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Università di BolognaUniversità di BolognaDipartimento di Medicina Clinica Specialistica e SperimentaleDipartimento di Medicina Clinica Specialistica e Sperimentale

Sezione di MicrobiologiaSezione di Microbiologia

Tecniche di amplificazione real-time nella Tecniche di amplificazione real-time nella determinazione della carica viraledeterminazione della carica virale

Parvovirus B19 e Papillomavirus umaniParvovirus B19 e Papillomavirus umani

Giorgio GallinellaGiorgio Gallinella

La ricerca di acidi nucleici virali mediante PCR assicura:

Specificità – la scelta nell’utilizzo dei primer determina il bersaglio della reazione

Sensibilità – la definizione delle condizioni di reazione determina il livello di sensibilità della reazione

La determinazione quantitativa mediante real-time PCR permette:

Valutazione quantitativa come parametro diagnostico

Valutazione quantitativa in corso di screening

Valutazione quantitativa in corso di follow-up

Diagnosi virologica e determinazione del carico virale

Real-Time PCR nella diagnosi virologicaReal-Time PCR nella diagnosi virologica

La determinazione mediante PCR end-point fornisce informazioni qualitative:

Informazioni quantitative possono essere ottenute mediante modificazioni della tecnica di base (diluizioni end-point, PCR competitiva, …)

La determinazione mediante PCR real-time fornisce informazioni quantitative:

Informazioni quantitative possono essere ottenute direttamente mediante analisi in tempo reale delle curve di accumulo dei prodotti di reazione



La tecnica di PCR real-time:

Si basa sulla rivelazione dell’emissione luminosa di fluorocromi presenti nella miscela di reazione

Fluorocromi intercalanti (SybrGreen) Flurocromi legati a sonde (FRET, Taqman, Molecular Beacons)

Utilizza strumenti che sono in grado di rilevare in tempo reale l’emissione luminosa dei fluorocromi

Thermal Cyclers a blocco Thermal Cyclers ad aria

Utilizza software in grado di effettuare analisi quantitative e delle curve di melting dei prodotti di amplificazione





Determinazione quantitativa mediante PCR real-time nello studio delle infezioni da Parvovirus B19 e Papillomavirus umani

• Famiglia Parvoviridae

• Genere Erythrovirus

• DNA monocatenario 5600 nucleotidi

• Struttura icosaedrica

• Privo di pericapside

Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19Real-Time PCR per la ricerca di Parvovirus B19

Caratteristiche molecolari di Parvovirus B19

Infezione da Parvovirus B19

Schema patogenetico dell’infezione da Parvovirus B19


Principali manifestazioni cliniche dell’infezione da Parvovirus B19

Eritema infettivo

Artralgie/Artropatie

Crisi aplastica transitoria

Idrope fetale e infezioni congenite

Possibile sviluppo di infezioni persistenti

Valutazione del carico virale per una più corretta valutazione del processo infettivo

Necessità di valutare l’andamento temporale del carico virale nel corso di infezioni croniche o persistenti



Vie di trasmissione dell’infezione da Parvovirus B19

Trasmissione aerogena

Trasmissione materno-fetale

Trasmissione mediante sangue ed emoderivati

Necessità di valutare il carico virale nelle unità di donazione e nei pool di plasma per la produzione di emoderivati

Valore soglia ammesso di contaminazione da parvovirus B19 nei pool di plasma per la produzione di emoderivati pari a104 UI/ml



Infezione in soggetti normali Picco viremico e graduale clearance virale

Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM e IgG

Depressione transitoria della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo modesto dell’emoglobina

Manifestazioni cliniche bifasiche:1. Sintomi aspecifici2. Rash, artralgia (quinta malattia)



Infezione in soggetti con stress eritroide Picco viremico e graduale clearance virale

Comparsa di anticorpi specifici di classe IgM e IgG

Depressione acuta ma transitoria della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo profondo dell’emoglobina

Manifestazioni cliniche legate allo stato di anemia profonda (TAC)



Infezione in soggetti con deficit del sistema immunitario

Picco viremico e ritardata o assente clearance virale

Deficit (quantitativo e/o qualitativo) di anticorpi specifici di classe IgM e IgG

Depressione persistente della funzionalità midollare – scomparsa dei reticolociti, calo profondo dell’emoglobina

Manifestazioni cliniche legate allo stato di anemia profonda (PRCA)



Materiale biologico

Sangue periferico, plasma, siero

Metodi di indagine

Ricerca virus mediante PCR

Determinazione anticorpi specifici anti-B19 (IgG+IgM)

Rilevanza diagnostica

Infezioni acute: malattia esantematica, artropatia

crisi aplastica midollare

Infezioni croniche: artropatia, aplasia eritrocitaria

Infezioni in gravidanza: infezione materna

Diagnosi di infezione da Parvovirus B19


Materiale biologico

Sangue midollare, sangue fetale, liquido amniotico, biopsie tissutali

Metodi di indagine

Ricerca virus mediante PCR

Ricerca virus mediante ibridazione in situ

Rilevanza diagnostica

Infezioni acute: crisi aplastica midollare

Infezioni croniche: aplasia eritrocitaria

Infezioni persistenti: presenza del virus nei tessuti

Infezioni in gravidanza: infezione fetale



Presenza di marcatori Numero di campioni Percentuale

DNA neg/ IgM neg/ IgG neg 123 35.8

DNA pos/ IgM neg/ IgG neg 14 4.1

DNA pos/ IgM pos/ IgG neg 9 2.6

DNA pos/ IgM pos/ IgG pos 40 11.6

DNA pos/ IgM neg/ IgG pos 36 10.5

DNA neg/ IgM pos/ IgG pos 26 7.6

DNA neg/ IgM neg/ IgG pos 96 27.8

Campioni con marcatore unico 40 11.6

Totale campioni 344 100



Presenza di marcatori Numero di campioni Percentuale

DNA neg/ IgM neg/ IgG neg 123 35.8

DNA pos/ IgM neg/ IgG neg 14 4.1

DNA pos/ IgM pos/ IgG neg 9 2.6

DNA pos/ IgM pos/ IgG pos 40 11.6

DNA pos/ IgM neg/ IgG pos 36 10.5

DNA neg/ IgM pos/ IgG pos 26 7.6

DNA neg/ IgM neg/ IgG pos 96 27.8

Campioni unicamente DNA pos 50 14.6

Totale campioni 344 100



Ricerca di Parvovirus B19

La ricerca del DNA di Parvovirus B19 mediante PCR deve: Permettere una valutazione quantitativa del carico virale

Includere l’utilizzo di un reagente di controllo analitico

Modalità di quantificazione mediante real-time PCR: Quantificazione relativa (riferimento a campione calibratore)

Quantificazione assoluta (riferimento a curva standard)

Utilizzo di un controllo analitico interno

Eterologo

Omologo


Metodi di indagine

Ricerca virus mediante PCRSono state descritte numerose coppie di primers che consentono un’efficiente amplificazione del bersaglio virale (del genoma virale oppure dellle diverse classi di messaggeri)

HR1 HR3 HR4 HR5 HR2



Metodi di indagine

Ricerca virus mediante PCR: PCR Real-Time

Rivelazione della fluorescenza emessa da un fluorocromo intercalante (SybrGreen)

Rivelazione della fluorescenza emessa da fluorocromi legati a sonde oligonucleotidiche (FRET, Taqman, Beacons, …)

Monitoraggio in tempo reale, ciclo per ciclo, della quantità di prodotto di amplificazione




Sviluppo di una tecnica di PCR real-time calibrata: Amplificazione in due reazioni parallele del bersaglio virale e di un

bersaglio di riferimento eterologo

Rivelazione dei prodotti di PCR mediante SybrGreen e definizione, per ciascuna reazione, di un crossing point

Quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto mediante applicazione della formula:

Etarget ed Ereference sono le efficienze, determinate sperimentalmente, delle due diverse reazioni di amplificazione

Cp (calb-sample) sono le differenze fra i crossing point del campione calibratore e dei campioni in esame

sample)(calbΔCref

sample)(calbΔCtarget

refP

targetP

E

E

ratio



Virus

Ref

Amplificazione parallela del bersaglio virale e del bersaglio di riferimento

Virus

Valutazione dell’efficienza della reazione: EVirus = 1.909

Valutazione della variabilità della reazione: CpVirus = 0.21-1.71%

Riferimento

Valutazione dell’efficienza della reazione: ERef = 1.658

Valutazione della variabilità della reazione: CpRef = 0.45-2.41%



0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Log Expected geq

Lo

g C

alc

ula

ted

ge

q

Analisi di regressione

Slope1.000 0.010

SD of Slope0.006 0.002

Standard Error0.1190.038

R2

0.996 0.002

Curve di regressione ottenute per la quantità calcolata di bersaglio virale rispetto alla quantità attesa, utilizzando come campione calibratore ciascun campione nell’intervallo 101-108 geq




CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG-

N=3, Media: 1.1e9; Mediana: 1.4e9

CAMPIONI PCR+, IgM+, IgG+


CAMPIONI PCR+, IgM-, IgG+


Determinazione quantitativa del carico virale in campioni di siero


Analisi mediante real-time PCR calibrata su campioni di siero ottenuti da pazienti con documentata infezione persistente da Parvovirus B19, utilizzando come calibratore lo standard internazionale NIBSC 99/800 all concentrazione di 104 geq/ml

Analisi quantitativa mediante real-time PCR calibrata:

Nei pazienti seguiti il carico virale è risultato compreso fra 102 – 106 geq/ml per periodi estesi di tempo


1.0E+00

1.0E+01

1.0E+02

1.0E+03

1.0E+04

1.0E+05

1.0E+06

1.0E+07

Days

Vir

us IU

/ml

Patient 1 Patient 2 Patient 3

100 200 300 400 500 600


1.0E+00

1.0E+01

1.0E+02

1.0E+03

1.0E+04

1.0E+05

1.0E+06

1.0E+07

1.0E+08

1.0E+09

1.0E+10

1.0E+11

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Pools

Vir

us g

eq

/ml

Analisi mediante real-time PCR calibrata su 16 pool di plasma destinati alla produzione di emoderivati, costituiti ciascuno da 960 singole donazioni, utilizzando come calibratore lo standard internazionale NIBSC 99/800 all concentrazione di 104 geq/ml

Analisi quantitativa mediante real-time PCR calibrata:

In quattro campioni il carico virale è risultato superiore al valore soglia predefinito di 104 geq/ml



I pool contaminati da Parvovirus B19 ad un valore superiore a 104 geq/ml sono risultati infettanti in esperimenti di infezione in vitro di cellule KU812Ep6, come dimostrato mediante ibridazione in situ, PCR e RT-PCR per la ricerca di acidi nucleici virali

Pool # geq/ml IgG (IU/ml) ISH PCR RT-PCR

1 1.81 x 1010 15.21 Pos Pos Pos 2 1.36 x 1006 29.55 Pos Pos Pos 3 2.29 x 1002 23.18 Neg Neg Neg 4 7.68 x 1000 36.77 Neg Neg Neg 5 5.17 x 1002 9.65 Neg Neg Neg 6 2.24 x 1003 19.20 Neg Neg Neg 7 1.99 x 1002 21.56 Neg Neg Neg 8 3.39 x 1002 35.47 Neg Neg Neg 9 5.02 x 1000 84.45 Neg Neg Neg

10 1.15 x 1003 23.98 Neg Neg Neg 11 6.08 x 1002 20.55 Neg Neg Neg 12 3.10 x 1002 46.27 Neg Neg Neg 13 2.88 x 1008 27.10 Pos Pos Pos 14 1.27 x 1002 27.37 Neg Neg Neg 15 1.57 x 1004 19.76 Neg Neg Neg 16 1.21 x 1002 11.71 Neg Neg Neg


Sviluppo di una tecnica di PCR real-time competitiva: Amplificazione in unica reazione del bersaglio virale e di un bersaglio

competitore

Rivelazione dei prodotti di PCR mediante coppie di sonde con emissione di segnali FRET e definizione, per ciascuna reazione, di un crossing point

Quantificazione assoluta mediante curve di calibrazione esterne



ITR IR ITR

NSVP

Competitore

Coppie di sonde oligonucleotidiche e emissione di distinti segnali FRET

Virus

Comp



Amplificazione del bersaglio virale e del bersaglio competitore

Reazione di amplificazione

Efficienza della reazione: EVirus = EComp = 1.98

Errore standard: 0.06; R2: 1.00;

Effetto competitivo

Amplificazione inibita in presenza di 1 Log in eccesso del bersaglio competitore

Ad equimolarità, CpVirus-Comp = -0.68 – +0.90

Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di Parvovirus B19:

L’utilizzo di un bersaglio di riferimento come controllo analitico consente un monitoraggio sia delle fasi pre-analitiche che analitiche

La quantificazione relativa ad un campione calibratore a titolo noto e la normalizzazione rispetto ad un bersaglio di riferimento eterologo consentono di minimizzare gli errori nella valutazione quantitativa

La quantificazione assoluta mediante real-time competitiva risente in maniera sensibile degli effetti di interferenza reciproca, ma può consentire uno screening rispetto ad un valore soglia prefissato

Conclusioni (1)


Caratteristiche delle tecnica di PCR real-time per la ricerca di Parvovirus B19:

La determinazione quantitativa del carico virale in campioni di sangue periferico consente di caratterizzare con maggior precisione il processo infettivo e di seguirne lo sviluppo nel tempo

In prospettiva, la valutazione quantitativa dell’espressione virale in campioni tissutali può consentire di definire il ruolo patogenetico del virus in numerose situazioni di rilevanza clinica

La diffusione del virus nella popolazione e la sua presenza nel sangue per periodi di tempo anche prolungati portano ad un rischio di trasmissione del sangue per via ematica: la valutazione quantitativa permette di discriminare i campioni di plasma con carico virale contaminante superiore al valore soglia di sicurezza

Conclusioni (2)


• Famiglia Papillomaviridae

• Genere Papillomavirus> 100 distinti genotipi

• DNA bicatenario 8000 nucleotidi

• Struttura icosaedrica

• Privo di pericapside

Real-Time PCR per la ricerca di PapillomavirusReal-Time PCR per la ricerca di Papillomavirus

Caratteristiche molecolari dei Papillomavirus

Infezione da Papillomavirus

Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus


LCR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2

Inibizione trascrizione di E6/E7

Replicazione DNAFattori cellulari

Particelle virali complete

Differenziamento cellulare

Infezione da Papillomavirus

Schema patogenetico dell’infezione da Papillomavirus


TRASFORMAZIONE IMMORTALIZZAZIONE

Blocco inibizione di E6/E7

LCR E6/E7 E1/E2 E4 E5 L1 L2

Integrazione

Ricerca di Papillomavirus

Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR: Rivelazione del DNA di un ampio spettro di genotipi mediante reazioni di

amplificazione che utilizzano coppie di primer di consenso

Tipizzazione del genotipo virale mediante sonde oligonucleotidiche specifiche per i diversi genotipi

Valutazione della persistenza dell’infezione da genotipi di HPV ad alto rischio oncogeno

Determinazione della carica virale e dello stato fisico che assumono rilevanza:

In caso di persistenza dell’infezione per valutare il rischio oncogeno

Nel follow up di pazienti conizzate per CIN di alto grado per identificare i casi di infezione persistente dopo il trattamento



Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: Metodi quantitativi che utilizzano pool di primer in grado di definire la

carica virale di un ampio spettro di genotipi, in relazione al numero di cellule presenti nel campione, e che consentono la successiva genotipizzazione virale

PCR real-time multiplex + tipizzazione in ELISA

Metodi quantitativi genotipo-specifici per la valutazione della carica virale di HPV16 e HPV18

PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16 e HPV18

Metodi quantitativi genotipo-specifici per la definizione dello stato fisico di HPV16 e HPV18

PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16 e HPV18



Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time:



PCR Real Time di consenso: Amplificazione con pool di primer (MGP5Bio/MGP6) e marcatura dell’amplificato con Biotina

Genoma HPV MGP5 Bio

MGP6

E6 E7 E1

E2

E4 E5 L2

L1

150 bpBIO

La quantificazione avviene mediante interpolazione su curve di calibrazione esterna, sia per il bersaglio virale (HPV) sia per il bersaglio cellulare (GAPDH) utilizzato per la normalizzazione





Genotipizzazione in ELISA: Cattura dell’amplificato su pozzetti streptavidinati e tipizzazione mediante l’utilizzo di sonde specifiche per HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58

amplificatoBIO

streptavidina

PODAb anti-DIG

POD

sonda DIGgenotipo specifica

ABTS

5206 11 16 18 31 33 35 45 58 sonde HPV

A

B

CAm

pli

fica

ti



PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16


HPV16 pap-colpo margini cono HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo22,520.20 HSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 1,459.50 LSIL/NTZ 350.1 LSIL/NTZ Neg NEG/NTZ

720.2 HSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 110.1 NEG/NTZ 87.23 NEG/NTZ Neg NEG/NTZ

520.2 LSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 160.6 NEG/NTZ 103.12 NEG/NTZ Neg NEG/NTZ

17.8 HSIL/ANTZ2 FM CIN3 7.7 HSIL/ANTZ2 2.6 NEG/ANTZ1 1.8 NEG/ANTZ1 4.2 NEG/ANTZ1

36.5 HSIL/ANTZ2 IM IA1 10 HSIL/ANTZ2 Neg NEG/ANTZ1 Neg NEG/ANTZ1 Neg NEG/ANTZ1

28.6 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 4.5 LSIL/NTZ 1.8 LSIL/NTZ 2.6 ASCUS/NTZ

26.4 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 9.3 HSIL/NTZ 3.3 NEG/NTZ

15.9 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 0.3 HSIL/NTZ 0.2 HSIL/NTZ 1.3 HSIL/NTZ 3.4 HSIL/NTZ

6.8 HSIL/ANTZ2 IM IA1 3.9 HSIL/ANTZ2 2 HSIL/ANTZ2 2.3 Ca./ANTZ2

6.8 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 0.2 HSIL/ANTZ2 0.2 HSIL/ANTZ2

6.7 HSIL/ANTZ2 IM IA1 0.3 LSIL/NTZ 0.6 LSIL/NTZ 0.3 LSIL/NTZ 3.2 LSIL/NTZ

4.1 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 0.8 HSIL/NTZ 0.4 NEG/NTZ 1.2 NEG/NTZ

1.3 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 0.4 LSIL/ANTZ2 1.6 HSIL/ANTZ2

4° Follow upCONO 1° Follow up 2° Follow up 3° Follow up

2° trattamento di conizzazione

Le pazienti che hanno un’alta carica virale iniziale e mostrano un decremento della carica virale dopo il trattamento risolvono spontaneamente l’infezione



PCR real-time regioni L1 e E6 per HPV16


HPV16 pap-colpo margini cono HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo HPV16 pap-colpo22,520.20 HSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 1,459.50 LSIL/NTZ 350.1 LSIL/NTZ Neg NEG/NTZ

720.2 HSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 110.1 NEG/NTZ 87.23 NEG/NTZ Neg NEG/NTZ

520.2 LSIL/ANTZ2 FM CIN3+HPV 160.6 NEG/NTZ 103.12 NEG/NTZ Neg NEG/NTZ

17.8 HSIL/ANTZ2 FM CIN3 7.7 HSIL/ANTZ2 2.6 NEG/ANTZ1 1.8 NEG/ANTZ1 4.2 NEG/ANTZ1

36.5 HSIL/ANTZ2 IM IA1 10 HSIL/ANTZ2 Neg NEG/ANTZ1 Neg NEG/ANTZ1 Neg NEG/ANTZ1

28.6 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 4.5 LSIL/NTZ 1.8 LSIL/NTZ 2.6 ASCUS/NTZ

26.4 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 9.3 HSIL/NTZ 3.3 NEG/NTZ

15.9 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 0.3 HSIL/NTZ 0.2 HSIL/NTZ 1.3 HSIL/NTZ 3.4 HSIL/NTZ

6.8 HSIL/ANTZ2 IM IA1 3.9 HSIL/ANTZ2 2 HSIL/ANTZ2 2.3 Ca./ANTZ2

6.8 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 0.2 HSIL/ANTZ2 0.2 HSIL/ANTZ2

6.7 HSIL/ANTZ2 IM IA1 0.3 LSIL/NTZ 0.6 LSIL/NTZ 0.3 LSIL/NTZ 3.2 LSIL/NTZ

4.1 HSIL/ANTZ2 IM CIN3+HPV 0.8 HSIL/NTZ 0.4 NEG/NTZ 1.2 NEG/NTZ

1.3 HSIL/ANTZ2 IM CIN3 0.4 LSIL/ANTZ2 1.6 HSIL/ANTZ2

4° Follow upCONO 1° Follow up 2° Follow up 3° Follow up

2° trattamento di conizzazione

Le pazienti che hanno una bassa carica virale iniziale e mostrano una carica virale costante dopo il trattamento non risolvono spontaneamente l’infezione e mostrano una persistenza/recidiva della lesione



PCR real-time regioni E2/E6 per HPV16


CARICA VIRALE HPV 16 STATO FISICO HPV 16

La carica virale e lo stato fisico di HPV 16 sono importanti parametri per la valutazione del rischio oncogeno in pazienti con infezione persistente

Nelle infezioni persistenti il DNA virale può integrarsi nel genoma umano, con interruzione dei geni E2/E1e conservazione dei geni E6/E7

DNA di HPV 16 episomiale: E2/E6 = 1

DNA di HPV 16 misto: 1< E2/E6 < 0

DNA di HPV 16 integrato: E2/E6 = 0

Costruzione delle curve standard per E6 e per GAPDH

La quantificazione del bersaglio virale E6 per ciascun campione è stata ottenuta per interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare della rispettiva curva standard, normalizzata sul valore corrispondente per GAPDH



CARICA VIRALE: espressa come numero di copie di E6 per 100.000 copie di GAPDH

CURVA STANDARD E6 CURVA STANDARD GAPDH

Costruzione delle curve standard per E2 e per E6

La determinazione del rapporto E2/E6 per ciascun campione è stata ottenuta per interpolazione del valore di Cp nella retta di regressione lineare delle rispettiva curve standard



STATO FISICO: espressa come rapporto di numero di copie E2/E6

CURVA STANDARD E2 CURVA STANDARD E6



E6 HPV 16 plasmid

Full length HPV 16 plasmid

E2

gen

e co

pie

s

E6

gen

e co

pie

s

Due cloni plasmidici sono stati utilizzati per valutare sperimentalmente i diversi valori del rapporto E2/E6, nell’intervallo relativo a 102 - 106 copie di E6

La PCR real-time può distinguere lo stato misto dallo stato episomiale quando più del 20% del DNA virale è allo stato integrato

È possibile costruire una retta di regressione lineare per distinguere lo stato episomiale dallo stato misto in funzione del numero di copie di E6



0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07

E6 copies

E2/

E6

STATO EPISOMIALE

STATO MISTO

Risultati dell’analisi per carica virale e stato fisico in 68 campioni citologici positivi per HPV 16 DNA – distribuzione dei valori quantitativi attorno alla retta di regressione dei valori di cut-off



1.00E+01

1.00E+02

1.00E+03

1.00E+04

1.00E+05

1.00E+06

1.00E+07

1.00E+08

1.00E+01

1.00E+02

1.00E+03

1.00E+04

1.00E+05

1.00E+06

1.00E+07

1.00E+08

Stato fisico e carica virale Lesione e carica virale

EPISOMALE MISTO INTEGRATO

29.4% 54.4% 16.2%

LSIL HSIL IA1

22.0% 69.2% 8.8%

Una elevata carica virale aumenta la probabilità di integrazione di HPV 16 nel genoma umano e rappresenta un fattore di rischio per la progressione a carcinoma invasivo

Le cellule con DNA virale integrato acquistano un vantaggio di crescita sulle altre cellule infettate, si ha una selezione dei cloni cellulari con DNA integrato, un abbassamento della carica virale e una progressione della lesione



Lesione e stato fisico

80.0%

20.0%

17.0%

72.3%

10.7%

100.0%

EPISOMAL CONCOMITANT INTEGRATED

La percentuale di DNA virale totalmente episomiale diminuisce con il progredire della gravità della lesione (LSIL - HSIL)

La percentuale di DNA allo stato misto aumenta con il progredire della gravità della lesione (LSIL - HSIL)

DNA virale totalmente integrato è presente solo in lesioni di alto grado (HSIL) e nei carcinomi invasivi

Conclusioni (3)

Ricerca del DNA di Papillomavirus mediante PCR real-time: L’andamento della clearance virale nel corso del follow up è indicativo

della risoluzione o persistenza dell’infezione e quindi della possibile persistenza o recidiva della lesione

Il decremento della carica virale conduce a risoluzione dell’infezione

Il mantenimento della carica virale indica una persistenza dell’infezione

La carica virale e lo stato fisico del DNA di HPVassumono rilevanza: Un’alta carica virale è associata allo stato episomiale di HPV16

Una bassa carica virale è associata allo stato integrato di HPV16

La quantificazione del DNA di HPV nello stato episomiale vs. integrato può assumere rilevanza nella valutazione del rischio oncogeno


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Sezione di MicrobiologiaSezione di Microbiologia

Monica MusianiMonica Musiani

Marialuisa ZerbiniMarialuisa Zerbini

Giorgio GallinellaGiorgio Gallinella

Giovanna GentilomiGiovanna Gentilomi

Elisabetta ManaresiElisabetta Manaresi

Francesca BonviciniFrancesca Bonvicini

Stefania DelbarbaStefania Delbarba

Claudia FilipponeClaudia Filippone

Simona VenturoliSimona Venturoli

Simone AmbrettiSimone Ambretti

Monica CriccaMonica Cricca

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