UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA

VIROLOGIA GENERALE

Replicazione virale

Classificazione e struttura

Patogenesi virale

Diagnosi delle infezioni da virus

Farmaci antivirali

“…a piece of bad news enwrapped in a protein coat”

(D. Baltimore)

1500 AC: prime evidenze della presenza di virus

Primo virus identificato: foot and mouth disease

(picornavirus), 1898

segni sul viso:

vaiolo

deformità della gamba:

poliomielite

COSA SONO I VIRUS?i virus sono....

• Mancano dell'informazione genetica che codifica l'apparato

necessario per la generazione di energia metabolica (ATPasi)

o per la sintesi di proteine (ribosomi) e sono quindi

assolutamente dipendenti dalla cellula ospite per queste

funzioni

• Si tratta di particelle prodotte dall'assemblaggio di

componenti preformati: non crescono e non si dividono

(gli altri organismi aumentano la somma dei propri componenti

e poi si replicano per divisione)

• Possono infettare animali, piante e batteri

.... parassiti endocellulari obbligati

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10

1 cm 1 mm 1 mm 1 nm 1 Å

cellule

animali batteri virus proteine atomi

microscopio ottico

microscopio elettronico

raggi-X

NMR

DIMENSIONI RELATIVE DI VIRUS E BATTERI

LE DIMENSIONI VARIANO

da 20-30nm a 300nm

(1nm è uguale a 10-6mm

= un milionesimo di mm)Koneman et al. Color Atlas and Textbook of Microbiology 5th Ed. 1997

1.0 mm

al microscopio:

al microscopio ottico si

osservano le cellule infette

al microscopio elettronico si

osservano le particelle virali

Struttura

e classificazione

dei virus

I VIRUS SONO ORGANISMI SUB-CELLULARI

ESSENZIALMENTE COSTITUITI DA:

• ACIDO NUCLEICO

• INVOLUCRO PROTEICO (CAPSIDE)

ALCUNI HANNO UN RIVESTIMENTO ESTERNO

CHIAMATO

• ENVELOPE o MANTELLO o PEPLOS o PERICAPSIDE

Le particelle virali o “virioni” presentano in superficie

antirecettori che riconoscono i recettori sulle cellule

bersaglio

STRUTTURA DEI VIRUS

CAPSIDE

(proteico)

VIRIONE

RIVESTIMENTO

CORE

INTERNO

ENVELOPE

(lipidico)

AC. NUCLEICO

PROTEINE

(enzimi)

ACIDO NUCLEICO

strettamente impacchettato nel capside:

• RNA oppure DNA

• a singola catena o a doppia catena

• nonsegmentato o segmentato

• lineare o circolare

• associato a ioni + o a proteine basiche (virali o cellulari) per neutralizzare le cariche negative dei gruppi fosfato

PROTEINE VIRALI

Si distinguono:

• Proteine funzionali che permettono ad es. all’acido

nucleico virale di replicarsi (DNA- o RNA-polimerasi)

• Proteine strutturali: incorporate nelle nuove particelle

virali come costituenti del capside o come strutture

particolari (es. le emoagglutinine) presenti

nell’envelope

• Proteine strettamente associate agli acidi nucleici

• Proteina di matrice o proteina M nei virus con

envelope sono le proteine con funzione strutturale, situate

proprio al di sotto dello strato fosfolipidico•Bersaglio di farmaci antivirali come amantadina e

•rimanatadina

CAPSIDE (RIVESTIMENTO PROTEICO)

Funzione: protezione,

riconoscimento recettori,

Struttura: strutture regolari a

partire da subunità irregolari

Definisce la SIMMETRIA: binaria,

elicoidale, icosaedrica,

complessa

Le forze che legano insieme i

protomeri sono non covalenti.

SIMMETRIA:

Le proteine del capside

caratterizzano la

simmetria :

• cubica o icosaedrica

• elicoidale

• complessa

• binaria

Simmetria CUBICA

o ICOSAEDRICA:

ICOSAEDRO: figura solida con

• 20 facce identiche (triangoli

equilateri)

• 12 vertici

• 30 spigoli

simmetria rotazionale 5:3:2Vertici, facce spigoli

Simmetria CUBICA

o ICOSAEDRICA

• Le unità strutturali proteiche

(protomeri) si dispongono in

raggruppamenti simmetrici detti

CAPSOMERI.

• Disposizione spaziale dei

protomeri in modo da formare

un solido regolare cavo che più

si avvicini alla sfera:

un ICOSAEDRO

• 3 assi di simmetria rotazionali

passanti al centro dell’icosaedro.

• PENTONI (5 protomeri) ai VERTICI

• ESONI (6 protomeri) sulle FACCE

Adenovirus

Simmetria ELICOIDALE

• I protomeri non si

raggruppano in

complessi, ma si

dispongono con un

andamento a spirale per

formare il capside

cilindrico nella cui cavità

si trova l’acido nucleico

• Questa simmetria ha un

solo asse di simmetria

rotazionale che coincide

con l’asse longitudinale

del cilindro

acido nucleico

proteine

Paramyxovirus umano tipo 1

Simmetria

COMPLESSA

è la simmetria dei

Poxvirus (forma a

mattone) e dei

Rhabdovirus (forma

a proiettile)

Simmetria BINARIA

è la simmetria dei fagi

(virus batterici)

MANTELLO

• è presente su tutti i virus a

simmetria elicoidale ed in

alcune famiglie con capside

a simmetria icosaedrica

(herpes, hepadna,

togavirus(RNA+),

retrovirus (RNA+)

• natura chimica del mantello:

lipidica o glicolipidica

• i virus acquisiscono il

mantello nella fase tardiva

del ciclo d’infezione, dopo

l’assemblaggio del

nucleocapside

Il mantello origina dalla:

• membrana nucleare

(herpes)

• membrana citoplasmatica

(virus a RNA)

Sul mantello sono presenti

GLICOPROTEINE virali come

l’emagglutinina (HA)

che permettono

l’adsorbimento

del virione sulle

cellule sensibili HIV gemmante

Esempio di

VIRUS NUDI

Esempio di

VIRUS CON ENVELOPE

CAPSIDE NUDO(HPV,poliovirus )

Proprietà

Resistente a:

alte temperature, acidi, detergenti,

essiccamento

E’ rilasciato dalla cellula per lisi

Conseguenze:

Facilmente diffuso (su oggetti, da

una mano all’altra, con la polvere

o piccole gocce d’acqua)

Può essere essiccato e

mantenere l’infettività

Può sopportare le diverse

condizioni dell’intestino

Può resistere ai detergenti e alle

acque di scolo trattate

blandamente I virus con envelope sono

più fragili (in genere…)

CAPSIDE CON ENVELOPE:

Proprietà

Distrutto da: acidi, detergenti,

essiccamento, calore

Modifica le membrane cellulari durante

la replicazione (fusione)

E’ rilasciato per gemmazione, talvolta

per lisi cellulare

Conseguenze:

Deve rimanere in ambiente umido

Si diffonde con gocce d’ acqua,

secrezioni, trapianti d’organi e

trasfusioni di sangue

Non sopravvive nel tratto gastro-

intestinale

Non uccide necessariamente la cellula

per diffondersi

From Principles of Virology Flint et al ASM Press

virus ad RNA

HAV polio

rinovirus ,

•

•Rosolia

dengueMorbillo

parotite

virus a DNA

•B19( quinta

• malattia )Papilloma

Virus ad RNA

Picorna

Calici

Norwalk

Toga

Flavi

Corona

Rhabdo

Paramyxo

Bunya

Arena

ReoRotavirus

subclinical Retro

Virus ad RNA e struttura del loro genoma

Le famiglie virali sono definite in base alla struttura del

genoma ed alla morfologia del virione

(RNA+) (RNA -) (RNA +/-) (RNA +

via DNA)

(N) (E) (E) (E)(Doppio capside)

Orthomyxo

(Morbillo -Virus respiratorio sinciziale)

•Genome:

•Segmented, d/s RNA

Infections cause endemic/epidemic gastroenteritis and

infantile diarrhoea is an a important cause of death in the

developing world:

•Reovirus-Rotavirus

Virus a DNA

Pox Herpes Hepadna Parvo

Adeno

Virus a DNA

Le famiglie virali sono definite in base alla struttura del

genoma ed alla morfologia del virione

Papova

Rivestiti Con capside nudo

Classificazione tassonomica dei virus

Criteri:

• acido nucleico (DNA o RNA)

• simmetria del capside (icosaedrica, elicoidale, complessa)

• envelope (si o no)

• architettura del genoma

• modalità replicative

• polimerasi associata al virione

• diametro virione (nm) e numero

dei capsomeri

• dimensioni genoma (kb)

herpesviridae

betaherpesvirinae

cytomegalovirus

International Committee on Taxonomy of Viruses

(ICTV)

Classificazione tassonomica dei virus

per esempio:

Nuovi ceppi virali possono originare dal ceppo

parentale o selvatico per mutazioni

Nuovi ceppi possono emergere anche per:

• ricombinazione (tra virus a DNA come HSV1 e 2)

• riassortimento (virus influenzali)

Denominazione dei virus

STRUTTURADIMENSIONI, MORFOLOGIA E TIPO DI ACIDO NUCLEICO

ad es.: PICORNAVIRUS = PICCOLI VIRUS AD RNATOGAVIRUS = VIRUS CON MANTELLO

CARATTERISTICHE BIOCHIMICHESTRUTTURA E TIPO DI REPLICAZIONE (SISTEMA CORRENTE PER LA CLASSIFICAZIONE TASSONOMICA DEI VIRUS)

MALATTIEad es.: VIRUS DELLE ENCEFALITI, VIRUS DELLE EPATITI

CELLULA OSPITE (SPETTRO D’OSPITE)ANIMALI (uomo, topo, uccelli),

TESSUTO OD ORGANO (TROPISMO)ad es.: ADENOVIRUS, ENTEROVIRUS

TIPO DI TRASMISSIONEad es.: ARBOVIRUS VIRUS = ARTHROPOD-BORNE VIRUS( enc )

Replicazione virale

FASI DELLA REPLICAZIONE VIRALE

1. RICONOSCIMENTO della cellula target

2. ADSORBIMENTO

3. PENETRAZIONE

4. DENUDAMENTO

5. SINTESI MACROMOLECOLARI

(mRNA precoci e proteine non strutturali

- REPLICAZIONE DEL GENOMA –

mRNA tardivi e proteine strutturali)

6. ASSEMBLAGGIO

7. RILASCIO

PERIODO

DI

ECLISSI

Nel ciclo di replica virale c’è una

1. Fase precoce

• Riconoscimento

• Penetrazione

• Rilascio del genoma

2. Fase tardiva

• replica

• sintesi macromolecolari

• assemblaggio

• rilascio Ogni cellula infetta può produrre fino a100000 particelle virali ma solo 1-

10% sono dotate di infettività

1-2

3

4

5

6

7

EBV: gp220-gp350

HIV: gp120

Influenza HA

Morbillo(paramyxovirus) H

Rhinovirus(picornavirus):VP1

-VP2-VP3 ( VP4 è interna)

CR2 (CD21)(Tand B

cells) - C3dR

CD4

Gp contenenti acido

sialico

CD46 ( B cells)

ICAM-1 cellule

epiteliali

RECETTORI CELLULARI

A) RICONOSCIMENTO-ATTACCO

Contatto virus-cellula (spettro d’ospite)

La cellula bersaglio suscettibile definisce il tropismo tissutale

ANTIRECETTORI VIRALI (viral attachment protein: VAP)

Emagglutinina (HA)

virus dell’influenza

ESEMPI di VAP

•(Virus attachment protein)

Virus senza mantello:

internalizzazione mediante:

a) endocitosi (o viropessi, mediata da clatrina, pH

neutro o acido) e trasferimento all’interno del

citoplasma in una vescicola endocitica

b) fagocitosi

B) PENETRAZIONE

ENDOCITOSI: alcuni esempi…

VIRUS SENZA MANTELLO: ADENOVIRUS, PICORNAVIRUS

VIRUS SENZA MANTELLO : PICORNAVIRUS

Molte proteine usate come recettori appartengono alla

superfamiglia delle Immunoglobuline

(ICAM = intracellular adhesion molecule).

Il Poliovirus si lega solo al recettore PVR( poliovirus

recettore) o CD155 espresso dai primati che ne determina

così lo spettro d’ospite

Virologia

generale• B) Penetrazione

• Virus senza mantello:

• a) adsorbimento

• Virus con mantello.

• A) per fusione dell’inviluppo

lipoproteico con la membrana

cellulare esterna

• azione delle

proteasi sul

capside proteico

• azione degli enzimi

lisosomiali sulle

strutture proteiche

• resistenza degli

acidi nucleici agli

enzimi nucleolitici

cellulari

(DNasi, RNasi).

C) DENUDAMENTO

•Virus a DNA (bicatenario)( Herpes virus)

•Utilizza trascrittasi virale

•L’assemblaggio avviene nel nucleo

•(Poxvirus si replicano nel citoplasma)

Genoma a RNA monocatenario positivo ( picornavirus

togavirus) che funziona da messaggero.

Genoma a RNA monocatenario negativo ( orthomyxovirus

paramyxovirus)

utilizzano trascrittasi virali

L’assemblaggio avviene nel citoplasma

•Genoma a RNA(2 molecole identiche)( HIV) viene

trascritto in DNA da una polimerasi virale ( DNA

polimerasi RNA dip) l’assemblaggio avviene nel citoplasma

D) ECLISSI

Sintesi delle

macromolecole virus

specifiche che consta

in 3 fasi:

1) trascrizione del

genoma virale in

mRNA

2) traduzione dei

messaggeri virali

in proteine

3) replicazione del

genoma virale

• la fase di eclissi dura per un periodo che va

da minuti a ore e dipende del tipo di virus .

In questa fase i virioni , perdendo la loro

integrità strutturale sembrano scomparire

alle comuni indagini immunologiche e

virologiche .

Per la replica del genoma occorre

DNA polimerasi - DNA dipendente

La trascrizione avviene nel nucleo

Per la sintesi dei mRNA viene usata

RNA polimerasi II - DNA dipendente cellulare

la replica del DNA virale avviene analogamente alla

replica del DNA cellulare

• i virus piccoli utilizzano la polimerasi cellulare

• i virus grandi codificano per una polimerasi virale

(adenovirus, herpesvirus)

Virus a DNA

Il genoma a RNA può essere:

• a RNA+ (cioè come un mRNA)

• a RNA- (cioè come un template per mRNA)

La trascrizione avviene nel citoplasma

Il genoma virale deve codificare per

la polimerasi

RNA polimerasi - RNA dipendente virale

Virus a RNA

. Virus a RNA+:

è come un mRNA, si lega ai ribosomi

per la sintesi delle proteine

C’è un intermedio a RNA-( stampo) per

la replicazione del genoma

enzima: RNA polimerasi - RNA dipendente

. Virus a RNA-

: sulla sua base vengono sintetizzati gli

mRNA che codificano per le proteine

virali

C’è un intermedio a RNA+( stampo) per

la replicazione del genoma

enzima: RNA polimerasi - RNA dipendente

E) ASSEMBLAGGIO

• assemblaggio delle copie del genoma virale e delle differenti proteine strutturali per formare i nuovi virioni

• tutti i virus a RNA si assemblano nel citoplasma delle cellule infettate

• i virus a DNA si assemblano nel nucleo tranne i Poxvirus (citoplasma)

F) LIBERAZIONE

Acquisizione del mantello:

in genere dalla membrana

cellulare

• herpesvirus (foglietto interno

della membrana nucleare)

liberazione:

la liberazione dei virus con

mantello avviene per

gemmazione

la liberazione dei virus senza

mantello avviene per

esocitosi

Retrovirus: l’RNA+ è convertito in

DNA che si integra con quello cellulare e viene trascritto come un gene cellulare

enzima: DNA polimerasi - RNA dipendente

o TRASCRITTASI INVERSA

Patogenesi virale

PATOGENESI VIRALE

è il processo tramite il quale

l’infezione virale porta alla

malattia

INFEZIONE

Ingresso del virus nell’organismo

senza sintomi o con sintomi transitori locali

MALATTIA

il virus raggiunge gli organi target e

causa segni e sintomi associati

della malattia

Infezione / malattia

L’esito di un’infezione virale è determinato:

• dalla natura dell’interazione virus-ospite

• dalla risposta immune dell’ospite

• il ceppo virale

• la consistenza dell’inoculo

• Le condizioni generali di salute della persona

infettata determinano la gravità e la durata della

malattia

La risposta immune è uno dei fattori responsabili

della patogenesi di una infezione virale

VIE DI INGRESSO

DEL VIRUS

NELL’OSPITE

Patogenesi delle infezioni virali:

a) impianto

b) diffusione

c) disseminazione

d) eliminazione

ingresso nell’organismo

iniziazione dell’infezione al sito primario

periodo d’incubazione (asintomatico o prodromi)

sintomi (organo bersaglio)

Virologia Generale

DIFFUSIONE DEL VIRUS

NELL’ORGANISMO

ORGANI

BERSAGLIO

Suscettibilità e

Permissività

INFEZIONE

DISSEMINATA

Malattie

(esantematiche) VIREMIA

SECONDARIA

VIREMIA

PRIMARIA

INFEZIONE

LOCALIZZATA

Virus influenzali, Virus enterici

REPLICAZIONE

PRIMARIA

PENETRAZIONE

REPLICAZIONE

SECONDARIA

• Cellula permissiva:

fornisce il complesso

biosintetico per sostenere

l’intero ciclo di replicazione

virale.

• Cellula non permissiva:

non permette la replicazione

di un particolare ceppo virale.

• Cellula semipermissiva:

quando è in grado di

sostenere alcune, ma non

tutte, le fasi della replicazione

virale.

TIPI DI INFEZIONE VIRALE A LIVELLO CELLULARE

TIPI DI INFEZIONE VIRALE:

1. abortiva (fallimento)

2. litica (morte cellulare)

3. persistente (infezione senza morte

cellulare)

Le infezioni persistenti comprendono le infezioni

3a. croniche (non litiche, produttive)

3b. latenti (sintesi di macromolecole, ma non di

nuovi virioni: ad es. herpes)

3c. ricorrenti

3d. trasformanti

Virologia Generale

PATOLOGIA VIRALE: progressione della malattia

• Infezione: il virus comincia a crescere nell’ospite

• Periodo di incubazione: periodo compreso fra l’infezione e la comparsa dei sintomi

• Fase prodromica: periodo di incubazione in cui possono manifestarsi sintomi non specifici

• Periodo acuto: picco della malattia e dei sintomi

• Periodo di declino: diminuzione dei sintomi, risoluzione dell’infezione

• Convalescenza: recupero

• Influenza

• Malattie da raffreddamento

• Herpes simplex

• Poliomielite

• Morbillo

• Rosolia

• Mononucleosi

• Rabbia

• Epatite A

• Epatite B

• AIDS

1-2 giorni

1-2 giorni

5-8 giorni

5-20 giorni

12-14 giorni

17-20 giorni

30-50 giorni

30-100 giorni

15-40 giorni

50-180 giorni

1-10 anni

Periodo d’incubazione delle più comuni infezioni virali

INFEZIONI LITICHE

= replica del virus nelle cellule infette con lisi

cellulare in poche ore-giorni

Infezioni persistenticondizione di parassitismo virale controllato

- produzione di Ag virali e di virus infettanti

• croniche (HBV, HCV)

INFEZIONI PERSISTENTI

= quando una cellula viene infettata, ma non uccisa, dal virus.

• possono essere infezioni latenti o trasformanti.

• infezioni latenti:herpesvirus

infezione primaria

fase di latenza

infezione riattivante

INFEZIONI

TRASFORMANTI:Virus oncogeni: alterazioni non

degenerative ma condizionanti la proliferazione anomala ed incontrollata delle cellule infette (trasformate).

Ad es: alcuni papillomavirus (HPV) possono inattivare delle proteine (p53, pRB105) che regolano il ciclo di replicazione delle cellule

DIFESE DELL’ORGANISMO CONTRO

LE INFEZIONI VIRALI

1. Barriere naturali anatomiche (epidermide, mucose)

2. Difese aspecifiche umorali (infiammazione, complemento

Interferon)

3. Difese aspecifiche cellulari (Cellule natural killer e

macrofagi)

4. Difese specifiche umorali (Anticorpi);

5. Difese specifiche cellulari (CTL e macrofagi).

6. Variabilità recettoriale (ad es: CCR5 variante allelica D32

e resistenza ad HIV)

INTERFERONE

Fattore che “interferisce” con la replicazione di molti virus

- prima difesa sia a livello locale che sistemico -

• blocco della replicazione virale nella cellula target

• attivazione dei linfociti T nel riconoscimento delle

cellule infettate

Type I

Type II

IFN-a

IFN-b

IFN-g

IFN-a B cells, monociti, macrofagi, DC immature

IFN-b fibroblasti

STATO ANTIVIRALE

gli IFN inducono la sintesi di due enzimi:

• 2’-5’ oligo-adenilato-sintetasi (2-5A)

• Proteina chinasi R (PKR)

RISULTATO:

blocco della sintesi proteica = no virus

IFN leucocitario

IFN fibroblastico

IFN-g T cells, NK IFN immune

INTERFERONE PRODOTTO DA:

Essendo “parassiti

endocellulari obbligati”

la propagazione dei

virus è possibile solo su

CELLULE VIVE

Possono essere

impiegati:

A) animali da

laboratorio

B) uova embrionate

di pollo

C) colture cellulari

A) Inoculazione negli

animali da laboratorio

è stato il primo metodo

usato per isolare i virus.

Nell’animale si osserva la

capacità del virus di

provocare la morte o di

produrre lesioni o sintomi

clinici evidenti.

L’inoculazione in animali

è stata usata soprattutto

per l’isolamento di virus

neurotropi.

B) Inoculazione in uova

embrionate di pollo

• Sono batteriologicamente sterili

e non sviluppano nessun

meccanismo immunitario.

• Le uova sono di 10-12 gg.

Le vie d’inoculazione sono:

• Membrana corion-allantoidea:

(virus vaiolo, vaccinico, herpes)

• Cavità amniotica:

(virus influenzale, parotitico)

• Cavità corion-allantoidea:

(vaccini anti-influenza).

• Sacco vitellino:

(Rickettsia, Chlamydia)

C) Colture cellulari

Vengono distinte in:

• colture primarie

• colture secondarie

• colture in linea continua

L’isolamento virale in colture cellulari è il metodo attualmente più usato in laboratorio

Terreni per colture cellulari esistono molte preparazioni:

RPMI 1640

MEM

Dulbecco-modified MEM (DMEM)

ISCOVE

….etc.

Composizione:

H2O, aminoacidi essenziali, vitamine, sali, glucosio, ormoni,

acidi grassi, fonti di carbonio, composti azotati

Deve essere sempre presenti:

• SIERO FETALE BOVINO (FBS) al 10%

• antibiotici ed antifungini per evitare inquinamento

• un indicatore di pH

La crescita cellulare fa variare il pH verso l’acido e il

terreno da rosso-arancio diventa giallo

Colture primarie:

Derivano da un o tessuto o da un

organo prelevato da un animale

(ad esempio rene, polmone, fegato)

Il materiale viene processato in

modo da avere cellule che vengono

risospese in terreno liquido e

inserite in una fiasca dove

aderiscono e formano un

monostrato cellulare

Le preparazioni devono essere fatte in

condizioni di sterilità!!

Colture secondariedopo 7-15 giorni le colture si invecchiano e

occorre fare un “trapianto”:

• dalle colture primarie si elimina il terreno liquido.

• si lava il tappeto con tampone fosfato (PBS) e poi si ricopre

con un velo di tripsina ed EDTA • si mantiene la coltura per pochi minuti a 37°C per far agire

la tripsina

• la sospensione viene raccolta e centrifugata a 1800

rpm/ x 3 min.

• si elimina il sovranatante ed il sedimento

è ridistribuito su altri contenitori

• sopravvivenza per 2-3 mesi

con trapianti settimanali

A seconda del tipo di cellule sono

possibili 30-50 TRAPIANTI,

poi la coltura muore

Colture in linea continua:

• Sono cellule modificate o trasformate

(poliploidi, aneuploidi, eteroploidi)

• Hanno perso l’inibizione da contatto

• Sono in grado di moltiplicarsi nel tempo

senza alcun limite, con trapianti settimanali

.Esistono migliaia di linee cellulari

di tutte le origini istologiche

(HeLa EP utero), Hep-2( ep laringe), KB

(oral carcinioma) , LLCMK2, MDCK ep

rene), etc.

• Vantaggi: si propagano in maniera indefinita e

conservano la vitalità per diversi anni se

congelate in azoto liquido (-196°C) una volta

sospese in glicerolo o in dimetilsulfossido

(DMSO).

1) Effetto citopatico

morte cellulare

arrotondamento cellulare

degenerazione

aggregazione

perdita dell’attacco al substrato

2) Cambiamenti delle

caratteristiche

istologiche

corpi inclusi nucleari,

citoplasmatici

La moltiplicazione di un agente virale in una coltura

cellulare può essere evidenziata in modi diversi:

3) Formazione di sincizi

cellule giganti

polinucleate causate dalla

fusione cellula-cellula.

4) Cambiamenti sulla

superficie cellulare

• Espressione degli Ag

virali

• Emoadsorbimento

5) Rilevamento di antigeni

virali mediante anticorpi

monoclonali marcati

con fluoresceina

6) Coltura rapida in

“SHELL-VIAL”

Centrifugazione del

campione su

monostrato cellulare

e immunofluorescenza

diretta dopo 24-48 ore

Farmaci Antivirali

• Per la loro replica, i virus utilizzano le

strutture biosintetiche e gli enzimi della cellula

ospite: è difficile inibire la replicazione virale

senza provocare anche effetti tossici per la

cellula ospite

bersaglio degli antivirali:

le differenti fasi della replica

A) Attacco - Fusione

Distruzione del virione (Nonoxynol-9: detergente)

B) Penetrazione e Denudamento

C) Sintesi di RNA

D) Inibitori della DNA polimerasi

E) Trascrizione

F) Sintesi proteica

G) Biosintesi dei nucleotidi – analoghi

H) Recupero dei nucleotidi

L) Assemblaggio

I) Modificazione delle glicoproteine

A) Attacco

analoghi peptidici delle proteine

di adsorbimento -

destransolfato, eparina..,

Anticorpi neutralizzanti

Bloccano il legame tra

gp120 e CD4 (HIV)

Blocco del legame

al recettore

Enfuvirtide o T20 o Fuzeon®

Inibisce l’azione della proteina

di fusione GP 41 di HIV Blocco della

fusione

A) Attacco

Molecole che bloccano il

corecettore

(nel caso di HIV CCR5 o CXCR4)

Blocco del legame

al corecettore

recettore: CD4 corecettore: CCR5

per CCR5:

Maraviroc o Selzentry®

B) Penetrazione e

Denudamento

Amantadina e Rimantadina,

Tramantadina, Arildone.

Sono amine sintetiche

primarie che inibiscono la

replica virale legandosi alla

proteina della matrice M2 e

bloccando i canali protonici

L’attività antivirale limitata al

virus dell’influenza tipo A

Biosintesi dei nucleotidi:

analoghi nucleosidici

Ribavirina (--> RSV)

C) Sintesi di RNA

• IFN

• Poli I:C (induce IFN)

D) Replicazione del DNA

Inibitori della DNA polimerasi

• Analoghi nucleosidici:

ACICLOVIR - (HSV).

Agisce come analogo della

deossiguanidina trifosfato

• GANCICLOVIR, Adenosina

arabinoside, Citosina

arabinoside, Zidovudina,

Dideossinosina,

Dideossicitidina, Idossiuridina,

Trifluoridina.

E) Eclissi, Trascrizione

• interferone,

• poli I:C

F) Sintesi proteica

IFN-a e IFN-b

• Degradano l’mRNA virale e cellulare e viene bloccato il

legame dell’mRNA al ribosoma, impedendo la sintesi proteica

e la replicazione virale.

Usato soprattutto IFN alfa - PEGILATO: coniugato a PEG

(polietilenglicole) per lento rilascio

Impiegato nelle infezioni da:

virus epatite A, B, C (HAV, HBV, HCV), papillomvirus (HPV)

G) Biosintesi dei

nucleotidi: analoghi

nucleosidici

• ribavirina

• acyclovir

• gancyclovir

• AZT

H) Recupero dei

nucleotidi

timidina chinasi (analoghi

nucleosidici)

• Herpes, HIV, HBV

I) Modificazione delle glicoproteine

• anti-proteasi.

L) Assemblaggio

• inibitori delle proteasi

• indinavir, ritonavir, saquinavir….

attivi verso HIV (in HAART)

Blocco

dell’assemblaggio

Blocco

dell’esocitosi

Anti-HIV

Virologia generale

Oltre ai Virus “classici”, esistono altri agenti infettivi

studiati dalla virologia:

• Viroidi: piccole molecole di RNA circolare (200-400

nucleotidi), prive di capside e envelope. Associati

con alcune malattie delle piante. Sono parassiti

endocellulari obbligati

• Virusoidi: simili ai viroidi, ma più grandi, sono

molecole di RNA 'satellite' (circa 1000 nt). Per la loro

moltiplicazione dipendono dalla presenza di virus

che si replicano (da cui 'satellite'), e sono assemblati

nel capside virale come “passeggeri”. Presenti in

animali e piante, sono associated a malattia (virus

Delta epatite)

Virus: scoperta dei vaccini

On 14th May 1796, Edward Jenner used cowpox-infected material obtained from the hand of Sarah Nemes, a milkmaid from Berkley in Gloucestershire to vaccinate 8 year old James Phipps.On 1st July 1796, Jenner challenged the boy by deliberately inoculating him with material from a real case of smallpox !He did not become infected!