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CAPITOLO 1 La visione mendeliana del mondo Le scoperte di Mendel 6 Il principio della segregazione indipendente 6 BOX 1.1 CONCETTI AVANZATI Le leggi di Mendel 6 Alcuni alleli non sono né dominanti né recessivi 7 Principio dell’assortimento indipendente 8 La teoria cromosomica dell’ereditarietà 9 Linkage genico e crossing over 9 BOX 1.2 ESPERIMENTI CHIAVE I geni sono legati ai cromosomi 10 Mappatura dei cromosomi 11 L’origine della variabilità genetica attraverso le mutazioni 14 Prime ipotesi sulla natura dei geni e sul loro funzionamento 15 Primi esperimenti per trovare una relazione gene-proteina 15 SOMMARIO 16 BIBLIOGRAFIA 17 CAPITOLO 2 Gli acidi nucleici trasmettono l’informazione genetica L’“esplosiva” scoperta di Avery: il DNA può portare la specificità genetica 19 I geni virali sono anch’essi acidi nucleici 20 La doppia elica 21 Alla ricerca delle polimerasi che sintetizzano il DNA 22 BOX 2.1 ESPERIMENTI CHIAVE La regola di Chargaff 23 Prove sperimentali indicano che i filamenti del DNA si separano durante la replicazione 25 L’informazione genetica all’interno del DNA viene trasmessa attraverso la sequenza dei suoi quattro componenti nucleotidici 27 Il DNA non può essere lo stampo che ordina direttamente gli amminoacidi durante la sintesi proteica 27 BOX 2.2 ESPERIMENTI CHIAVE Prova che i geni controllano la sequenza amminoacidica delle proteine 28 L’RNA dal punto di vista chimico è molto simile al DNA 29 Il dogma centrale 30 L’ipotesi dell’adattatore di Crick 31 La scoperta dell’RNA transfer 31 Il paradosso dei ribosomi non specifici 32 La scoperta dell’RNA messaggero (mRNA) 32 La sintesi enzimatica dell’RNA su uno stampo di DNA 34 La determinazione del codice genetico 35 La determinazione della direzione della sintesi proteica 35 I segnali di inizio e di terminazione (stop) sono anch’essi codificati nel DNA 37 L’era della genomica 37 SOMMARIO 38 BIBLIOGRAFIA 39 CAPITOLO 3 L’importanza dei legami deboli nelle interazioni chimiche Caratteristiche dei legami chimici 41 I legami chimici possono essere spiegati in termini di meccanica quantistica 42 La formazione dei legami chimici implica cambiamenti della forma di energia 43 Esiste un equilibrio fra i legami creati e quelli distrutti 43 Il concetto di energia libera 44 K eq è correlata al G in modo esponenziale 44 I legami covalenti sono molto forti 44 I legami deboli nei sistemi biologici 45 I legami deboli possiedono un’energia compresa fra 1 e 7 kcal/mole 45 Alle temperature fisiologiche i legami deboli si formano e si rompono continuamente 45 La distinzione fra molecole polari e non polari 45 Forze di van der Waals 46 Legami idrogeno 48 Alcuni legami ionici sono legami idrogeno 48 Le interazioni deboli richiedono superfici molecolari complementari 49 Le molecole d’acqua formano legami idrogeno 49 Legami deboli fra molecole in soluzione acquosa 50 Le molecole organiche che tendono a formare legami idrogeno sono idrosolubili 50 BOX 3.1 CONCETTI AVANZATI L’unicità delle forme molecolari e il concetto di adattamento strutturale selettivo 51 Parte 1 Chimica e genetica Indice
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CAPITOLO 1La visione mendeliana del mondo
Le scoperte di Mendel 6
Il principio della segregazione indipendente 6BOX 1.1 CONCETTI AVANZATI Le leggi di Mendel 6Alcuni alleli non sono né dominanti né recessivi 7Principio dell’assortimento indipendente 8
La teoria cromosomica dell’ereditarietà 9
Linkage genico e crossing over 9
BOX 1.2 ESPERIMENTI CHIAVE I geni sono legati ai cromosomi 10
Mappatura dei cromosomi 11
L’origine della variabilità genetica attraverso le mutazioni 14
Prime ipotesi sulla natura dei geni e sul loro funzionamento 15
Primi esperimenti per trovare una relazione gene-proteina 15
SOMMARIO 16BIBLIOGRAFIA 17
CAPITOLO 2Gli acidi nucleici trasmettono l’informazione genetica
L’“esplosiva” scoperta di Avery: il DNA puòportare la specificità genetica 19
I geni virali sono anch’essi acidi nucleici 20La doppia elica 21
Alla ricerca delle polimerasi che sintetizzano il DNA 22BOX 2.1 ESPERIMENTI CHIAVE La regola di Chargaff 23
Prove sperimentali indicano che i filamenti del DNA si separano durante la replicazione 25
L’informazione genetica all’interno del DNA viene trasmessa attraverso la sequenza dei suoi quattro componenti nucleotidici 27
Il DNA non può essere lo stampo che ordina direttamente gli amminoacidi durante la sintesi proteica 27
BOX 2.2 ESPERIMENTI CHIAVE Prova che i geni controllano la sequenza amminoacidica delle proteine 28
L’RNA dal punto di vista chimico è molto simile al DNA 29Il dogma centrale 30
L’ipotesi dell’adattatore di Crick 31La scoperta dell’RNA transfer 31Il paradosso dei ribosomi non specifici 32La scoperta dell’RNA messaggero (mRNA) 32La sintesi enzimatica dell’RNA su uno stampo di DNA 34La determinazione del codice genetico 35
La determinazione della direzione della sintesi proteica 35
I segnali di inizio e di terminazione (stop) sono anch’essi codificati nel DNA 37
L’era della genomica 37
SOMMARIO 38BIBLIOGRAFIA 39
CAPITOLO 3L’importanza dei legami deboli nelle interazioni chimiche
Caratteristiche dei legami chimici 41
I legami chimici possono essere spiegati in termini di meccanica quantistica 42
La formazione dei legami chimici implica cambiamenti della forma di energia 43
Esiste un equilibrio fra i legami creati e quelli distrutti 43Il concetto di energia libera 44
Keq è correlata al G in modo esponenziale 44I legami covalenti sono molto forti 44
I legami deboli nei sistemi biologici 45
I legami deboli possiedono un’energia compresa fra 1 e 7 kcal/mole 45
Alle temperature fisiologiche i legami deboli si formano e si rompono continuamente 45
La distinzione fra molecole polari e non polari 45Forze di van der Waals 46Legami idrogeno 48Alcuni legami ionici sono legami idrogeno 48Le interazioni deboli richiedono superfici molecolari
complementari 49Le molecole d’acqua formano legami idrogeno 49Legami deboli fra molecole in soluzione acquosa 50Le molecole organiche che tendono a formare
legami idrogeno sono idrosolubili 50BOX 3.1 CONCETTI AVANZATI L’unicità delle forme
molecolari e il concetto di adattamento strutturale selettivo 51
Parte 1Chimica e genetica
Indice
I legami idrofobici stabilizzano le macromolecole 51Il vantaggio di un G compreso fra 2 e 5 kcal/mole 52I legami deboli permettono la formazione
di complessi enzima-substrato 52I legami deboli mediano la maggior parte
delle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina 53SOMMARIO 53BIBLIOGRAFIA 54
CAPITOLO 4L’importanza dei legami chimici ad alta energia
Le molecole che cedono energia sono termodinamicamente instabili 55
Nelle reazioni biochimiche gli enzimi abbassano l’energia di attivazione 57
L’energia libera nelle biomolecole 58
L’idrolisi dei legami ad alta energia porta ad un Gsignificativamente negativo 58
I legami ad alta energia nelle reazioni biosintetiche 59
I legami peptidici si idrolizzano spontaneamente 61Un G positivo viene accoppiato ad uno negativo 61
L’attivazione dei precursori nelle reazioni di trasferimento di gruppo 62
La versatilità dell’ATP nel trasferimento di gruppo 63L’attivazione degli amminoacidi per mezzo
del legame con AMP 64I precursori degli acidi nucleici sono attivati
dalla presenza di ~ 64L’importanza del rilascio di ~ nella sintesi degli
acidi nucleici 65La rottura del ~ caratterizza la maggior parte
delle reazioni biosintetiche 66SOMMARIO 67BIBLIOGRAFIA 68
CAPITOLO 5I legami deboli e forti determinanola struttura delle macromolecole
Le strutture di ordine superiore sonodeterminate da interazioni intramolecolari e intermolecolari 69
Il DNA può formare un’elica regolare 69L’RNA forma una grande varietà di strutture 71La struttura chimica degli elementi base
che formano le proteine 72Il legame peptidico 73Esistono quattro livelli strutturali nelle proteine 73BOX 5.1 TECNICHE Determinazione della struttura
delle proteine 74
P P
P P
P P
α Eliche e foglietti β sono forme comuni di struttura secondaria 75
La formazione di legami idrogeno determina la conformazione specifica delle proteine 78
Le α eliche si avvolgono l’una sull’altra formandostrutture “coiled-coil” 79
La maggior parte delle proteine ha una struttura modulare, contenente due o tre domini 80
BOX 5.2 CONCETTI AVANZATI Le proteine grandisono spesso formate da diverse catene polipeptidiche più piccole 81
Le proteine sono formate combinando un numerostraordinariamente piccolo di motivi strutturali 82
Le diverse funzioni proteiche derivano dallacombinazione di diversi domini 82
I legami deboli permettono un correttoposizionamento delle proteine sulle molecole di DNA e RNA 83
Le proteine scorrono lungo il DNA per trovare uno specifico sito di legame 85
Le proteine usano strategie diverse per riconoscere l’RNA 86
L’allosteria, ovvero la regolazione di unafunzione proteica attraverso il cambiamento di forma 88
Esempi di regolazione allosterica mediata da piccoliligandi,da interazioni proteina-proteina e damodificazioni post-traduzionali 88
Non tutta la regolazione proteica avviene medianteeventi allosterici 91
SOMMARIO 91BIBLIOGRAFIA 92
CAPITOLO 6La struttura del DNA e dell’RNA
La struttura del DNA 98
Il DNA è formato da catene polinucleotidiche 98Ciascuna base si trova nella sua forma tautomerica
preferita 100I due filamenti della doppia elica sono tenuti assieme
dall’appaiamento delle basi con un orientamentoantiparallelo 101
Le due catene della doppia elica hanno sequenze complementari 101
Il legame idrogeno è importante nel determinare la specificità delle coppie di basi 102
Indice © 978-88-08-16412-4X
Parte 2Mantenimento del genoma
Le basi possono ruotare all’esterno della doppia elica 102
Il DNA è normalmente una doppia elica destrorsa 103La doppia elica presenta un solco maggiore
e un solco minore 103BOX 6.1 ESPERIMENTI CHIAVE Il DNA ha, in
soluzione, 10 coppie di basi per giro d’elica: l’esperimento con la mica 104
Il solco maggiore fornisce molte informazioni di tipo chimico 104
BOX 6.2 ESPERIMENTI CHIAVE Come si ottiene la struttura del DNA dai segnali puntiformi di una lastra a raggi X 106
La doppia elica può avere conformazioni multiple 107Il DNA alcune volte può formare un’elica sinistrorsa 108Le due catene del DNA possono separarsi
(denaturazione) e riassociarsi 109Alcune molecole di DNA sono circolari 112
La topologia del DNA 112
Il numero di legame topologico (linking number) è una proprietà non variabile del DNA circolarecovalentemente chiuso 113
Il numero di legame topologico ha due componenti: il twist e il writhe 113
Lk0 è il linking number di un cccDNA completamenterilassato in condizioni fisiologiche 114
Il DNA nelle cellule è superavvolto negativamente 115I nucleosomi introducono superavvolgimenti
negativi nel DNA degli eucarioti 116Le topoisomerasi possono rilassare il DNA
superavvolto 116I procarioti possiedono speciali topoisomerasi che
introducono superavvolgimenti nelle molecole di DNA 117
Le topoisomerasi permettono anche l’eliminazione di nodi e la separazione di molecole di DNA 117
Le topoisomerasi usano un legame covalente proteina-DNA per tagliare e successivamente risaldare i filamenti del DNA 118
Le topoisomerasi formano un ponte enzimatico e permettono il passaggio di un filamento di DNA attraverso l’altro 119
I topoisomeri di DNA possono essere separati mediante elettroforesi 121
BOX 6.3 ESPERIMENTI CHIAVE Dimostrazione che il DNA ha una periodicità dell’elica di circa 10,5coppie di basi per giro utilizzando le proprietà topologiche di un DNA circolare 121
L’etidio causa uno srotolamento della doppia elica del DNA 122
La struttura dell’RNA 123
L’RNA contiene il ribosio e l’uracile ed è normalmente a singolo filamento 123
Le catene di RNA si ripiegano su se stesse per formare brevi tratti a doppia elica simili al DNA di forma A 123
L’RNA può ripiegarsi per formare complesse strutture terziarie 125
Alcuni RNA sono enzimi 125
Il ribozima a martello (hammerhead) taglia l’RNA mediante la formazione di un fosfato ciclico 2’, 3’ 126
Gli RNA hanno avuto una parte importante nell’evoluzione biologica? 127
SOMMARIO 127BIBLIOGRAFIA 128
CAPITOLO 7La struttura del genoma, la cromatina e il nucleosoma
La sequenza del genoma e la diversità cromosomica 130
Il cromosoma può essere circolare o lineare 130Ogni cellula mantiene un numero definito
di cromosomi 131La grandezza del genoma è correlata
alla complessità dell’organismo 132Il genoma di E. coli è formato quasi interamente
da geni 133Gli organismi più complessi hanno una minore
densità genica 134I geni rappresentano soltanto una piccola porzione
del DNA cromosomico eucariotico 135La maggior parte delle sequenze intergeniche
umane è formata da DNA ripetuto 137Duplicazione del cromosoma e segregazione 138
I cromosomi eucariotici per essere mantenuti durante la divisione cellulare richiedono i centromeri, i telomeri e le origini di replicazione 138
La duplicazione del cromosoma eucariotico e la segregazione avvengono in fasi separate del ciclo cellulare 140
La struttura del cromosoma cambia durante la divisione cellulare eucariotica 142
La coesione dei cromatidi fratelli e la condensazione dei cromosomi sono mediate dalle proteine SMC 143
La mitosi mantiene il medesimo numero parentale di cromosomi 145
Nelle fasi gap le cellule si preparano per il ciclo cellulare successivo e controllano che il cicloprecedente sia terminato correttamente 145
La meiosi riduce il numero dei cromosomi parentali 147Al microscopio possono essere evidenziati diversi
livelli di struttura del cromosoma 147Il nucleosoma 149
I nucleosomi sono i mattoni fondamentali del cromosoma 149
BOX 7.1 ESPERIMENTI CHIAVE La nucleasi micrococcica e il DNA associato con il nucleosoma 150
Gli istoni sono piccole proteine cariche positivamente 151
La struttura atomica del nucleosoma 154Gli istoni nel nucleosoma legano tipiche regioni
del DNA 154Le interazioni fra il core istonico e il DNA sono
mediate da molti contatti indipendenti dalla sequenza 156
Indice© 978-88-08-16412-4 XI
Le code ammino-terminali degli istoni stabilizzano il DNA avvolgendosi attorno all’ottamero 156
Il DNA arrotolato sul core istonico accumula una superelicità negativa 157
BOX 7.2 ESPERIMENTI CHIAVE I nucleosomi e la densità di superelica 158
Strutture di ordine superiore della cromatina 160
L’eterocromatina e l’eucromatina 160L’istone H1 lega il DNA linker fra i nucleosomi 161I nucleosomi disposti in serie possono formare
strutture complesse: la fibra da 30 nm 161Le code ammino-terminali degli istoni intervengono
nella formazione della fibra da 30 nm 163Un ulteriore compattamento è determinato dalla
formazione di ampie anse di DNA nucleosomico 163Varianti istoniche alterano la funzione
del nucleosoma 164Regolazione della struttura della cromatina 165
L’interazione del DNA con l’ottamero istonico è dinamica 165
I complessi di rimodellamento possono facilitare il movimento dei nucleosomi 166
Alcuni nucleosomi si trovano in siti specifici: posizionamento dei nucleosomi 168
BOX 7.3 ESPERIMENTI CHIAVE Determinazione dellaposizione dei nucleosomi nella cellula 170
Le modificazioni della coda ammino-terminale degli istoni alterano l’accessibilità alla cromatina 172
Specifici domini proteici presenti nei complessi dirimodellamento e di modificazione dei nucleosomiriconoscono gli istoni modificati 174
Enzimi specifici sono responsabili delle modificazioni degli istoni 175
Le modificazioni del nucleosoma e il rimodellamento cooperano per aumentare l’accessibilità al DNA 175
Assemblaggio dei nucleosomi 176
I nucleosomi sono assemblati immediatamente dopo la replicazione del DNA 176
L’assemblaggio dei nucleosomi richiede dei chaperoni degli istoni 180
SOMMARIO 181BIBLIOGRAFIA 182
CAPITOLO 8La replicazione del DNA
La chimica della sintesi del DNA 184
La sintesi del DNA richiede deossiribonucleosidi trifosfato e una struttura innesco:stampo 184
Il DNA è sintetizzato allungando il terminale 3’ del primer 185
L’idrolisi del pirofosfato è il motore per la sintesi del DNA 186
Il meccanismo d’azione della DNA polimerasi 186
La DNA polimerasi utilizza un singolo sito attivo per catalizzare la sintesi del DNA 186
BOX 8.1 TECNICHE Gli esperimenti di incorporazionepossono essere usati per misurare la sintesi degli acidinucleici e delle proteine 187
BOX 8.2 RISVOLTI MEDICI I farmaci antitumorali e antivirali agiscono sulla replicazione del DNA 189
La DNA polimerasi assomiglia a una mano che afferra la giunzione innesco:stampo 190
Le DNA polimerasi sono enzimi processivi 193Attività esonucleasiche correggono eventuali errori
presenti sul DNA neosintetizzato 195La forca replicativa 196
Entrambi i filamenti di DNA vengono sintetizzati a livello della forca replicativa 196
L’inizio di un nuovo filamento di DNA richiede un innesco (primer) a RNA 197
I primer a RNA devono essere rimossi affinché la replicazione del DNA possa essere completata 198
La DNA elicasi apre la doppia elica davanti alla forca replicativa 198
BOX 8.3 TECNICHE Determinazione della polarità della DNA elicasi 199
La DNA elicasi tira il DNA a singolo filamento attraverso un poro centrale proteico 200
Proteine che si legano al singolo filamento stabilizzano la sua struttura prima della replicazione 201
Le topoisomerasi rimuovono i superavvolgimenti prodotti dall’apertura del DNA a livello della forca replicativa 202
Gli enzimi che lavorano a livello della forca replicativa estendono il substrato utile per la DNA polimerasi 203
La specializzazione delle DNA polimerasi 204
Le DNA polimerasi sono specializzate in ruoli differenti all’interno della cellula 204
Le proteine che permettono lo scivolamento delle polimerasi (sliding clamp) sul DNA aumentano notevolmente la processività della DNA polimerasi 206
Le sliding clamp vengono aperte e depositate sul DNA da caricatori specifici 208
BOX 8.4 CONCETTI AVANZATI L’ATP controlla la funzione di una proteina: il caricamento della sliding clamp 209
La sintesi del DNA a livello della forca replicativa 211
Le interazioni fra le proteine della forca replicativa danno luogo al replisoma di E. coli 214
La fase di inizio della replicazione 215
Specifiche sequenze genomiche promuovono l’inizio della replicazione del DNA 215
Il modello dei repliconi per l’inizio della replicazione 215I replicatori includono siti di legame per l’iniziatore
e si denaturano facilmente 216BOX 8.5 ESPERIMENTI CHIAVE Identificazione
delle origini di replicazione e dei replicatori 217Il legame e l’apertura della doppia elica:
l’iniziatore seleziona e attiva l’origine 219
Interazioni proteina-proteina e proteina-DNAdeterminano il processo di inizio della replicazione 220
Indice © 978-88-08-16412-4XII
I cromosomi eucariotici vengono replicati una sola volta ogni ciclo cellulare 222
BOX 8.6 CONCETTI AVANZATI L’ipotesi di una fabbrica di replicazione 222
La formazione del complesso pre-replicativo è il primo passaggio per la replicazione eucariotica 224
La formazione e l’attivazione del pre-RC sono regolate in modo tale da permettere un solo ciclo di replicazione durante ciascun ciclo cellulare 227
Analogie fra l’inizio della replicazione degli eucarioti e quella dei procarioti 228
BOX 8.7 CONCETTI AVANZATI La replicazione del DNA di E. coli è regolata dai livelli di DnaA•ATP e SeqA 229
La terminazione della replicazione 230
Le topoisomerasi II sono necessarie per separare le molecole di DNA figlie 230
Il normale meccanismo di sintesi del filamento discontinuo non è capace di copiare le estremità dei cromosomi lineari 231
La telomerasi è una particolare DNA polimerasi che non richiede uno stampo esogeno 232
BOX 8.8 RISVOLTI MEDICI Invecchiamento, cancro e l’ipotesi dei telomeri 234
La telomerasi risolve il problema della replicazione delle terminazioni allungando il terminale 3’ del cromosoma 235
Le proteine che legano il telomero influenzano l’attività telomerasica e la lunghezza del telomero 235
Le proteine che legano il telomero proteggono leestremità del cromosoma 236
SOMMARIO 238BIBLIOGRAFIA 239
CAPITOLO 9La mutabilità e la riparazione del DNA
Gli errori di replicazione e la loro riparazione 241
I diversi tipi di mutazione 241Alcuni errori di replicazione sfuggono alla correzione 242BOX 9.1 RISVOLTI MEDICI L’espansione delle ripetizioni
a triplette come fonte di malattia 242La riparazione dei mismatch rimuove gli errori che
sfuggono al sistema di correzione di bozze 243I danni al DNA 248
Il DNA va incontro a fenomeni di mutazione spontanea in seguito a idrolisi e deamminazione 248
BOX 9.2 RISVOLTI MEDICI Il test di Ames 249L’alchilazione, l’ossidazione e l’irradiazione
danneggiano il DNA 249Le mutazioni sono causate anche dagli analoghi
delle basi e dagli agenti intercalanti 250La riparazione del DNA danneggiato 251
Riparazione diretta del danno al DNA 252Gli enzimi di riparazione per escissione di basi
eliminano le basi danneggiate “ribaltandole”fuori dal DNA 253
Gli enzimi che riparano per escissione nucleotidicatagliano il DNA danneggiato ad entrambii margini della lesione 255
La ricombinazione ripara le rotture del DNA recuperando la sequenza nucleotidica dalla doppia elica non danneggiata 256
Le rotture a doppio filamento sono riparate anche dalla giunzione diretta delle estremità non omologhe 258
BOX 9.3 RISVOLTI MEDICI La giunzione delle estremità non omologhe 258
La sintesi di DNA translesione permette alla replicazione di superare il danno 260
BOX 9.4 CONCETTI AVANZATI La famiglia Y delle DNA polimerasi 262
SOMMARIO 263BIBLIOGRAFIA 264
CAPITOLO 10La ricombinazione omologa a livello molecolare
Spesso si hanno rotture nel DNA che dannoinizio alla ricombinazione 266
I diversi modelli per la ricombinazione omologa 267
Nella ricombinazione omologa l’invasione del filamento è un passaggio precoce fondamentale 268
La risoluzione delle giunzioni di Holliday è un passaggio fondamentale per terminare lo scambio genetico 268
Il modello della riparazione delle rotture a doppio filamento descrive molti eventi ricombinativi 270
BOX 10.1 RISVOLTI MEDICI Come risolvere un intermedio di ricombinazione con due giunzioni di Holliday 273
Gli apparati proteici per la ricombinazione omologa 274
L’elicasi/nucleasi RecBCD processa, per la ricombinazione, le molecole di DNA rotte 275
I siti chi regolano RecBCD 278La proteina RecA si assembla sul DNA a singolo
filamento e promuove l’invasione del filamento 279All’interno del filamento RecA si formano dei nuovi
appaiamenti tra filamenti 280In tutti gli organismi sono presenti degli omologhi
di RecA 282Il complesso RuvAB riconosce specificamente
le giunzioni di Holliday e promuove la migrazione del punto d’incrocio 283
Per terminare la ricombinazione RuvC taglia specifici filamenti di DNA a livello della giunzione di Holliday 283
La ricombinazione omologa negli eucarioti 284
La ricombinazione omologa negli eucarioti ha funzioni aggiuntive 284
La ricombinazione omologa è necessaria per la segregazione dei cromosomi durante la meiosi 285
Indice© 978-88-08-16412-4 XIII
Durante la meiosi si ha una formazione programmata di rotture a doppio filamento 286
La proteina MRX processa le estremità tagliate per assemblare le proteine simili a RecA che scambiano il filamento 287
Dmc1 è una proteina simile a RecA che funziona in modo specifico nella ricombinazione meiotica 288
La ricombinazione meiotica è data dall’attività di molte proteine 289
BOX 10.2 RISVOLTI MEDICI Il prodotto dell’oncosoppressore BRCA2 interagisce con la proteina Rad51 e controlla la stabilità del genoma 290
Il cambio del mating type 290
Il cambio del mating type inizia con una rottura a doppio filamento in un punto specifico 291
Il cambio del mating type è un evento di conversione genica non associato al crossing over 292
Le conseguenze genetiche della ricombinazione omologa 294
La riparazione del DNA durante la ricombinazione è una delle cause della conversione genica 295
SOMMARIO 296BIBLIOGRAFIA 297
CAPITOLO 11La ricombinazione sito-specifica e la trasposizione del DNA
La ricombinazione conservativa sito-specifica 299
La ricombinazione sito-specifica avviene su specifiche sequenze del DNA bersaglio 299
Le ricombinasi sito-specifiche tagliano e riuniscono il DNA per mezzo di un intermedio covalente proteina-DNA 300
La serina ricombinasi introduce nel DNA delle rotturea doppio filamento e poi scambia i filamenti per promuovere la ricombinazione 302
La struttura del complesso fra la serina ricombinasi e il DNA suggerisce che lo scambio del filamento avvenga grazie a una rotazione delle subunità 303
Le tirosina ricombinasi rompono e riuniscono una coppia di filamenti di DNA alla volta 304
La struttura delle tirosina ricombinasi legate al DNA svela il meccanismo dello scambio del DNA 305
Funzioni biologiche della ricombinazione sito-specifica 306
BOX 11.1 RISVOLTI MEDICI L’applicazione dellaricombinazione sito-specifica all’ingegneria genetica 307
L’integrasi di λ promuove l’integrazione e l’escissione del genoma virale nel cromosoma della cellula ospite 308
L’escissione del batteriofago λ richiede una nuovaproteina che curva il DNA 309
La ricombinasi Hin inverte un segmento di DNA permettendo l’espressione di geni alternativi 310
Hin per ricombinare necessita di un enhancer a DNA 311Le ricombinasi convertono molecole circolari di DNA
multimeriche in monomeri 312
BOX 11.2 CONCETTI AVANZATI La ricombinasi Xer catalizza la monomerizzazione dei cromosomi batterici e di molti plasmidi batterici 313
Ci sono altri meccanismi per portare la ricombinazione su specifici segmenti di DNA 315
La trasposizione 315
La trasposizione muove alcuni elementi genetici in nuove posizioni cromosomiche 315
Ci sono tre classi principali di elementi trasponibili 317I trasposoni a DNA contengono il gene
della trasposasi, fiancheggiato dai siti di ricombinazione 317
I trasposoni possono essere sia elementi autonomi che non autonomi 318
I retrotrasposoni simili ai virus e i retroviruscontengono delle sequenze terminali ripetute e due geni importanti per la ricombinazione 318
I retrotrasposoni poli-A assomigliano ai geni 318La trasposizione a DNA avviene con un meccanismo
del tipo taglia e incolla 319Nella trasposizione del tipo taglia e incolla
l’intermedio è risolto con il sistema di riparazione delle rotture 321
Esistono molteplici meccanismi per tagliare il filamento non trasferito durante la trasposizione del DNA 321
La trasposizione a DNA mediante meccanismo replicativo 323
I retrotrasposoni simili ai virus e i retrovirus si muovono tramite un intermedio a RNA 325
BOX 11.3 CONCETTI AVANZATI Il meccanismo di formazione del cDNA retrovirale 326
Le DNA trasposasi e le integrasi retrovirali fanno parte di una superfamiglia proteica 328
I retrotrasposoni poli-A si muovono con un meccanismo del tipo “splicing inverso” 329
Alcuni esempi di elementi trasponibili e della loro regolazione 331
La famiglia dei trasposoni IS4 è costituita da elementi compatti dotati di molteplici meccanismi per controllare il numero delle copie 331
BOX 11.4 ESPERIMENTI CHIAVE Gli elementi del mais e la scoperta dei trasposoni 332
La trasposizione di Tn10 è accoppiata alla replicazione del DNA cellulare 334
Il fago Mu è un trasposone molto robusto 336Per evitare di trasporsi nel proprio DNA, Mu
utilizza l’immunità del sito bersaglio 336BOX 11.5 CONCETTI AVANZATI Il meccanismo
dell’immunità dalla trasposizione del sito bersaglio 338Gli elementi Tc1/mariner sono elementi di grande
successo negli eucarioti 338Gli elementi Ty del lievito si traspongono
nel genoma in rifugi di sicurezza 339Gli elementi LINE promuovono la propria
trasposizione e perfino quella di RNA cellulari 340La ricombinazione V(D)J 342
Gli eventi precoci della ricombinazione V(D)J avvengono con un meccanismo simileall’escissione dei trasposoni 344
SOMMARIO 346BIBLIOGRAFIA 346
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CAPITOLO 12I meccanismi della trascrizione
Le RNA polimerasi e il ciclo della trascrizione 352
Le RNA polimerasi possono avere forme diverse ma condividono molte caratteristiche 352
La trascrizione da parte della RNA polimerasi avviene in una serie di passaggi 354
L’inizio della trascrizione richiede tre passaggi distinti 356
Il ciclo della trascrizione nei batteri 356
I promotori batterici pur avendo alcune caratteristiche ben definite si differenziano per la sequenza e la forza 356
BOX 12.1 TECNICHE Sequenze consenso 357Il fattore σ media il legame della polimerasi
al promotore 359La transizione verso il complesso aperto comporta
dei cambiamenti strutturali nella RNA polimerasi e nel promotore 360
La trascrizione è iniziata dall’RNA polimerasi senza l’ausilio di un primer 361
Nella prima fase della trascrizione l’RNA polimerasi resta ferma e tira dentro di sé il DNA a valle 362
Il distacco dal promotore richiede la rottura delleinterazioni tra la polimerasi e il promotore e tra il nucleo centrale dell’enzima e il fattore σ 363
BOX 12.2 CONCETTI AVANZATI Le RNA polimerasi a singola unità 364
La polimerasi in fase di allungamento è una macchina processiva che simultaneamente sintetizza RNA e corregge le bozze dell’RNA 364
L’RNA polimerasi si può bloccare e può avere bisogno di essere rimossa 366
La trascrizione termina grazie ad alcuni segnali all’interno della sequenza dell’RNA 366
La trascrizione negli eucarioti 369
Il core dei promotori della RNA polimerasi II è costituito da una combinazione di quattro elementi 370
L’RNA polimerasi II forma sul promotore un complesso di preinizio con i fattori generali di trascrizione 370
Il distacco dal promotore richiede la fosforilazione della “coda” della polimerasi 371
TBP si lega al DNA e lo piega usando un foglietto βinserito nel solco minore 372
Gli altri fattori generali di trascrizione hanno anche funzioni specifiche nella fase di inizio 373
In vivo, l’inizio della trascrizione ha bisogno di altre proteine, incluso il complesso del Mediatore 375
Il Mediatore è composto da molte subunità, alcune delle quali sono conservate dal lievito all’uomo 376
Un nuovo gruppo di fattori stimola l’allungamento e la capacità di correzione della Pol II 376
Le polimerasi in fase di allungamento devono risolvere il problema dell’incontro con gli istoni 378
La polimerasi in allungamento si associa con un nuovo gruppo di fattori proteici, necessari alla maturazione dell’RNA 379
La terminazione della trascrizione è associata alla distruzione dell’RNA da parte di una RNasi altamente processiva 382
La trascrizione dell’RNA polimerasi I e III 383
Le RNA Pol I e Pol III riconoscono promotori distinti, utilizzano un gruppo diverso di fattori di trascrizione, ma hanno comunque bisogno di TBP 383
I promotori della Pol III si trovano a valle del sito d’inizio della trascrizione 384
SOMMARIO 384BIBLIOGRAFIA 386
CAPITOLO 13Lo splicing dell’RNA
BOX 13.1 ESPERIMENTI CHIAVE L’adenovirus e la scoperta dello splicing 389
La chimica dello splicing dell’RNA 391
Le sequenze all’interno dell’RNA determinano dove avviene lo splicing 391
L’introne viene rimosso in una forma a cappio detta lariat e gli esoni laterali vengono uniti 391
Gli esoni provenienti da diverse molecole di RNA possono essere uniti attraverso uno splicing in trans 393
Il macchinario dello spliceosoma 393
Lo splicing dell’RNA viene effettuato da un complesso molto grande chiamato spliceosoma 393
Le vie dello splicing 395
Assemblaggio, riarrangiamenti e catalisi all’interno dello spliceosoma: il percorso dello splicing 395
Gli introni self-splicing dimostrano che l’RNA può catalizzare lo splicing 397
BOX 13.2 ESPERIMENTI CHIAVE La conversione in ribozimi degli introni del gruppo I 397
Gli introni del gruppo I rilasciano un introne lineare anziché un cappio 399
Come fa lo spliceosoma a trovare i siti di splicing in maniera affidabile? 401
Un gruppo ristretto di introni è processatoda uno spliceosoma alternativo formato da un corredo diverso di snRNP 403
Lo splicing alternativo 403
I singoli geni possono dare origine a diversi prodotti grazie allo splicing alternativo 403
Esistono diversi meccanismi per garantire uno splicing mutualmente esclusivo 405
L’incredibile caso del gene Dscam di Drosophila: un esempio di splicing mutualmente esclusivo su larga scala 406
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Parte 3Espressione del genoma
Lo splicing mutualmente esclusivo dell’esone 6 di Dscam non può essere ottenuto con nessunmeccanismo standard e probabilmente utilizza nuove strategie 408
BOX 13.3 ESPERIMENTI CHIAVE L’identificazione dei siti di ancoraggio e delle sequenze selettrici 410
Lo splicing alternativo è regolato da attivatori e repressori 410
La regolazione dello splicing alternativo determina il sesso dei moscerini 413
BOX 13.4 RISVOLTI MEDICI Errori nello splicing del pre-mRNA causano diverse malattie umane 415
Il rimescolamento degli esoni 416
Gli esoni vengono rimescolati dalla ricombinazione per produrre dei geni che codificano nuove proteine 416
L’editing dell’RNA 418
L’editing dell’RNA rappresenta un altro modo per modificare la sequenza di un mRNA 418
BOX 13.5 RISVOLTI MEDICI Le deamminasi e l’HIV 419Gli RNA guida dirigono l’inserzione e la delezione
delle uridine 420Il trasporto dell’mRNA 421
L’mRNA maturo viene impaccato ed esportato dal nucleo al citoplasma per la traduzione 421
SOMMARIO 422BIBLIOGRAFIA 424
CAPITOLO 14La traduzione
RNA messaggero 426
Le catene polipeptidiche sono specificate dalle open reading frame 426
Gli mRNA procariotici hanno un sito di legame per il ribosoma che recluta il macchinario per la traduzione 428
Gli mRNA eucariotici sono modificati alle estremità 5’ e 3’ per facilitare la traduzione 428
RNA transfer 429
I tRNA agiscono da adattatori tra codoni e amminoacidi 429
BOX 14.1 CONCETTI AVANZATI Gli enzimi che aggiungono la sequenza CCA: un meccanismo di sintesi dell’RNA in assenza di uno stampo 429
I tRNA hanno in comune una struttura secondaria con forma simile a un trifoglio 430
I tRNA hanno una struttura tridimensionale ad “L” 431Il legame degli amminoacidi al tRNA 432
I tRNA vengono caricati con un amminoacido che si lega all’adenosina dell’estremità 3’ tramite un legame acilico ad alta energia 432
L’amminoacil-tRNA sintetasi carica i tRNA in due passaggi 432
Ciascuna amminoacil-tRNA sintetasi attacca un solo amminoacido ad uno o più tRNA 433
Le tRNA sintetasi riconoscono le caratteristiche strutturali esclusive dei rispettivi tRNA 434
La formazione dell’amminoacil-tRNA è molto accurata 435
Alcune amminoacil-tRNA sintetasi usano un sitocorrettore per caricare il tRNA con un alto grado di accuratezza 436
Il ribosoma non è in grado di distinguere tra tRNA caricati in modo corretto o sbagliato 436
BOX 14.2 CONCETTI AVANZATI Selenocisteina 437Il ribosoma 437
Il ribosoma è costituito da una subunità maggiore e da una minore 438
Le subunità maggiore e minore si associano e si dissociano ad ogni ciclo di traduzione 439
I nuovi amminoacidi vengono attaccati all’estremità C-terminale della catena polipeptidica nascente 441
I legami peptidici si formano mediante il trasferimento della catena polipeptidica nascente da un tRNA all’altro 441
Gli RNA ribosomiali sono determinanti sia strutturali che catalitici del ribosoma 442
Il ribosoma ha tre siti di legame per il tRNA 443I canali che attraversano il ribosoma permettono
all’mRNA e alla catena polipeptidica nascente di entrare e di uscire dal ribosoma 444
Inizio della traduzione 445
Gli mRNA procariotici vengono inizialmente reclutati dalla subunità minore tramite appaiamento di basi con l’rRNA 445
Un tRNA specifico, caricato con una metioninamodificata, si lega direttamente alla subunitàminore procariotica 446
Tre fattori dirigono l’assemblaggio di un complesso iniziatore che contiene l’mRNA e il tRNA iniziatore 447
I ribosomi eucariotici vengono reclutati sull’mRNA dal Cap al 5’ 448
BOX 14.3 CONCETTI AVANZATI uORF e IRES: eccezioni che confermano la regola 448
Il codone d’inizio viene trovato leggendo la sequenza dell’mRNA a partire dall’estremità 5’ 451
I fattori d’inizio della traduzione mantengono l’mRNA eucariotico in una conformazione circolare 451
Allungamento durante la traduzione 453
Gli amminoacil-tRNA vengono trasferiti sul sito A dal fattore di allungamento EF-Tu 454
Il ribosoma adotta diversi meccanismi per evitare di selezionare gli amminoacil-tRNA errati 454
Il ribosoma è un ribozima 456La formazione del legame peptidico e il fattore
di allungamento EF-G governano la traslocazione dei tRNA e dell’mRNA 458
EF-G causa la traslocazione spostando il tRNA legato al sito A 459
EF-Tu-GDP ed EF-G-GDP devono scambiare il GDP con GTP prima di poter partecipare ad un nuovo ciclo di allungamento 460
La formazione di un legame peptidico consuma due molecole di GTP e una di ATP 461
BOX 14.4 CONCETTI AVANZATI Le proteine che si legano al GTP, i cambiamenti conformazionali e la precisione e l’ordine degli eventi della traduzione 461
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Terminazione della traduzione 462
I fattori di rilascio terminano la traduzione in risposta ai codoni di stop 462
Alcune brevi regioni dei fattori di rilascio di classe I riconoscono i codoni di stop e innescano il rilascio della catena peptidica 463
Lo scambio GDP/GTP e l’idrolisi del GTP controllano la funzione del fattore di rilascio di classe II 463
Il fattore di riciclaggio del ribosoma simula un tRNA 465BOX 14.5 RISVOLTI MEDICI Gli antibiotici arrestano
la divisione cellulare bloccando passaggi specifici della traduzione 467
La regolazione della traduzione 469
Nei batteri le proteine o gli RNA che si legano vicino al sito di legame del ribosoma regolanonegativamente l’inizio della traduzione 469
La regolazione della traduzione nei procarioti:le proteine ribosomiali sono dei repressori traduzionali della propria sintesi 470
I regolatori globali della traduzione eucariotica agiscono sui fattori indispensabili per il riconoscimento dell’mRNA e il legame del tRNAiniziatore al ribosoma 472
Le 4E-BP specifiche per un mRNA controllanospazialmente la traduzione 473
Una proteina di legame all’RNA, regolata dal ferro, controlla la traduzione della ferritina 474
La traduzione dell’attivatore trascrizionale del lievito Gcn4 è controllata da piccole ORF a monte e dall’abbondanza di un complesso ternario 475
Regolazione traduzione-dipendente dell’mRNA e della stabilità delle proteine 477
L’RNA SsrA libera i ribosomi che traducono mRNAspezzati 477
Le cellule eucariotiche degradano gli mRNA incompleti o dotati di codoni di stop prematuri 479
SOMMARIO 481BIBLIOGRAFIA 482
CAPITOLO 15Il codice genetico
Il codice è degenerato 483
La percezione dell’ordine nel codice 485Tentennamento dell’anticodone 485Tre codoni determinano la fine della catena 487Come venne svelato il codice 487Stimolazione dell’incorporazione di amminoacidi
da parte di mRNA sintetici 488Poli-U codifica la poli-fenilalanina 488I copolimeri misti consentirono l’assegnazione
di altri codoni 489L’RNA transfer si lega a codoni trinucleotidici definiti 490Assegnazione dei codoni tramite copolimeri ripetitivi 490
Tre regole disciplinano il codice genetico 491
Tre tipi di mutazioni puntiformi alterano il codice genetico 492
Prova genetica che il codice viene letto in gruppi di tre unità 493
Mutazioni soppressive possono trovarsi nello stesso gene o in geni diversi 493
La soppressione intergenica coinvolge tRNA mutanti 494I soppressori nonsenso leggono anche i normali
segnali di terminazione 496La prova della validità del codice genetico 496
Il codice è pressoché universale 497
SOMMARIO 499BIBLIOGRAFIA 499
CAPITOLO 16La regolazione trascrizionale nei procarioti
I principi della regolazione trascrizionale 505
L’espressione genica è controllata da proteine regolatrici 505
La maggior parte degli attivatori e repressori agisce a livello dell’inizio di trascrizione 506
Molti promotori sono regolati dagli attivatori, che favoriscono il legame dell’RNA polimerasi al DNA, e dai repressori, che bloccano questo legame 506
Alcuni attivatori e repressori funzionano allostericamente e regolano passaggi dell’inizio di trascrizione successivi al legame dell’RNA polimerasi 507
Azione a distanza e formazione di un’ansa sul DNA 508Il legame cooperativo e l’allosteria svolgono molte
funzioni nella regolazione genica 509Antiterminazione ed oltre: non tutta la regolazione
dell’espressione genica agisce sull’inizio di trascrizione 510
La regolazione dell’inizio di trascrizione: alcuni esempi nei procarioti 510
L’espressione dei geni lac è controllata da un attivatore e da un repressore 511
CAP e il repressore Lac influenzano in modo opposto il legame dell’RNA polimerasi al promotore lac 511
CAP possiede delle superfici separate per l’attivazione e il legame al DNA 513
BOX 16.1 ESPERIMENTI CHIAVE Gli esperimenti di eliminazione dell’attivatore 514
La proteina CAP e il repressore Lac legano il DNA per mezzo di un comune motivo strutturale 515
Le attività del repressore Lac e di CAP sono controllate allostericamente dai loro segnali 517
BOX 16.2 ESPERIMENTI CHIAVE Jacob, Monod e le loro teorie sulla regolazione genica 518
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Parte 4La regolazione
Il controllo combinatorio: CAP controlla anche altri geni 520
Fattori σ alternativi dirigono la RNA polimerasi su serie alternative di promotori 520
NtrC e MerR: due attivatori trascrizionali che funzionano per mezzo dell’allosteria e non del reclutamento 521
NtrC è dotato di un’attività ATPasica e lavora sul DNA in siti lontani dal gene 521
MerR attiva la trascrizione facendo ruotare il DNA del promotore 522
Alcuni repressori trattengono la RNA polimerasi sul promotore invece di escluderla 523
AraC controlla l’operone araBAD per mezzo dell’antiattivazione 524
L’esempio del batteriofago λ: diversi livelli di regolazione 525
Schemi di espressione genica alternativi controllano la crescita litica e quella lisogenica 526
Le proteine regolatrici e i loro siti di legame 527Il repressore di λ lega l’operatore in modo
cooperativo 528BOX 16.3 CONCETTI AVANZATI Concentrazione,
affinità e legame cooperativo 529Il repressore e Cro si legano in schemi alternativi
per controllare il ciclo litico e quello lisogenico 531L’induzione lisogenica richiede il taglio proteolitico
del repressore di λ 531L’autoregolazione negativa del repressore richiede
delle interazioni a lunga distanza e un’ampia ansa di DNA 532
BOX 16.4 ESPERIMENTI CHIAVE L’evoluzione dell’interruttore di λ 534
In seguito all’infezione di un nuovo ospite, un altro attivatore, λ CII, controlla la scelta tra ciclo litico e lisogenico 536
Il numero di particelle fagiche che infettano una cellula influenza l’andamento litico o lisogenico dell’infezione 536
Le condizioni di crescita di E. coli influenzano la stabilità della proteina CII e di conseguenza la scelta tra ciclo litico e lisogenico 537
BOX 16.5 ESPERIMENTI CHIAVE Approcci genetici che hanno portato all’isolamento dei geni coinvolti nella scelta tra ciclo litico e lisogenico 538
L’antiterminazione trascrizionale nello sviluppo di λ 539La retroregolazione: l’espressione del gene int
è determinata da un gioco di controlli sulla sintesi e la stabilità dell’RNA 541
SOMMARIO 542BIBLIOGRAFIA 543
CAPITOLO 17La regolazione trascrizionale negli eucarioti
I meccanismi che regolano la trascrizione sono conservati dal lievito ai mammiferi 547
Gli attivatori hanno domini di legame al DNA e domini di attivazione separati 547
BOX 17.1 TECNICHE Il saggio dei due ibridi 549I regolatori degli eucarioti usano domini differenti
per il legame al DNA, ma il riconoscimento del DNA si basa sugli stessi principi dei batteri 550
Le regioni di attivazione sono strutture non ben definite 552
Reclutamento di complessi proteici indotto dagli attivatori trascrizionali eucariotici 553
Gli attivatori reclutano il complesso trascrizionale sui geni 553
Gli attivatori reclutano anche modificatori dei nucleosomi che permettono al complessotrascrizionale di legarsi al promotore o iniziare la trascrizione 554
Gli attivatori reclutano su alcuni promotori un altrofattore necessario per un inizio efficiente o perl’allungamento 556
Attività a distanza: loop e isolatori 556Per la corretta regolazione di alcuni gruppi di geni
sono necessarie specifiche regioni di controllo 558BOX 17.2 ESPERIMENTI CHIAVE Interazioni a lunga
distanza sullo stesso e su diversi cromosomi 559Integrazione del segnale e controllo
combinatorio 561
Gli attivatori lavorano in modo sinergico per integrare i segnali 561
Integrazione del segnale: il gene HO è controllato da due regolatori, uno recluta modificatori dei nucleosomi, l’altro recluta un mediatore 561
Integrazione del segnale: legame cooperativo degli attivatori sul gene dell’interferone β umano 563
Il controllo combinatorio dell’attività genica è fondamentale per la complessità e la diversità degli eucarioti 565
Il controllo combinatorio dei geni del mating type di S. cerevisiae 565
BOX 17.3 ESPERIMENTI CHIAVE Come evolve un circuito di regolazione 567
Repressori trascrizionali 568
Trasduzione del segnale e controllo dei regolatori trascrizionali 570
I segnali sono spesso comunicati ai regolatoritrascrizionali attraverso sistemi di trasduzione del segnale 570
Vari segnali controllano i regolatori trascrizionali eucariotici in diversi modi 572
Gli attivatori e i repressori possono essere formati da moduli fisicamente separati 573
Silenziamento genico determinato dalla modificazione degli istoni e del DNA 574
Il silenziamento nel lievito è mediato da deacetilazione e metilazione degli istoni 575
Nella Drosophila, HP1 riconosce gli istoni metilati e la cromatina condensata 576
BOX 17.4 CONCETTI AVANZATI Esiste un codice istonico? 577
La metilazione del DNA, nei mammiferi, è associata al silenziamento genico 578
BOX 17.5 RISVOLTI MEDICI La repressione trascrizionale e le malattie umane 579
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L’epigenetica regola l’espressione genica 580
Alcune modalità di espressione genica vengono ereditate con la divisione cellulare anche quando il segnale scatenante non è più presente 580
BOX 17.6 RISVOLTI MEDICI I fattori trascrizionali sono usati per riprogrammare le cellule somatiche in cellule staminali embrionali 583
SOMMARIO 584BIBLIOGRAFIA 585
CAPITOLO 18Gli RNA regolatori
La regolazione mediata da RNA nei batteri 587
I riboswitch si ritrovano all’interno dei trascritti dei geni di cui controllano l’espressione attraverso cambiamenti della struttura secondaria 589
BOX 18.1 CONCETTI AVANZATI Gli operoni per la biosintesi degli amminoacidi sono regolati mediante l’attenuazione 592
L’interferenza da RNA (RNAi) è uno dei principali meccanismi regolatorinegli eucarioti 594
I piccoli RNA che silenziano i geni sono generati da diverse fonti e dirigono il silenziamento genico in tre modi distinti 594
Sintesi e funzione dei miRNA 596
I miRNA hanno una tipica struttura che li aiuta a riconoscere se stessi e i propri geni bersaglio 596
Un miRNA attivo è formato tramite due passaggi di processamento nucleolitico 598
Dicer è il secondo enzima che taglia l’RNA coinvolto nella produzione del miRNA 599
L’incorporazione del filamento di RNA guida in RISC porta alla formazione del complesso maturo, pronto a silenziare l’espressione genica 600
I siRNA sono RNA regolatori prodotti da lunghi RNA a doppio filamento 601
BOX 18.2 ESPERIMENTI CHIAVE La storia dei miRNA e degli RNAi 601
I piccoli RNA possono silenziare trascrizionalmente i geni inducendo una modificazione della cromatina 603
L’evoluzione e l’utilizzo dell’RNAi 604
L’RNAi si è evoluto come sistema immunitario? 604L’RNAi è diventato un sistema potente
per manipolare l’espressione genica 606BOX 18.3 RISVOLTI MEDICI L’RNAi e le patologie
umane 606Gli RNA regolatori e l’inattivazione
del cromosoma X 609
L’inattivazione del cromosoma X porta a individui a mosaico 609
Xist è un RNA regolatore che inattiva un solo cromosoma X nelle femmine di mammifero 609
SOMMARIO 610BIBLIOGRAFIA 611
CAPITOLO 19La regolazione genica nello sviluppoe nell’evoluzione
Strategie di regolazione dell’espressione genica differenziale durante lo sviluppo 614
BOX 19.1 TECNICHE I saggi con i microarray: teoria e pratica 614
Alcuni mRNA si localizzano precisamente all’interno della cellula uovo e dell’embrione grazie a una polarità intrinseca del citoscheletro 615
Il contatto cellula-cellula e le molecole segnale secrete stimolano i cambiamenti dell’espressionegenica nelle cellule vicine 615
Il gradiente delle molecole segnale può istruire le cellule a seguire diverse vie di sviluppo sulla base della loro posizione 616
Esempi delle tre strategie utilizzate per stabilire l’espressione genica differenziale 618
La localizzazione del repressore Ash1 controlla il mating type del lievito attraverso il silenziamento del gene HO 618
BOX 19.2 CONCETTI AVANZATI Il citoscheletro: asimmetria e crescita 620
Un mRNA precisamente localizzato promuove il differenziamento muscolare nell’embrione dell’ascidia 622
BOX 19.3 CONCETTI AVANZATI Lo sviluppo di Ciona 622Il contatto cellula-cellula stimola l’espressione genica
differenziale nel batterio sporigeno Bacillus subtilis 623Uno scambio regolativo pelle-nervo è controllato
dal segnale di Notch nel sistema nervoso centrale degli insetti 624
Il gradiente del morfogeno Sonic hedgehog controlla la formazione dei diversi tipi di neuroni nel tubo neurale dei vertebrati 626
La biologia molecolare dell’embriogenesi di Drosophila 627
Una sintesi dell’embriogenesi di Drosophila 627BOX 19.4 CONCETTI AVANZATI Lo sviluppo
di Drosophila 628Il gradiente di un morfogeno controlla la
regionalizzazione dorso-ventrale dell’embrione di Drosophila 630
BOX 19.5 ESPERIMENTI CHIAVE Il ruolo della sinergia degli attivatori nello sviluppo 633
La segmentazione viene iniziata da alcuni mRNA localizzati ai poli anteriore e posteriore dell’uovo non fecondato 634
BOX 19.6 RISVOLTI MEDICI Le cellule staminali 636Bicoid e Nanos regolano hunchback 637Il gradiente del repressore Hunchback stabilisce
i diversi limiti di espressione dei geni gap 637Hunchback e le proteine gap producono le bande
di espressione genica della segmentazione 638BOX 19.7 ESPERIMENTI CHIAVE Le sequenze
regolatrici che agiscono in cis nello sviluppo e nell’evoluzione animale 639
I gradienti dei repressori gap producono molte bande di espressione genica 640
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I repressori trascrizionali a corto raggio consentono a enhancer diversi di lavorare indipendentemente l’uno dall’altro all’interno delle regioni regolatrici complesse di eve 642
I geni omeotici: un’importante classe di regolatori dello sviluppo 643
I cambiamenti nell’espressione dei geni omeotici sono la causa della diversità tra artropodi 644
BOX 19.8 CONCETTI AVANZATI I geni omeotici di Drosophila sono organizzati in raggruppamenti speciali sui cromosomi 645
Gli artropodi sono incredibilmente differenti 647Le variazioni dell’espressione di Ubx spiegano
le modificazioni degli arti nei crostacei 647Perché gli insetti non hanno arti addominali 648La modificazione degli arti per il volo sembra derivare
dall’evoluzione di sequenze regolatrici del DNA 649SOMMARIO 650BIBLIOGRAFIA 651
CAPITOLO 20L’analisi dei genomi e la biologia dei sistemi
Una panoramica sulla genomica 653
La bioinformatica facilita l’identificazione su scala genomica dei geni codificanti proteine 653
Per analizzare il trascrittoma vengono usati tiling array comprendenti l’intero genoma 654
Le sequenze di DNA con funzione regolatrice possono essere identificate grazie a strumenti di allineamento specializzati 655
BOX 20.1 TECNICHE Approcci bioinformatici per l’identificazione di enhancer complessi 657
Il saggio ChIP-chip rappresenta il migliore approccio per l’identificazione di enhancer 659
Animali differenti contengono una serie di geni incredibilmente simili 661
Molti animali hanno strani geni 661La sintenia è molto antica dal punto di vista
evolutivo 662Il sequenziamento ad alta efficienza
(deep sequencing) è stato usato per esplorare l’origine dell’uomo 663
La biologia dei sistemi 664
I circuiti trascrizionali sono composti da nodi e segmenti 665
L’autoregolazione negativa riduce il rumore e permette una risposta rapida 666
Nell’espressione genica c’è rumore 667L’autoregolazione positiva ritarda l’espressione
di un gene 668Alcuni circuiti regolatori possono avere due stati
stabili 669BOX 20.2 ESPERIMENTI CHIAVE La bistabilità e l’isteresi 670I circuiti a retroazione positiva sono reti a tre nodi
con proprietà utili 672I circuiti a retroazione positiva sono usati
nello sviluppo 673
Alcuni circuiti generano profili oscillanti di espressione genica 674
I circuiti sintetici simulano alcune caratteristiche delle reti naturali di regolazione 677
Prospettive 677
SOMMARIO 678BIBLIOGRAFIA 679
CAPITOLO 21Tecniche di biologia molecolare
Gli acidi nucleici 686
L’elettroforesi su gel separa le molecole di DNA ed RNA in base al peso molecolare 686
Le endonucleasi di restrizione tagliano le molecole di DNA in siti particolari 687
L’ibridazione può essere usata per identificare specifiche molecole di DNA 689
Le sonde di ibridazione possono identificare DNA ed RNA separati elettroforeticamente 690
Isolamento di frammenti specifici di DNA 691Clonaggio del DNA 692Il clonaggio del DNA in vettori plasmidici 692Il DNA inserito nel vettore può essere introdotto
negli organismi ospiti mediante la trasformazione 693Mediante clonaggio si possono creare librerie
di molecole di DNA 694Un clone specifico di una libreria di DNA può essere
identificato mediante ibridazione 695Oligonucleotidi sintetizzati chimicamente 696La reazione a catena della polimerasi (PCR) amplifica
i DNA mediante ripetuti cicli di replicazione in vitro 697BOX 21.1 TECNICHE Aspetti legali e reazione a catena
della polimerasi 699Gruppi di frammenti interni di DNA rivelano
la sequenza nucleotidica 699BOX 21.2 ESPERIMENTI CHIAVE I Sequenator sono
utilizzati per il sequenziamento ad alta resa 702Il sequenziamento “in un colpo solo” (shotgun)
del genoma batterico 702Il sequenziamento shotgun consente l’assemblaggio
parziale di estese sequenze genomiche 703La strategia dell’accoppiamento delle estremità
consente di produrre ampi assemblaggi genomici 705Il genoma umano da 1000 dollari è a portata
di mano 707Le proteine 708
Specifiche proteine possono essere isolate da estratti cellulari 708
La purificazione di una proteina richiede un saggio specifico 709
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Parte 5Metodi
Preparazione di un estratto cellulare contenente proteine attive 709
Le proteine possono essere separate tra loro utilizzando la cromatografia su colonna 709
La cromatografia per affinità può facilitare una più rapida purificazione delle proteine 711
Separazione di proteine su gel di poliacrilammide 712Gli anticorpi possono essere usati per visualizzare
proteine separate per elettroforesi 712Le molecole proteiche possono essere sequenziate
direttamente 713Proteomica 716
L’uso combinato della cromatografia liquida con la spettrometria di massa permette di identificare singole proteine presenti in un estratto complesso 716
L’analisi comparativa dei diversi proteomi rivelaimportanti differenze tra cellule 717
La spettrometria di massa può anche seguire le diverse modificazioni proteiche 717
Le interazioni proteina-proteina forniscono informazioni funzionali 718
Le interazioni acidi nucleici-proteine 719
La mobilità elettroforetica del DNA varia in seguito al legame di una proteina 719
Una proteina legata al DNA lo protegge dalle nucleasi e dalla modificazione chimica 720
L’immunoprecipitazione della cromatina rivelal’associazione delle proteine con il DNA nelle cellule 722
La selezione in vitro può essere usata per identificare sul DNA o sull’RNA il sito di legame di una proteina 724
BIBLIOGRAFIA 725
CAPITOLO 22Organismi modello
I batteriofagi 727
Saggi per la crescita fagica 729Curva di crescita a passaggio unico 730Incroci tra fagi e test di complementazione 730Trasduzione e DNA ricombinante 731
I batteri 732
Analisi della crescita batterica 732I batteri si scambiano DNA mediante coniugazione,
trasduzione mediata dai fagi e trasformazione con DNA 732
I plasmidi batterici possono essere usati come vettori di clonaggio 734
I trasposoni possono essere utilizzati per generare mutazioni per inserzione e fusioni tra il gene e l’operone 734
Gli studi di biologia molecolare dei batteri hanno ricevuto impulso dalla tecnologia del DNAricombinante, dal sequenziamento del genoma e dal profilo trascrizionale 735
L’analisi biochimica è particolarmente efficace nelle cellule semplici con gli strumenti tradizionali e della genetica molecolare 736
I batteri possono essere studiati dal punto di vista citologico 736
I fagi e i batteri hanno fornito importanti informazioni sul gene 736
Il lievito di birra Saccharomyces cerevisiae 737
L’esistenza di cellule aploidi e diploidi facilita l’analisi genetica di S. cerevisiae 738
È facile ottenere mutazioni precise nel lievito 738S. cerevisiae possiede un genoma piccolo
e ben caratterizzato 739Le cellule di S. cerevisiae cambiano forma durante
la crescita 739Arabidopsis 740
Arabidopsis è caratterizzata da un ciclo vitale rapido con fasi aploidi e diploidi 741
Arabidopsis viene facilmente trasformata per la genetica inversa 742
Arabidopsis è caratterizzata da un piccolo genoma facilmente manipolabile 742
L’epigenetica 743Le piante rispondono all’ambiente 744Sviluppo e formazione della struttura 744
Il verme nematode Caenorhabditis elegans 745
C. elegans ha un ciclo vitale molto rapido 745C. elegans è costituito da relativamente poche linee
cellulari ben studiate 746La via della morte cellulare fu scoperta in C. elegans 747L’interferenza da RNA (RNAi) fu scoperta
in C. elegans 747Il moscerino della frutta Drosophila
melanogaster 748
Drosophila ha un ciclo vitale rapido 748Le prime mappe genomiche sono state realizzate
per la Drosophila 749I mosaici genetici consentono l’analisi dei geni letali
nei moscerini adulti 750La ricombinasi FLP di lievito consente la produzione
efficiente di mosaici genetici 751È facile generare moscerini della frutta transgenici
che contengono DNA esogeno 752Il topo comune Mus musculus 753
Lo sviluppo embrionale del topo dipende dalle cellule staminali 754
È facile introdurre DNA esogeno nell’embrione di topo 755
La ricombinazione omologa consente l’ablazione selettiva di singoli geni 756
I topi mostrano un’eredità epigenetica 757BIBLIOGRAFIA 759
INDICE ANALITICO 760
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