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IL LABORATORIO NELLE URGENZE ED EMERGENZEhs Troponina I e Peptidi Natriuretici:

punto di vista del Laboratorio

Ottavia Porzio

Dipartimento di Medicina di LaboratorioLaboratorio di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica

Policlinico di Tor Vergata

IL LABORATORIO NELLE URGENZE ED EMERGENZEhs Troponina I e Peptidi Natriuretici: punto di vista del Laboratorio

Troponine Danno cardiaco

Peptidi Scompenso cardiaconatriuretici

Il marcatore biochimico ideale di danno miocardicopossiede:

Alta sensibilità e specificità

Rapida cinetica di dismissione

Ampia finestra diagnostica

Può essere dosato velocemente (rapido turnaroundtime)


Il complesso delle troponine èresponsabile della regolazionedella contrazione muscolare, sianel muscolo scheletrico checardiaco.

Il complesso è composto da 3subunità:• Troponina C (TnC), proteinaCa2+-dipendente che interagiscecon la troponina I,• Troponina I (TnI), che inibiscel’interazione tra actina e miosina• Troponin T (TnT), responsabiledella trasmissione deicambiamenti conformazionali allefibre muscolari sottili


I cardiomiociti esprimono specifiche isoformedella TnI e TnT, indicate rispettivamente comecTnI e cTnT, che possono essere facilmentedistinte mediante immunodosaggi.

Le troponine cardiache sono determinate nelsiero mediante l’utilizzo di anticorpi monoclonalidiretti contro epitopi della cTnI e cTnT. Questianticorpi sono altamente specifici per la formacardiaca della troponina e non hanno alcunacrossreattività con l’isoforma del muscoloscheletrico.


Limite decisionale raccomandato (cut-off) per cTnI e cTnT:

99th percentile

Il livello di imprecisione (coefficiente di variazione) accettabile a concentrazioni pari al 99° percentile deve essere

≤ 10%.

National Academy of Clinical Biochemistry, IFCC Committee for Standardization of Markers of Cardiac Damage Laboratory Medicine Practice Guidelines, European Society of Cardiology/American College of CardiologyClin Chem 2007, 53,4: 547-574


Early Diagnosis of Myocardial Infarctionwith Sensitive Cardiac Troponin AssaysTobias Reichlin, M.D., Willibald Hochholzer, M.D., Stefano Bassetti, M.D.,Stephan Steuer, M.D., Claudia Stelzig, M.Sc., Sabine Hartwiger, M.D.,Stefan Biedert, M.Sc., Nora Schaub, M.D., Christine Buerge, M.D.,Mihael Potocki, M.D., Markus Noveanu, M.D., Tobias Breidthardt, M.D.,

361;9, august 27, 2009

Sensitive Troponin I Assay in EarlyDiagnosis of Acute Myocardial Infarction

Till Keller, M.D., Tanja Zeller, Ph.D., Dirk Peetz, M.D., Stergios Tzikas, M.D.,Alexander Roth, Ph.D., Ewa Czyz, M.D., Christoph Bickel, M.D.,

Stephan Baldus, M.D., Ascan Warnholtz, M.D., Meike Fröhlich, M.D.,Christoph R. Sinning, M.D., Medea S. Eleftheriadis, Philipp S. Wild, M.D.,Renate B. Schnabel, M.D., Edith Lubos, M.D., Nicole Jachmann, Ph.D.,

Sabine Genth-Zotz, M.D., Felix Post, M.D., Viviane Nicaud, M.A.,



L’accuratezza diagnostica perIMA, quantificata mediante AUC,era significativamente più altautilizzando la hs-trop rispetto aidosaggi standard (0.94-0.96 vs0.90, rispettivamente), differenzapiù evidente quando venivanoconsiderati soltanto i pazienti coninsorgenza recente del doloretoracico.

La hs-Troponina possiede:



CAUSE NON ISCHEMICHE DI INCREMENTO DELLE TROPONINE

Miocardite/pericardite Scompenso cardiaco Cuore polmonare acuto Trauma cardiaco Tossicità miocardica da chemioterapici Rigetto nel trapianto cardiaco Insufficienza renale cronica Intossicazione da monossido di carbonio Distrofie muscolari Sepsi


Till Keller MD, NEJM 361,2009







Può essere dosato velocemente(rapido turnaround time)


Quale potrebbe essere l’impatto dei nuovi metodi ad altasensibilità delle troponine I e T sulla diagnostica della SindromeCoronarica Acuta ?

L’utilizzo della TnI-Ultra aumentasignificativamente il numero di valoripositivi, senza modificare il numero deitest richiesti. L’elevato numero di valoripositivi è da ricondurre ai risultatipresenti nel range dei bassi-positivi(0.05–0.10 µg/l).Pertanto, il dosaggio ultrasensibile dellacTnI permette di identificare piùprecocemente il danno cardiaco maaumenta anche in patologie noncorrelate al danno ischemico.

Clin Chim Acta 2008, 395: 57-61


Troponine Danno cardiaco

Peptidi Scompenso cardiaconatriuretici

I Peptidi Natriuretici Cardiaci (PNC) appartengono ad unafamiglia di peptidi, con funzione ormonale, costituita da molecolealtamente omologhe:

ANP: Peptide Natriuretico di tipo A o atriale, prodotto dallecellule atriali; BNP: Peptide Natriuretico di tipo B o cerebrale, isolato per laprima volta nel cervello di suino; CNP: Peptide Natriuretico di tipo C, prodotto prevalentementedalle cellule endoteliali e a livello del SNC; DNP: Dendroaspis Natriuretic Peptide, il cui ruolofisiopatologico e le cui origini sono ancora incerte Urodilatina: prodotta esclusivamente dal rene, non si trova incircolo ma solo nelle urine


I vari peptidi natriuretici hanno in comune la porzione anulare dellamolecola, di cui condividono gran parte della sequenza aminoacidica.La lunghezza e la composizione aminoacidica delle porzioni residuedella catena peptidica variano notevolmente tra i vari ormoninatriuretici.

L'anello è la porzione recettore-specifica della molecola.

I peptidi natriuretici possiedono unaregione conformata ad anello, per lapresenza di un ponte cisteinico. Laporzione residua della molecola ècostituita dalle estremità terminalilibere (-NH2 e -COOH terminali) dellacatena peptidica.

ANP 28 aa Atria of heartBNP 32 aa Ventricles of heartC-type NP 53 aa or 22 aa Vascular endotheliumD-type NP 38 aa Green mamba snake venom


I recettori di I tipo (NPR-A ed NPR-B) hanno unsito di legame extracellulare, una regioneidrofobica transmembrana e un dominio carbossi-terminale intracellulare con attività guanil-ciclasica.La struttura dell’anello intatto è essenziale per illegame recettoriale.Il legame con il recettore determina la produzionedi GMPc come secondo messaggero.

I recettori di II tipo, NPR-C, non possiedonoattività guanil-ciclasica e il loro ruolo è quello dicontrollare la concentrazione plasmatica deipeptidi natriuretici mediante la lorointernalizzazione, endocitosi e degradazionelisosomiale.


Il successivo clivaggio enzimatico del legame tra gli aa in posizione76 e 77 dà luogo a due frammenti, secreti in quantità equimolecolarenel circolo sanguigno:

il frammento carbossi-terminale del pro-BNP 77-108,biologicamente attivo, noto con il nome di BNP

il frammento amino-terminale del pro-BNP 1-76, sprovvisto diattività ormonale, chiamato NT-pro-BNP


Dal pre-proBNP, attraversoil distacco proteolitico delpeptide segnale, origina ilpro-ormone (pro-BNP).

A differenza della sintesi dell’ANP, cheavviene a livello dell'atrio in risposta alladistensione della parete conseguenteall’aumento del volume intravascolare, lasintesi ventricolare del BNP è assente incondizioni basali ma è regolata a livellotrascrizionale da stimoli parietali e stimoliendocrini.


1. stimoli parietali distensione della parete ventricolare fibrosi e ipertrofia parietale (stress cronico della parete

ventricolare) ischemia


2. stimoli endocrini Noradrenalina Endotelina Angiotensina II Glicocorticoidi Estrogeni (gravidanza) Ormoni tiroidei Fattori di crescita Citochine (TNFα, IL-1, IL-6)

I PNC svolgono un'azione dicontroregolazione dei sistemineurormonale ed immunologico.Essi hanno infatti:

• azione diuretica• azione natriuretica• azione vasodilatatrice

Attraverso queste azioni i peptidinatriuretici svolgono il ruolo diantagonisti degli effettivasocostrittori e sodio-ritentividel sistema Renina-Angiotensina-Aldosterone.


Tutti e tre i peptidi (pro-BNP, NT-proBNPe BNP) sono dosabili nel plasma.

Variabilità biologica Variabilità pre-analitica Variabilità analitica


Clerico A, Clin Chem 50 (1), 2004

DonneUomini


Variabilità biologica

Nei soggetti normali, laconcentrazione plasmatica delBNP e dell'NT-proBN varianocon il sesso e con l'età: nelledonne in età fertile il peptideraggiunge valori doppi rispettoagli uomini di pari età; dopo i50 anni, aumenta in entrambi isessi.

Per tale motivo è statoproposto di usare livellidecisionali diversi in funzionedell'età e del sesso.

Variabilità pre-analitica:

1) eterogeneità delle molecole circolanti derivate dal pro-BNP

Le molecole di pro-BNP, così come quelle dei peptidi da esso derivati, possono interagire tra loro, dando luogo ad oligomeri circolanti.

Trattandosi di forme molecolari multiple, è possibile che alcuni epitopi siano più esposti di altri nel legame con gli Ab specifici utilizzati per la loro determinazione.

2) stabilità del campione biologico


2) Stabilità del campione biologico

Sia in vivo sia in vitro, il BNP subisce l’azione di alcuneproteasi plasmatiche che staccano i 2 aminoacidi terminali(serina 77 e prolina 78) della molecola: il campione biologico,pertanto, è instabile a temperatura ambiente.

Possibili ripercussioni sui metodi di dosaggio che contengonoun Ab contro l’estremità N-terminale del BNP.

Non è possibile effettuare il prelievo utilizzando una provettadi vetro: la callicreina, una volta attivata, esercita un'azioneproteolitica sull’estremità C-terminale della molecola del BNP.

Anche in questo caso, pertanto, la stabilità del campionebiologico è compromessa.

Possibile interferenza con i metodi analitici che riconosconol’epitopo C-terminale


Variabilità analitica:

I metodi più diffusi per la determinazione dei peptidi natriuretici BNP e NT-proBNP sono di tipo immunometrico (sandwich). Per la determinazione del BNP, disponiamo di due metodiche analitiche:

1) Ab (1) specifico per lastruttura anulare del BNP(aminoacidi 90-97) e di un Ab(2) specifico per l'estremitàN-terminale del BNP(aminoacidi 77-86).

Ab (2)


Ab (1)

2) un secondo gruppo, piùeterogeneo, comprende queimetodi in cui il sandwich èformato da un Ab (1)specifico per la strutturaanulare e da un Ab (2)specifico per l’estremitàcarbossi-terminale dellamolecola (residui 103-107del pro-BNP).

Ab (1)

Ab (2)

Questi metodi dosano anche il proBNP intattocircolante: possibile sovrastima della

concentrazione del BNP


• un Ab di cattura,specifico per l’epitopo1-21 dell’estremo N-terminale

• un Ab di rivelazioneche si lega all’epitopodella regione centraledella molecola(residui aminoacidici39-50).

Per il dosaggio dell’ NT-proBNP è disponibile un solometodo immunometrico totalmente automatizzato, chesfrutta il principio della ElettroChemiLuminescenza(ECLIA).Anche in questo caso sono utilizzati due anticorpi:


I vari metodi di determinazione non forniscono risultati comparabili.

Infatti, i risultati analitici risentono significativamente dell’eterogeneità metodologica.

Tale eterogeneità si deve a:- la diversa specificità immunologica (tipo di Ab

impiegato)- la differente standardizzazione analitica (tipo di Ag

utilizzato come calibratore)


L’eterogeneità metodologica si ripercuote sulla scelta dei valori di riferimento e dei cut-off

(Ital Heart J Suppl 2005; 6 (5): 308-325)


Patologia Concentrazioni Peptide natriuretico

Malattie cardiacheScompenso cardiaco Molto aumentatoInfarto del miocardio (primi 2–5 giorni) Molto aumentatoIpertensione essenziale con IVS AumentatoMalattie polmonariDispnea acuta AumentatoEmbolia polmonare AumentatoBPCO AumentatoMalattie endocrino-metabolicheIpertiroidismo AumentatoIpotiroidismo DiminuitoSindrome di Cushing AumentatoIperaldosteronismo primario AumentatoDiabete mellito Normale o AumentatoCirrosi epatica con ascite AumentatoInsufficienza renale (acuta o cronica) Molto aumentatoSindrome paraneoplastica Normale o AumentatoEmorragia subaracnoidea Aumentato


• E’ necessario utilizzare valori diriferimento e livelli decisionali propri delmetodo analitico adottato (metodi differenti valori numerici differenti)

• Non è possibile identificare cut-off validiper tutte le condizioni cliniche: si possonoutilizzare valori decisionali puramenteindicativi, limitatamente ai metodi didosaggio più documentati in letteratura


Qualsiasi sia la metodologia scelta, tanto il BNP quanto l’NT-proBNP sono utilizzabili quali markers biochimici di disfunzione cardiaca.I rispettivi vantaggi sono: BNP - più stretta relazione tra attività biologica ed

immunologica- concentrazione plasmatica più sensibile alle variazioni acute (emodialisi, attività fisica, risposta più pronta alla terapia)

NT-proBNP - livelli circolanti più elevati e più stabili nel tempo- minore degradazione in vitro


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