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Vol. 42 • N. 168Ottobre-Dicembre 2012

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INDICE numero 168 Ottobre-Dicembre 2012

MalattIE MEtabOlIChE ErEDItarIE (a cura di Generoso Andria)

Presentazione .....................................................................................................................................................................................193

aggiornamento sulle malattie metaboliche ereditarie ..................................................................................................................195

Roberto Cerone, Maria Cristina Schiaffino, Anna Rita Fantasia, Michela Cassanello, Simone Murgia, Ubaldo Caruso

Encefalopatie mitocondriali infantili ................................................................................................................................................202

Daria Diodato, Anna Ardissone, Graziella Uziel, Daniele Ghezzi, Massimo Zeviani

Nuovi approcci terapeutici alle malattie da accumulo lisosomiale .............................................................................................209

Giancarlo Parenti, Caterina Porto, Roberto Della Casa

DIabEtOlOgIa (a cura di Francesco Chiarelli)

Presentazione .....................................................................................................................................................................................219

Diabete in età pediatrica: cosa c’è di nuovo? .................................................................................................................................221

Maria Loredana Marcovecchio, Francesco Chiarelli

Diagnosi del diabete nel bambino: quando pensare anche al diabete non-autoimmune ..........................................................226

Franco Meschi, Valeria Favalli, Giusy Ferro

Novità nel trattamento del diabete di tipo 1: dal microinfusore al pancreas artificiale ...........................................................231

Stefano Tumini, Silvia Carinci

FrONtIErE (a cura di Andrea Biondi, Achille Iolascon, Luigi D. Notarangelo, Massimo Zeviani)

Nuove frontiere per la terapia genica: enzimi artificiali per correggere le mutazioni genetiche ............................................236

Claudio Mussolino

FOCus (a cura di Generoso Andria)

la promozione della salute riproduttiva .........................................................................................................................................243

Pierpaolo Mastroiacovo

In ricordo di Franco Panizon .............................................................................................................................................................253

193

La dizione “malattie metaboliche” può risultare spesso equivoca. Il medico dell’adulto pensa al diabete, alle dislipidemie, all’aterosclerosi, all’iperuricemia. Il pediatra, invece, pensa subito a quelli che una volta erano chiamati “errori congeniti del metabolismo” (Inborn errors of metabolism). Oggi quest’ultima definizione non è considerata “politicamente corretta”, in quanto etichettare un bambino con una malattia metabolica congenita come un “errore” non è più accettabile (uno scrittore francese, Michel Quoist, diceva che “ogni bambino è una parola che esce dalla bocca di Dio…e Dio non dice parolacce)”. È meglio, quindi, indicare questo gruppo di patologie genetiche come “Malattie metaboliche ereditarie”(MME). Di queste, in realtà, si sono da sempre occupati soprattutto i pediatri. Infatti esse esordiscono nella maggior parte dei casi alla nascita o nei primi anni di vita: perciò in tutto il mondo sono state sempre curate da specialisti, chiamati “pediatri metabolisti”. D’altra parte i nuovi pro-grammi di screening neonatale allargato, grazie all’uso di tecnologie come la spettrometria di massa in tandem, stanno progressivamente aumentando il numero di malattie che possono essere identificate nei primi giorni di vita: la maggior parte di esse sono appunto Malattie metaboliche ereditarie. Un problema da risolvere nella formazione medica specialistica è oggi quello di addestrare medici dell’adulto che abbiano competenza nella diagnosi e cura delle Malattie metaboliche ereditarie, analogamente a quanto avviene per tutta una serie di patologie croniche che, pur esordendo nell’età pediatrica, trovano, dopo la pubertà, centri specialistici competenti nell’area della medicina interna (ad esempio per diabetologia, reumatologia, epilettologia, cardiologia, gastroenterologia, etc.). Non è da sottovalutare il fatto che le Malattie metaboliche ereditarie, tra tutte le malattie genetiche, siano quelle che hanno messo a punto approcci terapeutici efficaci, sulla base dei quali, tra l’altro, sono stati estesi i programmi di screening neonatale. Per questo il medico deve avvertire la responsabilità di riconoscere in tempo utile pazienti di qualunque fascia di età, se pur rari, che possono essere sottratti con opportuni trattamenti a un destino di malattia e di disabilità. Non dimentichiamo,infine, che le Malattie metaboliche ereditarie hanno rappresentato e ancora rappresentano un modello di studio estre-mamente interessante nel campo della genetica: sono state, infatti, un primo esempio di ricerca proteomica, in un’epoca in cui la genomica era ancora in fase di sviluppo. È importante, quindi, che un aggiornamento sulle malattie metaboliche ereditarie sia periodicamente presente nel curriculum formativo del pediatra, non solo per le ricadute in campo assistenziale, cioè diagnostico e terapeutico, ma anche per la loro valenza educativa, in quanto modello per approfondire le basi genetiche e molecolari della medicina.La sezione sulle Malattie metaboliche ereditarie di questo numero di Prospettive in Pediatria comprende, come di consueto, tre articoli.L’articolo di Roberto Cerone e collaboratori riporta i progressi più recenti nel settore, anzitutto per discutere le problematiche circa l’allarga-mento del panel di malattie che oggi sono sottoposte a screening nei vari paesi del mondo. Vengono, poi, presentati alcuni esempi di malat-tie metaboliche con interessamento neurologico di recente individuazione e viene fatto il punto sui differenti approcci terapeutici, già in atto o in corso di sperimentazione, per le iperfenilalaninemie, prototipo delle malattie metaboliche identificabili mediante screening neonatale.Il secondo articolo di Daria Diodato e collaboratori presenta il capitolo delle encefalopatie mitocondriali pediatriche, a cui il gruppo che fa capo a Massimo Zeviani ha contribuito in maniera determinante negli ultimi anni con ricerche all’avanguardia, che hanno permesso di chia-rire la patogenesi di molte entità nosografiche, la loro storia naturale e la possibilità di applicare interventi terapeutici innovativi. Infine il contributo di Giancarlo Parenti e collaboratori costituisce un’aggiornata revisione circa le nuove terapie oggi disponibili per le ma-lattie da accumulo lisosomiale. Anche in questo caso le ricerche del gruppo di Parenti sono risultate di grande interesse per identificare in vitro e poi in modelli animali nuove possibilità di trattamento, con piccole molecole, tipo chaperone, che stanno oggi per essere trasferite al campo clinico con trial sperimentali in pazienti.

Generoso AndriaDipartimento di Pediatria, Università Federico II, Napoli

Malattie metaboliche ereditarie

Ottobre-Dicembre 2012 • Vol. 42 • N. 168 • pp. 195-201 MALATTie MeTAboLiChe eReDiTARie

195

Introduzione

In questi ultimi anni le conoscenze nel settore delle malattie meta-boliche ereditarie hanno avuto una crescita significativa.In particolare l’attenzione si è rivolta: all’individuazione precoce di un numero sempre maggiore delle suddette patologie mediante lo screening neonatale, alla scoperta di nuove malattie o di fenotipi clinici di malattie già note, nonché allo sviluppo di nuove terapie.Questo aggiornamento si focalizzerà soprattutto sugli errori conge-niti del metabolismo intermedio (non facendo quindi riferimento alle terapia delle malattie da accumulo lisosomiale e alle encefalopatie mitocondriali oggetto di due articoli in questo fascicolo di Prospet-tive in Pediatria), presentando le più rilevanti novità emerse dalla revisione della letteratura più recente.

Novità in tema di screening neonatale

L’applicazione della spettrometria di massa tandem (o MS/MS) allo screening neonatale ha permesso di espandere significativamente le malattie evidenziabili in epoca neonatale passando dal concetto tradizionale di un test-una malattia al concetto completamente nuo-vo un test-molte malattie.In questo contesto, la diagnosi di diverse malattie metaboliche pre-cede l’esordio sintomatologico, talora acuto, permettendo di mettere in atto metodiche e trattamenti adeguati preventivi. La MS/MS permette di analizzare aminoacidi e acilcarnitine su uno spot del diametro di circa 5 mm di sangue essiccato su carta bibula.

L’introduzione di questa tecnica ha permesso di aumentare note-volmente il numero di condizioni diagnosticabili con un unico test. Infatti con la MS/MS è possibile sottoporre a screening oltre 40 ma-lattie (aminoacidopatie, acidemie organiche, difetti dell’ossidazione degli acidi grassi). Esiste tuttavia una notevole disparità tra i vari Centri di screening in USA e in Europa riguardo al numero di patologie sottoposte a screening.Di fatto mentre negli USA vengono sottoposte a screening almeno 40 patologie metaboliche (Tortorelli et al., 2008) in Europa la situa-zione è molto disomogenea con un numero di malattie che a secon-da della nazione è variabile da 1 a 40 (Loeber et al., 2012).In Italia, l’offerta e la distribuzione dello screening neonatale meta-bolico esteso, presenta tutt’ora delle differenze regionali. Dai dati pubblicati nell’ultimo rapporto tecnico della Società Italiana per lo Studio delle Malattie Metaboliche ereditarie e lo Screening Neonatale (SIMMESN) dell’anno 2011, lo screening neonatale esteso mediante MS/MS era effettuato dai Centri di Firenze (per i neonati della Toscana e Umbria) e come progetti pilota dai Centri di Genova (anche per alcuni punti nascita della Sardegna), Roma “La Sapien-za”, Catania e Napoli (CEINGE) (Cerone et al., 2011). Nell’anno 2012 si è aggiunto il Centro di Bologna.Il successo internazionale dello screening neonatale metabolico esteso ha spinto la comunità scientifica a considerare un numero maggiore di patologie sottoponibili a screening. Oggi il gruppo di maggiore interesse è rappresentato dalle malattie da accumulo li-sosomiale (LSD) e dalle immunodeficienze combinate gravi (SCID).

aggiornamento sulle malattie metaboliche ereditarie

Roberto Cerone, Maria Cristina Schiaffino, Anna Rita Fantasia, Michela Cassanello, Simone Murgia, Ubaldo CarusoCentro Regionale di riferimento per lo screening neonatale e la diagnosi delle malattie metaboliche dell’Università, Istituto Giannina Gaslini, Genova

RiassuntoI recenti lavori scientifici hanno evidenziato un importante avanzamento delle conoscenze nel campo delle malattie metaboliche ereditarie, in particolare nel settore degli screening neonatali, nelle identificazione di nuove patologie e nel campo della terapia.Il presente articolo di revisione descrive i progressi fatti in questi ultimi anni in particolare in tre aree: gli screening neonatali con particolare riguardo alle nuove metodologie che hanno permesso l’espansione dello spettro di patologie identificabili nelle prime epoche della vita;nuove malattie metaboliche di interesse neurologico, nello specifico: il deficit di piridox(am)ina 5’-fosfato ossidasi, il deficit del trasportatore della dopamina, gli errori congeniti del metabolismo e trasporto dei folati;nuovi approcci terapeutici, con particolare riguardo alle iperfenilalaninemie, alla malattia delle urine a sciroppo d’acero e ai difetti del ciclo dell’urea.

SummarySeveral recent scientific papers have showed a growing interest in the field of inborn errors of metabolism.This review describes the progress made in the last years, mostly in three important fields:newborn screening, with special attention to the new technologies used to expand the metabolic panel;newly identified metabolic disorders with neurological involvement, i.e. the pyridox(am)ine 5’-phosphate oxidase deficiency, the dopamine transporter defect, the inborn errors of folate metabolism and transport; new therapeutic approaches, particularly to hyperphenilalaninemias, maple syrup urine disease and urea cycle defects.

R. Cerone et al.

196

Malattie da accumulo lisosomiale

Le malattie lisosomiali sono un gruppo di oltre 40 patologie eredita-rie con una prevalenza stimata di 1:7000-1:9000 (Fletcher, 2006); per i possibili interventi terapeutici, che si sono resi disponibili in questi anni recenti o lo saranno nell’immediato futuro (malattia di Gaucher, malattia di Fabry, malattia di Pompe, mucopolisaccaridosi I, II e IV, malattia di Niemann-Pick e malattia di Krabbe) alcune di queste sono state candidate per lo screening neonatale. Di fatto pur esistendo alternative biochimiche per la misura delle at-tività specifiche nel cartoncino per lo screening per singola malattia, la MS/MS presenta il vantaggio di poter rilevare, mediante l’analisi di differenti substrati, più difetti enzimatici simultaneamente.Tale possibilità è stata applicata per l’individuazione della malattia di Pompe, Fabry e MPS-I sullo stesso spot di sangue (Duffey et al., 2010). Recentemente è stata discussa la possibilità di introdurre nell’ambi-to di programmi di screening neonatale, il dosaggio di enzimi speci-fici, il cui deficit è causa di alcune malattie da accumulo lisosomiale; nello specifico il dosaggio dell’α-glucosidasi per la malattia di Pom-pe, quello della dell’α-galattosidasi A per la malattia di Fabry e della β-galattocerebrosidasi per la malattia di Krabbe. I dati attualmente disponibili non supportano l’inclusione delle suddette metodiche in programmi di screening neonatali applicabili nella pratica comune, poiché non rispondono ai criteri classici di fattibilità, di efficacia e di appropriatezza di prevenzione secondaria (Ross, 2011) (Tab. I).Uno dei problemi posti dallo screening per le malattie lisosomiali è l’iden-tificazione di pazienti il cui fenotipo non è chiaro: ad esempio la maggior parte dei pazienti con malattia di Fabry identificati allo screening sono affetti da forme late-onset che potrebbero non sviluppare sintomatologia anche senza trattamento (Spada et al., 2006, Doi et al., 2012). Sono in corso ulteriori studi su un più vasto campione di neonati per confermare la specificità di tale metodica.

Immunodeficienze combinate gravi (SCID)

Le immunodeficienze combinate gravi (SCID) rappresentano un gruppo molto eterogeneo di patologie, che compromettono grave-mente la funzione del sistema immunitario, ed in particolare dei lin-fociti T spesso associata ad assenza di linfociti B (Buckley, 2000). Si distinguono almeno 15 differenti malattie; in base alla modalità di trasmissione e al tipo di difetto, si riconoscono diverse forme di SCID: SCID con ipoplasia emopoietica generalizzata, SCID con man-cato sviluppo della cellula staminale linfoide (con assenza dei lin-fociti B e T), SCID con linfociti B normali, SCID con deficit di purina nucleoside fosforilasi (PNP), SCID con deficit di adenosindeaminasi

(ADA). Solo le ultime due forme sono anche errori congeniti del me-tabolismo.Abitualmente le SCID si manifestano in bambini di età inferiore all’anno, tipicamente nei primi tre mesi di vita, per l’elevata suscet-tibilità alle infezioni ed il grave interessamento multiorgano (polmo-nite interstiziale cronica, candidiasi, epatosplenomegalia, rash cuta-nei, diarrea cronica e deficit di accrescimento).In assenza di un trattamento adeguato (trapianto di cellule staminali ematopoietiche) l’exitus avviene entro 1 o 2 anni per infezioni da agenti opportunisti e virus.I bambini che sono stati diagnosticati precocemente (abitualmente per una storia familiare positiva) e trapiantati hanno una prognosi quod vitam più favorevole e minori complicanze rispetto ai soggetti diagnosticati tardivamente e con manifestazioni cliniche.Le SCID per alcune caratteristiche cliniche e terapeutiche (alta mor-talità se non trattata, possibilità di terapia se riconosciuta precoce-mente e markers di malattia specifici, identificabili sullo spot del cartoncino per lo screening) sono potenziali candidate per lo svilup-po di screening neonatali.Per l’interesse specialistico di questa review, rivolto per lo più alle patologie metaboliche ereditarie, si approfondisce la forma di SCID associata al difetto di adenosina deaminasi, coinvolta nel metaboli-smo delle purine, che rappresenta il 30% dei casi di SCID. Il deficit di adenosina deaminasi (ADA) è una immunodeficienza gra-ve, a trasmissione autosomica recessiva, fatale nei primi mesi di vita se non trattata. Uno studio pilota italiano ha dimostrato che la valu-tazione su spot di sangue alla nascita dell’adenosina e della 2- de-ossiadenosina (suo metabolita) tramite spettrometria di massa è una metodica efficace, economica, semplice e disponibile per diagnosi neonatale di ADA (Azzari et al., 2011). Auspicabile è la validazione dei risultati con studi di popolazione.

Nuove malattie metaboliche con presentazione neurologica

Vengono di seguito descritti i fenotipi associati ai disordini metabolici con prevalente coinvolgimento neurologico di recente identificazione: il deficit di piridox(am)ina 5’-fosfato ossidasi, il deficit del trasportatore della dopamina, gli errori congeniti del metabolismo e trasporto dei folati. La tabella II fornisce una sinossi di queste condizioni.

Deficit di piridox(am)ina 5’-fosfato ossidasi

Il piridossal-5’ fosfato, coenzima della vitamina B6 può essere for-mato dalla piridossina o piridossamina mediante l’azione di due

Tabella I.Caratteristiche di alcune malattie da accumulo lisosomiale, esaminate come possibili candidate per test di screening neonatali (da Ross, 2012).

Malattia di Pompe Malattia di Fabry Malattia di Krabbe

Esistenza di un test di screening sì sì, per i maschi sì

Test diagnostici discriminanti forme infantili da forme non classiche

no no no

Storia naturale nota sì, nuove problematiche gestionali stanno sorgendo in bambini sopravvissuti

sì sì

Trattamento efficace Trattamento enzimatico sostitutivo, non per i pazienti CRIM negativi

Terapia enzimatica sostitutiva Trapianto di cellule staminali

Possibilità di introduzione in programmi di screening neonatali

Non ancora Non ancora Non ancora

Aggiornamento sulle malattie metaboliche

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enzimi: la piridossal chinasi e la piridox(am)ina 5’-fosfato ossidasi (PNPO). Mentre l’epilessia piridossina responsiva è un’entità nota, ormai da circa 50 anni, il deficit di piridox(am)ina 5’-fosfato ossidasi, è una patologia di più recente identificazione, che causa una grave encefalopatia epilettica neonatale.La diagnosi clinica della classica epilessia piridossina responsiva si basa sui seguenti criteri: comparsa delle convulsioni prima o entro il primo mese di vita, non risposta ai farmaci antiepilettici, rapida risposta alla terapia con piridossina, controllo delle convulsioni con una terapia di mantenimento (5-10 mg/Kg/die), ricomparsa delle convulsioni dopo pochi giorni dall’interruzione della terapia di mantenimento.L’epilessia piridossina responsiva è una malattia autosomica reces-siva causata da mutazioni nel gene ALDH7A1 localizzato sul cromo-soma 5q31. La più comune mutazione responsabile di circa il 30% degli alleli mutati è la E399Q (Mills et al., 2010).

Per quanto riguarda il deficit di PNPO sono stati riportati in lettera-tura 16 pazienti di otto diverse famiglie (Khayat et al., 2008; Ruiz et al., 2008).Il quadro clinico è caratterizzato da: convulsioni fetali (3/16), distress fetale prima del parto (5/16), parto prematuro, basso punteggio APGAR (5/16), convulsioni nelle prime 24 ore di vita (11/14) quadro EEG di burst-suppression (10/11) con mancata risposta alla terapia antiepiletti-ca (13/18) e alla terapia con piridossina (7/10).La maggior parte dei pazienti risponde alla terapia con piridossal-fo-sfato. Il gene della PNPO è localizzato sul cromosoma 17q21.2. Le prin-cipali mutazioni individuate sono: una mutazione missenso in omo-zigosi (p.R95H), un composto eterozigote per una missenso muta-zione (p.D33V) e una mutazione nonsenso in omozigosi (p.A174X) (Hoffmann et al., 2006; Ruiz et al., 2008).

Tabella II.Caratteristiche genetiche e cliniche di malattie metaboliche con presentazione neurologica di recente caratterizzazione.

Nome Gene e cromosoma Fenotipo clinico Diagnosi Terapia

Deficit di piridox(am)ina 5’-fosfato ossidasi

PNPO17q21.32

Manifestazioni comiziali (mioclonie, convulsioni, movimenti oculari abnormi), acidosi lattica, bradicardia, asfissia perinatale, encefalopatia epilettica, ritardo cognitivo e del linguaggio

Ipoglicemia, acidosi, vanil lattato nelle urine;alla rachicentesi riscontro di: aumento di glicina, taurina, istidina, treonina e bassi livelli di arginina;burst suppression all’EEG;analisi molecolare per PNPO;valutazione attività enzimatica residua di PNPO su fibroblasti.

Piridossal-5 fosfato (dopo mancata risposta alla terapia con vitamina B6)

Deficit del trasportatore della Dopamina

SLC6A35p15.3

Irritabilità e difficoltà di alimentazione in epoca neonataleIpotonia assialeParkinsonismoSintomi ipercinetici (distonie, corea, discinesia)Movimenti oculari abnormiSegni piramidali

Lieve aumento di escrezione urinaria di acido omovanillico;alla rachicentesi evidenza di aumento del rapporto acido omovanillico/5-idrossindoloacetico;lieve aumento della PRL;aumento CPK;alterazione dei gangli della base alla PET-scan;analisi molecolare gene SLC6A3

Rilassanti muscolari,Agenti dopaminergici,anticolinergici, antiglutamatergici,acido γ-aminobutirrico

Difetto del recettore α dei folati

FOLR111q13.3-q14.1

Disordini del movimentoRegressione psicomotoriaEpilessiaLeucodistrofia

Riduzione della concentrazione dei folati nel liquido cefalo-rachidianoRMN-encefaloIpomielinizzazioneSpettroscopia: riduzione della colina e dell’inositolo

Acido folinico

Deficit di diidrofolato reduttasi

DHFR5q11.2-q13.2

Anemia megaloblastica e/o pancitopeniaEpilessia generalizzata tipo assenze atipiche o forme tonico-clonicheManifestazioni neurologicheRitardo mentale

Riduzione dei livelli dei folati nel liquido cefalo rachidiano

Acido folinicoIdrossicobalamina

Deficit di metilene tetra - idrofolato deidrogenasi

MTHFD14q24

Anemia megaloblasticaSindrome emolitico-uremicaImmunodeficienza

Elevati livelli plasmatici di omocisteina e acido metilmalonico

R. Cerone et al.

198

Deficit del trasportatore della dopamina

Il deficit del trasportatore della dopamina è stato descritto recente-mente in 11 bambini che presentavano un quadro clinico caratte-rizzato da ipercinesia e parkinsonismo (Kurlan et al., 2011). Tutti i pazienti hanno sviluppato un grave quadro di distonia con disordini del movimento oculare e del tratto piramidale.Nei pazienti studiati sono state identificate mutazioni SLC6A3.Il quadro biochimico presenta un aumentato rapporto acido omo-vanillico/acido 5-idrossiindolacetico e una aumentata escrezione urinaria di acido omovanillico.Tutti i soggetti hanno presentato una scarsa risposta alla terapia con neurotrasmettitori.

Errori congeniti del metabolismo e del trasporto dei folati

Nell’ambito degli errori congeniti che interessano il trasporto e il metabolismo dei folati cinque sono stati ampiamente studiati: 1) il malassorbimento ereditario dei folati (OMIM 229050),causato da mutazioni del gene che codifica il trasporto dei folati (SLC46A1) e caratterizzato clinicamente da anemia megaloblastica, infezioni ricorrenti con diarrea cronica, convulsioni e ritardo mentale; 2) il deficit di glutamato formiminotransferasi (OMIM 229100), dovuto a mutazioni nel gene FTDC (proteina bi-funzionale contenente la glu-tamato amino transferasi e la formimino tetraidrofolato ciclodeami-nasi con un fenotipo clinico caratterizzato principalmente da ritardo mentale; 3) il deficit della metilenetetraidrofolato reduttasi (OMIM 236250), il più frequente degli errori congeniti del metabolismo dei folati, causato da mutazioni nel gene MTHFR (metilentetraidrofola-to reduttasi) e con sintomatologia clinica variabile rappresentata da ritardo mentale e trombosi; 4) il deficit di metionina sintasi (OMIM 236270) e 5) il deficit di metionina sintasi reduttasi (OMIM 250940) che sono causate da mutazioni che interessano le funzioni delle metionina sintasi reduttasi o sintetasi. Questi due ultimi difetti (au-tosomici recessivi) presentano clinicamente anemia megaloblastica, atrofia cerebrale, cecità e alterazioni del tono muscolare.Ai cinque difetti conosciuti se ne sono recentemente aggiunti altri tre: il deficit cerebrale di folati dovuto a mutazioni nel gene che co-difica il recettore alfa, il deficit di diidrofolato reduttasi e il deficit di metilene tetraidrofolato (THF) deidrogenasi. Il deficit cerebrale di folati (OMIM 613068) dovuto a mutazioni nel gene che codifica il recettore α è stato identificato in un piccolo numero di famiglie (Cario et al., 2009). Il quadro neurologico dei pazienti è molto ampio e include ritardo mentale, ritardo motorio ed epilessia.Il trattamento con acido folinico ha aumentato i livelli di folato ce-rebrale (che sono invece normali nel sangue) ma ha avuto effetti limitati sul quadro epilettico.Il deficit di diidrofolato reduttasi (OMIM 613839) è stato descritto in tre famiglie con anemia megaloblastica, deficit cerebrale dei folati e convulsioni: nei casi più gravi è presente pancitopenia, atrofia cere-brale e grave ritardo mentale (Banka et al., 2011). Nei pazienti affetti sono state identificate mutazioni allo stato omozigote nel gene DHFR suggestive di una trasmissione autosomica recessiva della malattia (Carlo et al., 2011). Il trattamento con acido folinico ha determinato una normalizzazione del volume dei globuli rossi e un miglioramento del quadro neurologico, ma nei casi più gravi la terapia non ha mo-dificato il decorso del ritardo mentale.Il deficit di metilene THF deidrogenasi è stato identificato in un bam-bino di due mesi che presentava anemia megaloblastica, sindrome emolitica uremica atipica e grave immunodeficienza combinata. Il quadro biochimico é caratterizzato da aumentate concentrazioni

plasmatiche di omocisteina e acido metilmalonico. Alla base del di-fetto sono state identificate mutazioni nel gene MTHFD1 (Watkins et al., 2011).

Nuove terapie

Nell’ambito degli errori congeniti del metabolismo il trapianto di fe-gato o di epatociti e l’impiego di alcuni farmaci sono le terapie che hanno permesso l’introduzione di nuove strategie di trattamento.

Trapianto di fegato o di epatociti

Le malattie metaboliche ereditarie rappresentano, dopo la colestasi, la seconda più comune indicazione all’epatotrapianto in età pedia-trica (Burlina et al., 2002).Le esperienze più recenti fanno riferimento all’impiego del trapianto epatico e degli epatociti nella leucinosi, in alcune organicoacidemie e nei difetti del ciclo dell’urea (Meyburg-Hoffmann, 2010). Per quanto riguarda la leucinosi sono stati presi in considerazione 35 pazienti con leucinosi classica sottoposti a trapianto di fegato da donatori deceduti, dimostrando l’efficacia della terapia a lungo ter-mine nel bloccare la progressione del danno cerebrale, senza alcun miglioramento, però, del quadro neurologico preesistente (Mazarie-gos et al., 2012).Per le organicoacidemie l’esperienza si è rivolta principalmente alla propionico e alla metilmalonico acidemia con risultati contrastanti, che necessitano di un follow-up a lungo termine per conclusioni de-finitive (Vara et al., 2011). Il trapianto epatico, effettuato in 4 soggetti ad una età media di 1 anno e mezzo, è stato eseguito utilizzando in tutti i casi il lobo sini-stro epatico.Tra i difetti del ciclo dell’urea, i pazienti affetti da: difetto di ornitin-transcarbamilasi, carbamilfosfatosintetasi e arginino succinico liasi, più frequentemente necessitano del trapianto epatico. L’esperien-za americana relativa a circa 113 pazienti affetti da difetti del ciclo dell’urea, trattati con trapianto epatico, ha identificato una sopravvi-venza a cinque anni pari all’86% (Chang et al., 2005).Tali risultati sono sovrapponibili a quelli riportati in una casistica inglese con un miglioramento della qualità di vita e netta riduzione del numero dei ricoveri per episodi di scompenso metabolico (Leonard et al., 2004).

Farmacoterapia

Iperfenilalaninemie

In un nostro precedente articolo (Cerone et al., 2005) sono state riferite le terapie che erano all’epoca oggetto di studio per le iper-fenilalaninemie: la terapia genica, la supplementazione con amino-acidi neutri, la terapia con tetraidrobiopterina (BH4) e la terapia con fenilalanina ammonia liasi (PAL).Riprendiamo brevemente ciascuna delle terapie alternative alla die-toterapia convenzionale segnalando le novità pubblicate negli ultimi anni.Aminoacidi neutri: la fenilalanina e gli altri aminoacidi neutri (LNAA) (tirosina, triptofano, treonina, isoleucina, leucina, valina, metionina e istidina) condividono un trasportatore comune a livello cerebrale; aumentando la quantità degli LNAA è possibile ridurre il trasporto della fenilalanina a livello della barriera emato-encefalica (Fig. 1).Studi recenti hanno evidenziato in soggetti in terapia con LNAA una riduzione dei livelli della fenilalanina cerebrale e risultati positivi sul-le funzioni neuropsicologiche, in particolare quella verbale e cogniti-va (Giovannini et al., 2012).


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La terapia con LNAA può essere considerata una terapia alternativa in quei pazienti adolescenti/adulti che presentano una scarsa com-pliance con la classica dietoterapia.Terapia con BH4: come è noto alcuni pazienti affetti da iperfenilalani-nemia da deficit di fenilalanina idrossilasi possono essere responsivi a dosi farmacologiche di BH4, cofattore della fenilalanina idrossilasi. Tali pazienti mostravano una riduzione dei livelli della fenilalanina del 30% dopo una somministrazione di BH4 di 20 mg/Kg. Circa il 20-60% dei pazienti con iperfenilalaninemia risultano responsivi alla terapia con il cofattore (Macdonald et al., 2011).La sapropterina diidrocloruro (Kuvan ®), una formulazione sintetica del 6R-isomero della tetraidrobiopterina, è stata recentemente ap-provata in Europa per il trattamento dei pazienti con iperfenilalani-nemia o fenilchetonuria di età superiore ai 4 anni.Il trattamento con BH4 consiste in una singola somministrazione giornaliera alla posologia di 5-20 mg/Kg/die.Fra i soggetti responsivi, principalmente affetti dalla forma “lieve”, un numero ridotto di pazienti è in grado di mantenere il range te-rapeutico dei livelli della fenilalanina (2-6 mg/dl in età pediatrica) solamente con la dietoterapia; la maggior parte dei pazienti, pur con un’aumentata tolleranza (compresa fra i 500 e 1000 mg di fenilala-nina al giorno), devono associare alla terapia il trattamento dietetico.Nei follow-up a breve termine non sono stati segnalati effetti collate-rali importanti legati alla somministrazione della BH4.Sicuramente la terapia con BH4 ha portato, nel gruppo dei soggetti responsivi, ad un sostanziale miglioramento della qualità di vita ed è attualmente una valida terapia alternativa alla dietoterapia. La BH4 può pertanto essere definita uno chaperone farmacologico. Dato l’elevato costo della BH4 e la sua scarsa efficacia in alcuni pazienti con PKU classica è stata avviata la ricerca di chaperone molecolari alternativi. In particolare due composti sono stati identificati: la ben-zil-idantoina e il 6-amino-5-(benzilamino)-uracile; essi incrementa-no l’ossidazione delle fenilalanina e riducono la sua concentrazione ematica in vivo nel topo (Santos-Sierra et al., 2012). Fenilalanina ammonia liasi: la fenilalanina ammonia liasi (PAL) tra-sforma la fenilalamina in acido trans-cinnamico, metabolita che presenta una tossicità molto bassa e che non presenta effetti embri-otossici a livello animale (Fig. 2).L’acido trans-cinnamico è trasformato nel fegato in acido benzoico, che viene eliminato con le urine principalmente come acido ippurico.Dopo i numerosi studi sul topo, la somministrazione dell’enzima per

via sottocutanea alla dose di 0.1 mg/Kg ha ridotto i livelli della feni-lalanina in pazienti con fenilchetonuria.Studi clinici attualmente in corso (fase 2 terminata e fase 3 pro-grammata per i primi mesi del 2013) stanno valutando l’efficacia e la sicurezza del prodotto a dosi ripetute di PAL.Nello stesso tempo sono in corso studi per valutare l’efficacia della PAL per via orale (Kang et al., 2010).Contrariamente alla terapia con BH4 che sembra avere effetto sola-mente in un numero esiguo di pazienti con fenilchetonuria classica, la terapia con PAL potrebbe essere in un futuro prossimo un effettivo trattamento per questo gruppo di pazienti e nei pazienti non respon-sivi alla BH4.Terapia genica: un gene funzionale ricombinante, in questo caso il gene della PAH, viene introdotto nel fegato o in altri tessuti, utilizzan-do differenti vettori: questi comprendono vettori nonvirali, adenovi-rus ricombinanti e retrovirus ricombinanti.Nell’approccio in vivo i vettori vengono infusi direttamente nella cir-colazione portale o sistemica.I differenti vettori ed approcci sono stati valutati nella loro potenziali-tà ad attivare la funzione della PAH negli epatociti del topo con deficit di PAH (Yagi et al., 2012). Ad oggi, come nella precedente revisione, la loro applicazione in vivo, è sempre limitata dalla loro bassa efficacia e dalla transitoria efficacia.Proseguono gli studi per individuare nuovi vettori con una efficacia più duratura.Nella tabella III sono riassunti i nuovi approcci terapeutici e la loro applicazione: nell’uomo, ad esclusione della terapia genica, tutte le altre terapie alternative alla dieta sono utilizzate.

Leucinosi

La leucinosi o malattia delle urine a sciroppo d’acero (MSUD) è cau-sata dal deficit del complesso enzimatico coinvolto nel processo di decarbossilazione ossidativa dei chetoacidi (BCKD) che risultano dalla transaminazione dei tre aminoacidi ramificati leucina, isoleu-cina e valina (BCCA).La leucinosi sulla base del quadro clinico e biochimico viene classi-ficata in 5 forme: una “classica” forma grave neonatale, una forma “intermedia”, una forma “intermittente”, una forma “tiamino-respon-siva” e una forma dovuta al deficit della diidrolipoil deidrogenasi (E3).

Figura 1.Gli aminoacidi neutri (LNAA), saturando i trasportatori disponibili, ridu-cono il trasporto della Fenilalanina (Phe) a livello cerebrale.

Figura 2.La PAH converte la fenilalanina in tirosina utilizzando come cofattore

la BH4 (A)La PAL trasforma la fenilalanina in acido trans-cinnamico che viene metabolizzato nel fegato in acido benzoico (B).

R. Cerone et al.

200

I pazienti con la forma grave neonatale, dopo un periodo di benes-sere che può variare da poche ore ad alcune settimane, presentano una sintomatologia caratterizzata da rifiuto dell’alimentazione, son-nolenza a cui fa seguito un coma progressivo. In concomitanza con l’inizio della sintomatologia i pazienti eliminano urine con un odore caratteristico che ricorda quello dello sciroppo d’acero (dolce e ca-ramellato). Da qui la denominazione anglosassone di Maple Syrup Urine Disease (MSUD).Nella forma intermedia il quadro clinico è caratterizzato da ritardo mentale e/o convulsioni e possono non avere episodi di scompen-so metabolico. L’attività enzimatica residua è maggiore rispetto alla forma classica, ed è compresa fra il 3 e il 30% della normale attività.I pazienti con forma intermittente presentano uno sviluppo psico-motorio e una crescita staturo-ponderale nella norma, ma sono a ri-schio di scompenso metabolico acuto in occasioni di episodi febbrili intercorrenti e in tutte le situazioni di stress.L’attività enzimatica è compresa fra il 5 e il 20%.Nella forma tiamino-responsiva il quadro clinico è sovrapponibile a quello della forma intermedia ma i pazienti con questa forma rispon-dono a dosi farmacologiche di tiamina a dosaggi molto variabili e compresi tra i 10 e i 1000 mg/die.La forma, infine, dovuta al deficit di diidrolipoil deidrogenasi si carat-terizza per un quadro clinico simile a quello della forma intermedia ma è presente una grave acidosi metabolica.In tutte le forme di leucinosi il quadro biochimico presenta una mar-cato aumento nel sangue degli aminoacidi ramificati (leucina, valina, isoleucina) sempre accompagnato da un aumento dell’alloisoleucina (marker patognomonico) e da una marcata eliminazione dei cheto-e idrossiacidi a catena ramificata.Il trattamento a lungo termine si basa su una dieta ad apporto cal-colato e ridotto di leucina.Una recentissima pubblicazione ha proposto una terapia con sodio fenilbutirrato, farmaco abitualmente utilizzato nei difetti del ciclo dell’urea (Brunetti-Pierri et al., 2011).

Tale terapia è stata proposta sulla base dell’osservazione clinica che pazienti con difetti della ciclo dell’urea in trattamento con sodio fe-nilbutirrato presentano una selettiva riduzione dei livelli plasmatici dei BCCA, nonostante un adeguato apporto proteico.Su queste basi gli autori hanno posto in terapia con sodio fenilbutir-rato 5 pazienti con MSUD con una riduzione dei valori della leucina compresa fra il 28 e il 34% rispetto al valore basale e una stabilità del quadro clinico sovrapponibile a quello in dietoterapia.Se confermato in ulteriori trial il fenilbutirrato potrebbe rappresenta-re in futuro un potenziale trattamento aggiuntivo nei pazienti affetti da leucinosi.

Difetti del ciclo dell’urea

I difetti del ciclo dell’urea, come è noto, possono essere causa di gravi episodi di iperammoniemia, pericolosi per la vita del paziente.Durante gli episodi di scompenso metabolico, oltre all’interruzione dell’apporto proteico con un adeguato apporto calorico e supple-mentazione con arginina, vengono utilizzati farmaci, quali benzoato e fenilbutirrato, che favoriscono l’escrezione dell’azoto attraverso vie alternative.Da pochi anni sono stati introdotti in Italia due farmaci da utilizzare nel trattamento degli episodi di scompenso metabolico acuto: som-ministrabili per via e.v. e contenenti sia sodio fenilacetato che sodio benzoato (Ammonul ®).Il sodio fenilacetato è un composto metabolicamente attivo che si coniuga per acetilazione con la glutamina nel fegato a formare feni-lacetilglutamina, poi escreta attraverso i reni per filtrazione glome-rulare e secrezione tubulare. Una mole di fenilacetato rimuove due moli di azoto.Anche il sodio benzoato è un composto metabolicamente attivo che coniugandosi con la glicina per formare ippurato, viene anch’esso escreto per filtrazione glomerulare e secrezione tubulare. In questo caso ciascuna mole di benzoato rimuove una mole di azoto.La rimozione di glutamina da parte del fenilacetato è di notevole importanza, essendo proprio la glutamina il metabolita neurotossico.La pronta disponibilità sia di sodio benzoato sia di sodio fenilacetato in forma attiva permette di rimuovere rapidamente ed efficacemente l’iperammoniemia.Il secondo farmaco, a disposizione in Italia, viene utilizzato sotto forma di capsule contenenti ciascuna 200 mg di acido carglumico (Carbaglu ®) ed è di particolare efficacia nel trattamento dell’ipe-rammoniemia da difetto di N-acetilglutamato sintasi, un raro difetto enzimatico del ciclo dell’urea. Oggi è approvato l’utilizzo dell’acido carglumico nell’iperammoniemia associata alle “classiche” organi-co acidurie (Nordenstrom et al., 2007).

Tabella III. Strategie di trattamento per la fenilchetonuria e sue applicazioni.

in vitro in vivo nell’uomo

Terapia genica sì sì no

Terapia con fenilalanina ammonia liasi no sì sì

Supplementazione con aminoacidi neutri

no sì sì

Terapia con BH4 no sì sì

Le malattie metaboliche ereditarie continuano a rappresentare un capitolo rilevante nell’ambito della patologia pediatrica.L’applicazione della massa tandem (MS/MS) allo screening neonatale ha permesso di espandere significativamente il panel di malattie evidenziabili in epoca neonatale.Sono state individuate in questi ultimi anni ulteriori nuove malattie metaboliche con presentazione neurologica.In tema di terapia il trapianto di fegato o di epatociti e l’impiego di alcuni farmaci nuovi hanno permesso di individuare nuove strategie di trattamento che hanno dato stimolanti risultati.

Box di orientamento


201

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** In questo lavoro viene proposto per la prima volta l’utilizzo del fenilbutirato nel trattamento dei pazienti affetti da leucinosi.

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** Vengono valutati i risultati del trapianto di fegato in una ampia casistica di pazienti affetti da leucinosi.

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** Importante lavoro che descrive un nuovo difetto del metabolismo dei folati.

Corrispondenza

Roberto Cerone, Centro Regionale di riferimento per gli screening neonatali e la diagnosi delle malattie metaboliche dell’Università, Istituto Giannina Gaslini, Largo Gaslini 5, 16148 Genova. Tel. +39 010 5636369. Fax +39 010 3773210. E-mail: [email protected]


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IntroduzioneI mitocondri, organuli presenti in tutte le cellule eucariotiche, sono la maggior fonte di adenosina trifosfato (ATP), il “carburante” del-le cellule, sintetizzato attraverso il processo della fosforilazione ossidativa (OXPHOS). L’OXPHOS è svolta dalla catena respiratoria mitocondriale (MRC) composta di complessi multi-eteromerici lo-calizzati nella membrana mitocondriale interna (MIM). I mitocon-dri contengono un proprio DNA (mtDNA), che, nelle specie ses-suate, è trasmesso esclusivamente attraverso la linea materna. Il DNA mitocondriale umano, codifica 13 proteine e 24 RNA (22 tRNA e 2 rRNA), essenziali per la sintesi proteica mitocondriale. Le subunità codificate dal DNA mitocondriale interagiscono con più di 70 subunità codificate dal DNA nucleare per formare quattro dei cinque complessi della MRC. Mutazioni nei geni mitocondriali, o in geni nucleari correlati alla OXPHOS, possono portare ad una insufficienza energetica causata dal deficit di ATP, e all’insorgenza di una malattia mitocondriale.Il buon funzionamento dei diversi tessuti ed organi del corpo uma-no dipende dall’adeguata produzione di ATP, specialmente quando la richiesta energetica è cospicua, come nei neuroni e nelle cel-

lule muscolari scheletriche. Ciò spiega perchè disfunzioni primi-tive dei mitocondri causino solitamente neuro-degenerazione o miopatia in bambini ed adulti. Tuttavia, le malattie mitocondriali possono coinvolgere ogni altro organo, sia singolarmente sia in associazione con muscolo e cervello. Individualmente rare, prese nel complesso le malattie mitocondriali risultano tra le più fre-quenti malattie genetiche neurologiche, con una prevalenza mi-nima superiore a 1 su 5000 individui nella popolazione europea (Schaefer et al., 2004).In più del 50% dei pazienti adulti e in una percentuale ancora mag-giore di pazienti pediatrici non si è ancora in grado di giungere alla definizione genetica, e la diagnosi si basa esclusivamente sui risul-tati biochimici e/o morfologici nei campioni di muscolo scheletrico e, più raramente, di fibroblasti cutanei in coltura. La mancanza di una diagnosi genetica impedisce ai genitori di ottenere un’affidabile diagnosi prenatale. L’analisi del DNA mitocondriale è una procedura relativamente ben standardizzata offerta da diversi centri speciali-stici; tuttavia, la lista dei geni malattia di origine nucleare, associati a patologie mitocondriali, è costantemente in crescita, tanto da ren-dere le procedure diagnostiche e i percorsi diagnostico-terapeutici

Encefalopatie mitocondriali infantili

Daria Diodatoa, Anna Ardissoneb, Graziella Uzielb, Daniele Ghezzia, Massimo Zevianiaa Unità di Neurogenetica Molecolare, Fondazione Istituto Neurologico Carlo Besta (IRCCS), MilanobUnità di Neurologia Pediatrica, Fondazione Istituto Neurologico Carlo Besta (IRCCS), Milano

SommarioI mitocondri sono organuli, presenti in tutte le cellule eucarioti, deputati alla produzione di energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP), prodotto a livello della membrana mitocondriale interna attraverso il processo della fosforilazione ossidativa, effettuato da cinque complessi multieteromerici (I-V) che costituiscono la catena respiratoria mitocondriale. Il deficit energetico, conseguente alla disfunzione mitocondriale, esita spesso in gravi encefalopatie ad esordio nell’infanzia o nell’adolescenza. Le malattie mitocondriali sono caratterizzate da un’estrema eterogeneità sia clinica che genetico-molecolare. La lista dei geni malattia responsabili di queste patologie è in costante crescita, grazie anche alle tecniche di sequenziamento di nuova generazione. Ciò rende il percorso diagnostico particolarmente difficile, no-nostante sia di grande importanza arrivare ad una diagnosi genetica definita per poter fornire un opportuno consiglio genetico familiare ed, eventualmente, una diagnosi prenatale. Questo articolo intende presentare al pediatra una classificazione clinica delle principali encefalopatie mitocondriali ad esordio precoce, riunite in gruppi distinti, sulla base delle caratteristiche clinico-radiologiche più salienti, e al profilo biochimico e genetico. I gruppi nosologici principali comprendono (i) sindromi da deplezione del DNA mitocondriale, (ii) malattia di Leigh, (iii) leucoencefalopatie, (iv) encefalo-cardiomiopatie, e (v) un quinto gruppo che raccoglie “disordini miscellanei”, caratterizzati da ampia variabilità fenotipica. Commenteremo inoltre l’importanza della gestione dei piccoli pazienti con patologie mitocondriali, basata sull’approccio multidisciplinare, ed infine delle strategie terapeutiche attuali, la cui base razionale si fonda sulla crescente conoscenza dei meccanismi patogenetici del danno cellulare conseguenti alla disfunzione mitocondriale.

SummaryMitochondria are organelles responsible for energy supply to eukaryotic cells, based on the production of adenosine triphosphate (ATP), through the process of oxidative phosphorylation, which is carried out by the mitochondrial respiratory chain (MRC), composed by five multi-heteromeric complexes embedded in the inner mitochondrial membrane. The energy loss due to mitochondrial dysfunction often leads to severe encephalopathy with onset in infancy or early childhood. Both clinical features and genetic causes of mitochondrial disease are extremely heterogeneous. The list of known genes associated to these conditions is steadily increasing, and has recently further boosted by the systematic use of next generation sequencing technology. Hence, the diagnostic work-up can be very difficult; however, the achievement of a molecular definition for a given disease entity is the ultimate goal for the diagnostic investiga-tion, since this information allows the physician to offer reliable family counselling, including prenatal diagnosis. This review, intended for the paediatric practitioner, has been organized according to clinical classification of early onset mitochondrial encephalopathies, based on the clinical-radiological hall-marks of the diseases, and on the corresponding biochemical and genetic profiles. The main nosological groups include: i) mtDNA depletion syndromes; ii) Leigh disease; iii) leukoencephalopathies; iv) encephalocardiomyopathies; and (v) miscellaneous disorders, encompassing a large group of phenotypically heterogeneous syndromes. We will also comment the importance of clinical management of children with mitochondrial disorders, based on a multidis-ciplinary approach, and will discuss the currently vailable treatments, the rational basis of which is linked to increasing knowledge of the pathogenetic mechanisms underlying mitochondrial dysfunction.

encefalopatie mitocondriali infantili

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molto difficili. Inoltre, l’identificazione di nuovi geni malattia è resa difficoltosa dalla limitata disponibilità di famiglie informative. Nuove tecnologie di sequenziamento nucleotidico ad alta efficienza, come il sequenziamento esomico, offrono ora l’opportunità di ridurre il di-vario tra diagnosi biochimica e genetica.Questa review è focalizzata sulle patologie mitocondriali che si pre-sentano nei primi anni di vita con un coinvolgimento prevalente del sistema nervoso centrale. Per la presentazione delle diverse cate-gorie e sindromi nosologiche seguiremo la classificazione riportata nella tabella I, che è organizzata secondo criteri prevalentemente clinici. La ricerca degli articoli è stata condotta utilizzando PubMed come motore di ricerca con parola chiave “Early onset mitochondrial en-cephalopathies”, in un intervallo di tempo compreso tra il 1990 ed il 2011. Gli articoli sono stati scelti sulla base della pertinenza e della rilevanza rispetto al tema della review. Sono stati inclusi, inoltre, articoli pertinenti pubblicati dal nostro gruppo negli ultimi anni. La descrizione degli approcci terapeutici è basata su articoli che de-scrivono trials clinici controllati o strategie terapeutiche sperimentali supportate dalle recenti evidenze in campo genetico-molecolare.

Sindrome di Alpers-Huttenlocher e sindromi da deplezione del DNA mitocondriale

Quadro clinico

Questa patologia è caratterizzata da diffusa degenerazione della so-stanza grigia del cervello, associata ad un grado variabile di coinvol-gimento del fegato (dal semplice aumento dei livelli plasmatici degli enzimi epatici fino a grave epatopatia a rapida evoluzione cirroge-na). L’esordio è generalmente nella prima infanzia o adolescenza, con sintomi, quali ipotonia e crisi epilettiche resistenti alla terapia. La terapia con acido valproico è da evitare, poiché può precipitare il quadro epatopatico. Lo “stato epilettico” è un’evoluzione frequente di questa condizione. Nella maggior parte dei pazienti con esordio pre-coce il decorso della malattia è rapidamente progressivo con morte generalmente entro i tre anni d’età. La risonanza magnetica cerebrale mostra una grave atrofia subcorticale, ma è frequente il coinvolgimen-to di strutture nucleari profonde, particolarmente dei talami.

Genetica molecolare

La malattia è trasmessa con modalità autosomica recessiva; il fe-

Tabella I. Classificazione delle encefalopatie mitocondriali secondo criteri clinici.

Malattia Caratteristiche cliniche Deficit CR Genotipo

Sindrome Di Alpers-Huttenlocher e Epatoencefalopatie

Atassia spino cerebellare ad esordio precoce (IOSCA)

Encefalopatia precoce e progressiva con atrofia corticale e sottocorticale. Epilessia ad esordio precoce. Segni di epatopatia

Complesso I, III, IVComplesso IVDeficit multiplo

Complesso I

POLG1, DGOUK, MPV17SCO1EFG1

TWINKLE

Malattia di Leigh

Variante franco-canadese

Esordio nella prima infanzia con lesioni simmetriche della sostanza grigia profonda. Ipotonia, difficoltà di accrescimento, vomito ricorrente, alterazione dei movimenti oculari, atassia, distonia, neuropatia periferica, disfagia, difficoltà respiratorie

Complesso I

Complesso IIComplesso IIIComplesso IVComplesso VDeficit multiploComplesso IV

MTND2, MTND3, MTND5, MTND6NDUFS1, NDUFS3, NDUFS4 NDUFS7, NDUFS8, NDUFA2, NDUFV1, NDUFAF2, C8ORF38, C20ORF7, FOXRED1SHDAUQCRQSURF1, COX10, COX15, TACO1MTATP6EFG1, C12ORF65LRPPRC

Leucoencefalopatie

LBSL*

Esordio neonatale o nella prima infanzia con anomalie della sostanza bianca +/- alterazioni corticali.Ritardo psicomotorio, tetraparesi spastica, atassia, ritardo mentale, sordità, cecità

Complesso IComplesso IIComplesso IVComplesso I, III

Nessuno

NUBPL, NDUFV1SDHAF1COX6B1, SURF1TUFM

DARS2

Encefalocardiomiopatie Esordio neonatale.Cardiomiopatia ipertrofica, miopatia grave e/o ipotonia centrale, difficoltà di crescita e precoce distress respiratorio. Esito fatale nel 1 mese, o ritardo psicomotorio + vari segni neurologici. RM aspecifica.

Complesso I

Complesso IIComplesso IV

NDUFS2, NDUFV2,NDUFA11, NDUFAF4, ACAD9SDHASCO2, COX15

Cardiomiopatia Complesso VNon riportati

TMEM70, SLC25A3DNAJC19, TAZ

* LBSL: leucoencefalopatia con coinvolgimento del tronco-encefalo e del midollo spinale con aumento del lattato.

D. Diodato et al.

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gato e, più raramente, il muscolo, presentano deplezione del mtDNA che può, nel fegato, raggiungere livelli drammatici, >90%. Mutazioni in POLG1 sono la causa più frequente di questa grave encefalopatia (Naviaux et al., 1999, Naviaux et al., 2004). POLG1 codifica per la subunità A della polimerasi mitocondriale. La sindrome di Alpers-Huttenlocher si trova all’estremo di uno spettro clinico riferibile a mutazioni di POLG1, che comprende anche l’epilessia ed atassia spino cerebellare ad esordio giovanile (SCAE) e la sua variante, atas-sia sensitiva, sordità neurosensoriale, oftalmoplegia (SANDO, OMIM 607459), l’oftalmoplegia esterna progressiva (PEO) cronica ad esor-dio adulto, che può venire trasmessa sia come tratto autosomico re-cessivo (ar) che autosomico dominante (ad) (OMIM #258450; OMIM #157640) con o senza segni aggiuntivi come ad esempio la miopatia generalizzata, la neuropatia periferica sensitivo-motoria, il parkinso-nismo, o i disordine bipolari, la menopausa precoce, le insufficienze poliendocrine, ecc. Le sindromi PEO associate a mutazioni in POLG1 sono caratterizzate dall’accumulo di delezioni multiple del mtDNA nel muscolo scheletrico (e anche nel cervello). Questa è una carat-teristica molecolare comune delle PEO a trasmissione mendeliana, a prescindere dalla causa genetica primaria, che risiede in mutazioni in geni nucleari che controllano l’integrità del DNA mitocondriale (ad es. l’elicasi del mtDNA, detta Twinkle, il traslocatore ATP-ADP mu-scolare, oltre, naturalmente, a POLG1).La deplezione epato-cerebrale del mtDNA è una sindrome da deple-zione mitocondriale, MDS che, oltre a POLG1, può essere causata da mutazioni in almeno altri due geni nucleari, codificanti, rispetti-vamente, la deossiguanosina chinasi (DUOGK) (Salviati et al., 2002) e MPV17 (Spinazzola et al., 2006). In questi pazienti il coinvolgimen-to epatico prevale sul coinvolgimento neurologico, determinando un’importante acidosi metabolica connatale, o neonatale, con epi-sodi di grave ipoglicemia, ed epatopatia rapidamente progressiva ad evoluzione cirrotica, ed exitus. DGUOK codifica per dGK, la deossi-guanosina chinasi che ricicla i nucleosidi purinici ai rispettivi nucleo-tidi monofosfato mediante fosforilazione. L’attività deficitaria di dGK e del suo partner enzimatico specifico per i nucleosidi pirimidinici, la timidina chinasi 2, TK2, determina una riduzione e “squilibrio” dei nucleotidi mitocondriali, i “mattoni” per la costruzione di nuovo mtDNA, risultante nella deplezione dello stesso. Per ragion ancora poco chiare, mutazioni in TK2 causano una MDS prevalentemente a carico del muscolo e del cervello a esordio precoce, mentre il fegato risulta indenne (variante 2, OMIM 609560).

Encefalopatia di Leigh: malattia di Leigh (LD)

Quadro clinico

Si tratta della più frequente encefalopatia mitocondriale dell’infanzia e adolescenza. La malattia di Leigh è definita in primis come entità neuropatologica e neuroradiologica, essendo caratterizzata da lesio-ni focali bilaterali in una o più aree della sostanza grigia profonda, incluso il midollo spinale rostrale, il tronco encefalico, il talamo, il cervelletto e i gangli basali. Le lesioni consistono in aree di demieli-nizzazione, gliosi, necrosi con vacuolizzazione spongiforme e proli-ferazione capillare. Nella maggior parte dei casi la malattia di Leigh è la via finale comune di un danno primario nel sistema bioenergetico delle cellule nervose nel cervello in sviluppo. Questo spiega anche perché l’acidosi lattica, dovuta al blocco nella respirazione cellulare, è sempre presente anche se di variabile gravità. I segni neurologici consistono inizialmente in ipotonia e regressione psicomotoria, se-guiti da esordio variabile di distonia, movimenti involontari, atassia ed eventualmente tetraparesi spastica. Anche se il sistema nervoso,

incluso il muscolo scheletrico, è la struttura di gran lunga più colpita, in rari casi vi può essere un interessamento extraneurologico, sot-to forma, ad esempio, di cardiomiopatia ioertrofica, o di nefropatia, spesso causata da insufficienza del tubulo prossimale renale, nel quadro di una sindrome di De Toni-Debrè-Fanconi. Altri, frequenti, segni extraneurologici sono il ritardo di crescita staturo-ponderale, l’irsutismo, particolarmente nei casi dovuti a mutazioni di SURF1, e il vomito ricorrente, spia di episodici aggravamenti dell’acidosi lattica.

Genetica molecolare

Un deficit grave d’attività in ciascuno dei complessi della MRC può determinare la LD (OMIM 256000). In particolare, si possono distin-guere le seguenti categorie di difetti biochimico/molecolari: 1) difetti isolati di complesso I (Fig. 1A-B); 2) difetti isolati di complesso IV; 3) difetti multipli della MRC; 4) mutazioni nell’ATPasi 6, una subunità del complesso V codificata dal mtDNA. Nella nostra esperienza, il deficit del complesso piruvico deidrogenasi (PDHC) è causa piuttosto frequente di LD, anche se può causare quadri encefalopatici precoci meno specifici, con caratteristiche cliniche e neuroradiologiche che differiscono da, o si sovrappongono solo parzialmente, a quelle ti-piche della LD.

Difetti del complesso IIl complesso I (NADH deidrogenasi ubichinone-ubichinolo reduttasi) catalizza l’ossidazione del nicotinamide adenin-dinucleotide ridotto (NADH) accoppiata alla riduzione dell’ubichinone (CoQ) a ubichinolo.

Figura 1. (A, B): Risonanza magnetica di un paziente con fenotipo Leigh e deficit del complesso I da mutazione del gene ND5 13514 A>G: sezione coro-nale in FLAIR (A) e assiale in T2 (B) dimostrano un alterazione bilaterale dei caudati e putamina. (C, D): Risonanza magnetica di un paziente con leucoencefalopatia mitocondriale da difetto del complesso II dovuta a mutazione 169C>G del gene SDHAF1: C sezione coronale in FLAIR (C) e assiale in T2 (D) con iperintensità di segnale che coinvolge la sostan-za bianca lobare anteriore e posteriore, il corpo calloso e la sostanza bianca cerebellare.


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Il complesso I consiste di circa 45 subunità (Carroll et al., 2006), delle quali sette codificate dal genoma mitocondriale mentre le altre dai geni nucleari. La LD è stata associata a diverse mutazioni che colpiscono sia le subunità codificate dal mtDNA (ad es. MTND2 o MTND5) sia a quelle codificate dal DNA nucleare (ad es. NDUFS1 e NDUFA1), ed anche a mutazioni in fattori di assemblaggio specifici per il complesso I.

Difetti del complesso IVMutazioni nei geni che codificano fattori d’assemblaggio del com-plesso IV (citocromo c ossidasi, COX) sono la causa principale di difetti del complesso IV. Trattandosi di proteine a cdifica da geni nu-cleari, sono patologie trasmesse come tratto autosomico recessivo, e si presentano nella prima infanzia con un quadro di LD.Le mutazioni più frequentemente riportate in letteratura sono a ca-rico di SURF1, una proteina coinvolta nella formazione dell’olocom-plesso IV (Tiranti et al., 1998). Molto più rare sono le mutazioni in COX10 (Valnot et al., 2000) e COX15 (Antonicka et al., 2003), due enzimi coinvolti nella biosintesi del gruppo eme COX-specifico, e in TACO1 (Weraarpachai et al., 2009), fattore indispensabile per l’effi-ciente traduzione della subunità 1 della COX, che costituisce la pri-ma tappa nella formazione del complesso IV.

Difetti del complesso VL’ATP sintasi (complesso V) comprende una porzione integrale di membrana, la particella F0, ed una porzione periferica, F1. Due pic-cole ma essenziali proteine della porzione F0, le ATPasi 6 e 8, sono codificate dal mtDNA.La mutazione più frequente del complesso V è la trasversione nucleoti-dica T8993T>G nel gene codificante ATPasi 6. A seconda della percen-tuale di mutazione rispetto alla quota selvatica (eteroplasmia) presente nei tessuti critici, particolarmente il sistema nervoso, la mutazione può determinare una grave forma di LD, a trasmissione materna ed esor-dio infantile (MILS), o una condizione meno grave, detta NARP (astenia neurogena, atassia, retinite pigmentosa; OMIM 551500), ad esordio giovanile o in età adulta. La MILS tipicamente si riscontra quando la mutazione 8993T>G è presente in percentuale >90%, mentre la NARP è comunemente associata a percentuali intorno al 50%-60%.

Leucoencefalopatia mitocondrialeLe alterazioni di segnale RM prevalenti o esclusive nella sostanza bianca, con minima o assente alterazione di segnale nei gangli della base o nel tronco cerebrale, comprendono circa il 20% dei nostri 320 casi infantili di patologia mitocondriale. La leucoencefalopatia mitocondriale dell’infanzia è spesso associata a difetti del complesso I o del complesso II, sebbene alcuni rari pazienti con deficit di COX e mutazioni in SURF1 possano presentarsi con lesio-ni prevalentemente di tipo leucoencefalopatico (Rahman et al., 2001). A prescindere dal difetto biochimico, due sono le principali presenta-zioni cliniche: 1) deficit psicomotorio precocissimo e ritardo di crescita, seguiti da rapido peggioramento esitante in tetraparesi spastica con grave ritardo mentale; 2) un quadro caratterizzato da un periodo libero da malattia durante i primi anni di vita, seguito dall’esordio acuto di sin-tomi focali motori e/o crisi epilettiche e decorso lentamente progressi-vo. La diagnosi differenziale, primariamente basata sulle caratteristiche RM, deve considerare lo spettro delle leucoencefalopatie ad esordio precoce, incluse la malattia di Alexander, la malattia di Canavan, la leu-coencefalopatia megaencefalica con cisti sottocorticali, e la vanishing white matter disesase. Un aiuto alla diagnosi differenziale viene dalla spettroscopia protonica cerebrale, che può ben evidenziare l’accumulo

di lattato anche nelle regioni cerebrali non ancora anatomicamente al-terate e quindi non rilevabili alla RM standard.La leucoencefalopatia, associata a deficit specifico del complesso I è cau-sata da mutazioni nelle subunità strutturali o nei fattori di assemblaggio. Per esempio, mutazioni in NDUFV1 o in NDUFS1, possono causare leu-codistrofia ed epilessia mioclonica (Schuelke et al., 1999), oltre alla LD.

Encefalocardiomiopatie mitocondriale

L’encefalocardiomiopatia è una grave, sindrome mitocondriale spesso fatale nella prima infanzia. I piccoli sono di solito gravemente ammalati già alla nascita, con deficit della funzione di pompa car-diaca ed acidosi lattica. Le caratteristiche cliniche includono cardio-miopatia ipertrofica, ipotonia, ritardo di crescita, e precoce distress respiratorio.La risonanza magnetica è piuttosto aspecifica, mostrando in genere anomalie non specifiche d’intensità di segnale nella sostanza bianca periventricolare e, talora, dei nuclei grigi profondi. Il decorso clinico può essere fulminante, mentre i pazienti che sopravvivono ai pri-mi mesi di vita possono sviluppare un ritardo psicomotorio, e segni quali nistagmo, deficit cognitivo, atassia e miopatia. Spesso sono presenti alti livelli di lattato nel plasma, nel liquor e nelle urine. Come nella maggior parte delle patologie mitocondriali ad esordio precoce, la biopsia muscolare non è dirimente e soltanto l’analisi biochimica nel muscolo può portare alla diagnosi.

Genetica molecolare

I difetti biochimici più frequentemente riscontrati colpiscono il com-plesso I, il complesso IV o il complesso V. ACAD9 codifica per una acil-CoA deidrogenasi mitocondriale che ha verosimilmente un ruolo marginale nella beta ossidazione degli acidi grassi, ma è direttamente coinvolto nell’assemblaggio del complesso I, interagendo con altri fattori come ECSIT e FoxRed (Nouws et al., 2010); mutazioni in ACAD9 sono tipicamente associate a grave acidosi lattica connatale, a volte fatale, seguita da cardiomiopatia ipertrofica. Mutazioni in SCO2 e COX15, due fattori d’assemblaggio della COX, sono state descritte in pazienti con, rispettivamente, cardio-ence-falopatia e cardiomiopatia infantile a decorso fatale (Böhm et al., 2006).Mutazioni in TMEM70, che si suppone sia un fattore d’assemblag-gio del complesso V, sono state trovate in pazienti, prevalentemente d’origine ROM, con cardiomiopatia e deficit isolato di ATP-sintasi (CÍzkova et al., 2008).La sindrome di Barth, cardiomiopatia dilatativa, neutropenia e au-mentata escrezione di 3-metilglutaconico (OMIM 302060) è causata da mutazioni in TAZ, un gene X-linked che codifica per l’acil Co-A sintetasi cardiolipina specifica (tafazzina) cruciale per l’integrità dei complessi della MRC nella membrana interna mitocondriale, MIM (Schlame et al., 2000).

Miscellanea

Un gran numero di encefalopatie mitocondriali che non rientrano tra le presentazioni cliniche tipiche sono raccolte in un gruppo molto etero-geneo di patologie neurologiche (Tab. II). Alcune sono molto rare, es-sendo state descritte solo in singole famiglie o in popolazioni isolate. A dispetto della loro rarità, questi disordini ben illustrano la complessa relazione tra disfunzione mitocondriale e patologia umana. I neurologi pediatri e i pediatri clinici devono essere consapevoli della loro esisten-za, in modo da poter meglio indirizzare l’indagine molecolare.

D. Diodato et al.

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Diagnosi

Segni e sintomi clinici come il vomito ricorrente, alterazioni della motilità oculare, ipotonia, crisi epilettiche focali, difficoltà di accre-scimento e ritardo o regressione psico-motoria sono segni evocativi, seppur aspecifici, di patologia mitocondriale; l’analisi dei livelli di lattato e la risonanza magnetica sia di imaging che spettroscopica

risultano spesso alterati nelle encefalopatie mitocondriali infantili. A differenza dei pazienti adulti, i livelli di lattato sono di solito au-mentati nei bambini con malattie mitocondriali, sia nel plasma che nel liquor, con valori che concordano con la gravità clinica. Se la risonanza magnetica cerebrale può essere inizialmente normale, durante il decorso della malattia in genere rivela pattern caratteristi-

Tabella II.Caratteristiche di altre encefalopatie mitocondriali.

Gene Funzione della proteina Fenotipo clinico Deficit catena respiratoria Altre caratteristiche biochimiche/molecolari

BCS1L Fattore di assemblaggio cIII Tubulopatia neonatale, epatopatia ed encefalopatia+/- pili torti, accumulo di ferro, facies grossolana, sindrome GRACILE (ritardo di crescita, aminoaciduria, colestasi, accumulo di ferro, acidosi lattica e morte precoce), sindrome di Bjornstand, (sordità congenita neurosensoriale e pili torti)

Complesso III

TTC19 Fattore di assemblaggio cIII Encefalopatia progressiva Complesso III

UQCRB Subunità strutturale cIII Ipoglicemia e acidosi lattica Complesso III

FASTKD2 Dominio FAST kinasi Ritardo sviluppo psicomotorio, emiplegia, epilessia, atrofia cerebrale asimmetrica

Complesso IV

ETHE1 Zolfo-diossigenasi Encefalopatia progressiva, petecchie, acrocianosi, diarrea cronia

Complesso IV Etilmalonico aciduria

SUCLA2-SUCLG1 Sub unità della succinilCoA sintetasi

Sindrome encefalomiopatica da deplezione del mtDNA con metilmalonico aciduria

Difetti multipli Meiltmalonico aciduria – Deplezione mtDNA

AIF Fattore che induce apoptosi Encefalomiopatia Difetti multipli Deplezione mtDNA

MRPS16 Componente dei ribosomi mitocondriali

Agenesia del corpo calloso, caratteristiche dismorfiche, grave acidosi, esito fatale

Difetti multipli Difetto di sintesi delle proteine mitocondriali

RARS2 Arginil tRNA sintetasi Ipoplasia pontocereballare tipo 6

Difetti multipli Difetto di sintesi delle proteine mitocondriali

GFER Componente del sistema di rilascio del disulfide

Miopatia progressiva con cataratta congenita

Difetti multipli

COQ2 Biosintesi coenzima Q10 Encefalo miopatia, nefropatia, epatopatia

Complesso I+III Complesso II+III

Deficit coenzima Q

COQ9 Biosintesi coenzima Q10 Acidosi lattica neonatale, successivo esordio di epilessia farmaco resistente, ritardo di sviluppo, cardiomiopatia ipertrofica, tubulopatia renale

ComplessoII+ III Deficit coenzima Q

PDSS1 Biosintesi coenzima Q10 Esordio precoce di sordità, encefaloneuropatia, obesità

Complesso II+III Deficit coenzima Q

PDSS2 Biosintesi coenzima Q10 Sindrome di Leigh con nefropatia

Complesso II+III Deficit coenzima Q

CABC1 Biosintesi coenzima Q10 Atassia spinocerebellare Complesso I+ III Deficit coenzima Q

APTX Biosintesi coenzima Q10 Atassia aprassia oculomotoria Complesso II +III


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ci e utili all’orientamento diagnostico. Un buon esempio è il pattern di risonanza tipo Leigh, che dovrebbe spingere il neurologo infantile o il pediatra ad eseguire indagini della catena respiratoria e/o del complesso della piruvico deidrogenasi; in altri quadri di risonanza magnetica, come per esempio nel caso della leucoencefalopatia, i difetti di OXPHOS devono venire presi in considerazione nella dia-gnosi differenziale con la malattia di Alexander, la CACH (childho-od ataxia with central hypomyelination), la malattia di Canavan e le forme associate a diversi tipi di aciduria organica. A proposito di quest’ultimo gruppo di patologie, la ricerca degli acidi organici uri-nari è sempre importante; si pensi all’aciduria etilmalonica nei pa-zienti ETHE1, all’aciduria metilglutaconica nella sindrome di Barth, e all’aciduria metilmalonica nei pazienti con mutazioni in SUCLA1 e SUCLG1. Spesso è uno screening negativo degli acidi organici a sug-gerire un difetto della catena respiratoria piuttosto che, ad esempio, della beta-ossidazione, caratterizzato invece da alterazioni piuttosto specifiche del profilo degli acidi organici urinari. A differenza delle encefalopatie mitocondriali ad esordio adulto, in quelle ad esordio infantile l’esame istologico della biopsia muscolare è raramente in-formativo. Le fibre ragged red (rosse stracciate) o un’anomala distri-buzione della colorazione per la succinato deidrogenasi si riscon-trano raramente nei pazienti pediatrici, mentre sono più frequenti alterazioni relativamente aspecifiche, come la sproporzione dei tipi di fibra o una diffusa riduzione della colorazione per la COX.

Gestione del paziente

I medici chiamati a gestire le malattie mitocondriali devono af-frontare numerosi problemi differenti legati all’età dei pazienti e alle diverse presentazioni cliniche. Non esistono, di regola, tera-pie efficaci in grado di bloccare la progressione della malattia. La gestione delle principali manifestazioni della malattia è spesso l’unico approccio in grado di offrire beneficio al paziente ed alla sua famiglia e consiste in trattamenti di supporto quali: 1) cor-rezione dell’acidosi lattica con bicarbonato nella fase acuta dello scompenso metabolico; 2) terapia delle infezioni che possono peg-giorare le già compromesse funzioni neurologiche, 3) prevenzione della disidratazione in occasione di disfagia o vomito ricorrente, 4) trattamento aggressivo delle crisi epilettiche. L’ipotonia, il ritardo psicomotorio e le complicanze artro-scheletriche dovrebbero es-sere trattati con la terapia fisica, la correzione posturale o quella chirurgica. Uno dei problemi principali nei disordini mitocondriali infantili è il difetto di crescita. Questi sintomi possono generare ansia nei genitori, che di solito sviluppano un senso di inadegua-tezza personale o sensi di colpa che influenzano negativamen-te la relazione tra i diversi membri della famiglia e con il piccolo paziente. È importante, inoltre, inquadrare ed affrontare razional-mente i problemi nutrizionali del bambino con malattia mitocon-driale, distinguendo la vera disfagia dal reflusso gastro-esofageo, la dismotilità intestinale, l’anoressia o la debolezza dell’apparato muscolare di supporto alle funzioni digestive ed escretorie. In con-clusione, le malattie mitocondriali, in virtù della loro complessità e del loro interessamento multisistemico richiedono un approccio multidisciplinare (Kisler et al., 2010).

Terapia

Il danno energetico dovuto alla disfunzione mitocondriale si accom-pagna di solito a produzione eccessiva di radicali liberi, a fenomeni di apoptosi cellulare, e in alcuni casi, ad accumulo di sostanze tos-

siche. Tali fenomeni possono costituire l’oggetto di trattamenti ra-zionali. Le strategie disponibili si sintetizzano come segue: (i) evitare l’effetto tossico di alcuni farmaci (valproato, aspirina, antibiotici ami-noglicosidici, medicinali antiretrovirali); (ii) fornire come supplemen-to dosi farmacologiche di coenzimi o vitamine coinvolti nel processo di fosforilazione ossidativa o sostanze che tamponano metaboliti tossici (CoQ10, riboflavina, carnitina, tiamina); (iii) fornire molecole antiossidanti per combattere la produzione di specie reattive dell’os-sigeno (vitamina C, E, acido alfa-lipoico ed N-acetilcisteina).È ben documentato che il dicloroacetato (DCA) abbassa i livelli di lattato in diversi disturbi metabolici. Il DCA mantiene il complesso della piruvico deidrogenasi in forma attiva aumentando così la formazione di acetil-CoA dal piruvato e riducendo la formazione di lattato. Questi effetti bene-fici sembrano limitati alla fase acuta dell’acidosi lattica, mentre l’esposi-zione cronica al DCA è stata associata all’insorgenza di una neuropatia periferica progressiva (Stacpoole et al., 2006). La L-Arginina, che funge da donatore di ossido nitrico, agisce come un vasodilatatore della mi-crocircolazione cerebrale, ed è stata usata con qualche effetto benefico nella MELAS (miopatia mitocondriale con encefalopatia, acidosi lattica e stroke), potendo limitare le conseguenze di episodi simil-stroke acuti e ridurre la loro frequenza (Koga et al., 2005).Tra i diversi cofattori e vitamine usati nelle malattie mitocondriali, il coenzima Q10 e la riboflavina hanno dimostrato la maggiore ef-ficacia. I disordini dovuti a difetti biosintetici del CoQ10 rispondono parzialmente ad alte dosi di ubichinone esogeno. La riboflavina può migliorare le condizioni neurologiche di alcuni pazienti con leuco-encefalopatia dovuti a deficit del complesso I o del complesso II. Il meccanismo d’azione consiste, verosimilmente, nella stabilizzazio-ne di un complesso difettivo, ma parzialmente funzionante, aumen-tando l’apporto del precursore vitaminico del FMN e del FAD, i due gruppi prostetici rispettivamente dei complessi I e II.Molto recentemente, l’uso combinato di metronidazolo ed N-acetilci-steina si è dimostrato parzialmente efficace nel trattamento dell’en-cefalopatia etilmalonica, dovuta a mutazioni del gene ETHE1. L’effetto battericida del metronidazolo sugli anaerobi intestinali e l’aumentata disponibilità di glutatione derivato dall’N-acetilcisteina portano alla diminuzione delle concentrazioni plasmatiche di idrogeno solforato (H2S), un composto altamente tossico prodotto prevalentemente dagli anaerobi intestinali, che non viene detossificato se manca l’attività del-la zolfo-diossigenasi mitocondriale codificata da ETHE1.Il coinvolgimento multisistemico delle patologie mitocondriali ren-de difficile il trapianto d’organo (Dimmock et al., 2008). L’encefalo-patia mio-neuro-gastro-intestinale MNGIE, una malattia che porta all’accumulo di timidina a livelli tossici, ha mostrato un sostanziale miglioramento aumentando la capacità dell’organismo di rimuovere la sostanza tossica attraverso il trapianto di cellule staminali emato-poietiche. In linea di principio, altri disordini caratterizzati dall’accu-mulo di composti tossici, come la stessa encefalopatia etilmalonica, potrebbero essere trattati efficacemente con lo stessa strategia.In conclusione, con poche eccezioni, il trattamento delle encefalopatie mitocondriali ad esordio precoce è ancora inadeguato e la prevenzio-ne, attraverso il consiglio genetico e la diagnosi prenatale, è di prima-ria importanza. La diagnosi prenatale è stata applicata con successo in diversi casi di madri portatrici di mutazioni NARP/MILS (Harding et al., 1992) dal momento che l’eteroplasmia della mutazione T8993G è uniformemente distribuita tra i vari tessuti, inclusi i villi coriali, per cui conferisce un alto valore predittivo alla analisi quantitativa in questo tessuto. L’applicazione dello stesso approccio ad altre mutazioni ete-roplasmiche che invece variano in percentuale da tessuto a tessuto, come la MELAS, è ancora un punto eticamente controverso.

D. Diodato et al.

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* Mutazioni in SURF-1 sono una causa comune di malattia di Leigh associata a deficit di COX. Attraverso studi di complementazione su linee cellulari di pazienti con malattia di Leigh e successiva analisi di linkage questo articolo descrive la scoperta del gene e della sua associazione con questa patologia mitocondriale.

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La causa più frequente di encefalopatie metaboliche dell’infanzia è la disfunzione mitocondriale, la cui caratteristica è il deficit energetico dovuto a difetti del processo di fosforilazione ossidativa, effettuato nei mitocondri. Individualmente rari, come gruppo nosologico gli errori congeniti del metabo-lismo rappresentano una porzione significativa delle encefalopatie ad esordio precoce. A causa della loro rarità ed eterogeneità, le encefalopatie metaboliche sono ancora una difficile sfida per la maggior parte dei medici pediatri. Le nuove tecnologie e la crescente conoscenza delle basi biochimiche e molecolari di queste patologie consentono però già ora, ed ancor più nel pros-simo futuro, a neurologi infantili e pediatri di arrivare alla diagnosi molecolare precoce, indispensabile per il consiglio genetico informato, la gestione del paziente secondo la buona pratica medica, basata sull’evidenza, ed infine l’approntamento di terapie razionali, e sperabilmente efficaci.

Box di orientamento

Corrispondenza

Daria Diodato, U.O. Neurogenetica Molecolare, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico “C. Besta”- sede Bicocca, via Libero Temolo 4, 20126 Milano. Tel. +39 02 2394.2663. Fax +39 02 2394.2619. E-mail: [email protected]


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Introduzione

Le malattie da accumulo lisosomiale (lysosomal storage diseases, LSD) sono un gruppo di malattie metaboliche ereditarie causate da mutazioni in geni che codificano per enzimi, proteine integrali di membrana e proteine di trasporto a localizzazione lisosomiale (Fu-terman and van Meer, 2004). La mutazione di questi geni comporta quindi un difetto di una o più delle diverse funzioni dei lisosomi, organelli subcellulari deputati al turnover e riciclo di una vasta gam-ma di molecole complesse, tra cui sfingolipidi, glicosaminoglicani, glicoproteine e glicogeno.La caratteristica principale delle LSD è pertanto l’accumulo all’inter-no dei lisosomi di questi substrati. In generale l’accumulo si osserva in diversi tessuti e organi. Di conseguenza le manifestazioni feno-tipiche di questi disturbi sono complesse, e caratterizzate dall’as-sociazione variabile di manifestazioni viscerali, oculari, ematologi-che, scheletriche e neurologiche. Queste manifestazioni sono nella maggior parte dei casi responsabili di handicap fisici e neurologici. In particolare, quelle relative al coinvolgimento del sistema nervoso centrale (SNC) possono causare neurodegenerazione progressiva e grave compromissione cognitiva.Attualmente sono note circa 50 LSD che sono tradizionalmente classificate secondo le caratteristiche chimiche del substrato accu-mulato. Anche se ognuna di queste patologie è rara se considerata singolarmente, la loro prevalenza globale è relativamente elevata rispetto ad altri gruppi di malattie rare, ed è stimata in circa 1 su 8.000 nati vivi (Fuller et al., 2006).

Obiettivo

All’interno della revisione sarà fornita una rassegna delle nuove strategie terapeutiche basate sul miglioramento delle conoscenze della fisiopatologia delle malattie lisosomiali.È stata svolta una ricerca attraverso PubMed utilizzando termini chiave come: “lysosomal storage disease; therapy; enzyme repla-cement therapy; substrate reduction; gene therapy; hematopoietic stem cell transplantation”, anche tra loro incrociati. Sono stati sele-zionati articoli originali, revisioni, e linee guida più recenti.

L’interesse delle malattie lisosomiali per il pediatra

Come molte malattie rare le LSD sono meno note ai pediatri genera-listi. Tuttavia la loro prevalenza globale, gli effetti debilitanti delle loro manifestazioni cliniche ed il loro pesante impatto in termini di salute pubblica e di costi assistenziali devono essere motivi di interesse ed attenzione per i tutti pediatri. Il riconoscimento tempestivo di queste malattie, grazie ad un corretto sospetto diagnostico, può consentire di intervenire precocemente quando il fenotipo non è ancora severo. Inoltre, per la necessità di un approccio multidisciplinare alla gestio-ne di queste malattie, esse devono essere ben note anche a tutti gli specialisti coinvolti nell’assistenza dei pazienti con LSD.In aggiunta a questi motivi più squisitamente clinici, un motivo di particolare interesse per le LSD è legato al fatto che soprattutto negli ultimi decenni esse hanno rappresentato un modello per lo svilup-po di approcci terapeutici altamente innovativi, basati su tecnologie molto avanzate e potenzialmente esportabili ad altre malattie gene-tiche (Beck, 2007).

Nuovi approcci terapeutici alle malattie da accumulo lisosomiale

Giancarlo Parenti, Caterina Porto, Roberto Della CasaDipartimento di Pediatria, Università Federico II, Napoli

SommarioLe malattie da accumulo lisosomiale (LSD) sono un gruppo di malattie metaboliche ereditarie causate dal deficit di una delle diverse funzioni lisosomiali. Le LSD sono tipicamente caratterizzate dall’accumulo di substrati complessi in diversi tessuti e organi. Le manifestazioni cliniche di queste malattie sono spesso responsabili di handicap fisici e neurologici. Negli ultimi due decenni la ricerca ed il miglioramento delle conoscenze sulla fisiopatologia delle LSD hanno consentito lo sviluppo di tecnologie e di approcci terapeutici altamente innovativi. Questi approcci comprendono strategie che hanno lo scopo di aumentare l’attività residua dell’enzima mancante, quali il trapianto di cellule staminali ematopoietiche, la terapia enzimatica sostitutiva, la terapia con chaperones farmacologici e la terapia genica, nonché approcci basati sulla riduzione della sintesi del substrato accumulato. I recenti progressi compiuti nel trattamento delle LSD rappresentano un buon modello che potrebbe essere esteso anche ad altre malattie genetiche.

SummaryThe lysosomal storage diseases (LSDs) are a group of inherited metabolic disorders due to the deficiency of any of the lysosomal functions, in most cases of the lysosomal hydrolases. LSDs are typically characterized by the storage of a variety of substrates in multiple tissues and organs and by the variable as-sociation of peculiar clinical manifestations that are often responsible for physical and neurological handicaps. During the past two decades the research in the field of LSDs has made impressive progress, particularly with the development of a variety of innovative therapeutic approaches. These include several strategies aimed at increasing the residual activity of the missing enzyme, such as hematopoietic stem cell transplantation, enzyme replacement therapy, pharmacological chaperone therapy and gene therapy. An alternative approach is based on reducing the synthesis of the stored substrate. More recently the improved knowledge on LSDs pathophysiology has indicated additional targets of therapy. The recent progresses made in the treatment of LSDs represent a good model that may be extended to other genetic disorders.

G. Parenti, C. Porto, R. Della Casa

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Diversi fattori hanno fornito uno stimolo ai progressi nel trattamento delle LSD. La disponibilità di tecnologie che consentono la produzio-ne, purificazione e manipolazione su larga scala di nuovi farmaci, proteine ricombinanti e vettori virali, ha giocato un ruolo importante in questo senso, insieme alla legislazione in materia di farmaci orfa-ni, che ha incoraggiato le aziende biotecnologiche ad investire nella ricerca di nuove terapie per le malattie rare (Beutler, 2006).Tuttavia, il fattore che ha maggiormente stimolato lo sviluppo di nuove terapie per le LSD, e che rappresenta un modello anche per altre patologie, è stato l’avanzamento delle conoscenze sulla fisio-patologia e sui meccanismi cellulari e molecolari alla base di queste malattie.

I progressi nella comprensione della fisiopatologia delle LSD e le loro implicazioni terapeutiche

La cascata di eventi alla base della patogenesi delle LSD (Fig. 1A) è innescata da mutazioni dei geni codificanti per proteine coinvolte nella funzione lisosomiale, in massima parte enzimi lisosomiali. La conseguenza è la totale assenza di una proteina o la sintesi di una proteina non funzionale, malconformata nella sua struttura terziaria, che viene riconosciuta come alterata dai sistemi di controllo di qua-lità della cellula e per tale motivo viene degradata. La conseguen-za a livello dei lisosomi è l’impossibilità di degradare uno specifico substrato, che quindi si accumula nei lisosomi. È diventato ormai chiaro che l’accumulo di substrati all’interno del compartimento li-sosomiale è soltanto il primum movens di una serie di risposte cellu-lari secondarie che hanno come risultato finale la morte cellulare ed il danno di tessuti e organi. L’accumulo dei substrati non degradati interferisce, infatti, con diverse funzioni cellulari, con meccanismi che comprendono l’attivazione di recettori da parte di ligandi non fisiologici, la modulazione di risposte recettoriali e di cascate di trasduzione del segnale, l’attivazione di una risposta infiammato-ria, l’alterato traffico intracellulare di vescicole, di membrane e di proteine legate alle membrane, l’alterazione dei meccanismi legati all’autofagia (Ballabio and Gieselmann, 2009).La precisa conoscenza di questi meccanismi è di importanza crucia-le perchè ciascuno degli eventi nella cascata patogenetica delle LSD è un potenziale bersaglio della terapia. Di conseguenza è possibile che vari approcci, basati su differenti strategie e razionale, ognuno mirato ad un diverso bersaglio terapeutico, possano essere sfruttati, singolarmente o in combinazione, per il trattamento di queste pato-logie (Fig. 1B).

La terapia delle LSD

Fino a circa due decenni fa il trattamento di pazienti affetti da LSD era basato esclusivamente su terapie palliative o di supporto. Le prime strategie terapeutiche dirette verso la correzione del difetto di base di queste malattie sono state introdotte nei primi anni ’90, e da allora un certo numero di nuovi approcci sono stati divenuti disponibili o testati in studi preclinici.L’approccio più ovvio per correggere le malattie da perdita di funzio-ne, come le LSD, causate nella maggior parte dei casi dal deficit fun-zionale di una idrolasi lisosomiale, è quello di ripristinare o sostituire l’attività enzimatica deficitaria. Quindi, la maggior parte dei metodi finora sviluppati per trattare le LSD sono volti ad aumentare i livelli dell’enzima mancante in cellule e tessuti. Questi approcci si basa-no sul trapianto di cellule staminali ematopoietiche (hematopoietic stem cell transplantation, HSCT), sulla terapia enzimatica sostitutiva

(enzyme replacement therapy, ERT), sulla terapia farmacologica con molecole chaperone (pharmacological chaperone therapy, PCT), e sulla terapia genica (gene therapy, GT). Questi tipi di approccio pos-sono risultare particolarmente adatti per disordini come le LSD, nelle quali si assume che i sintomi clinici nei pazienti si presentino solo quando il livello dell’enzima residuo scende al di sotto di una soglia critica. Pertanto attività residue superiori a circa il 10% del livello normale possono, in linea di principio, essere sufficienti per impe-dire l’accumulo, ed è possibile ipotizzare che anche lievi aumenti di

Figura 1.A. La cascata di eventi alla base della patogenesi delle LSD è innescata da mutazioni dei geni codificanti per proteine coinvolte nella funzione lisosomiale, in massima parte enzimi lisosomiali. La conseguenza è la totale assenza di una proteina o la sintesi di una proteina non funzio-nale, malconformata nella sua struttura terziaria, che viene riconosciuta come alterata dai sistemi di controllo di qualità della cellula e per tale motivo viene degradata. La conseguenza a livello dei lisosomi è l’im-possibilità di degradare uno specifico substrato, che quindi si accumula nei lisosomi. L’accumulo innesca meccanismi secondari, ad esempio anomalie dell’autofagia, che sono responsabili del danno cellulare e tessutale.B. Ciascuno degli eventi nella cascata patogenetica delle LSD è un potenziale bersaglio della terapia. La maggior parte dei metodi fino-ra sviluppati sono volti ad aumentare i livelli di dell’enzima mancante, come la terapia enzimatica sostitutiva (enzyme replacement therapy, ERT), la terapia farmacologica con molecole chaperone (pharmacologi-cal chaperone therapy, PCT), la terapia genica (gene therapy, GT). Un approccio alternativo, la terapia di riduzione del substrato (SRT), si basa sull’uso di inibitori della sintesi dei substrati accumulati nei lisosomi. Di recente sono stati proposti approcci ancora più innovativi, basati sul-la correzione delle anomalie cellulari secondarie o sulla stimolazione della esocitosi lisosomiale.

a

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attività enzimatica si possano tradurre in un beneficio clinico per i pazienti.Un approccio alternativo, la terapia di riduzione del substrato (SRT), si basa sull’uso di inibitori della sintesi dei substrati accumulati nei lisosomi. Negli ultimi anni, grazie al miglioramento delle conoscenze sulla fi-siopatologia delle LSD, sono state proposte, inoltre, altre strategie terapeutiche innovative che sono in corso di valutazione in studi pre-clinici.

Il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (HSCT)L’HSCT è stato il primo approccio terapeutico introdotto per il tratta-mento delle LSD. Il midollo osseo è stato tradizionalmente usato come fonte di cellule da trapiantare per questa procedura. Tuttavia, negli ultimi anni, molti pazienti sono stati trattati con trapianti da sangue di cordone ombelicale da donatore non correlato, che permette un rapido e più facile accesso al trapianto (Prasad and Kurtzberg, 2010).Per l’HSCT l’agente terapeutico sono le cellule staminali emato-poietiche derivate da un donatore sano. Con questo approccio può

essere ottenuto un duplice effetto (Fig. 2). Uno è quello di ripopo-lare tessuti specifici da parte delle cellule sane del donatore. Un secondo effetto, molto importante, è conseguenza della secrezione di idrolasi lisosomiali funzionali da parte delle cellule del donatore nello spazio extracellulare e nella circolazione sanguigna. L’enzima normale secreto può essere, infatti, assorbito dalle cellule riceventi e correggere il difetto dell’enzima in queste cellule (effetto definito come cross-correction).L’esperienza clinica finora ottenuta con il trapianto, tuttavia, suggeri-sce che questa procedura deve limitarsi a poche malattie lisosomia-li. Il trapianto è risultato efficace per il trattamento della mucopoli-saccaridosi (MPS) tipo I (Valayannopoulos et al., 2011) ed ha effetti benefici sulle manifestazioni viscerali nella MPS VI, nella malattia di Krabbe pre-sintomatica o ad insorgenza tardiva, e nelle forme attenuate di leucodistrofia metacromatica (Orchard et al., 2007). Per la MPS I le indicazioni, i tempi ottimali, la sicurezza e l’efficacia di trapianto sono stati recentemente esaminati da un gruppo europeo di specialisti che hanno partecipato ad un consensus su questo ap-proccio (de Ru et al, 2011). Secondo tale consensus l’HSCT è consi-derato il trattamento preferenziale per i pazienti con MPS I gravi, che hanno ricevuto la diagnosi prima dell’età di 2 anni e mezzo, e può essere preso in considerazione anche in singoli pazienti con fenotipi intermedi se vi è un donatore idoneo.Per la malattia di Krabbe e la leucodistrofia metacromatica, il fenoti-po della malattia e la gravità della malattia al momento del trapianto sono di fondamentale importanza nel determinare il risultato (Or-chard and Tolar, 2010).Un potenziale vantaggio dell’HSCT è che alcune cellule di derivazio-ne del donatore sono in grado di migrare al cervello e di produrre enzimi normali che possono essere internalizzati dalle cellule neuro-nali del ricevente con il meccanismo di cross-correction preceden-temente citato. In linea di principio, quindi, questa procedura ha la possibilità di migliorare le funzioni neurocognitive e la qualità della vita, in particolare, quando eseguita precocemente nel corso della malattia. D’altra parte l’uso dell’HSCT è limitato dal rischio di mortalità lega-to alla procedura, dalla scarsa disponibilità di donatori idonei, dal numero esiguo di patologie che possono essere trattate con questo approccio e dall’insufficiente attecchimento e correzione della pato-logia in alcuni tessuti, quali ossa e cuore.

La terapia enzimatica sostitutiva (ERT)La ERT ha rappresentato la più importante acquisizione degli ulti-mi decenni nel trattamento delle LSD. Questo approccio si basa su infusioni endovenose periodiche di enzimi lisosomiali ricombinanti umani, prodotti e purificati su larga scala da fonti diverse con tecni-che di DNA ricombinante. Una volta iniettati, gli enzimi ricombinanti si distribuiscono ai tessuti, vengono internalizzati dalle cellule ed indirizzati al compartimento lisosomiale, dove devono sopperire alla disfunzione dell’enzima difettoso.Lo sviluppo della ERT è un eccellente esempio di come i progressi nella conoscenza della biologia lisosomiale possano favorire lo svi-luppo di nuovi approcci terapeutici. Il razionale della ERT, infatti, si è evoluto a partire da studi sui meccanismi molecolari e cellulari coinvolti nel traffico e la secrezione degli enzimi lisosomiali. Questi studi hanno dimostrato che le idrolasi lisosomiali recano sulla loro struttura marcatori, cioè il mannosio o il mannosio-6-fosfato, che sono riconosciuti da specifici recettori presenti nella cellula. Grazie a questi recettori gli enzimi neo-sintetizzati dalla cellula vengono indirizzati al compartimento lisosomiale, laddove devono svolgere

Figura 2.Per l’HSCT l’agente terapeutico sono le cellule staminali ematopoieti-che derivate da un donatore sano. Con questo approccio può essere ot-tenuto un duplice effetto. Uno è quello di ripopolare tessuti specifici da parte delle cellule sane del donatore. Un secondo effetto è conseguenza della secrezione di idrolasi lisosomiali funzionali da parte delle cellule del donatore nello spazio extracellulare e nella circolazione sanguigna. L’enzima normale secreto può essere, infatti, assorbito dalle cellule riceventi e correggere il difetto dell’enzima in queste cellule (effetto definito come cross-correction).


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la loro funzione. I recettori del mannosio o del mannosio-6-fosfato sono espressi però anche sulla membrana plasmatica delle cellule (Sly, 1985). Questo fa sì che enzimi lisosomiali ricombinanti prodotti e purificati in laboratorio possano essere “captati” dalle cellule, e seguendo il percorso della via endocitica, essere correttamente tra-sportati ai lisosomi (Fig. 3). I primi tentativi di sviluppare una ERT sono stati effettuati nella ma-lattia di Gaucher, una malattia dovuta al deficit di beta-glucosidasi caratterizzata da visceromegalia, coinvolgimento osseo e segni ematologici. Dopo oltre due decenni di esperienza clinica con mi-gliaia di pazienti trattati, il successo della ERT è stato chiaramente documentato in questa malattia. È stato definitivamente dimostrato che la ERT è efficace nel migliorare le manifestazioni viscerali, ema-tologiche e biochimiche nella malattia di Gaucher e nel migliorare la qualità di vita dei pazienti.Il successo della ERT nella malattia di Gaucher (Barton et al., 1991; Barton et al., 1990), ha stimolato lo sviluppo di questo approccio per il trattamento dei altre LSD, in generale quelle più prevalenti, per le quali la ERT è attualmente considerata la terapia standard.Nella malattia di Fabry, una malattia lisosomiale dovuta al deficit di alfa-galattosidasi A e che coinvolge prevalentemente endoteli vascolari, cuore, rene e sistema nervoso periferico, sono stati do-cumentati effetti benefici sulle funzioni cardiache e renali, con ridu-zione del dolore e miglioramento della qualità della vita (Mehta et al., 2009; Lidove et al., 2010; Feriozzi et al., 2012). Inoltre, la riduzione dei livelli plasmatici ed urinari del substrato accumulato avvalorano l’efficacia della ERT.Nella malattia di Pompe, dovuta al deficit di alfa-glucosidasi acida e che si manifesta con una quadro di miopatia generalizzata, l’espe-rienza clinica ha mostrato effetti sorprendenti sulla cardiomiopatia, con rapida riduzione dell’indice di massa ventricolare sinistra. Inoltre la ERT ha prolungato significativamente la sopravvivenza dei pazien-

ti affetti dalla forma più severa ad esordio precoce (van der Ploeg-Reuser, 2008), ed ha migliorato le prestazioni fisiche, stabilizzando o migliorando la funzione muscolare, nei pazienti ad esordio tardivo (Strothotte et al., 2010; van der Ploeg et al., 2010).Nelle MPS I, II e VI l’impiego della ERT ha consentito un miglioramen-to delle prestazioni generali, delle funzioni respiratorie e della qualità della vita (Valayannopoulos et al., 2011). Un marcatore biochimico di efficacia della ERT in queste patologie è la ridotta escrezione urina-ria di glicosaminoglicani nei pazienti trattati.Alla luce dei successi della ERT in queste patologie l’uso di questo approccio è stato proposto ed in corso di studio anche per il tratta-mento anche di altre LSD, tra cui la MPS IVA (malattia di Morquio A), la MPS VII (malattia di Sly), la MPSIIIA (malattia di Sanfilippo A), la leucodistrofia metacromatica, la mannosidosi, ed il deficit di lipasi acida.D’altra parte, l’esperienza clinica con la ERT ha dimostrato che que-sto approccio ha alcuni limiti, principalmente legati alla biodisponi-bilità degli enzimi ricombinanti. Gli enzimi ricombinanti sono grandi molecole che non diffondono liberamente attraverso le membrane e non sono in grado di raggiungere concentrazioni terapeutiche in alcuni dei tessuti bersaglio. Pertanto, un certo numero di tessuti ri-mangono refrattari a questo trattamento e alcuni pazienti in tratta-mento con ERT mostrano un beneficio clinico limitato o continuano a mostrare segni di progressione della malattia. Limitazioni della ERT sono state osservate nelle MPSI, II e VI, dove i risultati terapeutici sono insufficienti in tessuti quali ossa, cartilagine e cuore, che pe-raltro sono tra gli organi maggiormente interessati dalla patologia. Nella malattia di Pompe a livello del muscolo scheletrico i benefici della ERT sono in alcuni casi insufficienti (Parenti and Andria, 2011).Di rilevanza clinica ancora maggiore è l’incapacità degli enzimi ri-combinanti di attraversare la barriera ematoencefalica e di raggiun-gere il sistema nervoso centrale (Anson et al., 2001; Begley et al., 2008). In circa due terzi dei pazienti affetti da LSD è presente coin-volgimento neurologico e neurodegenerazione progressiva. In questi casi, quindi, l’impossibilità di ottenere livelli correttivi di enzimi nel cervello è una grave limitazione alla efficacia terapeutica della ERT. Per aggirare questi problemi e aumentare i livelli terapeutici di enzi-mi ai tessuti bersaglio, tra cui sistema nervoso centrale, sono in cor-so di valutazione diverse strategie. Purtroppo, tutte queste strategie sono ancora in fase largamente sperimentale.Sono stati fatti diversi tentativi di ottenere livelli correttivi di attività enzimatica nel cervello nelle LSD neuropatiche, manipolando chimi-camente gli enzimi ricombinanti. Ad esempio la beta-glucuronidasi, l’enzima carente nella MPSVII, è stata modificata per aumentare l’emivita plasmatica e facilitarne il traffico attraverso la barriera ematoencefalica (Grubb et al., 2008). Altri approcci che vengono attualmente esplorati sono basati sulla penetrazione recettore me-diata della barriera ematoencefalica, mediante coniugazione degli enzimi ricombinanti con molecole di transferrina al fine di sfruttare l’endocitosi mediata da recettori di tale proteina per il trasporto at-traverso la barriera (Osborn et al., 2008).Oltre a questi approcci è stata sperimentata anche una procedura invasiva, che prevede somministrazione intratecale della ERT, valu-tata in studi pre-clinici per diverse patologie lisosomiali e introdotta in terapia umana per la MPS I (Munoz-Rojas et al., 2008).Sono stati effettuati anche tentativi per migliorare il targeting della ERT ai muscoli scheletrici nella malattia di Pompe. Nel 2009 è stata sviluppata (Zhu et al., 2009) una rhGAA ingegnerizzata nella compo-nente oligosaccaridica (neo-rhGAA), nella quale sono state aggiunte ulteriori residui di mannosio 6-fosfato. Questa neo-rhGAA ha mo-strato una maggiore affinità per il recettore del mannosio-6-fosfato.

Figura 3.Gli enzimi lisosomiali recano sulla loro struttura marcatori, quali il man-nosio ed il mannosio-6-fosfato, che sono riconosciuti dagli specifici re-cettori presenti nella cellula. Grazie a questi recettori gli enzimi neo-sin-tetizzati dalla cellula vengono indirizzati al compartimento lisosomiale, laddove devono svolgere la loro funzione. I recettori del mannosio o del mannosio-6-fosfato sono espressi anche sulla membrana plasmatica delle cellule e questo fa sì che enzimi lisosomiali ricombinanti prodotti e purificati in laboratorio possano essere “captati” dalle cellule, e seguen-do il percorso della via endocitica, essere correttamente trasportati ai lisosomi. Una volta raggiunti i lisosomi gli enzimi ricombinanti possono rimpiazzare l’enzima deficitario e degradare il substrato accumulato.


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In un modello murino di malattia di Pompe l’enzima così modificato ha mostrato una maggiore capacità correttiva e di conseguenza una più efficace riduzione del glicogeno lisosomiale nei muscoli rispet-to all’enzima tradizionale. Altri approcci sono basati sulla fusione sulla rhGAA con un peptide derivato dall’insulin-like growth factor 2 (IGF-II), che è anch’esso un ligando per il recettore del mannosio-6-fosfato.Un altro fattore che non va assolutamente sottovalutato e che può rappresentare un’ulteriore limitazione per la ERT, è rappresentato dagli elevati costi degli enzimi ricombinanti. Gli investimenti iniziali per la ricerca ed i costi relativi alla produzione di grandi quantità di enzimi ricombinanti secondo i criteri della good manufacturing pratice, ha contribuito a mantenere i costi della ERT estremamente elevati. Il trattamento di un singolo paziente affetto da LSD può ri-chiedere perciò fino a diverse centinaia di migliaia di euro all’anno. Tali costi elevati, che sono accettabili nei paesi occidentali, sono difficilmente accessibili nei paesi del terzo mondo o nei paesi emer-genti, e limitano quindi l’accesso dei pazienti alla ERT. La disponibi-lità di nuove tecnologie molecolari, tuttavia, apre una speranza per consentire la produzione di preparazioni enzimatiche meno costose. Ad esempio, la beta-glucosidasi ricombinante, l’enzima carente nel-la malattia di Gaucher, è stato prodotto anche in specie vegetali o in cellule derivate da vegetali (Zimran et al., 2011).

La terapia con chaperones farmacologici (PCT)Come si è detto in precedenza uno dei meccanismi implicati nella patogenesi delle LSD è la sintesi di proteine enzimatiche alterate nella loro conformazione tridimensionale, in quanto derivate dal geni recanti mutazioni missenso. Tali proteine sono riconosciute dalla cellula e degradate. In queste malattie, definite da misfolding protei-co, la perdita di funzione non è quindi dovuta alla perdita di attività catalitica della proteina mutata, ma è il risultato della degradazione della proteina.Un approccio che ha recentemente attirato molto interesse per il trattamento delle malattie dovute a misfolding proteico in generale e in particolare per le LSD è la stimolazione enzimatica con piccole molecole definite chaperones farmacologici (Parenti, 2009; Valenza-no et al., 2011). È stato dimostrato che gli chaperones farmacologici possono interagire fisicamente con la proteina mutata, favorendone la corretta conformazione facendo in un certo senso da stampo, e migliorandone la stabilità. Come risultato l’attività enzimatica della proteina mutata viene parzialmente recuperata (Fig. 4). Come per la ERT e gli altri approcci diretti verso la sostituzione o l’aumento dell’attività residua dell’enzima difettoso, è ragionevole ipotizzare che anche un piccolo incremento dell’attività potrebbe avere un impatto favorevole sullo stato dei pazienti e sulla progres-sione della malattia.L’uso di chaperones farmacologici per il trattamento di malattie da accumulo lisosomiale è stato proposto per la prima volta nella ma-lattia di Fabry (Fan et al., 1999). In cellule di pazienti con malattia di Fabry è stato dimostrato che uno dei più potenti inibitori dell’alfa-ga-lattosidasi A, la 1-deossigalattonojirimicina (DGJ), paradossalmente stimolava l’attività residua dell’alfa-galattosidasi A. Tale effetto era osservato anche in vivo, in topi transgenici che iperesprimevano un forma di alfa-galattosidasi A mutata (Germain and Fan, 2009). Lo stesso approccio è stato successivamente valutato per un numero limitato di altre malattie di questo gruppo (Parenti, 2009; Valenzano et al., 2011), compresa la malattia di Gaucher (Sawkar et al., 2005) e la malattia di Pompe (Parenti et al., 2007; Okumiya et al., 2007).In linea di principio, gli chaperones (come tutte le piccole molecole)

hanno diversi vantaggi, rispetto alla ERT, in quanto possono essere assunti oralmente, consentendo un trattamento non invasivo, non sono immunogenici e non hanno bisogno di essere captati dalle cel-lule attraverso il recettore del mannosio-6-fosfato, che può essere secondariamente compromesso in alcune di queste patologie. Inol-tre, si assume che queste piccole molecole chaperone diffondano liberamente attraverso le membrane cellulari e raggiungano con-centrazioni terapeutiche in diversi tessuti e sistemi, inclusi sistema nervoso centrale. Nel modello animale di gangliosidosi GM1, un gra-ve disturbo neurodegenerativo dovuto al deficit di beta-galattosida-si, l’uso dello chaperone N-ottil-4-epi-β-valienamine (Noev) ha con-sentito un aumento dell’attività residua nel cervello e una migliore clearance del substrato (Suzuki et al., 2012).D’altra parte anche i farmaci chaperones possono presentare limi-tazioni. La terapia con questi farmaci sembra essere praticabile solo in pazienti con specifiche mutazioni responsive, per lo più situate in specifici domini strutturali dell’enzima (Flanagan et al., 2009).Desta inoltre preoccupazione ai fini dell’impiego di tali molecole in clinica il fatto che la maggior parte degli chaperones finora indivi-duati per il trattamento delle LSD sono molecole che interagisco-no con i siti attivi degli enzimi. In altre parole, esse sono inibitori competitivi degli enzimi bersaglio, anche se ci sono evidenze che nell’ambito dei lisosomi tale effetto inibitorio non si verifichi.In linea di principio, queste limitazioni possono essere superate mediante l’individuazione di nuove molecole che interagiscono con altri domini proteici, diversi dal sito attivo. Recentemente, sono stati identificati i primi chaperones allosterici per l’alfa-glucosidasi, l’en-zima carente nella malattia di Pompe, mediante la combinazione di una caratterizzazione biochimica ed un’analisi computazionale delle interazioni di questi farmaci con l’enzima (Porto et al., 2012).

Figura 4.A causa di mutazioni missenso gli enzimi lisosomiali mutati sono alte-rati nella loro conformazione tridimensionale, riconosciuti dalla cellula e degradati. Gli chaperones farmacologici possono interagire fisicamente con la proteina mutata, favorendone la corretta conformazione, migliorandone la stabilità e favorendone il corretto traffico verso i lisosomi, dove il complesso chaperone-enzima si dissocia. Come risultato l’attività enzi-matica della proteina mutata viene parzialmente recuperata.


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Screening ad ampio spettro (high throughput screenings) di librerie chimiche potrebbe essere un metodo rapido ed efficiente per iden-tificare altri chaperones di nuova generazione (Urban et al., 2008; Marugan et al., 2010).Dopo gli studi in vitro, che hanno consentito di identificare potenziali chaperones farmacologici per il trattamento delle LSD, la ricerca si sta ora spostando verso la traduzione clinica. Studi clinici in Fase 1/2 sono stati condotti per le malattie di Fabry, Gaucher e Pompe. Per la malattia di Fabry, studi clinici di fase 2/3 hanno mostrato risultati incoraggianti in termini di potenziamento dell’attività enzimatica re-sidua dell’alfa-galattosidasi A e clearance del substrato [http://www.amicustherapeutics.com/clinicaltrials/at1001.asp].

La combinazione di chaperones ed ERT

Sebbene la terapia con chaperones sia stata sviluppata come stra-tegia per proteggere gli enzimi mutati dalla degradazione intra-cellulare, studi recenti hanno dimostrato che questi farmaci sono anche in grado di migliorare la stabilità fisica e potenziare l’azione terapeutica degli enzimi normali, in particolare quelli utilizzati per la ERT (Porto et al., 2009; Porto et al., 2012; Benjamin et al., 2012; Khanna et al., 2012). Questi studi, effettuati in sistemi cellulari e nei modelli animali delle malattie di Pompe e di Fabry, hanno fatto da apripista per un importante cambiamento nell’uso degli chaperones. In entrambe le patologie, quando gli enzimi ricombinanti sono stati somministrati in associazione con le molecole chaperoniche, il traf-fico ai lisosomi, la maturazione e l’attività intracellulare (in altri ter-mini l’efficacia) degli enzimi ricombinanti usati per la ERT è risultata notevolmente migliorata.Sebbene il meccanismo alla base dell’effetto sinergico tra chape-rones farmacologici ed ERT non sia ancora del tutto chiaro, questa sinergia può avere importanti vantaggi rispetto all’uso “tradizionale” degli chaperones per proteggere enzimi mutati dalla degradazio-ne. Innanzitutto, in questo caso l’effetto terapeutico è diretto verso l’enzima esogeno normale, quello utilizzato per la ERT, e quindi è indipendente dalla mutazione del paziente. Questo significa che tale effetto può essere sfruttato in tutti i pazienti trattati con ERT e non solo in quelli che hanno specifiche mutazioni (Porto et al., 2012; Porto et al., 2012). In secondo luogo, mentre la stimolazione mediante chaperones degli enzimi endogeni mutati nella maggior parte dei casi sfocia in piccoli aumenti in termini di attività residua (probabilmente con un esito modesto sul decorso clinico dei pazienti), la sinergia tra chaperones e ERT induce apparentemente, almeno in modelli cellulari, notevoli aumenti di attività specifica con una correzione completa o quasi completa del difetto enzimatico. Studi clinici basati sulla combinazione di chaperones ed ERT sono già in corso (Trials NCT00214500 e NCT01196871 a http://clinical-trials.gov; Telethon fondazione Trial GUP09017, http://www.telethon.it/ricerca-progetti/progetti- finanziati).

I farmaci regolatori della proteostasi

In aggiunta alla terapia con chaperones, sono stati proposti altri ap-procci deputati al salvataggio degli enzimi mutati nelle LSD. Mentre, come si è detto in precedenza, gli chaperones sono ligandi che in-teragiscono specificamente con le proteine mutate (e sono quindi in grado di salvare una singola proteina), altri farmaci sono in grado di regolare i meccanismi cellulari che controllano l’omeostasi delle proteine, definita “proteostasi”. La proteostasi è un complesso in-

sieme di meccanismi che controllano la sintesi, la conformazione (il folding), il traffico, l’aggregazione, e la degradazione delle proteine. Piccole molecole, definiti regolatori della proteostasi, hanno la capa-cità di regolare le funzioni di questo network, e sono potenzialmente in grado di ripristinare il normale equilibrio tra sintesi e degrada-zione delle proteine. È stato dimostrato che due di questi regolatori della proteostasi erano in grado di ripristinare la funzione di due en-zimi lisosomiali mutati in due distinte LSD, quali malattia di Gaucher, di cui si è parlato in precedenza, e la gangliosidosi G

M2, una grave malattie neurodegenerativa dovuta al deficit di beta-esosaminidasi (Mu et al., 2008). Questo approccio, tuttavia, è ancora in gran parte sperimentale.

La terapia genica (GT)La GT è una strategia interessante che rappresenta una grande pro-messa per i pazienti affetti da LSD ed è comunemente vista come l’approccio che ha le maggiori potenzialità per la correzione comple-ta e prolungata del difetto enzimatico (Sands and Davidson, 2006; Cardone, 2007). La GT è anche un ottimo esempio di una strate-gia che si sta sviluppando grazie alla combinazione di una migliore conoscenza delle basi molecolari delle LSD, e dei progressi tecnici ottenuti nell’ottimizzazione e preparazione di agenti terapeutici, in questo caso i vettori virali.La GT, come tutti i metodi già citati, è finalizzata ad aumentare o ripristinare l’attività dell’enzima carente nelle cellule dei pazienti. Questo risultato non è ottenuto rimpiazzando l’enzima difettoso con un enzima ricombinante funzionante, ma fornendo la copia normale del gene mutato, contenuta in un vettore virale che verrà introdotto nelle cellule mediante infezione, e che consentirà la sintesi dell’en-zima normale nelle cellule che l’avranno ricevuto.Questo approccio terapeutico sembra essere particolarmente adatto per il trattamento delle le LSD per diversi motivi. Primo, queste pato-logie sono monogeniche ed è teoricamente possibile curarle correg-gendo il difetto genetico. In secondo luogo, anche se solo un piccolo numero di cellule conterrà copie normali del gene mutato in grado di sintetizzare l’enzima normale, sarà possibile correggere le cellule adiacenti tramite una cross-correction, grazie al fatto che la mag-gior parte degli enzimi lisosomiali vengono secreti e ricaptati tramite il recettore del mannosio-6-fosfato. Tale cross-correction, simile a quella documentata nell’HSCT, evita la necessità di trasferire il gene in tutte le cellule, con il vantaggio che una piccola percentuale di cellule trasdotte potrebbe agire terapeuticamente con conseguenti benefici per molti organi. Infine, come già detto, anche lievi aumenti di attività enzimatica (fino al 10%) potrebbero essere sufficienti per un beneficio clinico e per un sia pur parziale correzione fenotipica.Sono state progettati diversi vettori virali e diverse strategie per rea-lizzare il trasferimento genico in vivo. Sono stati testati come vettori Herpes virus, lentivirus, virus adeno-associati (AAV), adenovirus (Ad) ed altri (Sands and Davidson, 2006). La modificazione genetica può essere eseguita sia ex vivo che in vivo (Fig. 5). La prima strategia prevede la modificazione ex vivo di cellule ed il trapianto delle cellule modificate nei pazienti. Le cellule che vengono comunemente consi-derate come bersagli terapeutici per le LSD sono cellule progenitrici ematopoietiche.Un’altra strategia testata è basata invece sulla GT diretta in vivo. Questo approccio si basa sulla iniezione di un vettore di trasferimen-to genico direttamente in un tessuto o in circolo.Il vantaggio di un approccio con GT rispetto alla ERT è la potenzia-le espressione della proteina terapeutica a lungo termine. Pertanto, questo approccio potrebbe rappresentare una procedura definitiva,


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con vantaggi evidenti rispetto alla ERT, che richiede la somministra-zione periodica di enzimi per via endovenosa, e alle terapie con pic-cole molecole, che necessitano di una somministrazione giornaliera e per tutta la vita. Un altro vantaggio è che la GT può essere dispo-nibile per i pazienti con patologie così rare per le quali lo sviluppo di un enzima per la ERT sarebbe una impresa commercialmente non vantaggiosa.Anche se la GT è un trattamento promettente per le LSD, restano alcune problematiche aperte. Il problema principale è la sicurezza del vettore virale e la possibilità di carcinogenesi conseguente al trasferimento genico mediato da retrovirus o adenovirus. In questo senso i vettori AAV potrebbero risultare vantaggiosi e più sicuri in quanto non sono patogenici e generalmente non si integrano nel genoma dell’ospite. Una seconda considerazione è che i vettori ge-neralmente esprimono livelli sovra-fisiologici di enzima e non è noto se questo sia del tutto sicuro negli esseri umani.Altri problemi sono legati alle dosi di vettori da utilizzare, alla scelta dei vettori per ottenere la migliore correzione possibile in specifi-ci tessuti ed organi, nonché alla possibilità di risposta immunitaria verso l’enzima normale prodotto grazie alla GT, che potrebbe essere una proteina “estranea” per il paziente.Inoltre, modificare geneticamente o far arrivare l’enzima normale prodotto nei tessuti trasdotti al sistema nervoso centrale rimane un problema irrisolto. Ciò è dovuto anche in questo caso alla presenza

della barriera ematoencefalica, che esclude gli enzimi lisosomiali esogeni dal cervello. Per le LSD con manifestazioni neuropatiche è stata studiata come possibile strategia l’iniezione intracerebrale del vettore virale. Nel modello animale del deficit multiplo di solfatasi (multiple sulfatase deficiency, MSD), una grave malattia autosomica recessiva, causata da mutazioni nel gene di un fattore che rende attive le solfatasi (SUMF1), la combinazione di somministrazione si-stemica e intracerebrale del vettore recante il gene SUMF1 normale ha consentito correzione del difetto genetico, la quasi completa cle-arance dei glicosaminoglicani, e ha migliorato performance fisica degli animali (Spampanato et al., 2011).La GT è in fase di studio per diverse malattie, per lo più in studi pre-clinici condotti in modelli animali delle LSD. Tuttavia, i primi studi clinici sono già in corso o in fase di preparazione.

La terapia di riduzione del substrato – SRTLa SRT si basa sul concetto che l’inibizione di specifiche tappe delle vie biosintetiche dei substrati possono ridurre il loro flusso ai liso-somi, contribuendo così a ristabilire l’equilibrio tra la loro sintesi e il catabolismo (Platt and Jeyakumar, 2008; Schiffmann, 2010). Questa operazione viene generalmente eseguita utilizzando farmaci inibitori di enzimi coinvolti nella biosintesi dei substrati.SRT è stata già approvata per l’uso clinico nel trattamento della ma-lattia di Gaucher di tipo 1, la forma più lieve di questa malattia, e per la malattia di Niemann-Pick di tipo C (NPC), una grave malattia caratterizzata da manifestazioni viscerali (epatosplenomegalia, co-lestasi, pneumopatia) e da manifestazioni neurodegerative, e dovuta ad un difetto del traffico intracellulare del colesterolo.L’esperienza clinica più ampia per questo approccio è stata ottenu-ta con l’uso dell’ N-butildeossinojirimicina (Miglustat) nella malattia di Gaucher. In questa malattia il Miglustat ha dimostrato di essere efficace nel migliorare o stabilizzare markers biochimici, viscerali, ematologici e ossei della malattia (Giraldo et al., 2009), causando limitati eventi avversi (Hollak et al., 2009).Un nuovo inibitore del substrato, l’Eliglustat tartrato, è stato recen-temente introdotto e valutato in uno studio clinico aperto, multicen-trico, di fase 2 (Lukina et al., 2010). Il trattamento con Eliglustat tartrato ha migliorato i livelli di emoglobina e la conta piastrinica, ridotto il volume della milza e del fegato, e favorito una maggiore densità ossea della colonna vertebrale nella zona lombare.È stato dimostrato nella NPC che i glicosfingolipidi giocano un ruolo patogenetico nel coinvolgimento cerebrale (Lachmann et al., 2004). Pertanto, è stato proposto l’utilizzo del Miglustat, lo stesso agente terapeutico usato per la malattia di Gaucher, nei pazienti con NPC. In uno studio controllato in 29 pazienti adulti e giovani con NPC, il Mi-glustat si è dimostrato in grado di stabilizzare i disturbi neurologici, migliorando i movimenti orizzontali saccadici degli occhi, stabiliz-zando la deambulazione, e migliorando la deglutizione (Patterson et al., 2007; Wraith et al., 2010). Un miglioramento della deglutizione è stato anche osservato in uno studio sull’efficacia del Miglustat in quattro pazienti pediatrici (Fecarotta et al., 2011).L’approccio basato sulla SRT è stato esteso anche al trattamento delle MPS. Gli studi pre-clinici e clinici in questo caso erano basati sull’uso di inibitori non specifici della sintesi dei glicosaminoglicani, quali la genisteina e la rodamina B, un colorante chimico (Piotrow-ska et al., 2006; Roberts et al., 2006; Roberts et al., 2010; Mali-nowska et al., 2010). Gli effetti di questi farmaci, tuttavia, sono stati finora molto variabili. In due anni di follow-up di otto pazienti MPS III (Piotrowska et al., 2011) trattati con genisteina, cinque pazienti hanno mostrato un miglioramento o una stabilizzazione delle funzio-

Figura 5.La GT è finalizzata ad aumentare o ripristinare l’attività dell’enzima ca-rente nelle cellule dei pazienti fornendo la copia normale del gene mu-tato, contenuta in un vettore virale, che consente la sintesi dell’enzima normale nelle cellule che ricevono il vettore.Anche se solo un piccolo numero di cellule conterrà copie normali del gene mutato, in grado di sintetizzare l’enzima normale, grazie al fat-to che la maggior parte degli enzimi lisosomiali sono secreti, l’enzima potrà comunque essere captato tramite il recettore del mannosio-6-fosfato, dalle cellule adiacenti non infettate. Tale cross-correction, è simile a quella documentata nell’HSCT.La GT può essere eseguita sia ex vivo che in vivo. La prima strategia prevede la modificazione ex vivo di cellule, in genere cellule staminali ematopoietiche, che vengono modificate in laboratorio e reiniettate nel paziente. Un’altra strategia testata è basata invece sulla GT diretta in vivo. Questo approccio si basa sull’iniezione di un vettore di trasferi-mento genico direttamente in un tessuto o in circolo al fine di ottenere direttamente la modificazione genetica delle cellule del ricevente.


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ni cognitive, mentre tre hanno mostrato un ulteriore peggioramento.La SRT è stata proposta anche in alcuni studi pre-clinici per il tratta-mento di altre LSD, come la malattia di Sandhoff (Ashe et al., 2011), la malattia di Fabry (Marshall et al., 2010), e la malattia di Pompe (Douillard-Guilloux et al., 2008; Douillard-Guilloux et al., 2010).Anche gli inibitori della sintesi del substrato, essendo piccole mole-cole, presentano vantaggi rispetto all’uso di ERT e GT, in particolare in termini di biodisponibilità in vari tessuti ed organi, compreso il sistema nervoso centrale.

Altri approcci sperimentaliL’avanzamento delle conoscenze sulle basi molecolari delle malattie genetiche e sulla fisiopatologia delle LSD ha recentemente aperto nuove prospettive terapeutiche.Ad esempio, è stato dimostrato che la manipolazione del pathway dell’autofagia ha un effetto benefico nel modello murino della malat-tia di Pompe. La soppressione genetica dell’autofagia nel topo Pom-pe è responsabile di una riduzione dal 50% al 60% dell’accumulo di glicogeno nel muscolo scheletrico rispetto ai topi in cui l’autofagia non era geneticamente soppressa (Raben et al., 2010). Inoltre, in modelli murini Pompe in cui l’autofagia era soppressa l’efficacia del-la ERT è risultata notevolmente migliorata, con una clearance quasi completa del glicogeno nel muscolo scheletrico, un obiettivo tera-peutico mai raggiunto in topi con malattia di Pompe con autofagia normale.Sono state sviluppate anche strategie terapeutiche per indurre read-through ribosomiale di mutazioni di stop nel mRNA e con-sentire la produzione proteina funzionale. In altri termini, grazie ad alcuni farmaci, le mutazioni di stop non vengono riconosciute e la sintesi della proteina può continuare fino al codone di stop canonico. Farmaci come aminoglicosidi e Ataluren (PTC124) sono efficaci in tal senso e sono in fase di sperimentazione clinica in pazienti affetti da diverse malattie genetiche, come Becker / di-strofia muscolare di Duchenne, la fibrosi cistica, la metilmalonico acidemia e altre (Jones-Helm, 2009; Nelson et al., 2009; Sermet-Gaudelus et al., 2010; Finkel et al., 2010). In linea di principio, la soppressione di mutazioni nonsenso potrebbe offrire nuove pro-spettive anche per il trattamento di pazienti con altre malattie genetiche causate da un’anticipata interruzione di lettura ribo-somiale, comprese le LSD. Questo approccio è stato esplorato

in studi pre-clinici in cellule di ceroidolipofuscinosi con deficit di palmitoil-tioesterasi (Sarkar et al., 2011).Un approccio totalmente nuovo e affascinante per il trattamento del-le LSD è di recente emerso grazie a nuove scoperte sulla biologia dei lisosomi. È stato dimostrato che la biogenesi dei lisosomi e la sintesi degli enzimi lisosomiali sono regolate da un fattore di trascrizione chiamato TFEB (Sardiello et al., 2009). Tra le altre funzioni di TFEB c’è quella di regolare anche l’esocitosi lisosomiale (Sardiello et al., 2009). La sovraespressione di TFEB, infatti, aumenta il numero di lisosomi nella periferia delle cellule e facilita la fusione dei lisosomi con la membrana plasmatica con conseguente espulsione del loro contenuto all’esterno della cellula. È possibile sfruttare questo effet-to nelle LSD per favorire l’eliminazione del substato accumulato nei lisosomi, anche se è presente un difetto enzimatico che impedisce la normale degradazione del substrato. Si è infatti osservato sperimentalemente che la sovraespressione di TFEB riduce l’accumulo patologico nelle cellule e consente il recu-pero della normale morfologia cellulare in diverse LSD (malattia di Pompe, deficit multiplo di solfatasi, MPS III). Questi risultati indicano perciò una strategia terapeutica alternativa e totalmente innovativa per le LSD, non basata sull’incremento dell’attività enzimatica resi-dua o sulla riduzione delal sintesi del substrato.

ConclusioniGli ultimi due decenni hanno visto notevolissimi progressi nel trat-tamento delle LSD. Diverse opzioni terapeutiche sono disponibili o sono in corso di valutazione in studi pre-clinici. Tuttavia, nessuna di queste opzioni è applicabile a tutte le malattie lisosomiali e la maggior parte degli approcci hanno importanti limitazioni, relative a biodisponibilità degli agenti terapeutici, tossicità, risposta immuni-taria, e impatto sulla qualità di vita del paziente.La ricerca futura sarà indispensabile per affrontare questi problemi. Particolare attenzione deve essere prestata alla chiara definizione di linee guida per il trattamento dei pazienti. In questo senso sarà utile la raccolta accurata di informazioni in registri internazionali sulla storia naturale delle LSD, e sugli effetti delle terapie.La possibilità di combinare diversi approcci e di personalizzare pro-tocolli di trattamento per ogni disturbo e per ogni singolo pazien-te potrà rappresentare una strategia vincente al fine di ottenere la massima efficacia terapeutica.

Che cosa si sapeva primaLe malattie lisosomiali sono state a lungo considerate malattie trattabili soltanto con terapie di supporto. Negli ultimi venti anni sono iniziati i primi tentativi terapeutici con la terapia enzimatica sostitutiva e con il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Che cosa sappiamo adessoL’avanzamento delle conoscenze sulla fisiopatologia e sui meccanismi cellulari e molecolari alla base delle malattie lisosomiali ha fortemente stimolato lo sviluppo di nuove terapie per queste malattie. Oggi sono in corso di valutazione o già in fase di applicazione clinica altre strategie terapeutiche, quali la terapia di riduzione del substrato, la terapia farmacologica con molecole chaperone e la terapia genica.

Quali ricadute sulla pratica clinicaSi sono aperte nuove prospettive per il trattamento di pazienti affetti da malattie da accumulo lisosomiale. La disponibilità di diversi approcci terapeutici potrà consentire la scelta dell’approccio migliore per la singola malattia e nel singolo paziente, consentendo di personalizzare la terapia. L’esperienza ottenuta con le terapie già disponibili già oggi consente di fornire linee guida per il trattamento dei pazienti.

Box di orientamento


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Corrispondenza

Giancarlo Parenti, Dipartimento di Pediatria, Università Federico II, Via S. Pansini 5, Napoli. Tel. +39 081 7463390. Fax +39 081 7463116. E-mail: [email protected]

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Dedicare una sezione al “Diabete in età pediatrica” è di particolare attualità ed importanza, offrendo l’opportunità di discutere temi caldi riguardanti tale patologia, che rappresenta una frequente endocrinopatia dell’età pediatrica. Il crescente numero di casi di diabete di tipo 1, insieme al recente affermarsi di casi di diabete di tipo 2 in età pediatrica, senza dimenticare poi casi di diabete monogenico o secondario, continuano a stimolare ricerche volte ad una migliore comprensione della loro patogenesi e allo sviluppo di metodologie diagnostiche e terapeutiche appropriate. Una diagnosi e trattamento precoce del diabete nei bambini e negli adolescenti sono di fondamentale importanza al fine di evitare complicanze sia a breve termine, come ad esempio la chetoacidosi diabetica, che complicanze a lungo termine, soprattutto complicanze vascolari, che possono influire negativamente sulla prognosi di giovani pazienti. Questa sezione comprende tre articoli: il primo che riassume alcune delle novità salenti sul diabete in età pediatrica, sulla base di studi pubblicati nella letteratura internazionale nel corso degli ultimi anni. Gli altri due articoli si soffermano su aspetti diagnostici e terapeutici del diabete. In particolare, essi sono incentrati sulla diagnosi del diabete non-autoimmune nel bambino e su un aggiornamento sul trattamento del diabete di tipo 1.Nel corso degli ultimi anni vi è stato un approfondimento delle conoscenze su forme di diabete monogenico, come il diabete neonatale e il maturity-onset diabetes of the young. Progressi nel campo della genetica hanno permesso di identificare le basi genetiche di queste forme di diabete, la cui identificazione e caratterizzazione precoce sono fondamentali ai fini dell’impostazione di un trattamento adeguato.Durante gli ultimi decenni sono stati compiuti numerosi progressi, volti a migliorare il trattamento del diabete di tipo 1 nel bambino, con l’obiettivo di garantire un controllo metabolico ottimale ed evitare complicanze a breve e lungo termine. Tra i vari progressi in termini di trattamento del diabete di tipo 1 ci sono stati la diffusione della terapia con microinfusore, e l’introduzione di un monitoraggio continuo della glicemia. L’articolo sul trattamento del diabete di questa sezione si baserà soprattutto sulla terapia insulinica con microinfusore e di come questa, insieme all’introduzione di vari sistemi di monitoraggio continuo della glicemia, stia conducendo verso lo sviluppo del ‘pancreas artificiale’. Attraverso questi tre lavori speriamo di fornire una overview sullo ‘stato dell’arte’ del diabete in età pediatrica e di stimolare l’interesse del lettore ad approfondire ulteriormente l’argomento facendo riferimento ad altri lavori rilevanti presentati tra le referenze bibliografiche.

Francesco ChiarelliClinica Pediatrica, Università di Chieti

Diabetologia

Ottobre-Dicembre 2012 • Vol. 42 • N. 168 • pp. 221-225 DiAbeToLoGiA

221

Introduzione

Il diabete mellito è un disordine metabolico caratterizzato da ipergli-cemia cronica con disturbi del metabolismo dei carboidrati, lipidi e proteine conseguenti a difetti nella secrezione o nella azione insuli-nica o in entrambe (American Diabetic Association, 2012). Tra le varie forme di diabete (Tab. I e II), la più frequente in età pediatrica è il diabete di tipo 1 (T1D), caratterizzato da una distruzione su base autoim-mune delle β-cellule pancreatiche. Negli ultimi anni, parallelamente con la crescente epidemia dell’obesità infantile, si è assistito anche all’emergere del diabete di tipo 2 (T2D), patologia a lungo considerata come esclusi-va dell’età adulta. Il T2D deriva dalla presenza di uno stato di insulino-resistenza e da una progressiva perdita della secrezione β-cellulare. Il Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY) rappresenta un’altra forma di diabete che si può manifestare in bambini e adolescenti. Si tratta di un gruppo di disordini ereditati in modo autosomico dominante, con esordio prima dei 25 anni, in presenza di familiarità per diabete e in assenza di obesità e chetosi. Questa condizione è dovuta ad un deficit primario della funzione β-cellulare e della secrezione insulinica. Altre forme di diabete, che in misura minore possono interessare l’età pediatrica, sono il diabe-te neonatale, condizione monogenica rara (1/400.000-500.000 nascite), caratterizzata dalla comparsa di iperglicemia richiedente terapia insulini-ca nei primi mesi di vita, e legata a difetti nello sviluppo o funzione delle β-cellule pancreatiche. Tra le forme di diabete monogenico è da ricordare anche il diabete mitocondriale, in genere associato a sordità neurosen-soriale, e legato anch’esso a perdita della funzione β-cellulare su base non-autoimmune. Infine, in età pediatrica possono aversi anche forme di diabete secondario ad altre patologie (fibrosi cistica, malattie endocrine) o all’uso di farmaci, quali ad esempio i corticosteroidi.

Il diabete in età pediatrica rappresenta un argomento di notevole importanza per via della crescente incidenza soprattutto di forme quali il T1D e il T2D, ma anche delle forme monogeniche, molte del-le quali sono state a lungo incorrettamente classificate. Nel corso degli ultimi anni, notevoli progressi sono stati compiuti in termini di comprensione della patogenesi delle varie forme di diabete e dello sviluppo di migliori modalità diagnostiche e terapeutiche.

Obiettivo

L’obiettivo di questo articolo è quello di riassumere novità in tema di diabete in età pediatrica pubblicate nella letteratura internazionale negli ultimi 2-3 anni.

Metodologia della ricerca bibliografica

La ricerca degli articoli è stata effettuata sulla banca dati bibliografi-ca Medline utilizzando il motore di ricerca PubMed. Sono state utiliz-zate le seguenti parole chiave: “diabetes”, “type 1 diabetes”, “type 2 diabetes”, “monogenic diabetes” and “children” and “adolescents”. Sono stati selezionati articoli pubblicati prevelentemente tra 2010 e 2012, riguardanti la fascia di età tra 0 e 18 anni.

Novità in tema di epidemiologia del diabete in età pediatrica

Il T1D rappresenta il 90% di tutti i casi di diabete durante l’infanzia e l’adolescenza. Nel corso delle ultime decadi l’incidenza del T1D

Diabete in età pediatrica: cosa c’è di nuovo?

Maria Loredana Marcovecchio, Francesco ChiarelliClinica Pediatrica, Università di Chieti, Chieti

RiassuntoIn questo articolo verrano presentate novità in tema di diabete in età pediatrica, soprattutto sul diabete di tipo 1 (T1D), sulla base di recenti pubblicazioni in letteratura internazionale. Nel corso degli ultimi anni numerosi studi hanno portato a capire meglio i meccanismi alla base del T1D. Progressi nell’ambito della genetica hanno condot-to all’identificazione di numerosi geni implicati nella patogenesi del T1D. Un’altra area di intensa ricerca è stata quella volta ad identificare fattori ambientali in grado di spiegare il rapido aumento nell’incidenza del T1D. Numerosi studi hanno analizzato fattori quali infezioni virali, deficit di vitamina D, fattori pre-, peri- e post-natali, quali ad esempio aumento di peso materno durante la gravidanza, peso alla nascita, alimentazione nei primi mesi di vita che possano contribuire alla patogenesi del T1D, e che potrebbero rappresentare bersagli di strategie preventive future. Ulteriori argomenti che verranno discussi in questa sezione sono i risultati di recenti trial clinici con farmaci immunosoppressori, incretine e nuovi analoghi insulinici (insulina degludec). Infine verranno presentate novità in tema di diabete di tipo 2 e diabete monogenico nei bambini e adolescenti.

SummaryIn this article recent findings on paediatric diabetes, with particular emphasis on type 1 diabetes (T1D), will be presented. Over the last years, several stud-ies have allowed a better understanding of the mechanisms implicated in the pathogenesis of T1D. Genetic studies have led to the identification of several loci associated with the disease. In addition, a large number of studies have assessed the potential role of viral infections, vitamin D deficiency, as well as prenatal, neonatal and post-natal factors, such as maternal weight gain during pregnancy, birth weight, early feeding, in the pathogenesis of T1D. These factors could represent important targets for future preventive strategies. Recent progresses in terms of treatment of T1D, including immunosuppressive therapies, incretins and new insulin analogues (degludec) will be discussed. New findings in the context of type 2 diabetes and monogenic diabetes in children and adolescents will be also presented.

M. L. Marcovecchio, F. Chiarelli

222

è aumentata significativamente nella fascia di età 0-14 anni, con un aumento particolarmente marcato nei bambini di età inferiore ai 5 anni (Patterson et al., 2009). Sulla base di recenti dati pubblicati dalla International Diabetes Federation (IDF), relativi all’anno 2011, nel mondo ci sono circa 490.000 bambini di età inferiore ai 14 anni affetti da T1D; con 79.000 nuove diagnosi ogni anno e un incremen-to annuo dell’incidenza di circa il 3% (IDF, 2011).Per quanto riguarda la situazione italiana, recenti dati del Registro Italiano del Diabete mellito in Italia (RIDI) indicano un’incidenza del T1D, nel periodo 1990-2003, di 12,26 per 100.000 persone-anno, con aumento temporale pari a 2,9% per anno. La più alta incidenza si riscontra in Sardegna, seguita da regioni del Nord Italia, soprattut-to della provincia di Trento, mentre un’incidenza intermedia è stata riscontrata nel centro-Sud e la più bassa incidenza in Campania (8,10 per 100.000 per anno) (Bruno et al., 2010).Inoltre, negli ultimi anni, parallelamente con la crescente epidemia

dell’obesità infantile, si è assistito anche all’emergere del T2D, pa-tologia a lungo considerata come esclusiva dell’età adulta. Il T2D è particolarmente frequente negli USA e soprattutto tra adolescenti appartenenti a minoranze etniche (D’Adamo-Caprio, 2011). Tuttavia, un crescente numero di casi di T2D è stato riportato anche in altre parti del mondo, come in Giappone e in Europa. Per quanto riguarda la situazione italiana, sebbene casi di T2D manifesti non siano parti-colarmente frequenti tra i bambini e adolescenti (prevalenza: 0,5%), un recente studio ha documentato una prevalenza di intolleranza glucidica di circa il 12,4% tra i giovani pazienti obesi (Brufani et al., 2010).Progressi nell’ambito della genetica hanno permesso anche una migliore caratterizzazione e definizione epidemiologica di casi di diabete mongenico, come il diabete neonatale e il MODY, che sep-pur rappresentino forme rare di diabete, necessitano di una corretta diagnosi ai fini di una ottimale gestione ed impostazione terapeutica.

Tabella I.Classificazione eziologica del diabete

Diabete di tipo 1 (T1D) immuno-mediato idiopatico

Distruzione delle cellule β che conduce ad un deficit assoluto di insulina

Diabete di tipo 2 (T2D) Resistenza all’insulina e deficit di insulina di grado variabile

Altri tipi di diabete

a) Difetti genetici dello sviluppo o funzione delle β-cellule MODY, DNA mitocondriale, Diabete neonatale

b) Difetti genetici dell’azione insulinica insulino-resistenza di tipo A, diabete lipoatrofico, Leprechaunismo, sindrome di Rabson-Mendenhall, altri

c) Malattie del pancreas esocrino fibrosi cistica, pancreatite, emocromatosi, trauma/pancreatectomia, neoplasie

d) Endocrinopatie sindrome di Cushing, feocromocitoma, ipertiroidismo, somatostatinoma, alderosteronoma, acromegalia

e) Indotto da farmaci o prodotti chimici glucocorticoidi, diazossido, pentamidina, agonisti β-adrenergici, ac nicotinico, tacrolimus, α-Interferon

f) Infezioni rosolia congenita, cytomegalovirus, enterovirus, altri

g) Forme non comuni di diabete immuno-mediato sindrome dello ‘stiff-man’, anticorpi anti-recettore dell’insulina

h) Altre sindromi genetiche associate talora a diabete s. di Wolfram (DIDMOAD), s. Di Down, s. di Klinefelter, s. di Prader-Willi, s. di Bardet-Biedl, s. di Turner, distrofia miotonica, altre

Diabete gestazionale

Tabella II.Diagnosi differenziale tra le principali forme di diabete in età pediatrica.

Caratteristiche T1D T2D Diabete monogenico

Età alla diagnosi 6 mesi→età adulta Pubertà (o più tardi) Spesso post-pubertà (eccetto deficit di glucochinasi e diabete neonatale)

Presentazione clinica Acuta, rapida Variabile: presentazione con sintomi da lievi a gravi

Variabile (può essere incidentale in deficit glucochinasi)

Associazioni

Autoimmunità Si No No

Chetosi Comune Non comune Comune nel diabete neonatale, rara in altre forme

Obesità Stessa frequenza della popolazione

Aumentata frequenza Stessa frequenza della popolazione

Acanthosis nigricans No Si No

Frequenza (% di tutti i casi di diabete) 90% <10% (60-80% in Giappone) 1-3%

Genitore con diabete 2-4% 80% 90%


223

Novità in tema di patogenesi del T1D

Il T1D è una patologia complessa che risulta dalla interazione di vari fattori genetici e ambientali e in cui il sistema immune rappresenta una componente cardine (Todd, 2010). Progressi nell’ambito della genetica hanno portato alla identifica-zione di numerosi geni implicati nella patogenesi multifattoriale del T1D. Gli alleli del sistema HLA di classe II sono alla base di gran parte del rischio genetico del T1D (circa il 30-50%). Tuttavia, recenti studi hanno dimostrato che vi sono anche numerosi loci non-HLA (ad esempio geni dell’insulina, PTPN22, CTLA4, IL2RA, IFIH1) che contribuirebbero al rischio di sviluppare il T1D, sebbene ciascuno di tali alleli avrebbe un contributo di minima entità (Pociot et al., 2010). I nuovi casi di diabete che si sono manifestati nel corso degli ultimi anni presentano una minore frequenza di genotipi HLA ad alto rischio ed una più alta frequenza di genotipi a basso rischio (Gille-spie et al., 2004). Molte regioni cromosomiche associate con il T1D sono state identificate grazie a studi di genome wide association (GWAS), anche se ulteriori studi sono necessari per identificare i geni corrispondenti a tali regioni e la loro funzione. Recenti studi han-no sottolineato l’importanza di combinare studi GWAS con studi di espressione genica e analisi di network proteici, al fine di poter me-glio capire la componente genetica del T1D (Bergholdt et al., 2012). Recenti studi indicano che cambiamenti nel fenotipo immune po-trebbero in parte spiegare l’aumentata incidenza del T1D. In parti-colare recenti evidenze suggeriscono che i casi di T1D diagnosticati nelle decadi più recenti si associano ad una risposta immune più matura e aggressiva, rispetto ai casi diagnosticati in decadi pre-cedenti, come sottolineato da una maggiore frequenza e concen-trazione di autoanticorpi quali IA-2 and ZnT8A, che normalmente compaiono durante fasi avanzate del processo autoimmune diretto contro le β-cellule pancreatiche (Long et al., 2012).Da un punto di vista epidemiologico, il trend di aumento nell’inci-denza del T1D appare essersi verificato in maniera troppo rapida per poter essere semplicemente giustificato da cambiamenti nel background genetico, mentre appare essere più facilmente spiega-bile con cambiamenti in fattori ambientali (Vehik-Dabelea, 2011). Numerosi studi hanno analizzato fattori pre-, peri- e post-natali, il deficit di vitamina D e le infezioni virali, che possono rappresentare bersagli di strategie preventive future (Vehik and Dabelea, 2011).Fattori prenatali, come un eccessivo aumento ponderale materno durante la gravidanza, un elevato peso alla nascita sono emersi come fattori predisponenti allo sviluppo di T1D. Il parto cesareo è stato inoltre associato ad una maggiore frequenza di T1D quando confrontato con il parto spontaneo in nati da genitori con T1D, pro-babilmente dovuto ad una diversa composizione della flora intesti-nale del neonato, quale risultato di microorganismi con cui si viene a contatto al momento del parto, che sono diversi a seconda che esso si espleti per via vaginale o attraverso taglio cesareo (Bonifacio et al., 2011). Numerosi sarebbero i potenziali fattori di rischio che agirebbero du-rante fasi precoci della vita postnatale. Di particolare interesse in tale contesto sono stati i risultati di un recente trial che ha valutato l’effetto di due diverse formule per neonati, una formula standard (80% proteine del latte e 20% proteine idrolisate) e una formula alternativa basata su caseina idrolizzata, sulla sieroconversione agli autoanticorpi del T1D, in neonati a termine con suscettibilità gene-tica (Knip et al., 2010). L’intervento con formula idrolizzata è stata associata a riduzione significativa del rischio di sieroconversione. In-fatti durante il follow-up, la sieroconversione si è verificata nel 17% dei bambini del gruppo della formula idrolisata rispetto a un 30% dei

bambini allattati con formula standard. Vari studi hanno inoltre di-mostrato una diretta associazione tra deficit di vitamina D e aumen-tato rischio di sviluppare T1D (Cooper et al., 2011; Sorensen et al., 2012). Inoltre, come ben emerso da una recente meta-analisi, una diretta associazione esiste anche tra evidenza molecolare di infezio-ni da enterovirus e rischio di sviluppare T1D (Yeung et al., 2011). Il meccanismo attraverso cui gli enterovirus contribuiscono al rischio di T1D sono complessi, ma probabilmente è importante considerare l’interazione tra virus, sistema immune, cellule pancreatiche e geno-tipo del paziente. Recenti studi hanno evidenziato come le infezioni da enterovirus più che agire da trigger per l’innesco del processo autoimmune agirebbero sulla progressione dalla comparsa degli au-toanticorpi al diabete manifesto vero e proprio.

Novità in tema di patogenesi del T2D e diabete monogenicoPer quanto riguarda il T2D, studi condotti negli ultimi anni hanno confermato che, come nell’adulto, anche nel bambino, vi sia un ruo-lo concomitante di ridotta sensibilità insulinica a livello epatico e muscolare e deficit nella secrezione insulinica nella patogenesi di questa forma di diabete (Fig. 1) (D’Adamo and Caprio, 2011).Vari studi nel corso degli ultimi anni hanno cercato di smascherare la componente genetica che influenza il rischio di T2D. Tale com-ponente appare essere complessa e studi GWAS hanno portato alla identificazione di circa 60 loci associati con il T2D, anche se ciascu-no di essi ha un minimo contributo sul rischio globale (Ntzani and Kavvoura, 2012). In età pediatrica non bisogna dimenticare l’esistenza di altre forme di diabete, come il diabete monogenico (diabete neonatale, MODY), che spesso non richiedono terapia insulinica, ma possono benefi-ciare del trattamento con ipoglicemizzanti orali, quali le sulfanilu-ree. Recenti studi hanno evidenziato come vi siano numerosi casi di MODY incorrettamente diagnosticati, come T1D o T2D. Inoltre re-centi dati supportano l’idea che la classificazione classica del MODY e del diabete neonatale su base clinica debba essere sostituita da una diagnosi e classificazione su base genetico-molecolare, che of-frirebbe una migliore e più utile guida per il management clinico (Hattersley et al., 2009).

Novità in tema di trattamento del diabete in età pediatricaNel corso degli ultimi decenni sono stati anche compiuti numerosi progressi volti a migliorare il trattamento del T1D nel bambino, con

Figura 1.Rappresentazione schematica della patogenesi del diabete di tipo 2.

M. L. Marcovecchio, F. Chiarelli

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l’obiettivo di garantire un controllo metabolico ottimale ed evitare complicanze a breve e lungo termine. Questi hanno incluso l’intro-duzione di analoghi insulinici ad azione rapida e lenta nell’ambito di una terapia basal-bolus (basata sull’uso di analogo insulinico lento, per coprire il fabbisogno insulinico basale e analoghi insulinici rapi-di, per coprire le richieste associate ai pasti), la terapia con microin-fusore, e l’introduzione di un monitoraggio continuo della glicemia. Di crescente interesse sono i vari studi, ancora in corso, volti allo sviluppo di un ‘pancreas artificiale’, che consiste in un dispositivo che integra un microinfusore, un sistema di monitoraggio glicemico e un algoritmo, che aggiusta l’infusione insulinica in base ai valori glicemici rilevati (Elleri et al., 2011). Un’ulteriore area di particolare interesse riguarda la valutazione di nuove terapie, come gli immuno-soppressori e le incretine, da iniziare subito dopo la diagnosi o anche prima della diagnosi clinica di T1D, per cercare di bloccare il proces-so autoimmune, e di preservare la residua produzione insulinica e la funzionalità β-cellulare (Tooley et al., 2012). Vari trial su terapie immunosoppressive di breve durata volte a preservare la funziona-lità β-cellulare hanno fornito risultati deludenti, come ad esempio i recenti risultati di un trial di fase III sull’uso di anti-GAD (Ludvigsson et al., 2012). Tali risultati negativi sottolineano tuttavia l’importanza di una migliore selezione dei pazienti da sottoporre a tali terapie, l’importanza di un periodo di trattamento probabilmente più lungo, cosi come la possibilità che il trattamento ideale non si debba ba-sare su una singola terapia, ma su diversi approcci diretti a diverse componenti del sistema immune implicate nella patogenesi del T1D.Per quanto riguarda il trattamento del T2D in età pediatrica, esso

si basa soprattutto su dieta e esercizio fisico (Flint and Arslanian, 2011). La Metformina è l’unico farmaco approvato per l’uso in ado-lescenti con T2D, mentre in casi specifici può essere necessario il ricorso alla terapia con insulina. Di recente sono stati pubblicati i risultati di un ampio trial condotto in vari centri negli USA, che ha evidenziato come la combinazione di Metformina e Rosiglitazione fornisce qualche beneficio in più rispetto a Metformina e cambia-menti dello stile di vita (Zeitler et al., 2012). Vari studi sono in corso e stanno valutando ulteriori approcci terapeutici con farmaci approvati per l’adulto con T2D, quali ad esempio gli incretino-mimetici (analo-ghi del GLP-1, DPP-4 inibitori). Inoltre in termini di nuovi analoghi insulinici, promettenti sono i risul-tati di studi condotti su pazienti adulti con T1D e T2D sull’uso dell’in-sulina degludec, un analogo a lunga durata d’azione, con maggiore stabilità rispetto agli analoghi lenti attualmente in commercio e in uso. Si attendono però i risultati di studi in età pediatrica.

ConclusioniIl diabete mellito è senz’altro un’importante endocrinopatia dell’età pediatrica, la cui diagnosi e trattamento precoci sono di primaria importanza al fine di evitare la morbidità e mortalità associate con tale patologia. I dati epidemiologici di un crescente numero di casi di T1D e T2D sono allarmanti e suggeriscono l’importanza di ulteriori studi volti a chiarirne l’eziopatogenesi, al fine di poter implementare strategie preventive e di trattamento mirate.

Che cosa si sapeva primaIl T1D è stato a lungo considerato come la forma prevalente di diabete nel bambino e la terapia insulinica è da qualche tempo nota come l’unico trat-tamento di tale patologia.È noto che la patogenesi del T1D è multifattoriale ma non è del tutto chiara.

Cosa sappiamo adessoRecenti studi hanno documentato una crescente incidenza del T1D. Inoltre l’epidemia dell’obesità in età pediatrica si è associata con un sempre mag-gior numero di casi di T2D.Studi di genetica hanno permesso sia l’identificazione di varie regioni geniche associate con il rischio di sviluppare T1D o T2D che una migliore carat-terizzazione delle forme di diabete monogeniche, fondamentale ai fini diagnostici e prognostici. Vari fattori ambientali, agenti già in epoca pre-natale e durante le fasi precoci postnatali, appaiono essere implicati nella patogenesi del T1D e potreb-bero pertanto rappresentare targets di future strategie preventive.

Quali ricadute sulla pratica clinicaUna diagnosi corretta di diabete è di fondamentale importanza per stabilire un trattamento mirato e adeguato.Gli analoghi insulinici, la terapia con microinfusore, e altre terapie (metformina, sulfuniluree), hanno migliorato il management del diabete in età pe-diatrica.Altri studi sono tuttavia necessari per una migliore definizione eziopatogenetica delle varie forme di diabete e per guidare lo sviluppo di nuove strategie preventive e di trattamento.

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Corrispondenza

Francesco Chiarelli, Clinica Pediatrica, Università di Chieti, Via dei Vestini, 5, 66100 Chieti. Tel.: +39 0871 35815. Fax +39 0871 574831. E-mail: [email protected]


226

Introduzione

Il diabete è definito come un gruppo di patologie metaboliche ca-ratterizzate da iperglicemia, che può derivare da un difetto nella secrezione di insulina, nell’azione dell’insulina o in entrambi. Diver-si meccanismi eziopatogenetici possono condurre allo sviluppo di diverse forme di diabete.Tradizionalmente i pediatri hanno avuto esperienza clinica del dia-bete nella forma definita come insulino dipendente o giovanile e successivamente, in modo più preciso in base alla patogenesi, come autoimmune o di tipo 1 (DMT1), contrapposto al diabete di tipo 2 (DMT2), tipico dell’età adulta. Negli ultimi 10-20 anni con il perfezionamento delle metodiche di indagine di biologia molecolare e di studio dell’autoimmunità, il quadro si è modificato, consentendo di identificare nuove forme di diabete causate da mutazioni monogeniche, in particolare per ciò che riguarda il diabete neonatale. Si tratta diagnosi rare che hanno importanti implicazioni patogenetiche e terapeuticheInoltre come conseguenza dell’attuale epidemia di obesità è atteso un importante incremento del diabete tipo 2 già in età adolescen-ziale.

Obiettivo

Presentare le diverse forme di diabete non autoimmune, l’iter dia-gnostico da seguire in base al sospetto clinico e le conseguenti pos-sibilità terapeutiche

Modalità di ricerca

I dati per questo articolo sono stati selezionati da una Medline utiliz-zando le parole “type 2 diabetes children”, “MODY”, “neonatal dia-

betes”, con filtro per articoli successivi al 2008. Sono inoltre stati in-clusi studi noti agli autori, anche se pubblicati prima di questa data.

I criteri diagnostici per la diagnosi di diabete mellito sono stati rivisti dall’“American Diabetes Association” nel gennaio 2011 (Tab. I)”; la novità più rilevante è l’introduzione di un valore di emoglobina gli-cosilata pari a 6.5% come criterio diagnostico isolato sufficiente alla diagnosi. (ADA, 2012). Tuttavia ci sono difficoltà nella standardizza-zione dei metodi analitici e nella variabilità inter-individuale nella relazione tra glicemia e HbA1c.La maggioranza dei casi di DM rientra nelle categorie DMT1 o DMT2, a seconda che l’eziologia sia il danno auto immune delle beta-cel-lule pancreatiche, con conseguente mancata produzione di insulina, o anomalie che si traducono in una resistenza all’azione dell’insulina e in un’inadeguata aumentata produzione compensatoria. Il DMT1 rappresenta circa il 90% delle forme ad esordio in età pe-diatrica; la diagnosi clinica (poliuria, polidipsia, calo ponderale asso-ciati a riscontro di iperglicemia) viene confermata dalla presenza di positività per almeno uno dei noti autoanticorpi contro le beta cellule pancreatiche: ICA (anti isola pancreatica), IAA (anti insulina), GAD (anti glutammico decarbossilasi), IA2 (anti fosfo-tirosin-fosfatasi), ZnT8 (anti trasportatore dello zinco). Un inquadramento anamnestico (che comprenda anche un’accurata anamnesi familiare) del paziente affetto da DM è fondamentale per avanzare un sospetto clinico di diabete non autoimmune. Dati che devono far porre il sospetto di diabete su base non autoimmune:

• età di esordio inferiore ai 6 mesi;• insulinoresistenza importante (valori di insulinemia anche 100

volte superiori alla norma) (eventualmente associata a iperlipe-mia, ipertensione, acanthosis nigricans, policistosi ovarica, ste-atosi epatica);

Diagnosi del diabete nel bambino: quando pensare anche al diabete non-autoimmune

Franco Meschi, Valeria Favalli, Giusy FerroClinica Pediatrica, Istituto Scientifico Universitario, Ospedale San Raffaele, Milano

SommarioLa maggioranza di casi di diabete mellito dell’infanzia e dell’adolescenza è rappresentata dal diabete di tipo 1 (autoimmune). Negli ultimi anni sono però aumentati in tutto il mondo i casi di diabete a eziologia differente, ovvero diabete mellito di tipo 2 (correlato all’aumento dell’obesità infantile) e diabete mo-nogenico. Riguardo a quest’ultimo, tecniche diagnostiche e conoscenze genetiche sempre più accurate ne hanno permesso una caratterizzazione sempre più precisa. Anamnesi familiare e personale e caratteristiche cliniche peculiari permettono di formulare un corretto sospetto diagnostico e di orientare la diagnosi differenziale tra i diversi tipi di diabete, per un adeguato approccio diagnostico terapeutico.

SummaryType 1 (autoimmune) diabetes still represents the majority of cases of diabetes mellitus in children and adolescents. However, cases of different types of diabetes have recently increased, mainly type 2 diabetes (due to the global obesity epidemic) and monogenic diabetes. More accurate diagnostic tech-niques and genetic knowledge have led to a better characterization of monogenic diabetes. Personal/family medical history and specific clinical features allow a correct clinical suspect and to distinguish between types of diabetes, in order to implement an appropriate diagnostic and therapeutic approach.


227

• storia familiare di diabete ad eredità autosomica dominante;• iperglicemia lieve (valori compresi tra 100 mg/dl e 150 mg/dl a

digiuno) in paziente con familiarità;• fabbisogno insulinico minimo al di fuori della fase di parziale

remissione;• diabete associato a peculiari caratteristiche sintomatologiche/

cliniche extrapancreatiche (sordità, atrofia ottica, facies sindro-mica);

• storia di esposizione a farmaci responsabili di tossicità nei con-fronti delle beta cellule o responsabili dello sviluppo di insulino-resistenza.

Il sospetto clinico è avvalorato dalla negatività dello screening per autoimmunità correlata a DMT1.

Diabete mellito tipo 2Sta diventando un problema sanitario sempre più importante in tutto il mondo, ed è correlato in primo luogo al progressivo incremento della percentuale di bambini e adolescenti obesi (Gupta et al., 2012).Negli Stati Uniti il DMT2 in età adolescenziale rappresenta circa il 50% di tutte le diagnosi di DM (Reiner et al., 2006) mentre in Italia non si è ancora avuto un simile aumento della frequenza.Diventa quindi importante anche per il pediatra avere le compe-tenze necessarie per effettuare una diagnosi tempestiva di questa forma di diabete al fine di limitarne i rischi sul breve e sul lungo termine.

Sospetto DMT2 nei seguenti casi:• Insorgenza in età puberale (fisiologico picco di insulinoresistenza);• Associazione con obesità e segni di insulinoresistenza (iperli-

pidemia, ipertensione, acanthosis nigricans, policistosi ovarica, steatosi epatica);

• Razza non caucasica;• Familiarità per DMT2;• Assenza di autoanticorpi contro le beta cellule pancreatiche e

assenza di HLA predisponente.Le modalità di presentazione sono:• iperglicemia occasionale rilevata in corso di esami di routine o

episodi infettivi;• poliuria, polidipsia, glicosuria ed eventuale chetosi/chetoacidosi

(in questi casi molto spesso viene erroneamente posta diagnosi di DMT1);

• in rari casi disidratazione severa e potenzialmente fatale (coma iperglicemico iperosmolare, iperkaliemia).

La modalità di presentazione alla diagnosi influenzerà anche il tipo di trattamento (terapia dietetica ed esercizio fisico, metformina o insulina) e gli esami diagnostici da effettuare Nei soggetti asintomatici con riscontro di iperglicemia occasiona-le sarà necessaria la conferma del dato su almeno due prelievi ed eventualmente un test da carico orale con glucosio. Non esiste pos-sibilità di diagnosi genetica in quanto si tratta di forme a eziologia poligenica con il coinvolgimento di numerosi geni in buona parte ancora ignoti.

Nei soggetti sintomatici, per la diagnosi è sufficiente un singolo va-lore di glicemia superiore a 200 mg/dl.È inoltre fondamentale indagare già al momento della diagnosi la presenza di eventuali comorbilità e complicanze che possono asso-ciarsi al DMT2 attraverso:

• Misurazione della pressione arteriosa;• Ricerca della microalbuminuria;• Profilo lipidico;• Tests di funzionalità epatica ed eventualmente esame ecografico

del fegato.

Dovranno essere infine effettuati il dosaggio dell’insulinemia e del C-peptide e lo screening autoanticorpale: la distinzione tra DMT1e DMT2 non è però sempre così chiara, andandosi a delineare soprat-tutto negli ultimi anni (a causa dell’aumento del numero dei bambini sovrappeso) il “diabete doppio” o “diabete uno e mezzo” (Badaru and Pihoker, 2012).Si tratta della presenza di autoanticorpi (solitamente uno) contro la beta cellula in bambini con caratteristiche di insulinoresistenza e spesso familiarità per DMT2. Un confronto tra pazienti affetti da DMT2 con o senza autoanticorpi non pare evidenziare differen-ze in termini di età alla diagnosi, profilo lipidico, pressione, peso all’esordio, livelli di C-peptide e emoglobina glicosilata (Rheiner et al., 2006). Un altro studio indica l’importanza di una corretta clas-sificazione eziologica del diabete con esordio in età giovanile: seb-

Tabella I.Diabete Mellito: criteri diagnostici (IDF/ISPAD/ADA 2011).

Sintomi di diabete + riscontro di glicemia casuale ≥ 200 mg/dL

Oppure

Glicemia a digiuno ≥ 126 mg/dL

Oppure

Glicemia a 2 ore dopo carico orale di glucosio** ≥ 200 mg/dL

Oppure

HbA1c ≥ 6.5%

* per digiuno si intende la non assunzione di calorie per almeno 8 ore.** il test deve essere eseguito secondo le indicazioni OMS usando un carico di glucosio pari a 75 g di glucosio dissolto in acqua o 1,75 g glucosio/Kg di peso fino ad un massimo di 75 g.

Figura 1. Acantosis nigricans in paziente affetto da sindrome da insulinoresisten-za severa.

F. Meschi, V. Favalli, G. Ferro

228

bene la maggior parte rientri nelle categorie DMT1 (autoimmunità e insulinosensibilità) o DMT2 (non autoimmunità, insulinoresistenza), esiste una significativa percentuale di pazienti che si colloca al con-fine tra i due gruppi (circa il 20% presenta sia autoimmunità sia insulinoresistenza, circa il 10% non presenta né autoimmunità né insulinoresistenza) (SEARCH, Dabelea et al., 2011).

Diabete monogenicoÈ dovuto a mutazioni in singolo gene, spesso di geni che regolano la funzione beta cellulare; in rari casi possono essere mutati geni che si rendono responsabili di quadri di grave insulinoresistenza, oppure può essere mutato direttamente il gene dell’insulina.Deve essere sottolineato che le diverse forme di diabete monoge-nico rappresentano una piccola percentuale (1-5%) di tutti i casi di diabete (Massa et al., 2005).Il sospetto clinico deve insorgere nei casi di diabete neonatale, di diabete associato a particolari caratteristiche extrapancreatiche, di marcata familiarità per diabete, e di modesta iperglicemia a digiuno. A questo si andranno poi ad aggiungere elementi che permettano di escludere DMT1 e il DMT2: assenza di autoanticorpi, obesità, acan-thosis nigricans, insulinoresistenza.La diagnosi di diabete monogenico può essere confermata da spe-cifici test genetici, che andranno effettuati in modo mirato in base alla storia clinica e all’età di esordio in pazienti selezionati (ISPAD, 2009).

Diabete neonatale

La definizione classica è quella di presenza di iperglicemia persi-stente (valori superiori a 126 mg/dl dopo 4 ore di digiuno) che ne-cessiti di terapia insulinica per almeno 3 giorni e compaia nel primo mese di vita (incidenza 1: 90.000 circa in Italia negli anni 2005-2010) (Iafusco et al., 2011).In seguito alla definizione di eziologia prevalentemente genetica del diabete ad esordio nei primi sei mesi di vita, anche grazie ad uno studio italiano è stata proposta la definizione di Diabete Monogenico dell’Infanzia, che include tutti i casi di diabete mellito non autoim-mune nei quali la diagnosi è effettuata nei primi sei mesi di vita (ADA, 2012).Gli esami ematici da effettuare sono: profilo glicemico, dosaggio in-sulinemia e C-peptide basale e post-prandiale, autoimmunità corre-lata a DMT1 e fruttosamina.A seconda dell’esito di tali esami la diagnostica verrà indirizzata verso una forma di deficit funzionale della beta cellula (insulinemia e C-peptide indosabile), una forma autoimmune da inquadrarsi ve-rosimilmente in IPEX (sindrome da immunodisregolazione, poliendo-crinopatia, enteropatia, legata alla X) o APECED (poliendocrinopatia autoimmune, candidosi, distrofia ectodermica) o una forma di insu-linoresistenza ad esordio precoce (Insulinemia e C-peptide franca-mente elevati).Dopo la stabilizzazione del quadro clinico ogni caso di diabete ad esordio in età inferiore ai 6 mesi (e i genitori) deve essere sottoposto insieme con i suoi genitori a screening per le alterazioni genetiche più probabili in base alla storia clinica (Greeley et al., 2011). Le indagini genetiche unitamente alla clinica permetteranno di dif-ferenziare:

• diabete mellito neonatale transitorio: una forma compare entro le prime 6 settimane di vita e va in remissione entro i primi 18 mesi; una forma transitoria recidivante può invece ricompari-re nelle età successive (50% dei casi). Le basi genetiche sono

spesso anomalie del cromosoma 6q24 (disomia uniparentale) o mutazioni in KCNJ11 o ABCC8 (che codificano per le subunità proteiche Kir 6.2 e SUR1 del canali ATP-potassio dipendenti per l’insulina) (Greeley et al., 2011);

• diabete mellito neonatale permanente: la maggior parte dei casi è dovuta a mutazione in eterozigosi o omozigosi di uno dei geni che codificano per il canale dell’insulina (talvolta inquadrabile nel contesto della sindrome DEND-Developmental delay, Epilep-sy, Neonatal Diabetes) o del gene INS che codifica per l’insulina. Il deficit assoluto di glucochinasi da omozigosi è una causa non frequente di diabete mellito neonatale permanente, che deter-mina perdita della funzione di glucose sensor, con conseguente incapacità a produrre insulina in presenza di iperglicemia (Rus-so et al., 2012, Massa et al., 2005, Ashcroft and Harris, 1984);

• Sindrome da insulinoresistenza severa: mutazione a carico del gene che codifica per il recettore dell’insulina. L’esordio in età neonatale è tipico delle mutazioni responsabili delle espressioni fenotipiche particolarmente severe (leprecaunismo e sindrome di Rabson Mendenhall) (Fig. 1).

La terapia con insulina deve essere instaurata precocemente e mantenuta finché pemane l’iperglicemia, con l’importante eccezio-ne delle mutazioni del canale del potassio, che beneficiano di un trattamento con sulfaniluree per via orale con migliore controllo gli-cometabolico e qualità di vita (Tonini et al., 2006). Non esiste invece terapia efficace per il diabete da mutazioni del recettore per l’insuli-na: tentativi terapeutici sono stati effettuati con Insulin Like Growth Factor (IGF1) con incerti risultati.

Diabete familiare (MODy: maturity onset diabetes of the young)

È la forma più comune di diabete monogenico in Europa (1-2%) e rappresenta una forma autosomica dominante di diabete non insu-lino-dipendente, solitamente diagnosticata entro i 25 anni di vita. Diverse forme con specifiche mutazioni genetiche vengono raggrup-pate sotto l’acronimo MODY, e differiscono per a età d’esordio, entità dell’iperglicemia e caratteristiche cliniche associate.Molte forme di MODY vengono ancora erroneamente classificate come DMT1 o DMT2 (Shield et al., 2010); i test genetici molecolari attualmente disponibili permettono di effettuare diagnosi accurate, di definire il decorso clinico, il rischio di complicanze e il corret-to trattamento (dieta, ipoglicemizzanti orali, insulina). Dato il costo ancora elevato dell’analisi genetica molecolare, viene sottolineata l’importanza di effettuare un’accurata selezione clinica dei pazienti sui quali effettuare tali indagini.I difetti genetici più frequenti (75-90%), sono mutazioni a carico della glucochinasi (MODY 2) e a carico del fattore nucleare degli epatociti (HNF) (MODY 3) (Tab. II) (Thanabalasingham et al., 2011).

Il sospetto di MODY2 insorge in caso di:• Persistente iperglicemia a digiuno (110-140 mg/dl), confermata

su un periodo di mesi o anni;• Emoglobina glicosilata lievemente superiore ai limiti (raramente

oltre 7,5%);• Minimo incremento della glicemia dopo esecuzione di test da

carico orale con glucosio (OGTT);• Genitori, fratelli, zii, nonni con diagnosi di DMT2 senza compli-

canze o di diabete gestazionale o di iperglicemia persistente diagnosticate in età giovanile;

• È raccomandato, prima di procedere a test genetici, effettuare mi-surazione di glicemia e C-peptide nei genitori: si evidenzierà nella madre o nel padre la presenza di iperglicemia a digiuno (tranne rari casi di mutazione de novo nel bambino) (Ellard, 2008).


229

In uno studio italiano del 2009, condotto su una popolazione pedia-trica emerge che circa un quarto dei pazienti con riscontro di ipergli-cemia occasionale rientra dei criteri diagnostici per MODY: di questi il 63% risulta positivo per una mutazione del gene della glucochinasi (Massa, 2001, Lorini, 2009). La glucochinasi converte il glucosio in glucosio 6 fosfato, il cui metabolismo stimola la secrezione insuli-nica da parte delle beta cellule pancreatiche. Un difetto nell’enzima causa la necessità di una soglia glicemica più elevata per innescare la secrezione insulinica. Il MODY 2 costituisce la forma di diabete monogenico più spesso diagnosticata in stati dove il dosaggio della glicemia viene effettuato di routine in pazienti asintomatici (Italia, Francia, Spagna), mentre il MODY 3 rappresenta la forma più frequentemente diagnosticata laddove si ricorre meno frequentemente al dosaggio della glicemia come indagine di routine (Thanabalasingham et al., 2011).MODY 3 e il più raro MODY 1 sono causati da mutazioni a carico di un fattore di trascrizione epatico che causa una diminuzione del riassorbimento renale di glucosio. Sono caratterizzate da minima iperglicemia a digiuno ma importante rialzo dopo OGTT e presenza di glicosuria per valori glicemici inferiori alla soglia renale. Le altre forme di devono essere sospettate in base alle caratteristi-che cliniche riportate in tabella II.Negli ultimi anni sono state identificate altre mutazioni, non riportate in tabella, che rappresentano forme rarissime di diabete monogenico.

Mutazioni del gene dell’insulina

Mutazioni del gene dell’insulina sono state individuate come respon-sabili dell’insorgenza di diabete neonatale o della prima infanzia: hanno un effetto proteotossico che causa un danno persistente al reticolo endoplasmatico e risulta in ultima istanza nell’apoptosi della cellula beta. Studi recenti hanno evidenziato casi in cui il diabete dovuto a mutazione del gene dell’insulina si presenta al di fuori del periodo neonatale e viene quindi erroneamente diagnosticato come diabete di tipo 1. Si tratta di casi rari che devono essere presi in con-siderazione nel caso di pazienti che risultano negativi allo screening autoanticorpale (Bonfanti et al., 2009).

Sindrome di Wolfram

Una rara forma di diabete non autoimmune è presente nella sindro-me di Wolfram: diabete mellito, atrofia del nervo ottico,diabete insi-pido, anomalie renali (acronimo DIDMOAD). La sindrome è autoso-mica recessiva ed il diabete ha patogenesi ignota, con età media di esordio a 6 anni. L’associazione di diabete non autoimmune e atrofia del nervo ottico e/o diabete insipido consente di porre la diagnosi che può essere confermata con la ricerca di mutazione specifica (Wolframina – WFS1). La sindrome richiede terapia insulinica per tutta la vita, ha una prognosi severa, con progressione della atrofia del nervo ottico fino alla cecità, possibilità di insufficienza renale e deterioramento cognitivo (Greeley et al., 2011).

Cosa si sapeva primaIl diabete in età evolutiva viene tradizionalmente identificato con la forma insulino dipendente, dovuta al danno beta cellulare su base autoimmune diagnosticabile per la presenza di autoanticorpi specifici (Diabete mellito di tipo 1).

Cosa sappiamo adessoIl perfezionamento delle tecniche di biologia molecolare e di studio dell’autoimmunità hanno consentito di identificare forme di diabete monogenico non autoimmune.L’attuale “epidemia” di obesità porta a prevedere un aumento della prevalenza di diabete di tipo 2 con necessità di sicura diagnosi differenziale rispetto al tipo 1.

Quali ricaduteLa somministrazione di insulina per via sottocutanea rimane la terapia di gran lunga più comune in età evolutiva, tuttavia esistono alternative terapeu-tiche, come le sulfaniluree nel diabete monogenico neonatale e la metformina nel diabete tipo 2.

Box di orientamento

Tabella II.Caratteristiche del MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young).

Mutazione Prevalenza Clinica Età diagnosi Terapia

MODY 1 HNF 4α <5% Marcata sensibilità alle sulfaniluree, macrosomia fetale e ipoglicemia neonatale, HDL basse, LDL elevate

Prepubere dieta/insulina

MODY 2 GCK 30-70% Iperglicemia a digiuno moderata, scarso incremento dopo OGTT

Neonatale o prima infanzia dieta

MODY 3 HNF 1α 30-70% Bassa soglia renale per glicosuria, marcata sensibilità alle sulfaniluree

Prima infanzia ipoglicemizzanti orali, insulina

MODY 4 IPF1 <1% Agenesia pancreatica Neonatale (omozigote) / giovane adulto (eterozigote)

insulina (omozigote) / dieta (eterozigote)

MODY 5 HNF 1β 5-10% Malformazioni genitourinarie (cisti renali), atrofia pancreatica, insufficienza esocrina

dieta/insulina

F. Meschi, V. Favalli, G. Ferro

230

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Corrispondenza

Franco Meschi, Clinica Pediatrica, Istituto Scientifico Universitario, Ospedale San Raffaele, Via Olgettina 60, 20139 Milano. Tel. +39 02 2643 2624. Fax 02 2643 4050. E-mail: [email protected]


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Obiettivo

L’obiettivo di questo articolo è di evidenziare le enormi ricadute che l’introduzione delle nuove tecnologie avrà nel prossimo futuro sulla cura del diabete in età pediatrica.

Metodologia della ricerca bibliografica

La ricerca degli articoli rilevanti è stata effettuata sulla banca biblio-grafica Medline utilizzando il motore di ricerca PubMed. Sono state utilizzate le seguenti parole chiave: CSII, CGM, RT-CGM, Closed-loop. Sono stati considerati gli articoli comparsi negli ultimi 5 anni. È stato dato particolare rilievo alle linee guida delle società scientifiche (SIE-DP, AACE, ESPE-LWPES-ISPAD) e alle revisioni sistematiche (Health Technology Assessment, Cochrane database of systematic reviews). Sono stati citati alcuni articoli storici.

Microinfusione

Cenni storici

Gli obiettivi della terapia del diabete prevedono il mantenimento dei livelli glicemici in un range prossimo ai livelli fisiologici (DCCT, 1993) evitando le iperglicemie e particolarmente nei bambini in età pre-scolare le ipoglicemie protratte, che condizionano in maniera nega-tiva lo sviluppo cognitivo.Dopo l’introduzione nella pratica clinica della Continuous Subcuta-neous Insulin Infusion (CSII) negli anni Ottanta e con la commer-

cializzazione del primo analogo rapido nel 1996, il potenziale te-rapeutico della microinfusione è stato rivalutato suscitando nuovo interesse anche in età pediatrica (Pickup et al., 2002) (Fig. 1). Gli analoghi rapidi hanno ridotto le dimensioni del deposito di insulina nel sito di infusione rendendo più prevedibile l’assorbimento della stessa anche in età pediatrica.La terapia con CSII ha presentato negli ultimi dieci anni una progres-siva diffusione in età pediatrica, dimostrandosi sicura ed efficace anche per il notevole miglioramento delle caratteristiche tecniche dei microinfusori (Tab. I). Nel contempo sono state diffuse linee guida nazionali ed interna-zionali che hanno contribuito a definire le modalità di utilizzo anche considerando il rapporto costo/efficacia (Pinelli et al., 2008; Cum-mins et al., 2010; Grunberger et al., 2010).

Novità nel trattamento del diabete di tipo 1: dal microinfusore al pancreas artificiale

Stefano Tumini, Silvia CarinciClinica Pediatrica, Università di Chieti, Chieti

RiassuntoL’introduzione della Continuous Subcutaneous Insulin Infusion (CSII) e del Continuous Glucose Monitoring (CGM) ha comportato un miglioramento nella cura del diabete. Tuttavia l’impegno richiesto ai pazienti e/o alle famiglie rimane considerevole (controlli glicemici capillari, calcolo dei carboidrati, gestione dell’attività fisica e calcolo della dose d’insulina). Il rischio di ipoglicemia rimane inoltre un fattore limitante nel raggiungimento di un controllo glicemico ottimale e si associa a compromissione della qualità della vita. Le nuove tecnologie hanno riaperto le ricerche di un sistema ad ansa chiusa (Closed-Loop): il pancreas artificiale. Teoricamente l’utilizzo di un sistema CGM Real-Time (RT-CGM) associato ad un microinfusore, gestiti da un algoritmo computerizzato, è oggi fattibile. Per un uso clinico diffuso saranno necessari molti studi per superare le attuali limitazioni legate alla latenza con la quale viene rilevata la glicemia nel comparto interstiziale rispetto al sangue circolante e auspicabilmente saranno utili insuline con farmacocinetica ancora più favorevole rispetto agli attuali analoghi rapidi.

Summary Since their introduction in clinical practice, CSII (Continuous Subcutaneous Insulin Infusion) and CGM (Continuous Glucose Monitoring) have contributed to a significant improvement in daily care of diabetes. However, they require an intensive involvement of patients and families (self-monitoring of blood glucose, carbohydrates counting, management of physical activity and decisions about insulin dose). The risk of hypoglycaemia remains a limiting factor in the achievement of an optimal glycaemic control and it leads to a decreased quality of life. New technologies have stimulated research towards the development of a closed-loop system: the artificial pancreas. In theory, the use of a real-time CGM system (RT-CGM), associated to a pump, managed by a computerized algorithm, is feasible. For a larger clinical daily use, further studies are needed to overcome the actual technical limitations, consisting in delayed detection (by glucose sensor) of glucose value in the interstitial fluid, despite of rapid changes of glucose concentration in blood. Moreover new insulin molecules having a better farmacokinetic profile will be useful in clinical practice.

Figura 1. Principali tappe nello sviluppo tecnologico della CSII e del CGM.

S. Tumini, S. Carinci

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Selezione dei pazientiLa selezione dei pazienti pediatrici deve tener conto di caratteristi-che individuali e familiari. Ai pazienti e alle famiglie è richiesto un grado elevato di motivazione e una spiccata capacità di autogestio-ne. Infatti in molti casi sono necessarie anche 6-8 glicemie al giorno (Tab. II). Nel contempo le aspettative dei bambini e delle famiglie

devono essere realistiche in quanto spesso la CSII viene considerata come di per sé in grado di ottimizzare il controllo glicemico.Negli ultimi anni si è diffuso l’uso della CSII nei pazienti in età pre-scolare, visti gli evidenti vantaggi in termini di prevenzione delle ipo-glicemie e miglioramento della qualità della vita (Phillip et al., 2007) (Misso et al., 2010). In epoca neonatale la CSII si è affermata come terapia di elezione (Phillip et al., 2007) (Fig. 2). La diffusione della CSII ha permesso di definire dei pattern di fab-bisogno basale caratteristici delle varie fasce di età con indubbio vantaggio nell’approccio clinico pratico nell’avvio della CSII (Maahs et al., 2010).I fattori predittivi del successo terapeutico della CSII (riduzione dell’HbA1c e delle ipoglicemie, miglioramento della qualità della vita) sono rappresentati da (Shalitin et al., 2010):

• alti livelli di HbA1c all’inizio della terapia (in questi pazienti si osserva una significativa e persistente riduzione dell’HbA1c);

• età prescolare;• elevata frequenza dell’autocontrollo glicemico (SMBG);• bassi livelli di HbA1c all’inizio della terapia (in funzione del grado

dell’elevata motivazione questa tipologia di pazienti).

In termini assoluti il miglioramento dei livelli di HbA1c è modesto (0,3-0,9%) ma bisogna tener conto degli obiettivi terapeutici spe-cifici ed individuali prefissati, in particolare della riduzione marcata degli episodi di ipoglicemia grave (Misso et al., 2010) (Pańkowska et al., 2009).

Tabella I.Caratteristiche tecniche generali dei microinfusori attualmente in commercio.

Caratteristica Descrizione

Incremento basale Incremento dell’erogazione basale a partire da 0,025 U/ora

Basale temporanea Possibilità di modulare l’erogazione basale in maniera temporanea per intervalli prestabili (minimo 15-30’) rispetto alla basale attuale

Incremento dei boli Da un minimo di 0,05 U

Fattore di correzione per i carboidrati Può essere inserito manualmente o attraverso i software di gestione

Durata di erogazione del bolo Da 1 a 40”

Peso a vuoto 80-115 gr

Insulina residua Tiene conto dell’insulina precedentemente erogata per il calcolo dei boli

Profili basali È possibile preprogrammare profili basali diversi da utilizzare in giorni specifici

Tipi di bolo Standard, esteso, doppio (esteso + standard), correttivo, onda quadra, ecc.

Sofware di gestione Generalmente in versione per il paziente e per il medico, con la possibilità di visualizzare i dati in remoto

Tabella II. Indicazioni all’uso e caratteristiche dei centri e pazienti/famiglie che utilizzano la CSII.

Indicazioni per l’uso della CSII nelle varie età

Età prescolare e scolare

Ipoglicemia ricorrente

Marcata variabilità glicemica

Basse dosi di insulina con difficoltà di frazionamento

Agofobia

Età neonatale

Adolescenza

Ipoglicemia ricorrente

Fenomeno alba

Insulino resistenza

Miglioramento della qualità della vita

Scarso controllo metabolico

Caratteristiche e prerequisiti dei centri che utilizzano la CSII

Team pediatrico specializzato anche in grado di gestire l’istruzione

Reperibilità 24/24 ore

Interazione con personale scolastico

Caratteristiche e prerequisiti dei pazienti e delle famiglie

Consenso e assenso all’utilizzo

Elevato livello di motivazione

Elevato livello di istruzione all’autogestione

Propensione all’esecuzione di 5-8 glicemie al giorno

Figura 2. A: Sensore per glicemia Medtronic ENLITETM (Medtronic Minimed, Nor-thridge, USA); B: Microcannula per infusione sottocu-tanea d’insulina ComfortTM Short (Uno-medical, Lejre, Denmark);C: Ago per iniezione sottocutanea di insulina 0,23 mm, 32 G.


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Monitoraggio continuo della glicemiaIl monitoraggio glicemico continuo utilizza un sensore sottocutaneo che rileva i livelli di glucosio nei liquidi interstiziali e fornisce una sti-ma della glicemia plasmatica. La differente concentrazione nei due distretti (plasma e liquidi interstiziali) e la latenza con la quale i livelli di glucosio nei liquidi interstiziali si allineano a quelli plasmatici, ren-dono indispensabile una calibrazione attraverso l’esecuzione di gli-cemie capillari con reflettometri convenzionali (Mazze et al., 2009).

Aspetti tecniciAllo steady state la glicemia nei fluidi interstiziali è sovrapponibile a quella plasmatica ma in corso di rapido aumento o diminuzione della stessa la differenza tra i due distretti è direttamente proporzionale alla velocità di variazione dei livelli glicemici plasmatici (Cengiz et al., 2009). Le decisioni cliniche richiedono la conferma dei livelli di glucosio tramite esecuzione della glicemia capillare. I livelli di gluco-sio interstiziale presentano una latenza di 15-25 minuti rispetto alla glicemia plasmatica. L’errore percentuale medio degli attuali siste-mi Continuous Glucose Monitoring (CGM) si aggira intorno al 15% (Cengiz et al., 2009). Il monitoraggio continuo rileva l’andamento delle glicemie in maniera non evidenziabile con le metodologie tra-dizionali (Fig. 3).

Monitoraggio glicemico “real-time”

Dopo l’introduzione dei primi modelli, come ad esempio il MiniMed Continuous Glucose Monitoring System (CGMS©) (Northridge, CA) che misuravano i livelli di glucosio ogni 5 minuti per tre giorni e che fornivano l’analisi a posteriori ad uso prevalente dei centri di diabe-tologia, sono comparsi sul mercato i modelli Real-Time-CGM (RT-CGM), che presentano caratteristiche tecniche evolute (peso 7-10 gr, trasmissione dei dati tramite tecnologia wireless (generalmente onde radio)) e utilizzo di metodiche elettrochimiche basate sulla glu-cosio-ossidasi. I sistemi attualmente in commercio (Paradigm Veo (Medtronic, Northridge, CA, USA), l’Animas Vibe (Johnson & John-son, New Brunswick, NJ, USA) e il DexCom SevenPLUS CGM system) consentono una rilevazione continua della glicemia per intervalli di tempo di 7-10 giorni. I dati vengono visualizzati direttamente su un apposito display o sul display del microinfusore e consentono al paziente di adeguare l’infusione di insulina anche sulla base della velocità con la quale la glicemia aumenta o si riduce che viene se-gnalata con apposite frecce di tendenza. I sistemi attualmente in uso permettono di impostare limiti di sicurezza e quindi di segnalare gli episodi di ipo o iperglicemia con appositi allarmi.

Vantaggi dell’RT-CGM

Lo studio STAR 3 ha dimostrato l’efficacia con l’uso assiduo del mo-nitoraggio RT-CGM associato a CSII nel migliorare i livelli di HbA1c rispetto alla terapia multiiniettiva (Bergenstal et al., 2010) (Szypow-ska et al., 2012).I vantaggi dell’RT-CGM sono stati evidenziati anche in studi su casi-stiche di pazienti in buon controllo metabolico in cui si riducono so-prattutto le escursioni glicemiche (Beck et al., 2009). Ulteriori studi con RT-CGM hanno evidenziato come il problema delle ipoglicemie notturne rappresenti ancora un ostacolo al raggiungimento di glice-mie vicine alla norma (Roup et al., 2010). I sistemi attualmente in commercio sono il Paradigm Veo (Medtronic, Northridge, CA, USA), l’Animas Vibe (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA) e il DexCom SevenPLUS CGM system che può essere utilizzato anche nei pazienti in terapia multiiniettiva (Carg et al., 2011).

Rilevazione non invasiva delle ipoglicemie

Recentemente è stato proposto un interessante prototipo non in-vasivo per la rilevazione degli episodi di ipoglicemia notturna, ba-sato sulla rilevazione di parametri vitali quali: frequenza cardiaca, sudorazione, temperatura cutanea e tremori attraverso l’utilizzo di normali sensori transcutanei (privi quindi di aghi sottocutanei) ed un algoritmo in grado di prevedere le ipoglicemie (Schechter et al., 2012).

Verso la chiusura dell’ansa: CGM + CSII

I progressi realizzati nel campo della microinfusione e del moni-toraggio glicemico hanno portato all’implementazione di funzioni evolute combinando i due sistemi (Tab. III). Il primo risultato è sta-to quello della commercializzazione di un sistema (Paradigm Veo – Medtronic, Inc., Northridge, CA) in grado di sospendere l’erogazione di insulina in caso di ipoglicemia (O’Grady et al., 2012). Tali sistemi si sono dimostrati efficaci nel ridurre il numero di episodi ipoglicemici notturni (Choudhary et al., 2011).Un’ulteriore evoluzione verso la realizzazione di un pancreas artifi-ciale che utilizzi sistemi commerciali è rappresentato dall’integra-zione di CSII e CGM attraverso un algoritmo residente su smartpho-ne e attivo solo durante la notte (Medtronc Portable Glucose Control System – PGCS) (O’Grady et al., 2012). Tale finestra di applicazione temporale è favorevole in quanto le escursioni glicemiche sono mi-nori, permettendo di superare i limiti di latenza con i quali i sistemi CGM stimano la glicemia plasmatica e il ritardo con il quale gli at-tuali analoghi rapidi vengono assorbiti. Inoltre, per gli stessi motivi gli algoritmi utilizzati sono relativamente più semplici.Per le stesse ragioni si ritiene che nel prossimo futuro i sistemi semi-automatici, cioè con annuncio manuale del pasto potranno evolversi più rapidamente rispetto ai sistemi 24h closed-loop in quanto per-mettono di anticipare la dose preprandiale manualmente, evitando l’eccessiva latenza nel rilevare le escursioni glicemiche dei sistemi completamente automatici.Al momento le esperienze con sistemi bi-ormonali (insulina e glu-cagone) sono state realizzate solo in casistiche limitate di pazienti adulti (El Khatib et al., 2009) (Jacobs et al., 2011). Allo stesso modo gli studi con sistemi closed-loop ed infusione intraperitoneale attra-verso pompe impiantabili in addome sono utilizzati solo da alcuni gruppi di ricerca anche per il rischio di occlusioni e sovrainfezioni associati a quest’ultimo tipo di approccio.

Figura 3. Monitoraggio glicemico continuo (7 giorni) in un paziente con ipoin-sulinizzazione prevalentemente notturna ed ampia variabilita glicemica (Ipro TM, Medtronic Minimed, Northridge, CA, USA).

S. Tumini, S. Carinci

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Prospettive future

Gli sviluppi attesi per i sistemi CGM riguardano i miglioramenti dell’accuratezza, precisione e affidabilità complessiva. Sono in atto studi sulla fattibilità della rilevazione CGM in prossimità della sede di infusione dell’insulina (Rodriguez et al., 2011). Tali studi potrebbero essere il preludio all’introduzione di un’unica via di infusione/stima glicemica interstiziale e viste le dimensioni raggiunte da microcan-nule e sensori tale possibilità non appare remota (Fig. 4). Mentre per la via d’infusione sottocutanea sono importanti gli studi su nuove insuline ad azione ultra rapida e con inizio di azione molto antici-pato rispetto agli attuali analoghi rapidi (Pohl et al., 2012) (Steiner et al., 2008). Queste insuline permetterebbero di superare i limiti imposti dalle caratteristiche farmacocinetiche degli attuali analoghi rapidi troppo “lenti” per mimare la secrezione insulinica fisiologica prandiale, riducendo nel contempo le dimensioni del deposito sot-tocutaneo e conseguentemente il rischio di ipoglicemia legato alla variabilità di assorbimento.

Che cosa si sapeva primaLa microinfusione era considerata terapia di nicchia ed associata a quadri più gravi di malattia.

Cosa sappiamo adessoLe nuove tecnologie stanno rivoluzionando la cura del diabete del bambino.La microinfusione è entrata a pieno titolo tra le opzioni terapeutiche per la cura del diabete in età pediatrica.I sistemi RT-CGM permettono di prevenire le ipoglicemie che condizionano la possibilità di ottenere valori glicemici vicini alla norma.Gli ostacoli allo sviluppo di sistemi closed-loop sono legati alla farmacocinetica degli attuali analoghi rapidi e ai limiti tecnici dei sistemi RT-CGM.

Quali ricadute sulla pratica clinicaI servizi dedicati alla cura del diabete nel bambino devono assicurare un percorso educativo che consenta di fornire ai pazienti e alle famiglie le migliori opzioni terapeutiche comprese la CSII e il CGM.Le figure professionali anche territoriali coinvolte nella cura del diabete dovranno diventare più confidenti con le nuove tecnologie e conoscerle ciascuna per il proprio ambito di intervento.

Box di orientamento

Tabella III. Esperienze con sistemi Closed-loop nei bambini e negli adulti.

Esperienze in età pediatrica

Sistema Metodologia Riferimento

Sospensione per ipoglicemia Sospensione notturna dell’erogazione d’insulina in caso di ipoglicemia

Danne et al., 2011; Buckingham et al., 2009; Buckingham et al., 2010

Closed-loop notturno Il sistema controlla in autonomia la glicemia durante le ore notturne

Hovorka et al., 2010

Closed-loop con segnalazione preprandiale manuale Il paziente informa il sistema dell’intenzione di cominciare il pasto

Elleri et al., 2011

Closed-loop Il sistema gestisce in completa autonomia le glicemie

Weinzimer et al., 2008

Esperienze in età adulta

Closed-loop bi-ormonale Il sistema controlla in autonomia la glicemia attraverso l’infusione d’insulina o, in caso di ipoglicemia, di glucagone

El Khatib et al., 2009; Jacobs et al., 2011

Closed-loop con infusione intraperitoneale L’erogazione d’insulina avviene attraverso una pompa impiantabile intraperitoneale

Renard et al., 2010

Figura 4. Utilizzo del microinfusore in un caso di diabete neonatale.


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Corrispondenza

Stefano Tumini, Clinica Pediatrica, Ospedale policlinico, Via dei Vestini 5, 66100 Chieti. Tel.: + 39 0871 358014/338 7621977. Fax +39 0871 574831. E-mail: [email protected]

Aprile-Giugno 2011 • Vol. 41 • N. 162 • Pp. xx-xx NefrOlOGiA

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Ottobre-Dicembre 2012 • Vol. 42 • N. 168 • pp. 236-242

Introduzione

Le malattie genetiche sono causate da difetti nel DNA (mutazioni) che possono interessare singoli nucleotidi o ampie sequenze geni-che e nei casi più comuni aboliscono la funzione di un determinato gene all’interno di una cellula, inducendo l’insorgere di determinate patologie genetiche. La terapia genica ha come scopo la cura di tali difetti genetici, utilizzando del DNA come agente terapeutico contenente la sequenza corretta del gene mutato. Il DNA corretto deve essere tuttavia trasferito all’interno della cellula affetta e ciò è possibile utilizzando vettori virali, ovvero virus modificati in labora-torio il cui genoma è stato modificato per eliminare i geni codifanti proteine dannose e per inserire il DNA codificante per la proteina terapeutica. Tali vettori, una volta entrati nella cellula bersaglio, in-tegrandosi o meno nel genoma ospite, ristabiliranno la funzione del gene mutato. Negli ultimi venti anni, tale approccio è stato ampia-mente applicato anche nell’uomo, sopratutto per alcune malattie genetiche che interessano il sistema immunitario (Aiuti et al., 2009; Boztug et al., 2010; Hacein et al., 2010). In tali situazioni, cellule estratte da un individuo malato sono state coltivate in laboratorio, modificate ex vivo con vettori retrovirali in modo da ristabilire la funzione genica mancante e trapiantate nuovamente nel pazien-te di origine. Questo tipo di approccio, che si basa sul trapianto di cellule autologhe, rappresenta ad oggi un’alternativa più sicura

rispetto al trapianto di cellule eterologhe estratte da un donatore sano, in quanto quest’ultimo approccio è ancora associato ad un alto tasso di mortalità dovuto principalmente ai regimi di condi-zionamento a cui è sottoposto il paziente prima del trapianto, che sono altamente tossici, e alla malattia del trapianto contro l’ospite (GvHD), che si verifica quando le cellule del donatore, aggrediscono i tessuti del paziente che è riconosciuto come estraneo. Tuttavia, nonostante i primi successi, il rischio che il vettore virale possa in-tegrarsi in porzioni “funzionali” del genoma, alterando l’espressio-ne di oncogeni o onco-soppressori è alto. Casi di leucemia indotti dal vettore sono stati riportati, ridimensionando le speranze offerte da tale concetto terapeutico (Stein et al., 2010; Hacein-Bey-Abina et al., 2003; Hacein-Bey-Abina et al., 2008) in particolare utilizzan-do vettori gamma-retrovirali che integrandosi preferenzialmente in prossimità di geni correlati all’insorgenza di tumori, ne alterano i livelli di espressione, promuovendo lo sviluppo di neoplasie. Questo genere di tossicità, denominata mutagenesi inserzionale (Fig. 1), può essere limitata utilizzando vettori che presentano un profilo di integrazione potenzialmente più sicuro come i lentivirus o gli alfa-retrovirus (Montini et al., 2006; Cattoglio et al., 2007; Suerth et al., 2012) o utilizzando vettori non integranti come gli adenovirus che tuttavia possono indurre reazioni del sistema immunitario (Terama-to et al., 2000).Questi approcci descritti, prevedono che s’inserisca nella cellula

Nuove frontiere per la terapia genica: enzimi artificiali per correggere le mutazioni genetiche

Claudio MussolinoCenter of Chronic Immunodeficiency, University Medical Center Freiburg, Freiburg, Germania

SommarioLe malattie genetiche sono causate da alterazioni nella sequenza del DNA genomico di una cellula. Tali cambiamenti (o mutazioni) possono interessare singoli nucleotidi così come lunghi tratti di DNA e nei casi più comuni aboliscono la funzione di un gene. La terapia genica ha come scopo la cura di un difetto genetico, utilizzando un frammento di DNA contenente la sequenza nucleotidica del gene “corretto” come agente terapeutico. Tale concetto è stato applicato nell’uomo per la cura di varie malattie genetiche, utilizzando vettori virali per introdurre il DNA “corretto” nella cellula bersaglio, in modo da ripri-stinare l’espressione del gene mancante. Tuttavia, quest’approccio non è esente da rischi; il sistema immunitario può, infatti, reagire contro questi vettori virali o, in alcuni casi, il meccanismo parzialmente stocastico, con cui alcuni vettori si integrano nel genoma, può portare all’inattivazione di geni essenziali per la vita della cellula o alla pericolosa attivazione di proto-oncogeni. In quest’articolo saranno trattati metodi alternativi e potenzialmente più sicuri, che possono essere applicati per la “cura” di difetti genetici in un campo della terapia genica noto come “ingegneria genomica” evidenziando potenzialità terapeutiche e rischi ad essa associati.

SummaryGenetic disorders are due to alterations of the genomic DNA within a cell. These changes (or mutations) can affect single nucleotides as well as long DNA tracts leading to the loss of a gene function in the most common cases. The aim of gene therapy is the treatment of a genetic defect by using a DNA frag-ment containing the nucleotide sequence of the “corrected” gene as therapeutic agent. This concept has been applied in humans for the treatment of a variety of genetic disorders using viral vectors to introduce the “corrected” DNA fragment into the target cells to restore the expression of the mutated gene. However, this approach has risks; the immune system can react against these viral vectors and the non-random integration patterns used by some viral vectors to integrate into the host genome can result in the inactivation of endogenous genes important for cell viability or in the activation of proto-oncogenes. In this article, we reviewed alternative and potentially safer methods of “genome engineering”, a field of gene therapy aiming at the develop-ment of a “cure” for genetic disorders, and the risks associated with these approaches.

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malata un frammento di DNA esogeno, contenente la sequenza cor-retta dell’intero gene da rimpiazzare, dalla quale poi sarà espressa la proteina mancante. Tuttavia, il gene mutato è lasciato inalterato nel genoma del paziente. Un’alternativa a tale approccio consiste, invece, nella correzione diretta della mutazione nel gene alterato. A questo scopo, si utilizzano enzimi artificiali capaci di tagliare il DNA del paziente in prossimità della mutazione da correggere. Introdu-cendo nella cellula, insieme a tali enzimi, anche un piccolo fram-mento di DNA “corretto”, quest’ultimo sarà utilizzato dalla cellula come stampo per correggere la mutazione presente in quella spe-cifica posizione del genoma del paziente. Tale strategia rientra nel campo della terapia genica noto come “ingegneria genomica” che sfrutta i naturali meccanismi di riparo del DNA, per introdurre mo-dificazioni specifiche e stabili nel genoma bersaglio e che potrebbe rappresentare un nuovo potenziale terapeutico in futuro.

Il riparo del DNAIn ogni organismo, la stabilità del proprio patrimonio genetico è un requisito essenziale affinché esso possa essere trasferito alle gene-razioni future. Tuttavia, ogni giorno il DNA subisce lesioni dovute a fattori ambientali e metabolici che, se non riparate, potrebbero avere conseguenze serie per la vita stessa delle cellule. Di conseguen-za, meccanismi di riparo estremamente efficienti si sono evoluti per permettere alla cellula di rispondere rapidamente a tali lesioni. Quando il DNA genomico di una cellula subisce un danno, questo è riparato principalmente utilizzando due meccanismi: (i) la giunzione delle estremità non omologhe (non homologous end joining) e (ii) la ricombinazione omologa (Kass, 2010). Il primo è il meccanismo più diffuso in eucarioti multicellulari ed è attivo in tutte le fasi del ciclo cellulare, ma è principalmente utilizzato durante le fasi G0, G1 e la fase S iniziale. Quando avviene una rottura nella doppia elica di DNA, le estremità libere vengono riconosciute da fattori proteici essenziali che sono altamente conservati in varie specie, come Ku70/Ku80. Questi, legandosi alla protein-chinasi DNA-dipendente (DNA-PKcs), formano un complesso enzimatico che, in seguito, richiama altri fat-tori come nucleasi, polimerasi e ligasi, che ultimano il processo di giunzione delle due estremità di DNA libere (Lieber, 2008). Sebbene

questo meccanismo sia molto efficiente e rapido, esso purtroppo non è preciso, poiché alcuni nucleotidi sono inseriti o escissi per permettere che la giunzione possa avvenire in modo efficiente. Pertanto, se la lesione del DNA avviene all’interno di una sequenza codificante per un gene, il riparo genererà in esso una mutazione in esso. Il meccanismo di ricombinazione omologa, invece, è attivo principalmente durante le fasi S e G2 del ciclo cellulare e utilizza il cromatidio fratello come stampo per il riparo del DNA. In questo caso, il complesso proteico (MRE11/RAD50/NBS1 (MRN) inizia il ri-conoscimento del DNA danneggiato, rendendolo a singolo filamento e successivamente alcuni fattori proteici, come RAD51, BRCA1 e BRCA2, permettono a quest’ultimo di contattare il cromatidio fratello che contiene la corrispondente sequenza omologa, che può essere utilizzata da stampo per il riparo preciso del DNA danneggiato (San Filippo et al., 2008). In cellule umane, la giunzione delle estremità non omologhe (non homologous end joining) è il meccanismo di

Figura 2. Meccanismi di riparo del DNA. Quando il DNA genomico è danneggiato, la cellula cercherà di riparare il danno, attivando dei meccanismi specifici molto efficienti che garan-tiscono l’integrità del patrimonio genetico della cellula. Due meccanismi sono utilizzati con maggior frequenza: la giunzione delle estremità non omologhe (non homologous end joining) (sinistra) e la ricombinazione omologa (destra). Il primo è attivo durante tutto il ciclo cellulare ed è il meccanismo preferito per il riparo in eucarioti multicellulari. Questo meccanismo genera tuttavia mutazioni, in quanto pochi nucleotidi sono rimossi o aggiunti durante la fase di riparo per permettere la giunzione delle estremità libere di DNA. La ricombinazione omologa invece è at-tiva principalmente durante la fase S e G2, quando diventa disponibile il cromatidio fratello, che è utilizzato come stampo per correggere in modo preciso il DNA danneggiato. Tuttavia, tale meccanismo di riparo è impiegato più raramente. In figura sono indicati i fattori proteici più importanti che intervengono durante i due meccanismi di riparo e lo spessore delle frecce indica la frequenza con cui i due meccanismi sono utilizzati.

Figura 1. Fenomeno della mutagenesi inserzionale. Il vettore virale integrante, una volta entrato nella cellula, si integrerà in maniera stocastica nel genoma ospite. Se l’integrazione avviene in una regione che codifica per un gene oncosoppressore (sinistra) è probabile che il gene venga inattivato. Tuttavia, l’integrazione può anche avvenire in prossimità di oncogeni inattivi (destra). In tal caso, elementi genetici presenti nel genoma del vettore virale essenziali per l’espressione del gene terapeutico, come ad esempio il promotore o l’enhancer, possono indurre la riattivazione dell’oncogene. Entrambi questi meccanismi fa-cilitano l’insorgenza di tumore.

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riparo, mentre la ricombinazione omologa è utilizzata molto rara-mente (Fig. 2).

Ingegneria genomicaLa capacità di introdurre modifiche sito-specifiche in un genoma ha rappresentato un grande passo in avanti per i ricercatori interessati nella ricerca di base e nella terapia genica. L’ingegneria genomica sfrutta i meccanismi naturali che la cellula dispone per il riparo del DNA appena descritti, al fine di indurre modifiche permanenti nel ge-noma bersaglio. Affinché ciò sia possibile, il ricercatore deve mimare la creazione di un danno nella doppia elica del DNA, nella posizione dove si desidera introdurre una modifica. A questo punto la cellula bersaglio cercherà di riparare il danno al DNA utilizzando i meccani-smi naturali di riparo menzionati in precedenza, che possono essere sfruttati quindi per indurre la cellula a modificare il proprio genoma nella regione prescelta. In generale, il meccanismo della giunzione delle estremità non omologhe (non homologous end joining) è quel-lo più usato in cellule di mammiferi. Come discusso, questo tipo di riparo per risaldare le due estremità di DNA creerà delle mutazioni, aggiungendo o rimuovendo alcuni nucleotidi. Pertanto, il ricercatore può indurre la cellula ad utilizzare questo meccanismo per l’inat-tivazione mirata di un certo gene (Fig. 3, Box A) al fine di studiar-ne, ad esempio, la funzione in un organismo modello (Bibikova et al., 2002) o per esplorare nuovi concetti terapeutici. Strategie più complesse possono anche essere impiegate per indurre delezione di lunghi frammenti genomici (Sollu et al., 2010), inducendo due punti di rottura del DNA in zone diverse su uno stesso cromosoma. In tal caso, il frammento di DNA compreso tra i due siti di rottura sarà eliminato ottenendo una delezione (Fig. 3, Box B). Tuttavia, studi pionieristici in questo campo, effettuati nel laboratorio della Dr.ssa Jasin, hanno dimostrato che, creando una lesione nella doppia elica di DNA in una specifica posizione e, contestualmente, fornendo un frammento di DNA esogeno omologo al sito bersaglio, la frequenza di ricombinazione omologa in tale regione viene drammaticamente aumentata in cellule umane (Smih et al., 1994; Smih et al., 1995) e tale meccanismo di riparo viene preferito rispetto alla giunzione non omologa. In tale situazione, il frammento di DNA esogeno sarà utilizzato come stampo per il riparo e l’informazione genetica in esso contenuta sarà trasferita nel genoma ospite. Tale meccanismo può essere quindi sfruttato per correggere una mutazione nel caso in cui il DNA esogeno contiene la sequenza corretta (Fig. 3, Box C) o per inserire un nuovo gene in una porzione ‘sicura’ (Lombardo et al., 2011) del genoma bersaglio per scopi terapeutici o biotecno-logici (Fig. 3, Box D). Per questo tipo di approccio, generare il DNA esogeno, che dovrà fungere da templato per il riparo, è un processo cruciale e complesso, in particolare quando tale DNA è inteso sotto forma di plasmide (Bibikova et al., 2003). Pertanto, negli ultimi anni sono stati riportati nuovi approcci per semplificare questa strategia, utilizzando frammenti di DNA lineare con corte sequenze omologhe al sito bersaglio (Orlando et al., 2010) o ancora corti oligonucleotidi a singolo filamento (Radecke et al., 2010; Chen et al., 2011). Poiché per indurre una modifica nel genoma è essenziale introdurre una lesione sito-specifica nel genoma bersaglio, grandi sforzi sono stati compiuti negli ultimi anni per generare enzimi artificiali capaci di tagliare il DNA genomico in sequenze a scelta, in modo da per-mettere modifiche permanenti in genomi di diversa complessità. Tali enzimi, noti anche come nucleasi artificiali, sono dimeri in cui ogni monomero è composto da una porzione capace di legare il DNA in modo specifico, e da un dominio che opera il taglio nella doppia elica di DNA. Ad oggi, diverse classi di nucleasi artificiali sono state

introdotte a tale scopo. In particolare, tre diversi tipi sono studiati maggiormente: le nucleasi a “dita di zinco” (ZFNs), quelle basate su struttura “TALE” (TALENs) e le Meganucleasi (MNs; Fig. 4). In questo articolo ci interesseremo principalmente delle due classi più diffuse, le ZFNs e le TALENs, in quanto le MNs rappresentano una classe di nucleasi con minore flessibilità ad essere manipolate, al fine di rico-noscere una sequenza di DNA a scelta e pertanto meno utilizzate nel campo della terapia genica.

Nucleasi artificiali a “dita di zinco” (ZFNs)Le nucleasi artificiali più comuni sono le zinc finger nucleases (ZFNs), composte dal dominio di taglio derivante dall’enzima di restrizione FokI e il dominio di legame al DNA, formato da moduli con struttura a “dita di zinco” (Urnov et al., 2010). Tali moduli sono capaci di legare in una prima approssimazione tre o quattro nucleotidi adiacenti e il legame avviene attraverso alcuni residui amminoacidici ‘chiave’, che contattano direttamente il solco maggiore del DNA. Sostituen-do tali amminoacidi ‘chiave’, è possibile modificare la specificità del singolo modulo. Tali modifiche hanno permesso la creazione di moduli sintetici che riconoscono quasi tutte le 64 possibili triplette nucleotidiche, e la loro naturale modularità permette la fusione in serie di moduli con differente specificità, al fine di creare domini di legame al DNA capaci di legare sequenze di DNA a scelta. Poiché FokI è un enzima dimerico, affinché il taglio possa avvenire, due nu-cleasi devono essere generate in modo da legare sequenze di DNA separate da un opportuno spaziatore, all’interno del quale il dominio di taglio può dimerizzare e tagliare il DNA (Fig. 4a). Tuttavia, nella pratica, creare dei domini di legame a dita di zinco che riconoscano efficientemente una sequenza di DNA prescelta è un processo lungo e laborioso, in quanto ogni modulo mantiene le sue caratteristiche di legame solo nel contesto dei moduli adiacenti. Ciò significa che

Figura 3. Modifiche sito-specifiche del genoma. Creando un danno al DNA in una porzione specifica si attivano i mecca-nismi di riparo che possono essere utilizzati per creare modifiche sta-bili nel genoma bersaglio. Il danno al DNA sarà principalmente riparato attraverso il meccanismo di giunzione delle estremità non omologhe (non homologous end joining) (sinistra) che, inducendo mutazioni (*), può essere utilizzato per inattivare un gene (Box A) o, inducendo due tagli nel cromosoma bersaglio, per creare una delezione (D; Box B). Fornendo alla cellula un DNA esogeno omologo al sito danneggiato, il meccanismo della ricombinazione omologa sarà preferito (destra) e tale strategia può essere utilizzata per correggere una mutazione nel caso in cui il DNA esogeno contiene la sequenza corretta (Box C) o per inserire un nuovo gene in un sito ‘sicuro’ del genoma bersaglio (Box D).


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la specificità di un modulo può cambiare a seconda dei moduli che ad esso sono fusi e questo fenomeno può portare alla formazione di nucleasi non specifiche per la sequenza desiderata, ma che posso-no tagliare il genoma anche in sequenze diverse, creando tossicità. Inoltre, non tutte le possibili triplette di nucleotidi possono essere, ad oggi, riconosciute da moduli a dita di zinco e questo complica ulteriormente il disegno di ZFN con nuove specificità di sequenza.

Nucleasi artificiali basate su struttura “tale” (TALENs)Recentemente è stato scoperto un nuovo dominio di legame al DNA isolato da fattori di trascrizione presenti in batteri del genere Xanthomonas, chiamati transcription activator-like effectors (TALE) (Boch et al., 2009; Moscou, 2009). Anche questo dominio di legame al DNA è modulare, ma ogni singolo blocco è capace di riconosce-re un singolo nucleotide; pertanto esistono soltanto quattro diversi moduli TALE capaci di riconoscere i quattro nucleotidi (Boch, 2010; Mussolino and Cathomen, 2012). Così come per le ZFNs, anche i singoli moduli TALE possono essere legati in serie per formare domi-ni di legame al DNA, che riconoscono una sequenza di DNA a scelta, che è poi unito al dominio di taglio di FokI (Mussolino and Cathomen,

2012) (Fig. 3b). A differenza dei moduli a dita di zinco, l’interazione con il DNA dei singoli moduli TALE non è ostacolata dai domini vicini e, pertanto, generare nuove nucleasi artificiali basate su struttura TALE (TALENs) con diverse specificità è semplice e veloce e può essere fatto in ogni laboratorio, utilizzando tecniche di clonaggio standard (Engler et al., 2008).

Specificità delle nucleasi artificialiLa possibilità di applicare tecniche di ingegneria genomica in or-ganismi modello e, in futuro, anche nell’uomo è strettamente di-pendente dall’utilizzo di nucleasi artificiali estremamente specifiche, che sono capaci idealmente di tagliare un singolo sito in genomi complessi, come quello umano. Molti progressi sono stati fatti per rendere le nucleasi artificiali più specifiche, in modo da annullare o limitare il taglio in regioni genomiche non specifiche, i cosiddetti off-targets, che possono indurre effetti deleteri sulla cellula bersa-glio, come l’inattivazione di geni essenziali per la vita della cellula o traslocazioni cromosomiche, aumentando il rischio potenziale di indurre tumori. A tal scopo, sono state introdotte mutazioni nel do-minio di taglio, in modo da indurre la dimerizzazione di FokI, solo quando due eterodimeri sono nella giusta configurazione spaziale, come mostrato in figura 4 (Miller et al., 2007; Szczepek et al., 2007). Sebbene tale strategia abbia permesso di limitare notevolmente la citotossicità associata all’uso di nucleasi artificiali, in particolare per ZFNs, essa non è del tutto abolita e ancora molto lavoro deve essere compiuto per rendere tali nucleasi adatte all’utilizzo più diffuso in clinica. Con l’introduzione delle TALENs, un notevole passo avanti sembra essere stato fatto verso una piattaforma più sicura e meno citotossica. Gli off-targets occorrono principalmente in regioni di DNA che presentano un certo grado di identità nucleotidica rispetto al sito bersaglio. Ciò è stato osservato in vitro (Pattanayak et al., 2011) e in vivo (Gabriel et al., 2011), in due studi in cui le ZFNs analizzate hanno mostrato di tagliare principalmente i rispettivi siti bersaglio sono stati rivelati numerosi tagli in posizioni differenti del menoma, ma con sequenze nucleotidiche quasi identiche al ber-saglio originale. Pertanto, poiché ogni monomero ZFN riconosce soltanto 12 nucleotidi nella configurazione più comune, è lecito sup-porre che le nucleasi TALEN abbiano una maggiore specificità, in quanto generalmente tali monomeri sono disegnati in modo da rico-noscere sequenze bersaglio di 19 nucleotidi. A supporto di tale teo-ria, una comparazione tra ZFNs e TALENs, specifiche per una stessa regione nel genoma umano, ha evidenziato meno citotossicità nelle cellule trattate con TALENs (Mussolino et al., 2011), e simili risultati sono stati ottenuti in vivo in modello animale di ratto (Tesson et al., 2011). Inoltre, gli stessi ricercatori hanno anche dimostrato che due bersaglio quasi identici, differenti per un solo nucleotide, sono effi-cientemente discriminati da TALENs, ma non da ZFNs (Mussolino et al., 2011). Tuttavia, ad oggi, è ancora molto complicato identificare i siti off-targets. Bisogna infatti tenere presente che il taglio in siti off-targets avviene con una frequenza molto più bassa rispetto al sito bersaglio anche soltanto in una cellula su mille o meno. Eventi così rari possono portare a conseguenze deleterie, come l’immor-talizzazione di cellule staminali che possono indurre tumori, come è stato riportato in seguito all’utilizzo di vettori retrovirali integranti (Modlich et al., 2006); ed è dunque essenziale sia migliorare la spe-cificità associata alle nucleasi artificiali disponibili, sia investire in tecnologie che facilitino l’identificazione di off-targets rari. Inoltre, idealmente, il profilo di specificità delle nucleasi artificiali dovrebbe essere testato direttamente nel tipo cellulare che interessa al fine terapeutico, e non può essere testato in modelli animale, in quanto il

Figura 4. Tipi di nucleasi artificiali più diffusi. (a) Nucleasi a ‘dita di zinco’ (ZFNs). Tali nucleasi sono enzimi dimerici in cui ogni monomero è composto dal dominio di taglio derivante dall’en-zima di restrizione FokI (in rosso) e dal dominio di legame al DNA (in blu) formato in genere da 3 o 4 moduli a ‘dita di zinco’, ognuno capace di riconoscere una specifica tripletta di DNA. Il taglio avviene nella se-quenza di DNA che separa i due siti bersaglio dei singoli monomeri. (b) Nucleasi con struttura ‘TALE’ (TALENs). In questo tipo di nucleasi ar-tificiali il dominio di taglio è legato a moduli di legame al DNA con strut-tura ‘TALE’. Un singolo modulo lega un solo nucleotide e in genere fino a 18 moduli sono fusi insieme per creare il dominio di legame al DNA. (c) Meganucleasi (MNs). Tali nucleasi presentano una struttura proteica molto complessa, in cui il dominio di taglio è incorporato nella molecola insieme al dominio di legame al DNA e pertanto questi enzimi sono meno flessibili per essere modificati al fine di legare una sequenza ber-saglio a scelta.

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differente contesto genomico ed epigenetico risulterebbe nell’iden-tificazione di sequenze off-targets che potrebbero persino essere assenti nell’uomo.

ApplicazioniLe tecniche di ingegneria genomica, ad oggi, sono utilizzate sem-pre più frequentemente e ciò è principalmente dovuto alla sempre maggiore disponibilità di nucleasi artificiali che possono anche es-sere acquistate da aziende specializzate. ZFNs o TALENs sono sta-te utilizzate in molti laboratori al fine di studiare la funzione di un gene in un determinato organismo o per creare modelli cellulari di malattie umane o ancora per generare cellule isogeniche (Dreyer 2012; Soldner et al., 2011) o mammiferi transgenici (Hockemeyer et al., 2011; Tesson et al., 2011; Wood et al., 2011; Meyer et al., 2010; Bedell et al., 2012). Dopo i risultati positivi ottenuti in vitro, dove ZFNs sono state utilizzate per modificare il genoma umano in maniera sito-specifica, attivando il meccanismo di riparo della ricombinazione omologa (Bibikova et al., 2001; Porteus, 2003; Urnov et al., 2005), queste nucleasi artificiali sono state applicate anche in vivo in modello animale di emofilia B (Li et al., 2011), in cui la mutazione nel gene del Fattore IX è stata corretta direttamente nelle cellule epatiche del topo, in modo da ottenere i livelli circolanti di tale molecola capaci di fornire un beneficio terapeutico (>1-5%). Invece di correggere la mutazione nel gene dove essa è presen-te, un approccio alternativo è quello di trasferire il DNA per l’intero gene terapeutico, in un punto ‘sicuro’ del genoma umano, ottenendo un’integrazione specifica e non stocastica, come nel caso di utilizzo di vettori virali integranti. Per questo obiettivo è stato usato un sito sul cromosoma 19 umano, nel primo introne del gene PPP1R12C (meglio conosciuto come AAVS1), che rappresenta il naturale sito di integrazione del virus adeno-associato di tipo 2 (AAV2), un virus non patogeno per l’uomo. È stato infatti provato che l’introduzione di geni esogeni in questo sito permette l’espressione del gene inserito a lungo termine e senza interferire con geni vicini (Lombardo et al., 2011; Smith et al., 2008) e tale concetto può essere pertanto esteso per fini terapeutici.Le tecniche di ingegneria genomica possono essere anche impiegate nel campo della terapia tumorale, con lo scopo di creare linfociti ca-paci di riconoscere in modo specifico un tumore ed eliminarlo. Uno studio pre-clinico effettuato in Italia ha dimostrato che tale approccio è possibile, sfruttando ZFNs e il meccanismo di ricombinazione omo-loga per creare linfociti tumore-specifico (Provasi et al., 2012). In tale studio è stato osservato che linfociti T umani possono essere privati del recettore delle cellule T (TCR) endogeno che può poi essere sosti-tuito con un TCR artificiale capace di riconoscere in modo specifico le cellule del tumore di Wilms. Tali linfociti tumore-specifici, trapiantati in un modello animale di topo con tumore di Wilms, hanno efficiente-mente eliminato la formazione neoplastica, fornendo nuove speranze per un approccio simile nell’uomo.Gli studi riportati hanno anche fornito nuove speranze per l’appli-cazione di tecniche di ingegneria genomica nell’uomo. Infatti, con-siderando i grandi successi in modello animale, ZFNs sono state applicate in clinica per inattivare il gene umano CCR5, che è un co-recettore utilizzato da alcuni ceppi del virus HIV per infettare le cellule T. Quando tale recettore non è presente sulla membrana cellulare, il virus non può entrare nella cellula bersaglio e l’infezione non può pertanto aver luogo. La prova che tale concetto può avere rilevanza terapeutica è stata fornita dal “Berlin Patient” (Hutter et al., 2009). Tale paziente era affetto da AIDS e, in seguito allo sviluppo di leu-cemia mieloide acuta (AML), fu sottoposto a trapianto allogenico di

cellule staminali ematopoietiche da un donatore omozigote, per una mutazione che inattiva il gene CCR5 (la mutazione 32). Tre anni dopo, il paziente non ha alcun segno di infezione virale da HIV e presenta solo linfociti T circolanti, che non hanno il recettore CCR5. L’espe-rienza clinica di questo singolo paziente ha aperto la strada a due studi pre-clinici, in cui è stato dimostrato che tecniche di ingegneria genomica possono essere impiegate con finalità terapeutiche, inat-tivando CCR5 direttamente in cellule T (Perez, Wang et al., 2008) o in cellule staminali ematopoietiche (Holt, Wang et al., 2010). Questi studi hanno fornito la prova di principio che tale approccio può essere applicato all’uomo e, nel 2009 e 2010, due trial clinici (NCT00842634 and NCT01044654) sono iniziati con l’intento di estrarre cellule CD4+ da pazienti affetti da HIV, modificare il loro genoma utilizzando ZFNs in modo da inattivare il gene CCR5 e ritrapiantarle in maniera autolo-ga nei pazienti. Tale approccio è al momento sotto osservazione per valutarne soprattutto la sicurezza, ma i primi risultati hanno mostrato miglioramenti importanti in molti parametri clinici associati con un declino dell’infezione virale. Sebbene le ZFNs utilizzate in questi studi sull’uomo hanno mostrato di avere effetti off-targets e una certa ci-totossicità (Gabriel et al., 2011; Pattanayak et al., 2011; Mussolino et al., 2011), ciò non ha limitato la loro applicazione in clinica su un ber-saglio cellulare, le cellule T, che ha un basso potenziale proliferativo. Tuttavia queste cellule sono ciclicamente rinnovate nell’organismo e pertanto tale approccio non rappresenta una cura definitiva all’infe-zione da HIV. In futuro, tale concetto terapeutico dovrebbe essere ap-plicato ad un bersaglio cellulare più rilevante, come le cellule stami-nali ematopoietiche che, una volta rese HIV-resistenti, produrrebbero per tutta la vita del paziente cellule T resistenti all’infezione virale. Tuttavia l’alto potenziale proliferativo di queste cellule, associato al profilo genotossico delle ZFNs utilizzate per inattivare il gene CCR5 discusso precedentemente, rende questo approccio ancora troppo rischioso per applicazioni sull’uomo. Pertanto, una piattaforma che associa una minore tossicità e una maggiore specificità come le TALENs può essere determinante in futuro per identificare una cura definitiva per l’infezione da HIV.

ProspettiveL’ingegneria genomica negli ultimi anni ha ottenuto successi di pri-maria importanza. I risultati pre-clinici per il trattamento di immu-nodeficienze acquisite o di tumori sono estremamente promettenti e l’evidenza che cellule umane parzialmente differenziate, come i linfociti T, possano essere estratte da pazienti, modificate ex vivo in modo da renderle resistenti ad infezioni virali e ritrapiantate a fina-lità terapeutiche, rappresenta un traguardo senza precedenti. Con l’avvento di nuovi tipi di nucleasi artificiali, che riducono l’intrinseco potenziale genotossico associato a tali enzimi, è lecito immaginare che in futuro tali tecniche possano essere applicate in cellule ad alto potenziale proliferativo, come le cellule staminali ematopoietiche, in modo da fornire una cura definitiva per pazienti che soffrono di im-munodeficienze croniche o acquisite al momento incurabili. Tuttavia, poiché le TALENs sono state studiate da molto meno tempo rispetto alle ZFNs, c’è ancora molto da capire per evidenziare vantaggi e limiti associati a questa nuova piattaforma per modificare il genoma. In particolare, le TALENs sono enzimi di notevoli dimensioni, rispetto alle ZFNs, e la loro struttura altamente ripetuta rende il loro trasporto nelle cellule bersaglio molto complicato. Inoltre, un chiaro profilo di siti off-targets per TALENs non è stato ancora riportato, ma i primi risultati ottenuti, in termini di specificità e di genotossicità, suggeri-scono che tali nucleasi artificiali abbiano un notevole potenziale per essere applicate in futuro anche sull’uomo.


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*** Questo articolo ha evidenziato come TALENs siano superiori a ZFNs in termini di tossicità.

Orlando SJ, Santiago Y, et al. Zinc-finger nuclease-driven targeted integration into mammalian genomes using donors with limited chromosomal homology. Nucleic Acids Res. 2010;38:e152.

Pattanayak V, Ramirez CL, et al. Revealing off-targets cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection. Nat Methods 2011;8:765-70.

Perez EE, Wang J, et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 2008;26:808-16.

** Questo articolo rappresenta la base pre-clinica che ha portato ai trial clinici per il trattamento dell’infezione da HIV.

Che cosa si sapeva primaLe malattie genetiche sono causate da alterazioni nella sequenza del DNA genomico di una cellula (mutazioni), che possono essere ‘curate’ utilizzando tecniche di ingegneria genomica. In tali approcci una molecola di DNA, che contiene la sequenza corretta del gene da rimipiazzare, è inserita in un vettore virale, che è utilizzato per infettare la cellula malata. Dopo l’infezione, la sequenza del gene corretto, contenuto nel DNA virale, sarà utilizzata per esprimere il prodotto proteico deficiente nella cellula.

Cosa sappiamo adessoL’ingegneria genomica ha compiuto grossi passi avanti negli ultimi anni. Oggi sono disponibili enzimi artificiali capaci di tagliare un genoma complesso, come quello umano contenente 3 miliardi di nucleotidi, in una sequenza ben precisa. Una volta indotto un danno nel DNA, la cellula attiva i naturali mec-canismi di riparo del DNA, che possono essere utilizzati al fine di introdurre modifiche sito-specifiche nel genoma. Tale concetto può essere applicato a scopi terapeutici per correggere, ad esempio, una mutazione direttamente nel gene dove essa è presente o per inattivare un gene dannoso o ancora per inserire un nuovo gene in una porzione ben precisa del genoma ospite.

Quali ricadute sulla pratica clinicaRisultati estremamente incoraggianti hanno provato che le tecniche di ingegneria genomica possono essere utilizzate con successo, sia in studi pre-clinici per la cura di tumori e di malattie genetiche, come l’emofilia B, che in trial clinici per la cura dell’infezione da HIV nell’uomo. Con l’avvento di nucleasi artificiali più specifiche e metodi più robusti per il controllo degli effetti collaterali, associati all’uso di tali enzimi, è possibile in futuro che tali metodiche siano applicate per il trattamento di un numero sempre maggiore di malattie genetiche.

Box di orientamento

C. Mussolino

242

Porteus MH, Baltimore D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science 2003;300:763.

Provasi E, Genovese P, et al. Editing T cell specificity towards leukemia by zinc finger nucleases and lentiviral gene transfer. Nat Med. 2012;18:807-15.

** In questo articolo che descrive uno studio pre-clinico si dimostra che l’ingegneria genomica può essere utilizzata anche per la cura del tumore.

Radecke S, Radecke F, et al. Zinc-finger nuclease-induced gene repair with oli-godeoxynucleotides: wanted and unwanted target locus modifiRouet P, Smih F, et al. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recom-bination in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91:6064-8.

* Questo articolo dimostra che la frequenza di riparo del DNA, utilizzando il mec-canismo di ricombinazione omologa, può essere aumentata anche in cellule umane, ponendo le basi per le tecniche di ingegneria genomica volte alla cor-rezione di difetti genetici.

San Filippo J, Sung P, et al. Mechanism of eukaryotic homologous recombina-tion. Annu Rev Biochem. 2008;77:229-57.

Smih F, Rouet P, et al. Double-strand breaks at the target locus stimulate gene targeting in embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 1995;23:5012-9.

* Questo articolo dimostra che la frequenza di riparo del DNA, utilizzando il mec-canismo di ricombinazione omologa, può essere aumentata anche in cellule umane, ponendo le basi per le tecniche di ingegneria genomica volte alla cor-rezione di difetti genetici.

Smith JR, Maguire S, et al. Robust, persistent transgene expression in human embryonic stem cells is achieved with AAVS1-bersaglioed integration. Stem Cells 2008;26:496-504.

Soldner F, Laganiere J, et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differ-ing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell 2011;146:318-31.

Sollu C, Pars K, et al. Autonomous zinc-finger nuclease pairs for targeted chro-mosomal deletion. Nucleic Acids Res. 2010;38:8269-76.

Stein S, Ott MG, et al. Genomic instability and myelodysplasia with monosomy 7 consequent to EVI1 activation after gene therapy for chronic granulomatous disease. Nat Med. 2010;16:198-204.

Suerth JD, Maetzig T, et al. Alpharetroviral self-inactivating vectors: long-term transgene expression in murine hematopoietic cells and low genotoxicity. Mol Ther. 2012;20:1022-32.

Szczepek M, Brondani V, et al. Structure-based redesign of the dimeriza-tion interface reduces the toxicity of zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 2007;25:786-93.

Teramato S, Ishii T, et al. Crisis of adenoviruses in human gene therapy. Lancet 2000;355:1911-2.

Tesson L, Usal C, et al. Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs. Nat Biotechnol. 2011;29:695-6.

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Urnov FD, Rebar EJ, et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet. 2010;11:636-46.

Wood AJ, Lo TW, et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science 2011;333:307.

Corrispondenza

Claudio Mussolino, Laboratory of Cell and Gene Therapy, Center for Chronic Immunodeficiency, University Medical Center Freiburg, Engesserstr. 4, D-79108 Freiburg, Germania. Tel +49 (0)761 270-77738. Fax +49 (0)761 270-77744. E-mail: [email protected]

243

Ottobre-Dicembre 2012 • Vol. 42 • N. 168 • pp. 243-252

PremessaIl pediatra, insieme a ginecologi-ostetrici e altri operatori socio-sanitari, si adopera per migliorare la salute delle future generazioni. La sua missione è: più neonati e più bambini in buona salute; più di ieri, e domani più di oggi. Anche in presenza di classici indicatori sanitari soddisfacenti, come quelli raggiunti in Italia, e in molti paesi

sviluppati (es.: mortalità infantile), la nostra missione ci spinge ad intravedere nuovi orizzonti ed affrontare nuove sfide. Ebbene, una delle ultime sfide della medicina, che vede il pediatra in prima linea, è la “promozione della salute riproduttiva”1, che può essere definita come “un continuum integrato di interventi socio-sanitari che pro-muovendo la salute delle persone in età fertile, di genere femminile e maschile, sin dalla giovane età e fino a poco prima di avere un figlio, ha come obiettivo specifico quello di prevenire o ridurre il ri-schio di alcuni esiti avversi della riproduzione”. Questo nuovo campo di azione è pieno di promesse e può permetterci di compiere un ulteriore passo in avanti verso l’obiettivo finale: ridurre ulteriormente mortalità e morbilità materno-infantile.Migliorare la salute materno-infantile significa ridurre il rischio indi-viduale che ha ogni donna (coppia) di avere uno o più esiti avversi della riproduzione, e quindi ridurre la loro incidenza nella popola-zione generale. Gli esiti avversi della riproduzione sono molteplici (Tab. I) e possono essere definiti come “eventi indesiderati, patolo-gici o a rischio di patologia, derivanti dal desiderio riproduttivo (es.: infertilità, aborto spontaneo) e/o dal suo esito (es.: nati con malfor-mazione o pretermine)”. Le motivazioni che giustificano l’inserimento della promozione della salute riproduttiva nel continuum degli interventi socio-sanitari di promozione della salute in generale e di quella materno-infantile in particolare, sono quattro: (a) un fatto arcinoto, ma trascurato, (b) nuove o più solide nozioni emerse negli ultimi anni, (c) una barriera, (d) una riflessione. Il fatto arcinoto: la nostra esistenza biologica inizia con il concepi-mento. Questo è fuori di dubbio, al di là di ogni disquisizione etica sulla definizione di inizio vita, di persona umana o altro. Il conce-pimento e le primissime tappe dello sviluppo embrionale sono es-senziali per il nostro futuro benessere. È nei primissimi giorni dopo

la promozione della salute riproduttiva

Pierpaolo MastroiacovoAlessandra Lisi International Centre for Birth Defects and Prematurity, Roma

FoCUS

Figura 1. Rappresentazione schematica dei tempi in cui si verificano i principali eventi biologici che avvengono subito dopo il concepimento, espressi in età embrionale e in età gestazionale. Si può notare che la prima visita ostetrica, anche quando è effettuata precocemente, risulta posteriore alle principali tappe di sviluppo embrionale.

Tabella I. Esiti avversi della riproduzione.

Infertilità1 e subfertilità2

Aborto spontaneo

Gravidanze indesiderate o intempestive3

Interruzione di gravidanza per motivi psico-sociali4

Complicanze della gravidanza, tra cui:

Gravidanza ectopica

Diabete gestazionale

(Pre-)eclampsia

Distacco di placenta

Insufficienza placentare

Rottura precoce membrane

Malformazioni

Basso peso neonatale dovuto a:

Parto prematuro

Restrizione della crescita fetale

Disabilità congenite

Motorie (es.: paralisi cerebrale)5

Cognitive - comportamentali

Tumori congeniti

SIDS6

Malattie genetiche

Cromosomiche

Monogeniche

Note alla Tabella I1 Infertilità: mancato inizio della gravidanza dopo 12 mesi o più di rapporti sessuali non protetti nelle fasi fertili del ciclo mestruale (Anonimous, 2008). 2 Subfertilità: mancato inizio della gravidanza dopo 6 mesi di rapporti sessuali non protetti nelle fasi fertili del ciclo mestruale (Gnoth et al., 2005).3 Inserita nell’elenco degli esiti avversi della riproduzione, poiché rappresenta un fallimento del controllo della fertilità da parte della donna (coppia).4 Inserita nell’elenco degli esiti avversi della riproduzione, poiché rappresenta un fallimento del controllo della fertilità da parte della donna (coppia).5 La paralisi cerebrale almeno nel 90% dei casi ha un’origine prenatale (Mc Len-nan, 1999; Strijbis et al., 2006).6 Dopo le campagne Back-To-Sleep il fumo in gravidanza rappresenta il principale fattore di rischio per la SIDS. Evidenze sperimentali sugli animali da laboratorio suggeriscono un effetto nocivo della nicotina sui meccanismi di controllo centrale della respirazione (Abbott-Winzer-Serhan, 2012).

P. Mastroiacovo

244

il concepimento che si verifica la riprogrammazione epigenetica (Morgan et al., 2005), la formazione della placenta, e la formazione degli organi (Fig. 1). Se vogliamo attuare programmi di prevenzione primaria e ridurre il rischio di infertilità, aborti spontanei o indotti, complicanze della gravidanza o di condizioni neonatali e infantili che riconoscono il loro primum movens prima della gravidanza o nei pri-missimi giorni dopo il concepimento bisogna pensarci prima. La pri-ma visita ostetrica è tardiva per realizzare una prevenzione primaria a tutto campo degli esiti avversi della riproduzione. Le nuove o più solide nozioni: da tempo sapevamo che alcuni in-terventi di prevenzione di uno o più esiti avversi della riproduzio-ne dovevano essere realizzati ben prima del concepimento. Basti

pensare alla vaccinazione anti-rosolia, alla supplementazione con acido folico, al trattamento di condizioni croniche (es.: diabete, iper-fenilalaninemia), e alla consulenza genetica. Più di recente abbiamo imparato che gli stili di vita non salutari, ovvero fumo, uso anche non eccessivo di bevande alcoliche, uso di sostanze psico-attive, abuso di caffè, dieta non-mediterranea (o comunque scorretta) e scarso esercizio fisico con conseguente sovrappeso /obesità, e per finire, lo stress e la violenza domestica rappresentano fattori di rischio per uno o più esiti avversi della riproduzione (Tab. II). Infine, si stan-no delineando nuove conoscenze sul ruolo della riprogrammazione dell’epigenoma, sia nei gameti prima del concepimento che nella fase di pre-impianto dell’embrione, che aprono nuove strade per

Tabella II.Elenco dei principali effetti sulla riproduzione di stili di vita non salutari1.

Fattore di rischio Rischio aumentato di:

Fumo Infertilità e subfertilità (Augood et al., 1998); aborto spontaneo (Nielsen et al., 2006); gravidanza ectopica, placenta previa, distacco di placenta, rottura prematura delle membrane (Castles et al., 1999); malformazioni congenite (Hackshaw et al, 2011) in particolare schisi orali (Little et al., 2004); natimortalità (Flenady et al., 2011); prematurità (Shah-Bracken, 2000); basso peso neonatale (McCowan et al., 2009) (dose dipendente e per esposizione continua in gravidanza); SIDS (Mitchell-Milerad, 2006); obesità infantile (Ino, 2010). Possibile subfertilità e infertilità in età adulta nei figli (Shrestha et al., 2011).

Fumo passivo Natimortalità, malformazioni (Leonardi-Bee et al., 2011); basso peso neonatale (Liu e Chen, 2009).

Alcol Uso eccessivo (> 50 gr/die): sindrome feto-alcolica, 5% degli esposti (Ornoy-Ergaz, 2010). Uso eccessivo occasionale (>50 gr): dati pochi chiari: possibili effetti sul neuro-sviluppo (Henderson et al., 2007), un ampio studio di coorte Danese osserva aumento di convulsioni neonatali ed epilessia per esposizioni 11-16° sett. (Sun et al., 2009). Uso variabile ad effetto dose, con soglia: nati SGA e pretermine più frequenti sopra 10 gr/die per SGA e di 18 gr/die per i pretermine (Patra et al., 2011). Uso moderato (10-20 gr/die): disturbi cognitivi e comportamentali (O’Leary-Bower, 2102). Uso scarso (< 100 gr/sett. e mai > 20 gr in unica occasione): dati incerti e non conclusivi per disturbi cognitivi e comportamentali (Anonimo, 2012). Inoltre: possibile subfertilità maschile e femminile, aborti spontanei, ridotto volume spermatico nei figli ventenni (Ramlau-Hansen et al., 2010).

Caffeina Possibile subfertilità (Stanton et al., 1995; Bolúmar et al., 1997)

Sostanze psico-attive Cocaina: placenta previa (Faiz-Ananth, 2003), SGA, prematurità (Gouin et al., 2011); possibili deficit cognitivi (Williams-Ross, 2007). Cannabis: riduzione del peso neonatale (-131 gr per uso 4 volte a settimana) (English et al., 1997), possibile effetto sul comportamento e salute mentale (Jutras-Aswad et al., 2009). Eroina e metadone: riduzione peso neonatale (-489 gr e -279 gr rispettivamente) (Hulse et al., 1997), mortalità neonatale (Hulse et al., 1998). Amfetamine: basso peso neonatale (-279 gr), prematurità, SGA (Ladhani et al., 2011). Possibile aumento di cardiopatie (McElatthon et al., 1999) e di problemi neuro-comportamentali (Oei et al., 2012).

Alimentazione non-mediterranea2 Possibili esiti: ridotta fertilità (Toledo et al., 2011, Vujkovic et al., 2010); preeclampsia (Brantsaeter et al., 2009, Borgen et al., 2012); labioschisi e difetti del tubo neurale (Carmichael et al., 2012); spina bifida (Vujkovic et al., 2009); pressione più alta in gravidanza (Timmermans et al., 2011); parto pretermine (Mikkelsen et al., 2008, Haugen et al., 2008); peso neonatale inferiore (Timmermans et al., 2012); asma e atopia (Chatzi et al., 2008).

Esercizio fisico Minimo: diabete gestazionale (Tobias et al., 2011). Eccessivo nel lavoro: nati pretermine, effetto modesto se esistente (Bonzini et al., 2007).

Sovrappeso e obesità Aborti spontanei anche ripetuti (Boots-Stephenson, 2011); varie complicazioni della gravidanza (Heslehurst et al., 2008); diabete gestazionale – anche per sovrappeso (Torloni et al., 2009a); preeclampsia (O’Brien et al., 2003); alcune malformazioni congenite – per sovrappeso DTN e cardiopatie (Stothard et al., 2009); parto cesareo, elettivo e di urgenza (Poobalan et al., 2009); natimortalità (Flenady et al., 2012); nati pretermine spontanei e indotti – anche sovrappeso (McDonald et al., 2010, Torloni et al., 2009b); inizio tardivo e durata inferiore allattameno (Lepe et al., 2011). Possibile: infertilità (anche maschile), macrosomia, parto cesareo più frequente, emorragie post-partum, e varie complicanze della gravidanza (Vasudevan et al., 2011).

Magrezza eccessiva Nati pretermine spontanei ed indotti, e nati di basso peso (Han et al., 2011). Possibile: infertilità, aborti spontanei (Davies, 2006); gastroschisi (Siega et al., 2009).

Violenza domestica Nati di basso peso, pretermine, SGA (Shah et al., 2010). Possibili: gravidanze non desiderate, complicanze della gravidanza, infezioni trasmesse sessualmente (ACOG, 2012).

Note alla Tabella II. 1 Gli esiti avversi della riproduzione elencati in questa tabella sono quelli più documentati e per i quali esiste una revisione sistematica con metanalisi. Fanno eccezione gli esiti preceduti dall’aggettivo possibile che sono suggeriti da revisioni narrative o singoli studi molto recenti che meritano in futuro conferme più solide.2 Per alimentazione non-mediterranea, definita variamente, si intende in genere un pattern alimentare a basso contenuto di frutta, verdura, cereali, pesce, olio e zuccheri complessi, e alto contenuto di carne, burro, grassi, zuccheri semplici e addizionati alle bevande.Abbreviazioni. SIDS: morte improvvisa del lattante; SGA: nati con peso inferiore alla norma per l’età gestazionale.

La promozione della salute riproduttiva

245

la comprensione dell’insorgenza di molte patologie (Gabory et al., 2011) e la loro prevenzione. Tutto ciò sottolinea l’importanza dello stato di salute dei futuri genitori, a tutto campo, per “programma-re” la salute dei propri figli. E forse dovremmo cominciare a par-lare di “programmazione peri-concezionale della salute infantile e dell’adulto”. La barriera: molte gravidanze non sono programmate. In Italia e negli Stati Uniti la percentuale di gravidanze che si verificano nei tempi desiderati è intorno al 50% (Finer, 2006; Mastroiacovo, 2012). Se tutte le gravidanze fossero programmate, forse, potremmo im-maginare di promuovere la salute riproduttiva in un arco di tempo ben definito. Sottolineo il forse: il breve arco di tempo potrebbe non essere sufficiente per modificare abitudini inveterate o a ripristinare uno stato di salute compromesso per affrontare in modo ottimale la gravidanza. La riflessione: molti fattori di rischio per gli esiti avversi della ripro-duzione sono anche fattori di rischio per patologie dell’età adulta, o più avanzata. Gli esempi più paradigmatici sono tutti gli stili di vita elencati sopra, ma si possono fare altri esempi a cominciare dalle malattie croniche non diagnosticate tempestivamente o trascurate. In altre parole promuovendo la salute riproduttiva si promuove più in

generale la salute delle persone, e viceversa, e con una motivazione, forse, più emotivamente sentita e più vicina nel tempo.

Sette domande e sette risposte

Quali sono gli interventi utili per la “promozione della salute (anche) riproduttiva”?

Gli interventi utili per promuovere la salute riproduttiva sono stati ampiamente descritti altrove (HCN, 2007; Jack et al., 2008; Berghel-la et al., 2010; Seshadri et al., 2012). In Italia “Pensiamoci Prima”2 nel 2010 ha messo a punto 28 “Raccomandazioni per il Counseling Preconcezionale” con la condivisione di 22 Società Scientifiche. Nella tabella III sono elencati tali interventi che possono essere clas-sificati in 4 sezioni, sebbene la distinzione sia strumentale e non sostanziale: A. Promuovere la salute della donna (coppia) in generale e proteg-gerla dal rischio di un esito avverso della eventuale riproduzione;B. Trattare (o affrontare) eventuali condizioni di salute o sociali della donna (coppia) che aumentano il rischio di un esito avverso della riproduzione;

Tabella III.Interventi utili per promuovere la salute riproduttiva.

A. Promuovere la salute della donna (coppia) in generale e proteggerla dal rischio di un esito avverso dell’eventuale futura riproduzione.

Vaccinazione anti rosolia, varicella, epatite B, tetano, pertosse

Educazione sessuale

Colloqui individualizzati per un efficace controllo della fertilità

Prevenire gravidanze sotto i 20 anni e a breve distanza da una precedente, scoraggiare quelle in età riproduttiva avanzata

Educazione sugli stili di vita salutari: alimentazione mediterranea, esercizio fisico, fumo, alcol, uso di sostanze psico-attive

Identificare e affrontare situazioni di: fragilità socio-economica; stress, depressione, ansietà; violenza domestica

Supplementazione con 0,4 mg/die di acido folico1

B. Identificare e trattare eventuali condizioni di salute della donna (coppia) che aumentano il rischio di un esito avverso della riproduzione.

Malattie sessualmente trasmesse

Sovrappeso e obesità

Eventuali patologie (es.: diabete, epilessia, asma, patologie della tiroide, ipertensione, iperfenilalaninemia, varicocele)

Condizioni che possono aver determinato un precedente esito avverso della riproduzione

C. Aiutare la donna (la coppia) che programma o non esclude la possibilità di una gravidanza ad affrontare le situazioni che aumentano il rischio di un esito avverso della riproduzione

Revisione generale delle problematiche indicate nelle due sezioni precedenti e correzione di quelle ancora presenti, es.: acido folico, fumo, alcol, obesità, malattie croniche.

Farmaci

Sostanze chimiche nocive, in ambienti lavorativi e non

Radiazioni ionizzanti

Febbre elevata

Toxoplasmosi

Citomegalovirus2

Gruppo sanguigno, fattore Rh

D. Identificare rischi di natura genetica, informare la coppia e aiutarla a prendere decisioni libere e responsabili

Albero genealogico

Screening malattie genetiche comuni (es.: talassemia), comprese quelle tipiche di specifici gruppi di popolazione

Note alla Tabella III1 Vedi Box per la raccomandazione di “Pensiamoci Prima” più recente ed elaborata sulla base di ricerche e riflessioni più recenti.2 Per donne che hanno bambini piccoli o che lavorano con bambini piccoli.

P. Mastroiacovo

246

C. Aiutare la donna (la coppia) che programma o non esclude la pos-sibilità di una gravidanza ad evitare le esposizioni che aumentano il rischio di un esito avverso della riproduzione; D. Identificare rischi di natura genetica per informare la coppia e aiutarla a prendere decisioni libere e responsabili.Gli interventi della sezione A vanno realizzati sin dall’età adolescen-ziale (le vaccinazioni ovviamente prima, in età infantile) e reiterati per tutto l’arco della vita. Si tratta infatti di interventi di promozione della salute in generale che se non attuati influiscono anche sull’in-cremento del rischio di esito avverso della riproduzione. Gli interven-ti inclusi nella sezione B, ovviamente vanno realizzati non appena vengano identificati, possibilmente in modo proattivo e attraverso appositi screening (es.: lue, HIV, questionari ad hoc). Nella sezione C sono elencati quegli interventi che vanno presi in considerazione non appena la coppia manifesta l’intenzione di avere un figlio e non ne esclude la possibilità. Il loro obiettivo è evitare rischi nelle prime settimane di gravidanza, quando ancora la donna non sa di essere incinta o non ha eseguito la prima visita ostetrica. In questa lista non sono compresi quegli interventi che dovranno poi essere mes-si in atto alla prima visita ostetrica. Infine la sezione D comprende principalmente interventi mirati alla prevenzione per rinuncia3 che possono essere effettuati sin da quando si forma la coppia, non è necessario attendere infatti il momento in cui comincia più seria-mente a pensare di avere un figlio. Da notare che molti degli in-terventi suggeriti nella tabella III non vengono forniti dal Sistema Sanitario Nazionale e talora non fanno ancora parte della comune pratica medica, ciò non significa che non debbano essere presi in considerazione e/o offerti ai pazienti. Anzi, è auspicabile, e questo articolo ne è uno dei tanti strumenti. È importante sottolineare che nella realizzazione dei vari interventi il ruolo del partner non può essere sottovalutato, anzi. Contribuisce al controllo della fertilità e a programmare le gravidanze. Il suo comportamento condiziona quel-lo della donna, induce comportamenti a rischio o al contrario l’aiuta a seguire quelli salutari. Può essere una fonte di rischio, es.: fumo passivo, comportamenti sessuali rischiosi, stress, violenza dome-stica. Infine influisce direttamente sull’esito riproduttivo: il 30-40% delle cause di infertilità sono attribuibili all’uomo e alcune sono ri-muovibili (es.: alcol, fumo, obesità) (Case, 2003), così come può in-fluire direttamente sulla salute dei propri figli (Mocarelli et al., 2000; Ngo et al., 2006; Wigle et al., 2009; Liu et al., 2011).

Gli interventi elencati e unanimemente ritenuti utili sono “evidence-based”?

La risposta puntuale a questa domanda è complessa. E richiedereb-be ben più ampio spazio. Per tutti gli interventi elencati nella tabella III esiste una robusta, o sufficiente, dimostrazione o consenso, tale da essere raccomandata ai sanitari per promuovere la salute ripro-duttiva. Ma la domanda cruciale è qual è l’evidenza che realizzando l’intervento si ottiene il risultato atteso? Ovvero la riduzione del ri-schio di uno o più esiti avversi della riproduzione o almeno, se questo non è possibile per la sua rarità, la riduzione del fattore di rischio? Vorremmo, per tutti gli interventi, evidenze chiare e robuste come quelle prodotte per la vaccinazione anti-rosolia (Muscat et al., 2012), per la supplementazione con acido folico (De Regil et al., 2010), per il trattamento del diabete (Wahabi et al., 2010) o della iperfenilala-ninemia (Prick et al., 2012). In tutti questi casi l’intervento, effet-tuato proprio prima della gravidanza è basato su prove di efficacia robuste, l’esito avverso diminuisce. E per tutti gli altri? L’intervento proposto è basato su prove di efficacia mutuate da quanto osservato in gravidanza [(es.: vari metodi di counselling o farmacologici per far smettere di fumare (Lumley et al., 2009; Moore et al., 2009;

Civljak et al., 2010; Cahill et al., 2010; Coleman et al., 2012)] o più in generale in donne in età fertile. Altri interventi sono raccomandati sulla base del buon senso. È certo sensato, ad esempio, perseguire l’obiettivo di un trattamento tempestivo, ottimale e continuato nel tempo, se esiste una determinata malattia, soprattutto se influisce sull’esito della riproduzione (es.: diabete, epilessia, asma, iperten-sione, ipotiroidismo) o promuovere stili di vita salutari. A prescindere dalla dimostrazione di decremento dell’esito riproduttivo. Altrettanto sensato è prodigarsi nei confronti di una donna in età fertile, che può rimanere incinta il giorno dopo l’incontro con il sanitario di fiducia, o che ha programmato la gravidanza a breve termine, per evitare l’esposizione ad un fattore di rischio nocivo per il futuro bambino. L’industria farmaceutica ha già provveduto. Nelle schede informative redatte più di recente è infatti riportata a dicitura: “Il medico, all’atto della prescrizione, dovrà valutare l’opzione di trattamenti alternativi in donne in gravidanza o che stiano pianificando una gravidanza”.

Quale è il ruolo del pediatra?

La promozione della salute (anche) riproduttiva va perseguita “da ogni sanitario – ad ogni donna in età fertile – in ogni occasione”. La domanda di routine da rivolgere alla donna è: “Sta forse pensando di avere una (altra?) gravidanza?”. Ciò premesso si può affermare senza ombra di dubbio che il ruolo del pediatra e del neonatologo è rilevante. Non è necessario ricordare che la sua missione è proprio quella di promuovere la salute della persona sin da prima della na-scita con obiettivi che non si limitano all’età infantile o adolescenzia-le, ma si estendono all’età adulta. Ma forse va ricordato: a) il suo ruolo nell’identificazione di un possibile fattore di rischio che ha determinato una eventuale condizione congenita (es.: re-strizione della crescita intrauterina, prematurità, malformazione). Il conseguente colloquio inter-concezionale con la coppia deve avere b) l’obiettivo di cercare di rimuovere il fattore di rischio e di evitare il ripetersi dell’evento avverso; c) il suo ruolo di medico di fiducia della famiglia in vista di ulteriori gravidanze, considerato che: (i) il 45-50% dei nati nasce da una cop-pia che ha già un figlio e… un pediatra (Regione Emilia Romagna, 2010; Regione Lazio, 2012); (ii) una donna con un bambino ha più spesso contatto con il pediatra che con il proprio medico o gineco-logo (Cheng et al., 2012);d) il ruolo che svolge il pediatra nei confronti degli adolescenti;il ruolo di educatore sanitario nell’ambito della famiglia. Senza infine dimenticare il ruolo nell’ambito della rete socio-sani-taria e il ruolo di advocacy. Tutte attività che possono essere svolte con grande autorevolezza, considerata la missione specifica della pediatria: più bambini in buona salute.

Quali esperienze esistono nel mondo di programmi mirati alla promozione della salute riproduttiva?

In Italia esistono esperienze di varia natura, alcune hanno come obiettivo la promozione degli stili di vita salutari (es.: “Guadagnare Salute”, promosso dal Ministero della Salute), altri sono mirati a pro-muovere specifiche tematiche (es.: contraccezione), o a ridurre l’im-patto sull’esito riproduttivo di specifici fattori di rischio (es.: alcool, fumo) o a promuovere la supplementazione di acido folico. L’unico progetto che affronti in modo olistico la salute riproduttiva è il pro-getto noto come “Pensiamoci Prima”4 che, tra l’altro, ha dato vita ad altre iniziative quali “Prima della Gravidanza”5 e “Mamma InFor-ma”6. In Europa, senza ombra di dubbio, l’attività più sviluppata e a tutto campo, dalla ricerca all’implementazione di programmi, è quel-la olandese, in particolare quella realizzata dall’Università Erasmus di Rotterdam da Eric A.P. Steegers7 e Regine P.M. Steegers-Theunis-


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Tabella IV.Calcolo del numero di esiti attribuibili in Italia ad alcuni fattori di rischio.

Fattore di rischio Prevalenza del fattore di rischio

Esito Incidenza dell’esito

Rischio relativo

Numero esiti attribuibili al fattore di rischio /anno

Referenza per stima del rischio relativo

Gravidanza non voluta **

3%Nati di basso peso 7.0% 1.51 601

Shah et al., 2011Gravidanza intempestiva **

40%1.31 4 402

Mancata supplementazione con acido folico ***

80%

DTN 1 per 1.000 2.00 384 De Regil et al., 2010

Cardiopatie congenite 8 per 1.000 1.24 734 Leoncini, 2012

L +/- PS 0.6 per 1.000 1.33 72Johnson-Little, 2008

Palatoschisi 0.4 per 1.000 1.14 22

BMI < 18.5 ** 8% Nati pretermine 7.0% 1.22 690 Han et al., 2009

BMI 25 - 29.9 ** 15%

Diabete gestazionale 4.0% 1.97 2.896 Torloni et al., 2009

Nati morti 0.3% 1.23 54 Flenady et al., 2011

Nati pretermine 7.0% 1.06 356 Mc Donald et al., 2011

DTN 1 per 1.000 1.20 17 Stothard et al., 2009

Cardiopatie congenite 8 per 1.000 1.17 113 Stothard et al., 2009

BMI > 30 ** 6%

Aborti spontanei 15.0% 1.31 1.561 Boots-Stephenson, 2011

Diabete gestazionale 4.0% 3.01 2.454 Torloni et al., 2009


Nati pretermine 7% 1.13 309 Mc Donald et al., 2011

5 malformazioni 1 per 1.000 Variabile 114 Stothard et al., 2009

Asma * 3%

Pre-eclampsia 5.0% 1.54 454

Murphy et al., 2011SGA 3.0% 1.22 112

Nati pretermine 7.0% 1.41 485

Diabete ** 0.35%


Maformazioni gravi 2.0% 3.00 79Wahabi et al., 2010


Epilessia ** 0.30% Maformazioni gravi 2.0% 3.11 72 Meadow et al., 2008

Ipertensione * 2% Nati morti 0.3% 2.58 49 Flenady et al., 2011

Fumo inizio gravidanza ***

25%

Infertilità 5.0% 1.42 2.708 Augood et al., 1998

Gravidanza ectopica 1.3% 1.77 1.196Castles et al., 1999

Placenta previa 0.7% 1.58 476

9 malformazioni 1.1% Variabile 252 Hackshaw et al., 2011

Obesità (3-33 anni) 12.0% 1.52 4.017 Ino 2010

Fumo durante l’arco della gravidanza **

12%

Distacco di placenta 0.9% 2.00 550 Ananth et al., 1999

PROM 1.4% 1.70 596 Castles et al., 1999


Nati pretermine 7.0% 1.19 889 Lumley et al., 2004

SIDS 0.1% 3.93 19 Mitchell et al., 2006

Fumo passivo 5%

Nati morti 0.3% 1.23 18Leonardi-Bee et al., 2011

Malformazioni 2.0% 1.13 74

Basso peso neonatale 7.0% 1.60 332 Liu-Chen, 2009

Violenza domestica 0.5% Nati di basso peso 7.0% 1.53 105 Shah et al., 2010

Cocaina 0.5%

SGA 3.0% 3.23 189Gouin et al., 2011


Placenta previa 0.4% 2.50 17 Faiz-Ananth, 2003

P. Mastroiacovo

248

Note alla Tabella IV 1. I fattori di rischio elencati sono stati selezionati sulla base della: (a) disponibilità di almeno una metanalisi che ne abbia stimato la dimensione del rischio (rischio relativo o odds ratio); (b) possibilità di modificarlo; (c) interesse personale, sperando sia simile a quello del lettore. 2. La frazione attribuibile nella popolazione si calcola matematicamente se si dispone della: (a) dimensione del rischio e (b) della prevalenza del fattore di rischio nella popolazione di interesse (nel nostro caso quella di donne all’inizio o nell’arco della gravidanza). Il primo dato è ragionevolmente robusto, deriva sempre e soltanto da metanalisi, il secondo, in mancanza più o meno totale di informazioni affidabili su donne all’inizio o in corso di gravidanza è una stima basata da varie indagini nazionali o internazionali. Per semplicità il numero degli asterischi indica l’affidabiltà (tre asterischi = buona, nessun asterisco = del tutto ipotetica). 3. Gli esiti considerati sono stati selezionati con gli stessi criteri dei fattori di rischio (vedi sopra).4. La stima dell’incidenza degli esiti, insieme al numero dei nati in Italia ogni anno, serve a calcolare la numerosità dei casi attribuibili al fattore di rischio. La frazione attribuibile ci fornisce infatti solo la percentuale (che va bene per qualunque popolazione). La prima è molto affidabile per tutti gli esiti neonatali e infantili (tratta da statistiche disponibili, es.: CedAP, registri di malformazioni), ma lo è meno per le complicanze della gravidanza (tratta dalla letteratura). I dati per gli aborti spontanei e l’infertilità sono tratti dalla letteratura e si adattano molto bene alla realtà italiana. Per quanto riguarda la numerosità di nati/anno si tratta di una media di quanto avvenuto negli ultimi anni: 570.000/anno. 5. Nella colonna del numero degli esiti attribuibili al fattore di rischio/anno (la più importante) si può osservare che a parità di rischio relativo, ad esempio 1.5, il numero dei esiti attribuiti al fattore di rischio varia molto: 4.400 per i nati di basso peso attribuiti a gravidanze intempestive (non desiderate proprio in quel momento), 454 per la pre-eclampsia attribuita all’asma non trattata correttamente. Ciò dipende dalla prevalenza del fattore di rischio. Tanto più è il fattore di rischio è frequente tanto più elevato è il numero dei casi ad esso attribuiti. 6. Caveat

- L’obiettivo di questa tabella è fornire una stima dei casi potenzialmente prevenibili in Italia, grossolana, e non certo raggiungibile in tempi brevissimi perché si basa sull’assunto che il fattore di rischio sia rimosso del tutto (leggi fumo, obesità, gravidanze intempestive). Va usata con estrema cautela, soprattutto per rendersi conto su quali sono le priorità.- Non sommare mai esiti attribuiti a fattori di rischio diversi, con l’intento di calcolare il numero totale di casi che potrebbero essere prevenuti se si rimuovono contemporaneamente più fattori di rischio.

sen8. Progetti di vario tipo e natura sono attuati in varie nazioni (Re-eve, 2009): negli Stati Uniti (il CDC, che ha rinnovato recentemente tutta la sezione sulla salute riproduttiva-preconcezionale nella sua web9, merita una visita), in Cina, nelle Filippine, in Bangladesh, solo per fare alcuni esempi. A livello internazionale operano organizzazio-ni quali la March of Dimes10, Preparing for Life. L’OMS ha promosso un meeting (il primo) di consenso globale sulle cure preconcezionali il 6-7 Febbraio 2012 (report in preparazione).

Quali sono i potenziali benefici che si possono ottenere con la promozione della salute riproduttiva?

Il beneficio atteso, finale, è la riduzione della morbilità e mortalità materna e infantile, e possibilmente quella dell’adulto (se teniamo presente i dati emersi sulla programmazione fetale delle malattie dell’adulto). Certo vorremmo avere dati precisi sui vari benefici at-tesi. La ricerca di sanità pubblica dovrebbe essere così sviluppata, e non solo in Italia, da aver già proposto esperienze pilota che ci possano consentire stime affidabili su tutti i possibili vantaggi attesi. Ciò non è possibile. Possiamo però avventurarci. Calcolare la co-siddetta “frazione attribuibile nella popolazione” almeno per alcuni fattori rischio e per alcuni esiti e calcolare il numero di esiti che sono potenzialmente prevenibili in Italia (o in una sua regione) se il fattore di rischio viene rimosso completamente (Tab. IV). Altro beneficio non trascurabile di un programma olistico di promozione della salute ri-produttiva è la spinta che viene data ad una maggiore attenzione alla propria salute, soprattutto tra i giovani. La responsabilità di diventare genitori, presto o tardi, potrebbe aumentare l’efficacia di programmi di salute mirati a prevenire altre patologie: oncologiche, cardiova-scolari e metaboliche.

Quali sono i potenziali svantaggi che si possono verificare?

Il primo svantaggio è deludere le aspettative. Se un programma di promozione della salute riproduttiva ad esempio promette tout court la nascita di un figlio sano, osserveremo forti resistenze al mantenimento di un tale programma. Un figlio sano non può esse-re previsto da nessuno nonostante tutti gli sforzi si possano fare. Ciò vale sia per l’intervento globale (promozione della salute ripro-

duttiva) che per gli interventi specifici. Per questo motivo è racco-mandabile usare più spesso il termine “riduzione del rischio di…” piuttosto che di prevenzione. Infatti il concetto di prevenzione è as-sociato più spesso a quello di non comparsa della malattia, e può essere utilizzato solo per le condizioni monofattoriali, per le quali esiste un intervento preventivo efficace (es.: la sindrome da rosolia congenita non si verifica se la donna è protetta adeguatamente nei confronti di questa malattia infettiva). Per la grande maggioranza degli esiti (di natura multifattoriale) si ottiene una riduzione del rischio. In pratica si verifica il seguente scenario, utilizzando come esempio la supplementazione con acido folico. Prescrivendo a 10.000 donne in età fertile 0,4 mg/die di acido folico, invece di os-servare 10 casi di difetti del tubo neurale, ne osserveremo solo 5, dovuti ad altre cause ancora poco sconosciute. Queste 5 donne, se non informate correttamente, potranno recriminare che l’acido folico non è servito a nulla, o peggio ancora avere sensi di colpa. È importante quindi fornire l’informazione in modo realistico e pre-ciso. Il paradosso dello scenario è che né noi, né le loro mamme, sapranno chi dei rimanenti 9.995 nati è nato senza il difetto del tubo neurale, che altrimenti avrebbe avuto. Altri svantaggi possibili sono: (a) considerare la donna, magari sin dall’età adolescenziale, solo o soprattutto sotto l’aspetto riprodut-tivo, fino ad arrivare a negare l’eventuale diritto a non volere figli; (b) focalizzare eccessivamente l’attenzione sull’evento riprodutti-vo e non sottolineare al contrario il vantaggio prodotto da gran parte degli interventi per la salute generale della donna (coppia); (c) stigmatizzare socialmente donne che continuano, per motivi psico-sociali, a mantenere stili di vita non salutari (es.: fumare in gravidanza). La comunicazione sociale e individuale deve tener conto di questi possibili svantaggi e trovare il necessario equilibrio tra il dovere dei sanitari di proteggere la vita nascente, il diritto della donna ad ottenere informazioni preventive e il rispetto della sua autonomia decisionale. Una particolare attenzione dovrà esse-re data a non creare sensi di colpa ingiustificati. Il nostro dovere come operatori sanitari è realizzare il diritto delle persone ad es-sere informate correttamente e ampiamente, senza alcun giudizio morale sulle loro scelte.


249

Quali strumenti può utilizzare il pediatra, o altro operatore sanitario, per contribuire a realizzare un programma organico e completo di promozione della salute riproduttiva?

Dato per scontato che:a) un programma di promozione della salute riproduttiva non può

che essere multisettoriale, con impegno serio della famiglia, delle strutture di formazione (scuola dell’obbligo e università), dei ser-vizi sociali, dei mezzi di comunicazione di massa, delle organizza-zioni di volontariato e di promozione sociale;

b) i principali attori di un programma di promozione della salute ri-produttiva sono i consultori e i ginecologi.

Che cosa può fare un pediatra, o altro operatore sanitario (medico di medicina generale, laureata in ostetricia, farmacista), per contribuire a realizzare un programma organico e completo di promozione della salute riproduttiva, con il poco tempo a disposizione, i tagli della spesa pubblica e le continue nuove richieste di salute da parte della cittadinanza? Nell’ambito del progetto “Pensiamoci Prima” è stato sviluppato uno schema di comportamento che è stato apprezzato e messo in pra-tica da alcuni colleghi, ma non ancora valutato formalmente. Tale schema è sinteticamente riassunto nel Box 2.

Conclusioni

La ricerca bio-medica e di sanità pubblica ha recentemente indivi-duato una nuova strategia per migliorare la salute materno-infantile, sia nei paesi con un reddito medio-basso che in quelli a reddito ele-vato: promuovere la salute riproduttiva durante tutto l’arco dell’età fertile della donna e della coppia e, con una maggiore intensità, in vi-sta di una gravidanza programmata. Non si tratta di introdurre nuove tecnologie o nuove pratiche sanitarie, ma piuttosto di utilizzare in modo più organico e sistematico conoscenze già acquisite, di inte-grarle con quelle esistenti, di renderle accessibili a tutte le fasce di popolazione, in particolare a quelle più fragili economicamente, con l’obiettivo specifico di ridurre l’incidenza dei vari e molteplici esiti avversi della riproduzione. Il pediatra ha la possibilità di contribuire

box 1

Proposta di nuova raccomandazione per la supplementazione con acido folico

Si raccomanda ai sanitari1 di donne (coppie) in età fertile, con o senza figli, che:a. non utilizzano un efficace metodo di controllo della fertilità (coito in-

terrotto, uso del profilattico o altre barriere chimiche o meccaniche, metodi basati sul riconoscimento dei giorni fertili);

b. non escludono la possibilità di una gravidanza anche se non attiva-mente ricercata;

c. programmano una gravidanza, di prescrivere alla donna la vitamina acido folico alla dose giornalie-

ra di 0,4 mg al giorno per ridurre il rischio di difetti congeniti, altre malformazioni2 e di altri esiti indesiderati della riproduzione3 oltre che raccomandare un’alimentazione di tipo mediterraneo (ricca di frutta e verdura).

Una dose superiore (massimo 4-5 mg/die) va prescritta a donne che hanno avuto in precedenza un nato affetto da difetto del tubo neurale, siano esse stesse affette da spina bifida, da diabete o siano in tratta-mento con antiepilettici. Va anche presa in considerazione all’inizio del trattamento e per un mese tale dose soltanto per donne che possono rimanere incinta nel mese successivo. Tale dosaggio non è indicato in altre situazioni di ipotetici rischi di carenza, genetici o non. L’assunzione dell’acido folico deve essere continuata per tutto il primo trimestre di gravidanza.La prescrizione, a gravidanza iniziata, non è efficace per ridurre il ri-schio di difetti congeniti.

Note1 La raccomandazione è indirizzata ai sanitari, poiché in Italia sono coloro che influ-iscono maggiormente (90% dei casi) sull’uso (e dosaggio) della supplementazione. L’acido folico, se usato per la prevenzione dei difetti del tubo neurale (0,4 mg) è in fascia A.2 Evidenze osservazionali, meno robuste di quelle esistenti per la riduzione del ri-schio dei difetti del tubo neurale, ma non trascurabili, suggeriscono una diminuzione del rischio di cardiopatie e labio e/o palatoschisi.3 Evidenze osservazionali basate su diversi studi suggeriscono una possibile diminu-zione del rischio di vari esiti tra cui: prematurità e basso peso neonatale.

box 2

Comportamento suggerito per sensibilizzare, nel proprio ambulatorio, le coppie in età fertile a prestare attenzione alla propria salute riproduttiva.

1. Essere pronti a sostenere un colloquio (possibilmente con modali-tà di counseling) mirato alla promozione della salute riproduttiva e preconcezionale:

a) Partecipare ad un corso di aggiornamento; b) Stampare le raccomandazioni per il counseling preconcezio-

nale, digerirle, e tenerle sempre a disposizione http://www.pen-siamociprima.net/sanitario/counseling_eseguire.html;

c) Navigare attentamente sul sito www.pensiamociprima.it e sul sito www.primadellagravidanza.net e stampare materiale ritenuto utile.

2. Stampare e affiggere nella sala di attesa del proprio ambulatorio il manifestino di “Pensiamoci Prima” (reperibile su http://www.pen-siamociprima.net/content/Manifestino.pdf), per attrarre l’attenzione di tutti i propri pazienti.

3. Stampare, tenere a propria disposizione, e lasciare sul tavolo della sala di attesa del proprio ambulatorio il volantino “10 Azioni per la tua salute e quella dei tuoi figli futuri”.

4. Durante un colloquio, di qualsiasi tipo, trovare il momento adatto per: a) Rivolgere domande del tipo: Ha visto il manifesto e il pieghe-

vole “10 Azioni per la tua salute e quella dei tuoi figli futuri” che sono in sala di attesa?

i. Se no, consegnare il volantino, invitare a leggerlo e riman-dare al prossimo incontro un approfondimento sul tema.

ii. Se si, rivolgere una domanda del tipo: Questi argomenti le possono interessare?

1. Se no, chiedere se possono interessare un familiare o un amico e consegnare il volantino se non già preso.

2. Se si, ovvero se l’argomento interessa personalmente, perché, uomo o donna che sia, pensa nel futuro, a breve o lunga scadenza, di avere un figlio, fare un’affermazione del tipo: è più che giusto pensarci prima e:

a) consegnare con opportune frasi di accompagnamen-to il questionario auto-compilabile reperibile su http://www.primadellagravidanza.it/download-materiale-in-formativo/item/9-questionario-preliminare.html e spie-gare che è opportuno compilarlo con calma, a casa, e poi riportarlo alla prossima visita.

b) far notare che per cominciare a prendere dimesti-chezza con i vari argomenti è opportuno navigare sui siti www.pensiamociprima.it e www.primadellagravidanza.net, su ambedue.

5. Quando la persona interessata torna con il questionario compilato: a) valutare se è necessario porre ulteriori domande di approfondimento; b) chiedere se ha navigato sui siti web consigliati; c) fornire le informazioni necessarie, e sempre che sia necessa-

rio, indicare le strutture o gli specialisti da contattare per meglio affrontare certi problemi (es.: centri antifumo per smettere di fu-mare, specialista diabetologo).

P. Mastroiacovo

250

significativamente a realizzare questa nuova strategia, considerata la sua missione di tutore della salute di neonati, bambini e adole-scenti e la sua posizione privilegiata nel rapporto con le mamme che

non hanno ancora completato il loro progetto riproduttivo. I risultati attesi, sebbene ancora non quantificabili nel loro insieme, sembrano essere di significativa portata.

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** Ampia revisione sugli effetti del fumo in gravidanza con dati epidemiologici e sperimentali. Consigliato per breve ma interessante revisione degli studi speri-mentali dell’effetto della nicotina sulle alterazioni della regolazione centrale della respirazione e SIDS.

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** Va letta, fornisce tutti gli elementi conoscitivi per comprendere con precisione i problemi associati all’uso di alcol in gravidanza. Non tradisce la tradizione di questa ottima rivista.

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** Imperdibile. Fornisce stime di rischio di natimortalità per i principali fattori di rischio, e soprattutto per paesi sviluppati. Indicata anche la frazione attribuibile nella popolazione.

Note1 Il termine “salute riproduttiva” è preferito a termini più comunemente usati

fino ad oggi in letteratura, come prima della gravidanza, preconcezionale, interconcezionale (prepregnancy, preconception, interconception,) poiché questi ultimi fanno pensare a qualcosa che debba essere realizzato poco prima del concepimento. Ciò è assolutamente vero per alcuni specifici interventi, ma è riduttivo. Facciamo qualche esempio. Il fumo aumenta il rischio di svariati esiti avversi della riproduzione. È opportuno promuovere l’astensione dal fumo in vista di una gravidanza, o piuttosto è necessario promuoverla sin dall’età adolescenziale? Se non addirittura prima, influendo sulle abitudini dei genitori? Il diabete misconosciuto, o trascurato, aumenta il rischio di malformazioni e di altri esiti avversi della riproduzione. Dob-biamo attendere che una donna pensi ad una gravidanza nel breve termine per identificare il diabete o trattarlo in modo ottimale? Alcuni interventi quindi si sovrappongono con interventi di promozione della salute in gen-erale, che vanno promossi per tutto l’arco della vita. Oggi sappiamo che hanno influenza anche sulla salute riproduttiva (dalla fertilità ad esiti neuro-comportamentali del nascituro). Per questo motivo, e tenendo presente che solo il 50% delle gravidanze è programmato, mi sembra più adatto parlare di promozione della salute riproduttiva piuttosto che di promozione della salute preconcezionale, anche se fino ad oggi il termine “riproduzione” e “riproduttivo” è stato usato soprattutto per indicare problematiche relative alla fertilità.

2 Pensiamoci Prima è un progetto di promozione della salute riproduttiva e preconcezionale coordinato da ICBD-Alessandra Lisi International Centre on Birth Defects and Prematurity, WHO Collaborating Centre, finanziato nel periodo 2008-2011 dal CCM-Centro Nazionale per il Controllo e Prevenzi-one delle Malattie del Ministero della Salute, e attualmente svolto sotto la sua egida.

3 Per prevenzione per rinuncia s’intende quella forma di prevenzione possi-bile solo in medicina riproduttiva che una Commissione dell’OMS ha definito “prevention by option”. Si tratta della rinuncia ad avere figli se uno dei due genitori o entrambi hanno un rischio considerato troppo elevato per tentare di avere figli propri. La rinuncia all’ipotetico figlio affetto determina una pre-venzione della malattia (e del possibile effetto!). Viene distinta dalla preven-zione primaria poiché non consente di avere figli sani invece che affetti da una qualche patologia.

4 www.pensiamociprima.net5 www.primadellagravidanza.it6 www.mammainforma.it7 www.erasmusmc.nl/47393/1584119/1603959/Eric_Steegers8 www.erasmusmc.nl/47393/1584119/1603959/RegineSteegersCV9 www.cdc.gov/preconception/index.html10 www.marchofdimes.com/pregnancy/getready_indepth.html


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** Consigliata a tutti coloro che desiderano avere stime del rischio di malfor-mazioni associato al fumo materno nelle prime settimane di gravidanza.

Han Z, Mulla S, Beyene J, et al. Maternal underweight and the risk of preterm birth and low birth weight: a systematic review and meta-analyses. Int J Epide-miol. 2011 Feb;40:65-101.

Haugen M, Meltzer HM, Brantsaeter AL, et al. Mediterranean-type diet and risk of preterm birth among women in the Norwegian Mother and Child Cohort Study (MoBa): a prospective cohort study. Acta Obstet Gynecol Scand. 2008;87:319-24.

Health Council of the Netherlands. Preconception care: a good beginning. The Hague: Health Council of the Netherlands, 2007; publication no. 2007/19.

* Lavoro del gruppo olandese di revision sistematica della letteratura e formu-lazioni di raccomandazioni per la pratica clinica.

Henderson J, Kesmodel U, Gray R. Systematic review of the fetal effects of pre-natal binge-drinking. J Epidemiol Community Health 2007;61:1069-73.

Heslehurst N, Simpson H, Ells LJ, et al. The impact of maternal BMI status on pregnancy outcomes with immediate short-term obstetric resource implications: a meta-analysis. Obes Rev. 2008; 9:635-83.

Hulse GK, Milne E, English DR, et al. The relationship between maternal use of heroin and methadone and infant birth weight. Addiction 1997;92:1571-9.

Hulse GK, Milne E, English DR, et al. Assessing the relationship between mater-nal opiate use and neonatal mortality. Addiction 1998;93:1033-42.

Ino T. Maternal smoking during pregnancy and offspring obesity: meta-analysis. Pediatr Int. 2010;52:94-9.

*Vale la segnalazione: indica un effetto a distanza del fumo in gravidanza.

Jack BW, Atrash H, Coonrod DV, et al. The clinical content of preconception care: an overview and preparation of this supplement. Am J Obstet Gynecol. 2008;199:S266-79.

** Articolo chiave di una serie di articoli contenuti in un numero speciale della rivista che affronta tutte le tematiche che riguardano la salute riproduttiva. Frut-to di un lavoro promosso dai CDC, durato mesi e che ha coinvolto una nutrita equipe di specialisti.

Johnson CY, Little J. Folate intake, markers of folate status and oral clefts: is the evidence converging? Int J Epidemiol. 2008;37:1041-58.

Jutras-Aswad D, DiNieri JA, Harkany T, et al. Neurobiological consequences of maternal cannabis on human fetal development and its neuropsychiatric out-come. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosc. 2009;259:395-412.

Ladhani NN, Shah PS, Murphy KE, et al. Maternal phenylketonuria: report from the United Kingdom Registry 1978-97. Arch Dis Child. 2005;90:143-6.

Lambert B, Scheiner M, Campbell D. Ethical issues and addiction. J Addict Dis. 2010;29:164-74.

Leoncini E. Metanalisi dell’effetto della supplementazione con acido folico con o senza altre vitamine sulla frequenza di cardiopatie congenite. 2012 [Dati non pubblicati].

Lepe M, Bacardí Gascón M, Castañeda-González LM, et al. Effect of maternal obesity on lactation: systematic review. Nutr Hosp. 2011;26:1266-9.

Leuridan E, Hens N, Peeters N, et al. Effect of a prepregnancy pertussis booster dose on maternal antibody titers in young infants. Pediatr Infect Dis J. 2011;30:608-10.

Little J, Cardy A, Munger RG. Tobacco smoking and oral clefts: a meta-analysis. Bull World Health Organ. 2004;82:213-8.

Liu R, Zhang L, McHale CM, et al. Paternal smoking and risk of childhood acute lymphoblastic leukemia: systematic review and meta-analysis. J Oncol. 2011;854584.

* Il titolo è esplicativo. Il rischio è aumentato. E ciò non si verifica per le donne fumatrici in gravidanza. L’interpretazione dei risultati va letta e ricordata. È probabile che il fumo paterno agisca sui meccanismi epigenetici della sper-matogenesi.

Lumley J, Chamberlain C, Dowswell T, et al. Interventions for promoting smoking cessation during pregnancy. Cochrane Database Syst Rev. 2009;3:CD001055.

* Esiste la concreta possibilità di aiutare donne fumatrici a smettere in gravi-

danza. Probabilmente un simile successo può essere ottenuto in vista di una gravidanza.

MacLennan A. A template for defining a causal relation between acute intrapar-tum events and cerebral palsy: international consensus statement. Br Med J. 1999;319:1054-9.

** Imperdibile! Per chiunque. Fornisce le argomentazioni essenziali per valutare l’origine di una paralisi cerebrale, 90% di probabilità che sia di origine prenatale.

McElhatton PR, Bateman DN, Evans C, et al. Congenital anomalies after prenatal ecstasy exposure. Lancet. 1999;354:1441-2.

McCowan LM, Dekker GA, Chan E, et al. Spontaneous preterm birth and small for gestational age infants in women who stop smoking early in pregnancy: pro-spective cohort study. Br Med J. 2009;338:b1081.

McDonald SD, Han Z, Mulla S, et al. Overweight and obesity in mothers and risk of preterm birth and low birth weight infants: systematic review and meta-analyses. Br Med J. 2010;341:c3428.

Mikkelsen TB, Osterdal ML, Knudsen VK, et al. Association between a Mediter-ranean-type diet and risk of preterm birth among Danish women: a prospective cohort study. Acta Obstet Gynecol Scand. 2008;87:325-30.

Mitchell EA, Milerad J. Smoking and the sudden infant death syndrome. Rev Environ Health 2006;21:81-103.

Mocarelli P, Gerthoux PM, Ferrari E, et al. Paternal concentrations of dioxin and sex ratio of offspring. Lancet 2000;355:1858-63.

* Studio svolto nell’area di Seveso dimostra come l’esposizione a diossina, nell’uomo, possa influire sull’esito della riproduzione: effetto epigenetico?

Mooi FR, de Greeff SC. The case for maternal vaccination against pertussis. Lancet Infect Dis 2007;7:614-24.

Moore D, Aveyard P, Connock M, et al. Effectiveness and safety of nicotine re-placement therapy assisted reduction to stop smoking: systematic review and meta-analysis. Br Med J. 2009;338:b1024.

Morgan HD, Santos F, Green K, et al. Epigenetic reprogramming in mammals. Hum Mol Genet. 2005;14:R47-58.

* Ottima revisione sulla riprogrammazione epigenetica che avviene dopo il con-cepimento e prima dell’impianto dello zigote.

Muscat M, Zimmerman L, Bacci S, et al. Toward rubella elimination in Europe: an epidemiological assessment. Vaccine 2012;30:1999-2007.

Ngo AD, Taylor R, Roberts CL, et al. Association between Agent Orange and birth defects: systematic review and meta-analysis. Int J Epidemiol. 2006;35:1220-30.

Nielsen A, Hannibal CG, Lindekilde BE, et al. Maternal smoking predicts the risk of spontaneous abortion. Acta Obstet Gynecol Scand. 2006;85:1057-65.

* Lo studio più recente ed ampio disponibile sul rischio di aborto spontaneo nelle donne fumatrici.

O’Brien TE, Ray JG, Chan WS. Maternal body mass index and the risk of pre-eclampsia: a systematic overview. Epidemiology 2003;14:368-74.

O’Leary CM, Bower C. Alcohol. Guidelines for pregnancy: what’s an accept-able risk, and how is the evidence (finally) shaping up? Drug Alcohol Rev. 2012;31:170-83.

** Consigliabile per un’ampia ed equilibrata disamina dei rischi associati a mod-este quantità di alcol ingerite durante la gravidanza.

Oei JL, Kingsbury A, Dhawan A et al. Amphetamines, the pregnant woman and her children: a review. J Perinatol. 2012 [Epub ahead of print].

Ornoy A, Ergaz Z. Alcohol abuse in pregnant women: effects on the fetus and newborn, mode of action and maternal treatment. Int J Environ Res Public Health 2010;7:364-79.

Patra J, Bakker R, Irving H, et al. Dose-response relationship between alcohol consumption before and during pregnancy and the risks of low birthweight, pre-term birth and small for gestational age (SGA)-a systematic review and meta-analyses. BJOG 2011;118:1411-21.

Pensiamoci Prima. “Raccomandazioni per il Counseling Preconcezionale”. www.pensiamociprima.net 2011.

Poobalan AS, Aucott LS, Gurung T, et al. Obesity as an independent risk factor for elective and emergency caesarean delivery in nulliparous women – systematic review and meta-analysis of cohort studies. Obes Rev. 2009;10:28-35.

Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Defini-tions of infertility and recurrent pregnancy loss. Fertil Steril. 2008;90:S60.

* Utile per le definizioni.

Preterm/LBW Births. Prenatal amphetamine exposure and birth outcomes: a systematic review and metaanalysis. Am J Obstet Gynecol. 2011;205:219.e1-7.

P. Mastroiacovo

252

Prick BW, Hop WC, Duvekot JJ. Maternal phenylketonuria and hyperphenylal-aninemia in pregnancy: pregnancy complications and neonatal sequelae in un-treated and treated pregnancies. Am J Clin Nutr. 2012;95:374-82.

Ramlau-Hansen CH, Toft G, Jensen MS, et al. Maternal alcohol consumption dur-ing pregnancy and semen quality in the male offspring: two decades of follow-up. Hum Reprod. 2010;25:2340-5.

Reeve ME. Preconception health: the missing link in the MNCH continuum of care. Beijing Da Xue Xue Bao. 2009;41:383-8.

Regione Emilia Romagna. La nascita in Emilia Romagna. 7° Rapporto CedAP-Anno 2009. 2010.

Regione Lazio. Agenzia di Sanità Pubblica. Le nascite nel Lazio – Anno 2010. 2012.

Seshadri S, Oakeshott P, Nelson-Piercy C, et al. Prepregnancy care. Br Med J. 2012;31;344:e3467.

** Ottima, concisa e aggiornata revisione. Va letta e conservata.

Siega-Riz AM, Herring AH, Olshan AF, et al. The joint effects of maternal prepreg-nancy body mass index and age on the risk of gastroschisis. Paediatr Perinat Epidemiol. 2009;23:51-7.

Shah NR, Bracken MB. A systematic review and meta-analysis of prospective studies on the association between maternal cigarette smoking and preterm delivery. Am J Obstet Gynecol. 2000;182:465-72.

* Classica revisione sistematica. Fornisce la dimensione del rischio di prematu-rità più affidabile.

Shah PS, Balkhair T, Ohlsson A, et al. Intention to become pregnant and low birth weight and preterm birth: a systematic review. Matern Child Health J. 2011;15:205-16.

Shrestha A, Nohr EA, Bech BH, et al. Smoking and alcohol use during pregnancy and age of menarche in daughters. Hum Reprod. 2011;26:259-65.

** Lo studio più recente che suggerisce disturbi endocrinologici della sfera ses-suale. In questo studio l’età del menarca nelle figlie delle donne fumatrici risulta anticipata anche nelle figli di mamme che avevano smesso di fumare durante la gravidanza.

Stanton CK, Gray RH. Effects of caffeine consumption on delayed conception. Am J Epidemiol. 1995;142:1322-9.

Stothard KJ, Tennant PW, Bell R, et al. Maternal overweight and obesity and the risk of congenital anomalies: a systematic review and meta-analysis. JAMA 2009;301:636-50.

Strijbis EM, Oudman I, van Essen P, et al. Cerebral palsy and the application of the international criteria for acute intrapartum hypoxia. Obstet Gynecol. 2006;107:1357-65.

* Verifica sul campo delle cause che hanno determinato la paralisi cerebrale.

Sun Y, Strandberg-Larsen K, Vestergaard M, et al. Binge drinking during preg-nancy and risk of seizures in childhood: a study based on the Danish National Birth Cohort. Am J Epidemiol. 2009;169:313-22.

Timmermans S, Steegers-Theunissen RP, Vujkovic M, et al. Major dietary pat-terns and blood pressure patterns during pregnancy: the Generation R Study. Am J Obstet Gynecol. 2011;205:337.e1-12.

Timmermans S, Steegers-Theunissen RP, Vujkovic M, et al. The Mediterranean diet and fetal size parameters: the Generation R Study. Br J Nutr. 2012;21:1-11 [Epub ahead of print].

Tobias DK, Zhang C, van Dam RM, et al. Physical activity before and during pregnancy and risk of gestational diabetes mellitus: a meta-analysis. Diabetes Care 2011;34:223-9.

Toledo E, Lopez-del Burgo C, Ruiz-Zambrana A, et al. Dietary patterns and dif-ficulty conceiving: a nested case-control study. Fertil Steril. 2011;96:1149-53.

Torloni MR, Betrán AP, Daher S, et al. Maternal BMI and preterm birth: a system-atic review of the literature with meta-analysis. J Matern Fetal Neonatal Med. 2009;22:957-70.

Torloni MR, Betrán AP, Horta BL, et al. Prepregnancy BMI and the risk of gesta-tional diabetes: a systematic review of the literature with meta-analysis. Obes Rev. 2009;10:194-203.

Vasudevan C, Renfrew M, McGuire W. Fetal and perinatal consequences of ma-ternal obesity. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 2011;96:F378-82.

Vujkovic M, de Vries JH, Lindemans J, et al. The preconception Mediterra-nean dietary pattern in couples undergoing in vitro fertilization/intracytoplas-mic sperm injection treatment increases the chance of pregnancy. Fertil Steril. 2010;94:2096-101.

Wahabi HA, Alzeidan RA, Bawazeer GA, et al. Preconception care for diabetic women for improving maternal and fetal outcomes: a systematic review and meta-analysis. BMC Pregnancy Childbirth 2010;10:63.

** Ottima e aggiornata. Indica l’efficacia dell’intervento preconcezionale nel ri-durre il rischio di malformazioni ed altri esiti.

Wigle DT, Turner MC, Krewski D. A systematic review and meta-analysis of child-hood leukemia and parental occupational pesticide exposure. Environ Health Perspect 2009;117:1505-13.

Corrispondenza

Pierpaolo Mastroiacovo, Direttore Alessandra Lisi International Centre on Birth Defects and Prematurity, WHO Collaborating Centre, via Carlo Mirabello 14, 00195 Roma. Tel 063701905. Email: [email protected]

253

Ottobre-Dicembre 2012 • Vol. 42 • N. 168 • pp. 253

Pochi mesi dopo che Antonio Cao ci ha lasciato, un’altra grande personalità della pediatria italiana è venuta a mancare. Il 15 ottobre 2012 è morto Franco Panizon. Due grandi personalità, diverse per impostazione culturale e per il messaggio che hanno lasciato con la loro lunga attività di leader, ma ambedue capaci di influenzare grandemente una intera generazione di pediatri italiani.Prospettive in Pediatria vuole doverosamente ricordare ai suoi lettori Franco Panizon, con commozione e ammirazione.Doverosamente anche e soprattutto perché il contributo di Franco Panizon alla fondazione e al successo di Prospettive è stato fondamentale, avendo Lui curato la redazione, e scritto il commento finale di tutte le ventidue Tavole Rotonde che hanno arricchito e caratterizzato la rivista nei primi undici anni della sua esistenza (dal 1971 al 1981 compreso).Ricordo, a questo proposito, che uno degli obiettivi fondamentali per cui fu creata Prospettive fu di aprire un colloquio-confronto tra pediatri e società civile, per sottolineare nuovi problemi e urgenti necessità, nella speranza di incidere positivamente sulla politica assistenziale e sanitaria per l’infanzia nel nostro Paese. Strumento di questo obiettivo furono le Tavole Rotonde.Orbene, Franco Panizon, con la sua inimitabile capacità di sintesi, con il suo senso critico, con il suo dire senza reticenze tutto ciò che rite-neva rilevante, è stato decisivo per il grande successo delle Tavole Rotonde e, quindi, di Prospettive.Nel 1982 Franco Panizon lasciò Prospettive per fondare Medico e Bambino, rivista soprattutto dedicata ai problemi clinici e assistenziali del-la pediatria di famiglia, pubblicazione quindi non certo antagonista nei confronti di Prospettive, ma diversa e sicuramente complementare. Medico e Bambino non poteva non essere un grande successo, come è poi stato.E questo anche e soprattutto perchè Franco Panizon è stato il pediatra con il maggiore “carisma” della sua generazione.Franco non era solo grande pediatra, era molto altro e molto di più. Claudio Magris, sul Corriere della Sera, lo ha ricordato con grande effi-cacia, e vorrei che tutti i pediatri leggessero il suo lungo articolo, soprattutto per comprendere appieno la grandezza e la poliedricità della personalità del professor Panizon. Egli non era solo medico, lui era anche, e io mi permetto di dire soprattutto, uomo di cultura umanistica fuori dal comune.Nella nostra abitazione, mia moglie Lucia ed io conserviamo con amore innumerevoli disegni e pitture che Franco nei lunghi cinquanta anni della nostra amicizia ci ha donato. Non ci stanchiamo di mostrarli a tutti gli amici che ci vengono a trovare, per dire loro come un grande pediatra ha potuto essere anche un artista di valore.

Fabio Sereni

In ricordo di Franco Panizon

Figura 8

Figura 8aGPU sin. acutamente scompensatoImmagini assiali e coronali ottenute da sequenza GRE3D dina-mica e GRE 3D urografica ad alta risoluzione dopo mdc.Bilateralmente apprezzabile il contrast enhancement in fase parenchimografica; assente la fase urografica a sinistra, com-pleta l’opacizzazione della trafila urinaria a destra.

Figura 8bCurva parenchimografica pre intervento Rappresentazione delle curve parenchimografiche del rene destro e sinistro: si noti la presenza bilaterale del picco vasco-lare con completo appiattimento della curva, relativamente alla fase di filatrazione glomerulare. La funzione renale differenzia-le calcolata con area sotto la curva ( AUC) risulta:AUC 91% a dx e 9% a sinistra.

Figura 8cCurva parenchimografica 6 mesi post intervento di giunto-plastica Rappresentazione delle curve parenchimografiche del rene destro e sinistro: si noti la variazione della curva parenchimo-grafica di sinistra rispetto alla valutazione pre-intervento (fig. 8a) con comparsa del picco relativo alla fase glomerulare non apprezzabile nel precedente controllo. La funzione renale differenziale calcolata con area sotto la curva ( AUC) risulta:AUC 62% a dx e 38% a sinistra.

eRRATA CoRRiGe

A pagina 167 del fascicolo n.167, vol. 42 è stata pubblicata una versione parziale della figura 8, che riportiamo di seguito completa.

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Vol. 42 • N. 168 Ottobre-Dicembre 2012 · Luigi Daniele Notarangelo, Boston Luca Ramenghi, Genova...

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