A N I M A L I T R A N S G E N I C I
animali in cui sia stata indotta una deliberata modificazione del genoma
ANIMALI TRANSGENICI: campi di applicazione
Studi biologici di base Ricerca medica Tossicologia Biotecnologie Agricoltura e acquacoltura
Promotore cDNA Sito di splicing
Poli-A
STRUTTURA DI UN COSTRUTTO TRANSGENICO
PRODUZIONE DI
TOPI TRANSGENICI
PRODUZIONE DI
TOPI TRANSGENICI
Mediante iniezione pronucleare del costrutto
Mediante iniezione pronucleare del costrutto
Mediante ricombinazione
omologa in cellule staminali embrionali
Mediante ricombinazione
omologa in cellule staminali embrionali
Costrutto transgenico “tradizionale”:
può contenere fino a 5-50 kbp
si integra casualmente in un singolo sito, sotto forma di 1-50 copie (tandem repeats)
importanza del sito di integrazione
variabilità di espressione nelle diverse linee founder
Yeast Artificial Chromosomes (YACs):
possono contenere fino a diverse centinaia di kbp
espressione più uniforme e prevedibile
relativa importanza del sito di integrazione
scarsa stabilità durante la manipolazione
Bacterial Artificial Chromosomes (BACs):
possono contenere fino a 100-150 kbp
espressione più uniforme e prevedibile
relativa importanza del sito di integrazione
stabilità durante la manipolazione
ONCOMOUSE
Mouse Mammary Tumor Virus
GENE TARGETING
I II III IV V VI VII VIII IX X
I II III IV V VI VII VIII IX X XI
Allele wild-type
I II III IV V VIII IX X XIPGK-neo
Allele null KO
TK
Neo
Targeting vector
Target locus1 2 3
TK
Neo
1 2 3
Neo
Targeted locus5’ probe 3’ probe
HOMOLOGOUS RECOMBINATION
TK
Neo
Targeting vector
Target locus1 2 3
1 2 3
TK
Neo
1 2 3
1 2 3
HOMOLOGOUS RECOMBINATION
Neo1 2 3
Targeted locus
Neo1 2 3
1 2 3
1 2 3
1 2 3
Espressione di Cre In cellule ES
Screening per individuare cellule che hanno perso Neo ma mantengono gli esoni 1 e 2 e le regioni fiancheggianti loxP
Generazione di topi che presentano i siti loxP in entrambi gli alleli
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