U.O. ANATOMIA PATOLOGICA

Il percorso del campione dal prelievo al refertoDiagnosi cito-istologica

eMarcatori biomolecolari

Rossana CulliRossana Culli08/06/201308/06/2013

Il percorso del campione dal prelievo al referto

FASE PRE-ANALITICA

FASE ANALITICA

FASE POST-ANALITICA

FASE PRE-ANALITICA

PRELIEVO DEL MATERIALE DA ESAMINAREPRELIEVO DEL MATERIALE DA ESAMINARE

ALLESTIMENTO ALLESTIMENTO

inizia al momento del prelievo e si completa in laboratorio a opera del personale tecnico di Anatomia Patologica

TRASPORTO TRASPORTO

dal punto di prelievo al laboratorio

In questa fase si annidano numerosi punti critici :* insufficienza del materiale prelevato* presenza di una quantità eccessiva di sangue o di flogosi,che offuscano il preparato* contaminazione con talco che può mimare la presenza di

cellule neoplastiche* scorretto allestimento dei preparati(vetrini mal strisciati

mal fissati in cui le cellule si presentano danneggiate e non valutabili)

* trasporto ritardato del materiale fresco.

Molte di queste criticità sono superabili usando procedure e metodiche corrette.

flogosi-necrosi

Brushing bronchiale:Inquinamento da cristalli di talco

TECNICA CORRETTA ALLESTIMENTO AGOASPIRATI

TECNICHE DI FISSAZONE CON CITOSPRAY

Agoaspirato polmonare:Artefatti di allestimento

Caso precedente Strato sottile su lavaggio dell’ago

ESAMI ISTOLOGICI

• BIOPSIE DA SEDI DIVERSE IN CORSO DI FIBROBRONCOSCOPIA

• AGOBIOPSIE POLMONARI TC GUIDATE

BIOPSIA:fissazione in formalina

inclusione in paraffina allestimento di sezioni microscopiche colorazione con ematossilina-eosina

ESAMI CITOLOGICI In corso di broncoscopia

Broncoaspirato-lavaggio-espettorato

Metodica “ CITOINCLUSO” Fissazione in alcool 95° Inclusione in paraffina Allestimento sezioni microscopiche Colorazione con ematossilina –eosina

Vantaggi: conservazione di tutto il materiale possibilità di allestire preparati per immunocitochimica e di eseguire metodiche di biologia molecolare

Brushing il materiale prelevato viene strisciato sul vetrino, fissato con citospray e colorato con Papanicolaou

Agoaspirato transcarenale/intralesionale

striscio convenzionale strato sottile

lo strato sottile offre un fondo pulito, permette di conservare il materiale per 30 giorni, di allestire preparati per immunocitochimica e di eseguire metodiche di biologia molecolare.

ESAMI CITOLOGICI

in corso di agobiopsia percutanea TC guidata

Agoaspirato (FNA)

Striscio convenzionale Strato sottile

Valutazione estemporanea adeguatezza del materialesi esegue su uno o due vetrini convenzionali inviati immediatamente dopo il prelievo e colorati con una metodica rapida.

ESAMI CITOLOGICI in corso di toracentesi

Liquido pleuricoDal materiale inviato “a fresco”

* si allestiscono 6 vetrini con citocentrifuga si colorano con Papanicoleau, MGG, PAS

(colorazioni diverse permettono di valutare diverse caratteristiche cellulari)*se si forma o è presente un coagulo si allestisce un citoincluso* il materiale rimanente viene lasciato

nel fissativo liquido per strato sottileper eventuali ulteriori indagini (immunocitochimica –biologia molecolare)

FASE ANALITICA

OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO OTTICO OSSERVAZIONE AL MICROSCOPIO OTTICO DEL MATERIALE OPPORTUNAMENTE DEL MATERIALE OPPORTUNAMENTE

PROCESSATOPROCESSATO

DIAGNOSTICA IMMUNOISTOCHIMICADIAGNOSTICA IMMUNOISTOCHIMICA

ESAMI DI BIOLOGIA MOLECOLAREESAMI DI BIOLOGIA MOLECOLARE

FASE POST-ANALITICA

Referto istologico / citologico

descrizione e conclusione diagnostica

FASE POST-ANALITICA Referto citologico

1. INADEGUATO (vedi fase pre-analitica)

2. NEGATIVO PER CELLULE MALIGNE

3. DUBBIO4. SOSPETTO

5. POSITIVO PER CELLULE MALIGNE

In ogni tipo di patologia oncologica ,ma in modo particolare nella diagnostica delle neoplasie toraciche,due sono le questioni fondamentali da affrontare

• LA NEOPLASIA IN ESAME E ‘ PRIMITIVA ?

SE METASTATICA DA DOVE VIENE ?

• QUAL E’ L’ISTOTIPO DELLA NEOPLASIA ?

In entrambi i casi, oltre all’osservazione delle caratteristiche citoarchitetturali della neoplasia ,che rimane il punto fondamentale della diagnostica ,sono di aiuto le metodiche immumocitochimiche .

IMMUNOCITOCHIMICA

Si ricercano antigeni presenti nelle cellule tumorali, diversi da neoplasia a neoplasia, tramite anticorpi specifici ai quali è legato un segnale colorato.

Se la reazione antigene-anticorpo avviene,cioè se nelle cellule è presente l’antigene cercato, il segnale colorato è visibile al microscopio ottico.

CASI ESEMPLIFICATIVI

1) liquido pleurico con cellule chiaramente maligne le cui caratteristiche pongono il problema della diagnosi differenziale fra adenocarcinoma metastatico e mesotelioma

Si eseguono indagini mmunocitochimiche usando il pannello costituito dagli anticorpi CEA e Calretinina

Risultati possibili:

CEA+ Calretinina – …….. Adenocarcinoma

CEA- calretinina + ………. Mesotelioma

Nel caso adenocarcinoma si pone il quesito dell’origine della neoplasia che può derivare dal polmone, dal colon,dall’ovaio……..

Può essere di aiuto un pannello costituito da citocheratina 20 ,citocheratina 7,ttf1

Risultati possibili

ttf1+ citocheratina 7+citotocheratina 20 – Depone per carcinoma del polmonettf1 –citocheratina 7-citocheratina 20+Depone per carcinoma del colonretto

2) Carcinoma primitivo del polmone con alterazioni cellulari poco differenziate,del quale si vuole determinare con la maggiore accuratezza possibile l’istotipo.

Cd56 + neoplasie neuroendocrineCitocheratina 7+ adenocarcinoma

P63+ carcinoma squamoso

3) Cellule da microcitoma versus linfociti

Lca - CD56 + microcitomaLca+ CD56- linfociti

Liquido pleurico mesotelioma MGG citocentrifuga

Mesotelioma Liquido pleurico Citocentrifuga Calretinina

Mesotelioma liquido pleurico citoincluso calretinina

Adenocarcinoma del polmone espettorato citocheratina 7

Stesso caso P63

LIMITI DELLA METODICA 1)Tumori diversi hanno antigeni in comune(Ck 7+ /20- caratterizza carcinoma del polmone ,ma anche di mammella,endometrio e pancreas)2) Non sempre i tumori esprimono gli antigeni che dovrebbero caratterizzarli ( il ttf1 caratteristico degli adenocarcinomi del polmone è espresso nel 70% circa dei casi)3) La presenza di necrosi altera l’antigenicità dei tessuti.4) Lo stesso effetto è prodotto da non corretta fissazione e conservazione del materiale .5) Cellule della stessa origine maligne o benigne esprimono gli stessi antigeni (la calretinina non è di aiuto nel distinguere fra mesoteli attivati e mesoteli maligni ,il cui aspetto citologico è in parte sovrapponibile)

L’accuratezza diagnostica nella determinazione dell’istotipo neoplastico si riflette su terapia e prognosi,poiché i percorsi terapeutici sono diversi per neoplasie diverse.E’ quindi doverosa la distinzione fra fra neoplasie neuroendocrine(microcitoma),adenocarcinoma e carcinoma squamoso.Anche all’interno dello stesso istotipo neoplastico si sono individuati trattamenti farmacologici differenziati,in base a alterazioni genetiche e mutazioni presenti o meno nella neoplasia.L’evidenziazione di queste alterazioni richiede l’uso di tecniche di biologia molecolare.

Indagini di biologia molecolare

Analisi molecolare mediante PCR e sequenziamento diretto per ricerca mutazioni esoni 19 e 21 del gene EGFR

AdenocarcinomaAnalisi mediante metodica di ibridazione in situ

flourescente (FISH) per riarrangiamento gene ALK

Carcinoma non piccole cellule pre-trattatoKRAS BRAF ROS1 quando non sono presenti altre alterazioni geniche

Exon 19DeletionsN= 192(56%)

Exon 21(L858R/Q)N= 143(41%)

Exon 18N= 9 (3%)

30%

Mutated Wild type N= 335

Frequency of EGFR mutationsand its subtypes.Tanaka et al. Int J Cancer. 126:651-5, 2010.

Cases examined N= 1117

1416

19

264

348

384

394

Cases examined N= 1390

Frequency of EGFR mutationsIn Italy.

Exon 21(L858R/Q)N= 82(47%)

Exon 19DeletionsN= 86(49%)

Exon 18N= 6 (3%)

13%

Mutated Wild typeN= 174

ESONE 19 MUTATO

Dott.ssa Francesca Castiglione

ESONE 19 WT

Dott.ssa Francesca Castiglione

Dott.ssa Francesca Castiglione

DIPARTIMENTO DAI BIOMEDICINASOD ISTOLOGIA PATOLOGICA E DIAGNOSTICA

MOLECOLAREDIRETTORE GL.TADDEI

Dott.ssa Francesca CastiglioneDott.ssa Milena Paglierani

Centro di riferimento

UN FATTORE LIMITANTE NELLA DIAGNOSTICA DELLE NEOPLASIE TORACICHE E’ RAPPRESENTATO DALLA QUANTITA’ DI MATERIALE A DISPOSIZIONE.

Si deve infatti ricordare che in questo tipo di diagnosticai campioni prelevati consistono o di piccole biopsie o, molto più spesso ,di materiale citologico costituito talvolta da un numero scarso di elementi cellulari. Ne conseguono sia difficoltà nella diagnostica classica sia nella applicazione di pannelli immunocitochimici ottimali, sia nel reperire materiale per biologia molecolare.

LA FASE POST-ANALITICA ALTRI REPERTI

•QUADRI CITOLOGICI RICONDUCIBILI A TBC

•ALTERAZIONI CITOLOGICHE DA VIRUS

•PRESENZA DI PARASSITI

•PRESENZA DI FUNGHI

•PRESENZA DI BATTERI

Agoaspirato polmonare: tubercolosi

BAL Pneumocystis carinii

Stesso caso immunocitochimica

Aspergillo . agoaspirato polmonare .strato sottile

Mucor . Lavaggio bronchiale

Mucor .lavaggio bronchiale

espettorato alterazioni cellulari da Herpes virus

Brushing tracheale alterazioni citologiche da HPVBiologia molecolare HPV 16

Lavaggio bronchiale actinomiceti

Lavaggio bronchiale actinomiceti

Un sincero grazie allo staff tecnico della U.O.di Anatomia Patologica