Verifiche qualitative dell’RNA e cDNA in ambito dei trials ... · • La verifica della qualità...
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Verifiche qualitative dell’RNA e cDNA in
ambito dei trials “BCR/ABL e AML
translocation programme”
Massimo Degan, CRO Aviano (PN)
Verifiche qualitative dell’RNA
…perch è è importante verificare l’RNA …• La verifica della qualità dell’RNA nei saggi
diagnostico-molecolari viene fatta allo scopo di evidenziare un’eventuale degradazione del campione che può compromettere le successive reazioni di retro-trascrizione e amplificazione del target.
• Le procedure di verifica dell’RNA e cDNA permettono di evitare il problema dei falsi negativi.
• Verifica della presenza di DNA contaminante.
• Non è sufficiente considerare il parametro relativo al rapporto 260/280 nella lettura spettrofotometric a dell’RNA per stabilirne la qualità.
Verifiche qualitative dell’RNA
…perch è è importante verificare l’RNA …Il successo delle applicazioni successive all’estrazione dell’RNA (RT -PCR, microarrays, etc) dipende da 3 fattori:
INTEGRITA’
PUREZZA
QUANTITA’
QUALITA’
RNases
Verifiche qualitative dell’RNA
…perch è è importante verificare l’RNA …
QUANTITA’
• Lettura Spettrofotometrica
• Lettura Fluorimetrica
Verifiche qualitative dell’RNA
…perch è è importante verificare l’RNA …
QUANTITA’
• Lettura Spettrofotometrica
• Lettura Fluorimetrica
Verifiche qualitative dell’RNA
QUANTITA’
Lettura Spettrofotometrica (tradizionale)• 260 nm DNA, RNA• 280 nm contaminanti proteici
260/280 range 1.8-2.2
• 230 nm altri contaminanti (es. guanidine thiocyanate) 260/230 >1.7
Limitazioni
• Diluizione del campione (la lettura avviene in cuve tte)
Lettura tramite Nanodrop (Thermo Scientific)
• Nessuna diluizione del campione• 0.5-2 ul di campione, range di conc: 2 ng-12 ug
NanoDrop ® spectrophotometer data of RNA with various contaminants.
A. Pure RNA sample.B. RNA sample with 0.01% (v/v)
guanidine thiocyanateC. RNA with 5% ethanol (EtOH)
contaminationD. RNA with 5% isopropanol (IPA)
contamination
Verifiche qualitative dell’RNA
Lettura SpettrofotometricaLimitazioni•Mancanza di specificità nella lettura dell’RNA.
•Non è in grado di stabilire la purezza del campione. Il metodo non è in grado di distinguere la presenza di DNA genomico contaminante.
•La presenza di DNA genomico contaminante contribuis ce alla sovrastima della concentrazione del campione.
•Non è in grado di verificare l’integrità del campione in quanto i singoli nucleotidi sono in grado di contribuire all a lettura a 260 nm.
Verifiche qualitative dell’RNA
…perch è è importante verificare l’RNA …
QUANTITA’
• Lettura Spettrofotometrica
• Lettura Fluorimetrica
Verifiche qualitative dell’RNA
QUANTITA’
Lettura Fluorimetrica•Utilizzo di dye fluorescenti che legano gli ac. nuc leici, il cambiamento dello stato conformazionale conseguente , risulta in un aumento della fluorescenza alla specifica lun ghezza d’onda del fluoroforo.
•L’utilizzo di una curva di calibrazione o di un ref erence a concentrazione nota rende possibile la quantizzazio ne del campione.
• Sensibilità molto elevata (1 pg/ul – 2.5 ng)
Limitazioni• Stesse limitazioni della lettura spettrofotometrica .
QuantiFluor ™ RNA Dye standard curves .
A. high-concentration RNA standard curve using the QuantiFluor™ RNA Dye .
B. low-concentration RNA standard curve using the QuantiFluor™ RNA Dye. Linear range is 0.1–10ng of RNA in a 200µl assay.
Verifiche qualitative dell’RNA
INTEGRITA’PUREZZA
QUALITA’
Metodi
•Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni denaturanti
• 2100 Bioanalyzer (Agilent)
Verifiche qualitative dell’RNA
INTEGRITA’PUREZZA
QUALITA’
Metodi
•Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni denaturanti
• 2100 Bioanalyzer (Agilent)
Verifiche qualitative dell’RNA
Elettroforesi con gel di agarosio
•Metodo economico che permette la verifica dell’inte gritàdell’RNA tramite corsa elettroforetica in condizion i denaturanti (formaldeide / formamide) in presenza d i bromuro di etidio.
•Può essere determinata anche la concentrazione dell ’RNA se si dispone di software di analisi dell’immagine e di uno STD a quantità note (densitometria).
•Nei mammiferi si osservano 2 bande predominanti di rRNA: 28S e 18S. Il rapporto 2:1 è indicatore di buona qua litàdell’RNA.
Intact High Quality RNA Characterized by:
�Two prominent rRNA Bands (28S e 18S)
�Slight smear of various sized mRNA molecules in background
Verifiche qualitative dell’RNA
Verifiche qualitative dell’RNA
Elettroforesi con gel di agarosio
Limitazioni
•L’analisi elettroforetica richiede quantità signific ative di RNA (~ 1 ug).
•Il metodo non permette di determinare se il campion e contiene degli inibitori che potrebbero inficiare l e reazioni successive di reverse transcriptase e PCR.
•Esposizione di agenti tossici da parte dell’operato re nell’allestimento dell’elettroforesi in condizioni denaturanti.
Verifiche qualitative dell’RNA
INTEGRITA’PUREZZA
QUALITA’
Metodi
•Elettroforesi con gel di agarosio in condizioni denaturanti
• 2100 Bioanalyzer (Agilent)
Verifiche qualitative dell’RNA
2100 AGILENT Bioanalyzer
•Miglior metodo esistente nel mercato, sfrutta il pr incipio dell’elettroforesi capillare permettendo la verific a dell’integritàdell’RNA tramite chips. In pratica il campione comb inato con un fluorescente, viene iniettato nel pozzetto del chip e attraverso una matrice di poliacrilammide presente nei microchannels viene separato elettroforeticamente in base al peso molec olare.
•1 ul di campione di RNA (~ 25 ng; 12 samples / chip ), rilevato tramite fluorescenza
•RNA 6000 Nano kit: 25 a 500 ng/µL di RNA
•RNA 6000 Pico Kit: 50 pg/µL a 5000 pg/µL di RNA
Verifiche qualitative dell’RNA 2100 Bioanalyzer
•L’algoritmo RIN (RNA Integrity number) è un’indice qualitativo dell’RNA che il software di analisi att ribuisce al campione biologico in esame.
•RIN: range 0-10. RIN = 0 RNA completamente
degradato;
RIN = 10 RNA eccellente.
Analisi qualitativa tramite 2100 Bioanalyzer
High integrity RNA
Low integrity RNA
Very low integrity RNA
• Verifica del cDNA tramite PCR competitiva con B2M
Verifica cDNA con B2M
B2M =800 bp
Comp =600 bp
Routine Diagnostica in OECS (CRO)
Verifica qualitativa dell’RNA e cDNA• Estrazione di RNA con TriZol e lettura con Nanodrop
• Verifica dell’integrità dell’RNA tramite 2100 Bioana lyzer
Competitive RT - PCR
Principio
Un competitore interno di dimensione differente rispetto all’amplicone specifico di B2M preparato da un frammento di DNA eterologo e ingegnerizzato in modo da contenere la stessa sequenza dei primers della B2M, viene amplificato in presenza del campione che deve essere quantizzato. Dal momento che è nota la quantità di competitore aggiunto nel mix di reazione, è possibile determinare la quantità in termini di cDNA del campione ignoto.
• Verifica del cDNA tramite PCR competitiva con B2M
• Multiplex PCR con primers di B -actin e primers BCR/ABL
Verifica cDNA con B2M
B2M =800 bp
Comp =600 bp
I°R p210
B-ACT
B3A2
Routine Diagnostica in OECS (CRO)
Verifica qualitativa dell’RNA e cDNA• Estrazione di RNA con TriZol e lettura con Nanodrop
• Verifica dell’integrità dell’RNA tramite 2100 Bioana lyzer
UK NEQASBCR/ABL and AML
Translocation Programme
Foglio di accompagnamento campioni (attuale)
Il campione liofilizzato viene risospeso con 1 ml di H2O RNAse free.
UK NEQASBCR/ABL and AML Translocation Programme
Campione 122 Analisi Elettroforetica
I°R p210 I°R p190 I°R p230
UK NEQASBCR/ABL and AML Translocation Programme
CONCLUSIONI
• Negli esercizi UK NEQAS che prevedono RNA come materiale di partenza, è preferibile addizionare direttamente TRIzol al campione liofilizzato, al po sto dell’H2O.
• RNA è facilmente degradabile ed è preferibile mantene rlo nelle condizioni di maggior stabilità (TRIzol).
• L’utilizzo di H2O nella risospensione del campione liofilizzato deve essere di assoluta qualità in term ini di RNAse free.