reso la PCR così
facilmente accessibile?
La disponibilità di DNA polimerasi
termostabili.
Taq DNA polimerasi (estratta da Thermus
aquaticus).
L’ingegnerizzazione di termociclatori capaci
gestire velocemente e con elevata
precisione i cambi di temperatura che
caratterizzano il processo di amplificazione.
Scelta dei primers
Il disegno della coppia di primers è molto importante per la buona riuscita della PCR.
Sono disponibili supporti bioinformatici che aiutano nella selezione.
On-line PRIMER3: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
Specificità della reazione di
PCR
Nested PCR - l’utilizzo di primers interni a quelli utilizzati in una precedente amplificazione può garantire la specificità del prodotto
Hot-Start PCR – si creano le condizioni per una partenza a caldo della reazione limitando la formazione di prodotti aspecifici
Touch-down PCR – il termociclatore gestisce la temperatura di annealing, decrementandola ad ogni ciclo in un range definito. E’ possibile così selezionare il prodotto specifico.
Gradient PCR – il termociclatore può gestire contemporaneamente diverse temperature di annealing, consentendo una precisa ottimizzazione delle condizioni di amplificazione.
Vantaggi e Svantaggi della
PCR
Velocità e semplicità.
Sensibilità
Duttilità
Necessità di
informazioni sulla
sequenza bersaglio
Dimensioni ridotte del
prodotto di PCR
Imprecisione della
replicazione del DNA
Genotyping mediante PCR (1)
Genotyping mediante PCR (2)
STR polimorfici
Analisi di Linkage
Test genetico d’identità
personale
Esempio di referto
RISULTATO (in grassetto si evidenziano i marcatori paterni condivisi dal figlio)
Marcatore - cromosoma Padre Figlio Madre D8S1179 – crom. 8(q24.13) 13/13 13/14 14/15 D21S11 – crom 21( q21.1) 29.2/29.2 29.2/32 26.2/32 D7S820- crom 7(q21.11) 8/10 8/11 11/11 CSF1PO – crom. 5(q32) 11/12 11/12 10/12 D3S1358 – crom. 3(p21.31) 15/17 15/16.2 15/16.2 TH01- crom 11(p15.5) 5.3/5.3 5.3/9.3 8.3/9.3 D16S539 – crom. 16(q24.1) 8/10 10/10 10/11 D2S1338 – crom. 2(q35) 17/17 17/23 17/23 D19S433 – crom. 19 (q12) 12/13.2 12.2/13.2 12.2/13.2 vWA- crom. 12(p13.31) 15.2/16 15.2/16 16/17 TPOX- crom. 2(p25.3) 9/11 7/11 7/9 D5S818- crom. 5(q23.2) 7/11 7/13 13/13 FGA – crom. 4(q31.3) 20.2/29 20.2/21.2 21.2/25.2
CONCLUSIONI:. Dall’analisi del DNA emerge una ATTRIBUZIONE della paternità di con una probabilità di paternità maggiore del 99,99%. Questo indica una paternità praticamente provata.
Top Related