UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI ROMA'LA SAPIENZA' · screening di mutazioni del DNA mitocondriale (50) e...

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI ROMA"LA SAPIENZA"

Re

Pr

Scuola di Specializzazione in Genetica MedicaDirettore Prof. Bruno Dallapiccola

Diagnosi molecolare di miopatia miotubulare legata all'X

(XLMTM) mediante Denaturing High Performance Liquid

Chromatography (DHPLC)

latore Specializzando

of. Giuseppe Novelli Dott.ssa Maria Rosaria D'Apice

Anno Accademico1999-2000

INDICE

PREMESSA

INTRODUZIONE

MIOPATIA MIOTUBULARE X-LINKEDClinicaQuadro istopatologicoGene MTM1 e miotubularinaMutazioni e polimorfismi del gene MTM1Diagnosi molecolare di miopatia miotubulare legata all’XDenaturing High Performance liquid Chromatography

MATERIALI E METODICasistica analizzataEstrazione del DNADHPLCSequenziamento direttoStudio dell’inattivazione del cromosoma X

RISULTATI

DISCUSSIONE

BIBLIOGRAFIA

PREMESSA

La miopatia miotubulare X linked (XLMTM; MIM# 310400) è una

grave miopatia congenita, caratterizzata alla nascita da una marcata ipotonia e

debolezza muscolare generalizzata e dalla presenza di piccole cellule muscolari

con nucleo centralizzato sparse tra le fibre muscolari normali. La malattia è

dovuta a mutazioni della miotubularina, una proteina ad attività tirosin-

fosfatasica (PTP) codificata dal gene MTM1, che è composto da 15 esoni e

mappa nella regione Xq28. Sono state attualmente identificate 133 diverse

mutazioni su un totale di 198 pazienti non consanguinei. La mancanza di

mutazioni ricorrenti, unita all’assenza di vere e proprie regioni “hot spot”,

rende la diagnosi molecolare lunga e difficoltosa sia in termini di tempo che

economici. La tecnica attualmente più utilizzata prevede una prima analisi dei

polimorfismi di conformazione (SSCP) dell’intera sequenza codificante del

gene, seguita dal sequenziamento diretto delle varianti identificate.

Allo scopo di definire un protocollo di diagnostica molecolare del gene

MTM1, più rapido e sensibile, abbiamo sviluppato ed elaborato una strategia

molecolare innovativa basata sull'utilizzo della tecnica "Denaturing High

Performance Liquid Chromatography" o DHPLC. Questa tecnica utilizza la

capacità della cromatografia liquida a fase inversa di discriminare, all’interno

di prodotti eterogenei di PCR, molecole di DNA eteroduplici da quelle

omoduplici, in condizioni di parziale denaturazione e sotto diretto controllo

della temperatura. Il vantaggio della DHPLC, rispetto alle tecniche tradizionali,

è essenzialmente dovuto all’elevata sensibilità e riproducibilità, alla facilità di

applicazione, nonché alla rapidità e possibilità di automazione.

INTRODUZIONE

Le miopatie miotubulari, anche dette miopatie centronucleari,

comprendono una serie di miopatie congenite caratterizzate, dal punto di vista

istologico, dalla prevalenza di fibre ipotrofiche con nucleo centralizzato. Il

quadro clinico della miopatia miotubulare è piuttosto variabile in termini di età

di insorgenza, gravità della malattia, quadro istochimico e tipo di eredità (1).

La miopatia miotubulare esiste in una forma X-linked (MIM#310400) (2), una

forma autosomica dominante (MIM# 160150) e una forma autosomica

recessiva (MIM# 255200) (3).

MIOPATIA MIOTUBULARE X-LINKED

Clinica

La miopatia miotubulare X-linked (XLMTM; MIM # 310400) è una

malattia congenita caratterizzata da grave ipotonia e debolezza muscolare

generalizzata, che in particolare interessa i muscoli respiratori, facciali ed

oculari (Figura 1). I movimenti spontanei sono ridotti o assenti ed, alla nascita,

raramente si stabilisce una respirazione normale (4, 5). Spesso si osserva

un’insorgenza prenatale della malattia caratterizzata dalla presenza di

polidramnios e di movimenti fetali ridotti. Nelle portatrici obbligate si

osservano, con una frequenza superiore alla media, aborti spontanei e parti

prematuri. La maggior parte dei pazienti muore per insufficienza respiratoria

tra le prime settimane e i primi 4-5 mesi di vita. Si osserva anche un ridotto

numero di pazienti che sopravvive per molti mesi o anche sino all’età adulta,

specialmente quando sin dalla nascita viene fornito un supporto respiratorio

(3). La ragione di questa diversa progressione clinica rimane ancora

sconosciuta.

Le portatrici generalmente non mostrano manifestazioni cliniche

significative, sebbene in alcuni casi sia stata riportata una leggera debolezza dei

muscoli facciali (3, 6, 7). Sono inoltre descritti in letteratura casi di femmine

affette da miopatia miotubulare legata all’X in seguito a fenomeni di

inattivazione non casuale (eterozigoti estreme) (8, 9).

Quadro istopatologico

Il quadro istopatologico delle biopsie muscolari dei maschi affetti

evidenzia la presenza di molte fibre piccole e rotonde, con nucleo centrale

circondato da aggregati di mitocondri e di elementi contrattili che ricordano i

miotubi fetali (10). La percentuale di fibre contenenti nuclei centralizzati varia,

nella serie di casi riportati, dal 10 al 50% (11-13) oltre che nei diversi campi

microscopici (Figura 2 a, b) (6). Attualmente non è possibile stabilire con

certezza la percentuale minima di questo tipo di fibre necessaria per effettuare

la diagnosi. In circa la metà delle portatrici obbligate, la biopsia muscolare

evidenzia una certa proporzione di fibre con nuclei centralizzati. Questi dati

Figura 1 : Paziente con miopatia miotubulare legata all’X

istologici suggeriscono che la differenziazione è stata arrestata ad uno stadio

precedente la formazione delle fibre muscolari (14, 15). Infine, ulteriori

conferme a sostegno di quest’ipotesi derivano dall’osservazione della

persistenza nel muscolo di isoforme pesanti di miosina prenatale (16)

Gene MTM1 e miotubularina

Il locus responsabile per la XLMTM è stato mappato nella parte

prossimale della regione Xq28 per analisi di linkage (17-21). L’analisi di una

delezione interstiziale in Xq, in una paziente con una forma lieve di miopatia

miotubulare, ha permesso di ridefinire la regione candidata in un intervallo di

600 kb (9). La successiva caratterizzazione di microdelezioni sovrapponibili in

due pazienti con miopatia miotubulare con associato sviluppo sessuale

anomalo, ha permesso di restringere l'area di mappatura a circa 430 Kb, e

precisamente nella regione compresa tra il marcatore DXS304 ed il marcatore

DXS1345 (22). Un ulteriore restringimento dell'area, è stato in seguito ottenuto

mediante la caratterizzazione di eventi di ricombinazione (23, 24).

Nel 1996 è stato possibile isolare e caratterizzare il gene MTM1

utilizzando la strategia del clonaggio per posizione (25). Il gene MTM1 è

A B

Figura 2. Biopsia muscolare di un paziente con miopatia miotubulare legata all’X.(a) 200 X Sezione longitudinale. Si osservano fibre con nucleo centrale. (b) 200 XSezione trasversa. Si osservano fibre ipotrofiche con nucleo centrale

trascritto in un mRNA di 4 Kb, ad espressione ubiquitaria ed una forma

alternativa di 2.4 Kb, che utilizza un diverso segnale di poliadenilazione,

selettivamente espresso nel muscolo e nel testicolo. Il gene MTM1 è composto

da 15 esoni (26), che si estendono per una regione genomica di 100 kb ed è

localizzato 20 kb prossimale ad un gene omologo MTMR1. La proteina

codificata, detta miotubularina (Figura 3), contiene una sequenza consensus di

12 aminoacidi per il sito attivo della tirosina fosfatasi (PTP) e la sua attività

fosfatasica è stata confermata su p-nitrofenil fosfato (p-NPP), un substrato

sintetico analogo alla fosfotirosina (27). La miotubularina contiene inoltre un

dominio di legame con le proteine SET (SID), una famiglia di proteine

coinvolte nella regolazione dei meccanismi epigenetici alla base della crescita e

del differenziamento cellulare (28). Diversi omologhi del gene MTM1 sono

stati isolati in topo, nel pesce Danio rerio, in Drosophila, in C. elegans, in S.

pombe e in S. cerevisiae e nel genoma umano, indicando che la miotubularina

appartiene ad un'ampia famiglia genica di tirosin-fosfatasi conservata nel corso

dell'evoluzione. Il possibile ruolo fisiologico di questa proteina viene suggerito

da un dato di recente acquisizione che dimostra che la miotubularina è in

grado, sia in vitro che in vivo, di defosforilare il secondo messaggero lipidico

fosfatidilinositolo 3-fosfato PI(3)P, coinvolto nel processo di trasporto

vescicolare dai compartimenti intracellulari alla membrana plasmatica. È

possibile che nei pazienti con miopatia miotubulare X-linked una regolazione

impropria del PI(3)P interrompa il traffico vescicolare necessario ai processi di

fusione dei mioblasti provocando un arresto nel corretto sviluppo del muscolo.

La miotubularina potrebbe, attraverso il controllo dei livelli cellulari di PI(3)P,

agire come regolatore della localizzazione subcellulare delle proteine con

dominio FYVE intervenendo nei pathway di trasduzione specifici dipendenti

da questi effettori (29). Un'ipotesi alternativa implica l'interazione della

miotubularina con le proteine contenenti i domini SET (Suvar3-9, Enhancer-of-

zeste, Trithorax). La forma mutata della miotubularina mimerebbe l'azione

fisiologica di alcune proteine appartenenti alla famiglia delle miotubularine

mancanti di attività fosfatasica ma capaci di legare i domini SET, come sbf1,

che quando viene superespressa è in grado di indurre in vitro la trasformazione

neoplastica dei miociti e di inibire in coltura la formazione dei miotubi (28).

Mutazioni e polimorfismi del gene MTM1

Il gene MTM1 è mutato nella maggior parte dei pazienti con XLMTM.

Sono state attualmente identificate 133 sono mutazioni differenti in 198

famiglie non imparentate (Figura 3) (30-41). Una lista completa e aggiornata è

presente sul sito web Human Gene Mutation Database (HGMD;

http://www.uwcm.ac.uk).

Le mutazioni del gene MTM1 sono distribuite lungo tutta la sequenza

codificante anche se gli esoni maggiormente interessati sono il 3, 4, 8, 9, 11 e

12. Al momento, la lista delle mutazioni risulta piuttosto eterogenea

comprendendo 55 mutazioni missenso, 40 non senso, 50 microinserzioni e

delezioni, 15 delezioni grandi e 38 mutazioni di splicing (41). La maggior parte

delle mutazioni provoca l’introduzione di un codone di stop e la traduzione di

una proteina tronca, anche se il 26% della mutazioni è costituto da variazioni

missenso che interessano sempre residui aminoacidici ben conservati durante

l'evoluzione. Queste ultime sono localizzate principalmente tra gli esoni 8 e 12

intorno al sito attivo tirosin-fosfatasico (PTP), codificato dall'esone 11, ed al

sito di legame delle proteine SET (SID), codificato dagli esoni 12 e 13. Un

elevato numero di mutazioni missenso mappa comunque negli esoni 8 e 9

senza un'apparente correlazione con i due domini funzionali noti della proteina.

Sono state inoltre descritte varianti polimorfiche non patogenetiche nelle

regioni introniche e nella regione del promotore.

http://www.uwcm.ac.uk)/

Diagnosi molecolare di miopatia miotubulare legata all’X

La diagnosi clinica ed istologica di XLMTM deve essere confermata

attraverso l’analisi molecolare del gene MTM1. L’importanza della conferma

deriva dalla presenza di fenocopie di cui le più frequenti sono costituite dalle

forme autosomiche dominanti e recessive delle miopatie centronucleari, dalla

forma congenita di distrofia miotonica (DM) e dalla forma più grave di atrofia

muscolare spinale (SMAI). La diagnosi molecolare delle mutazioni del gene

MTM1 si basa sull’analisi delle varianti di conformazione (SSCP) e degli

eteroduplici (HD) dei frammenti di PCR ottenuti dall’amplificazione dei

singoli esoni (32). Le varianti anomale rilevate, vengono quindi isolate e

sequenziate. In genere il protocollo utilizzato prevede una prima analisi degli

esoni 8, 9, 4, 11, 12 e 5, nell’ordine menzionato, in quanto contengono oltre i

due terzi delle mutazioni, e solo in una seconda fase l'analisi degli esoni

rimanenti. Nonostante questo protocollo diagnostico abbia permesso

l’identificazione di un elevato numero di mutazioni si presenta di difficile

applicazione in un laboratorio diagnostico a causa dei lunghi tempi della messa

a punto e della difficoltà di automazione. Inoltre, come è ben noto, il metodo di

ricerca di mutazioni tramite SSCP dipende in larga misura dall’esperienza

dell’operatore e raramente raggiunge una sensibilità superiore al 80%.

Allo scopo di definire un protocollo per la diagnostica molecolare dei

pazienti XLMTM più rapido e sensibile, rispetto a quelli sino ad ora proposti,

abbiamo messo a punto nel nostro laboratorio una metodica alternativa per

l'analisi di mutazioni nel gene MTM1 denominata Denaturing High

Performance Liquid Chromatography (DHPLC), inizialmente descritto da

Underhill e coll. nel 1996 (42) e recentemente applicato con successo alla

ricerca di varianti genomiche di geni di discrete dimensioni, come BRCA1/2

(43-47), e TSC1/2 (48, 49). Questa tecnica è anche applicata con successo allo

screening di mutazioni del DNA mitocondriale (50) e alla ricerca di marcatori

biallelici tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) utilizzati per la

mappatura di regioni di suscettibilità a malattie complesse (51) o negli studi

evoluzionistici della genetica di popolazioni (52, 53).

Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC)

La DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography)

(Figura 4) è una metodica di rapido impiego, accurata e automatica per

identificare variazioni nella sequenza di frammenti di DNA amplificati ottenuti

da reazioni di PCR (42). Questa metodica si basa sulla capacità della

cromatografia a fase inversa a coppie ioniche di discriminare tra le molecole di

DNA eteroduplici e omoduplici, sfruttando le differenze dei loro tempi di

ritenzione in una matrice di particelle alchilate, in specifiche condizioni di

parziale denaturazione dipendenti dalla temperatura. L’appaiamento non

corretto che si produce nelle molecole di DNA eteroduplice, a causa della

rinaturazione di due molecole non perfettamente complementari per la

presenza di una mutazione, produce una struttura instabile che destabilizza la

doppia elica. Per questo motivo, alle stesse condizioni di temperatura, la

molecola di DNA eteroduplice si trova in uno stato di parziale denaturazione,

mentre la molecola di DNA omoduplice corrispondente, più stabile, non viene

denaturata (Figura 5). La conseguente riduzione delle cariche negative nelle

porzioni a singolo filamento nel DNA eteroduplice provoca una diminuzione

del numero di legami tra il DNA ed un catione, il trietilammonio acetato, che

funziona come un ponte elettrostatico tra le molecole cariche negativamente

del DNA e la colonna. Una volta sottoposte ad un gradiente di acetonitrile, le

due specie molecolari, mostrando una differente affinità per la colonna,

vengono liberate in tempi differenti. Il campione di DNA, una volta eluito dalla

colonna, viene rilevato da uno spettrofotometro e visualizzato attraverso un

elettroferogramma. I dati relativi ad ogni singolo elettroferogramma vengono

poi immagazzinati automaticamente sotto forma di singoli files. L'amplificato

ottenuto da un eterozigote, essendo costituito sia molecole di DNA omoduplice

che eteroduplice viene eluito in più tempi diversi e produce un

elettroferogramma con più picchi, mentre l'amplificato ottenuto dal DNA di un

omozigote, essendo costituito esclusivamente da DNA omoduplice viene eluito

tutto insieme e visualizzato in un singolo picco. La risoluzione che si riesce ad

ottenere non è uguale per tutte le mutazioni, ma dipende dalla loro posizione

nel frammento di PCR e dalla lunghezza dalla composizione in basi del

frammento stesso.

Figura 4: DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography)

MATERIALI E METODI

Casistica analizzata

Questo studio è stato condotto su 10 pazienti sporadici, 8 maschi e 2 femmine,

e su una famiglia con diagnosi clinica di miopatia miotubulare legata all’X.

Una volta individuata la mutazione veniva caratterizzato lo status della madre e

di altri eventuali parenti di sesso femminile, potenziali portatrici asintomatiche

della mutazione. In ciascun caso la diagnosi clinica è stata confermata sulla

base di un esame istologico, di tipo istochimico o di tipo istoenzimatico per

evidenziare la presenza di cellule muscolari con nucleo centralizzato e

aggregati di mitocondri al centro della fibra muscolare. Sia la diagnosi clinica

che l'esame istologico sono stati effettuati secondo i criteri fissati dal Consorzio

Internazionale delle Miopatie Miotubulari,

(http://www.enmc.spc.oxac.uk/DC/Myotucrit) presso il Centro di

Epidemiologia e Prevenzione delle Malattie Neuromuscolari dell'Università di

Figura 5 . Esempio di elettroferogramma.

http://www.enmc.spc.oxac.uk/DC/Myotucrit

Padova, l'Ospedale Infantile di Alessandria e l'Unità Operativa di Medicina

Molecolare dell'Ospedale Pediatrico Bambino Gesù. Le analisi molecolari sono

state effettuate su DNA estratto da un campione di biopsia muscolare o da un

campione di sangue periferico, prelevato in quantità variabile da 5 ml per i

neonati e 10 ml per i loro genitori e addizionato con EDTA 0.5% per evitarne

la coagulazione.

I soggetti di controllo sono costituiti da pazienti affetti da

patologie non muscolari.

Estrazione del DNA

La preparazione di DNA genomico da sangue periferico è stata ottenuta

mediante le tecniche standard di estrazione con fenolo/cloroformio e

precipitazione etanolica.

Il DNA genomico ottenuto dalle biopsie muscolari è stato preparato

secondo metodiche standard. In breve, i frammenti di muscolo sono stati prima

omogeneizzati e successivamente incubati in una soluzione di lisi contenente

Tris 0.02 mM, NaCl 100mM, EDTA 25mM pH 8.0 SDS 0.2% e proteinasi K

0.1 mg/ml per tutta la notte a 37°C. Il DNA totale è stato estratto con un

tampone saturato fenolo/cloroformio/isoamilico (25:24:1), precipitato in

etanolo e risospeso in H2O bidistillata.

DHPLC

Per lo screening di mutazioni/polimorfismi del gene MTM1 con la metodica

DHPLC è stata eseguita una reazione di PCR per ogni esone utilizzando 50 ng

di DNA genomico, 10 mM Tris HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5-2.0 mM MgCl2,

100 µM dNTPs, 0,2 µM primers, 2.5 U AmpliTaq Gold (PE Applied

Biosystems, Foster City, CA). Sono state utilizzate le seguenti condizioni di

amplificazione: un ciclo di denaturazione di 10 min a 94°C, seguito da 30 cicli

di 30 s a 94°C, 30 s a 52°C o 55°C e 30 s a 72°C. Le condizioni specifiche

della reazione di PCR relativa a ciascun esone e la sequenza dei primers

utilizzati sono state riportate nella Tabella 1.

Prima del caricamento su DHPLC i prodotti di PCR di ogni campione sono

stati denaturati a 95°C per 5 minuti e poi rinaturati lentamente (1°C/min) fino

ad una temperatura di 65°C. Inoltre, per l’analisi delle mutazioni nei maschi

emizigoti, è stato necessario mischiare i prodotti di PCR ottenuti dai pazienti

con quelli ottenuti da un individuo sano. L’analisi per DHPLC è stata eseguita

su uno strumento automatico di DHPLC (Transgenomic Inc., San Jose, CA).

La fase stazionaria consiste di una matrice non porosa di polistirene-

divinilbenzene (DNA Sep ) che lega il DNA durante l’analisi. La fase mobile

è costituita da due eluenti a pH 7.0. Il tampone A contiene 0.1 M TEAA

(trietilammonio acetato), una molecola ponte i cui gruppi alchilici coprono

parzialmente la fase stazionaria da un lato, mentre gli ioni ammonio caricati

positivamente interagiscono con gli ioni fosfati caricati negativamente delle

Esone Primer senso (*) Primer antisenso (*) Lunghezza delframmento di PCR (bp)

MgCl2

(mM)T

(°C)

2 AGAACCTGTAAAGTAGTACC TAGGCCAGCCCAAAATGAC 272 1.5 52

3 AACAGTGTGTAAATGTAACGTC AGACTTCTCCTCAAGTTATGC 172 1.5 52

4 AGTGCCATTTGTTGTGTATC TGACCCACAGTCAATCTTGC 255 1.5 55

5 TAATTATACTGACAGAAATACTG TCCACATTAATTGTCTACTATC 234 2 55

6 TTGAAGACTGAACTGTCATAC AACCTTCCCACGCTGAGG 175 1.5 55

7 AGATGTACTATAATAGTAGAC AGGTTCATCACATACCAGAC 188 1.5 52

8 TCCAGAGATGAGGTCAAGC GGTGCTCTTCAAGAGAAACG 239 1.5 52

9 TTGATAGCTTAAACTTTCTGAC TCCAGCACATCATTAAGTCC 247 1.5 55

10 CTGATTGTTTGTATTTCATG TATATACACAAATATTTTCAC 251 2 52

11 AACTCCCTACTGACTCACG AATCCTGAATGGTAGTGATCT 292 1.5 55

11 AACTCCCTACTGACTCACG CTTTTTCTACCAGTATTTCG (11a) 210 1.5 52

12 ATGCTTTCTCAGTTTTGTACC TAAACAATGAGTTGAATGTA 195 1.5 52

13 TTATAAAGTTTCAGTCCCAG TTTGGCAAGCCTAATGTATC 211 2 52

14 TTTTACTTAGGCTCTCCAC CTATCTTTTAACAGTGCTAC 248 1.5 52

Tabella 1. Sequenza dei primer e condizioni di PCR utilizzati per l’analisi di mutazioni e/opolimorfismi del gene MTM1 mediante DHPLC. (*) i primers sono stati disegnati sullabase delle sequenze introniche, tranne il primer antisenso 11a disegnato sulla base dellasequenza dell’esone 11.

molecole di DNA interagisce. Il tampone B contiene 0.1 M TEAA e 25%

acetonitrile. L’interazione idrofobica tra la fase stazionaria e le catene

alchiliche delle molecole ponte è ridotta con l’aumento di acetonitrile nella fase

mobile.

I frammenti vengono eluiti con un gradiente lineare di acetonitrile di 2% per

minuto con un flusso di 0.9 ml/min. Il gradiente comprende uno step di

caricamento del DNA, un altro di separazione lineare dei frammenti di PCR,

seguito dal lavaggio e dall’equilibratura della colonna (DNA Sep ). I tempi di

inizio e di fine per ciascun passaggio sono dipendenti dalla sequenza di quel

determinato frammento di PCR .

Le temperature necessarie ad ottenere una risoluzione ottimale delle molecole

eteroduplici sono state calcolate con il programma DHPLC Melt

(http://insertion.stanford.edu/cgi-bin/melt.pl).

Le seguenti tabelle riportano, per ciascun esone analizzato, il gradiente lineare

della fase mobile (percentuali dei tamponi A e B) stabilito con il programma

WAVEMaker e le temperature di denaturazione dell’intero frammento di PCR

consigliate dal programma DHPLC Melt.

http://insertion.stanford.edu/cgi-bin/melt.pl

MTM1 esone 2

Step tempo %A %B ml/min rilevatoreCaricamento 0.0 50 50 0.9 2.2Gradiente iniziale 0.5 45 55 2.7Gradiente finale 5.0 36 64 7.2Lavaggio iniziale 5.1 0 100 7.3Lavaggio finale 5.6 0 100 7.8Equilibratura iniziale 5.7 50 50 7.9Equilibratura finale 7.2 50 50 9.4

T (°C) domini analizzati*53°C 248-280,289-29154°C 166-247,281-28855°C 157-16556°C 1-156La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 55°CLa temperatura consigliata è 56°C

MTM1 esone 3


T (°C) domini analizzati*56°C 18557°C 156-18458°C 1-65,152-15559°C 66-151La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 58°CLa temperatura consigliata è 59°C

MTM1 esone 4


T (°C) domini analizzati*53°C 46-10754°C 1-45,108-274La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 54°CLa temperatura consigliata è 54°C

MTM1 esone 5

Step minuti %A %B ml/min rilevatoreCaricamento 0.0 52 48 0.9 2.2Gradiente iniziale 0.5 47 53 2.7Gradiente finale 5.0 38 62 7.2Lavaggio iniziale 5.1 0 100 7.3Lavaggio finale 5.6 0 100 7.8Equilibratura iniziale 5.7 52 48 7.9Equilibratura finale 7.2 52 48 9.4

T (°C) domini analizzati*54°C 230-25355°C 1-84,148-22956°C 85-147La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 55°CLa temperatura consigliata è 56°C

MTM1 esone 6


T (°C) dominio analizzato*60°C 1-194La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 60°CLa temperatura consigliata è 60°C

MTM1 esone 7


T (°C) domini analizzati*54°C 62-69, 96-10255°C 1-61, 70-95, 103-11856°C 119-207La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 55°CLa temperatura consigliata è 56°C

MTM1 esone 8


T (°C) domini analizzati*55°C 86-8956°C 1-11, 21-22, 34-34, 75-85, 90-9357°C 12-20, 23-33, 35-74, 94-9558°C 96-9959°C 100-259La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 59°CLa temperatura consigliata è 59°C

MTM1 esone 9


T (°C) domini analizzati*53°C 1-654°C 7-1655°C 17-2556°C 26-31, 116-18557°C 32-59, 112-115, 186-18858°C 60-111, 189-247La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 57°CLe temperature consigliate sono 53°C e 58°C

MTM1 esone 10


T (°C) domini analizzati*50°C 236-24551°C 224-23552°C 222-22353°C 1-6, 220-22154°C 7-30, 82-21955°C 31-81La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 54°CLa temperatura consigliata è 55°C

MTM1 esone 11


T (°C) domini analizzati*52°C 284-31153°C 272-28354°C 224-27155°C 218-22356°C 212-21757°C 191-193, 199-21158°C 183-190, 194-19859°C 1-68, 73-78, 173-18260°C 69-72, 79-172La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 59°CLe temperature consigliate sono 55°C e 60°C

MTM1 esone 12


T (°C) domini analizzati*51°C 213-21452°C 207-21253°C 194-20654°C 42-73, 180-19355°C 1-41, 74-77, 164-17956°C 78-163La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 55°CLa temperatura consigliata è 56°C

MTM1 esone 13


T (°C) domini analizzati*53°C 228-23054°C 94-119, 193-22755°C 1-93, 120-192La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 54°CLa temperatura consigliata è 55°C

MTM1 esone 14


T (°C) domini analizzati*51°C 1-452°C 5-5, 242-24853°C 6-8, 23954°C 9-9, 88-105, 116-11755°C 10-87, 106-115, 118-144, 236-23856°C 145-235La temperatura di denaturazione dell’intero frammento di PCR è 55°CLe temperature consigliate sono 51°C e 56°C

(*) I numeri si riferiscono al nucleotide iniziale e finale del dominio didenaturrazione all’interno del frammento amplificato

Sequenziamento diretto

I prodotti di PCR sono stati purificati con il kit Seq-Prep GD400

(GeneDia) per eliminare primers, dNTPs e dimeri. Per la reazione di sequenza

è stato utilizzato il kit CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing (Beckman).

Dopo la rimozione dell’eccesso di ddNTP marcati con il kit Seq-Prep, i

campioni sono stati sottoposti ad elettroforesi capillare su DNA Analysis

Sistem CEQ 2000 (Beckman Coulter).

I primers utilizzati sono gli stessi della reazione di PCR descritti nella tabella 1.

Studio dell'inattivazione del cromosoma X

Il campione costituito da 2�g di DNA genomico è stato digerito con 20

U di HpaII a 37°C per 12 ore. Successivamente un’aliquota della digestione

viene quindi utilizzata come stampo per una reazione di PCR contenente: 10

mM Tris HCl pH 8.3, 50 mM KCl, primer 1�M, dNTPs 250 �M, 0.05 U di

AmpliTaq Gold TM (PE Applied Biosystems, Foster City, CA).

La sequenza dei primers utilizzati, tratta da Tilley et al. (1989), è:

5’-GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT-3’

5’-TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC-3’

Sono state utilizzate le seguenti condizioni di amplificazione: un ciclo di

denaturazione di 5 min a 94°C, seguito da 28 cicli di 45 s a 94°C, 30 s a 60°C e

30 s a 72°C.

I prodotti di PCR sono stati successivamente sottoposti ad elettroforesi

capillare su un modello ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer (PE Applied

Biosystems, Foster City, CA). Un microlitro di reazione di PCR è stato unito

con 20 �l di formamide e 0.5 �l del marcatore di peso molecolare fluorescente

(TAMRA GS-500 PE Applied Biosistems, Foster City, CA). Ogni campione è

stato corso per 30 minuti. Durante l’elettroforesi la fluorescenza rilevata nella

regione del laser è stata raccolta e immagazzinata usando il software Genescan

collection (versione 3.1 PE Applied Biosistems, Foster City, CA) alla fine di

ogni corsa.

RISULTATI

In questa tesi vengono riportati i risultati di uno studio effettuato su 10 pazienti

(8 maschi e 2 femmine) con diagnosi clinica di miopatia miotubulare. Inoltre,

lo studio ha riguardato anche una famiglia nella quale la malattia segrega da

più generazioni in maniera chiaramente legata alla X. Per ciascun paziente è

stata amplificata tutta la regione codificante del gene MTM1, tranne gli esoni 1

e 15 per i quali è stato riportato un esiguo numero di mutazioni. Gli amplificati

relativi ai singoli esoni sono stati esaminati mediante analisi di DHPLC. La

tabella 2 riporta, per ogni paziente, l’esone in cui è stato osservato un

elettroferogramma che suggeriva la presenza di una variante. Per discriminare

tra una mutazione ed un polimorfismo, ogni volta venivano analizzati 20

soggetti di controllo. Sono state individuate e caratterizzate 5 nuove mutazioni

e confermati 4 mutazioni precedentemente descritte e un polimorfismo

intronico comune nella popolazione caucasica (Tabella 3) (Figure 8, 11, 12).

Paziente ex 2 ex 3 ex 4 ex 5 ex 6 ex 7 ex 8 ex 9 ex10 ex11 ex 12 ex 13 ex 14

M1 - - - - - - + - - - - - -

F2 - - - - - - + - - - - - -

M3 - - - - - - + - - - - - -

M4 - - - - - - + - - - - - -

M5 - - - - - - - + - - - - -

F6 - - + - - - - - - - - - -

M7 - - - - - - - - - + - - -

M8 - - - - - - - - - + - - -

M9 - - - - - - - - - - - - +

M10 - + - - - - - - - - - - -

Tabella 2. Varianti identificate in ciascun paziente in base all'analisi deglielettroferogrammi dei singoli esoni.

Delle mutazioni identificate, 3 sono state evidenziate nell'esone 8, che anche

nel nostro gruppo di pazienti, analogamente a quanto già descritto da altri

ricercatori (41), presenta il maggior numero di mutazioni. La mutazione

T197I (39), evidenziata nel paziente M1, risulta associata con un

quadro clinico grave della malattia che oltre alla classica

sintomatologia muscolare, presentava anche uno sviluppo osseo

anomalo. La mutazione non è stata osservata nei genitori del

paziente, suggerendo pertanto un’origine de novo della stessa.

La seconda mutazione osservata nell'esone 8, la P199S, è stata

identificata allo stato eterozigote in una femmina (F2) affetta con

fenotipo lieve (Figura 6).

Paziente Esone/introne Mutazione Cambio Tipo Referenza

M1 esone 8 644 C→T T197I missenso Novelli G. et al.

F2 esone 8 649 T→C P199S missenso questo studio

M3 esone 8 646 insA (646-647)insA non senso questo studioNovelli G. et al.

M4 esone 8 646 insA (646-647)insA non senso questo studioNovelli G. et al.

M5 esone 9 811 C→T R253X non senso questo studio

F6 introne 3 191-11T→A (191-11)T→A splicing Laporte J. et al.

M7 esone 11 1186 G→A G378R missenso Laporte J. et al.

M8 esone 11 1321 C→G G421R missenso Nishino I. et al.

M8 introne 11 1314+3 A→G (1314+3)A→G polimorfismo Laporte J. et al.

M9 introne 14 1644+2 insG (1644+2)insG splicing questo studio

M10 esone 3 163 C→T R37X non senso Laporte J. et al.

Tabella 3. Mutazioni del gene MTM1 identificate mediante DHPLC

Lo studio dell'inattivazione della X ha permesso di dimostrare la

presenza in questo soggetto di una inattivazione sfavorevole

(Figura 7).

WT (646-647)insA

WT

644C TT197I

649T CP199S

811C TR253X

a

b

Figura 6. Profili di eluizione DHPLC degli esoni 8 e 9.

La mutazione (646-647)insA (Figura 6) (40), che introduce una

singola base tra i nucleotidi 646-647, è stata riscontrata in due

pazienti (M3, M4) non consanguinei provenienti dalla stessa

regione geografica. Questa mutazione determina l'introduzione di

un codone non senso in posizione 198. In entrambi i casi, la

mutazione è risultata associata ad un fenotipo grave della malattia.

Il paziente è deceduto nei primi tre mesi di vita.

La mutazione R253X, individuata nell'esone 9, consiste nella transizione C→T

al nucleotide 811 che introduce un codone non senso in posizione 253 al posto

di un residuo di arginina (Figura 6). Questa mutazione è associata ad

un fenotipo grave della malattia in quanto il paziente (M5) è

deceduto subito dopo la nascita per complicanze respiratorie. La

ricerca della mutazione nella madre e nei nonni materni, ha

1000

500

12823 01219

4000

3000

2000

1000

3525441107

4000

3000

2000

1000

32880 43654

4000

3000

2000

1000

78971 46867

4000

3000

2000

1000

4000

3000

2000

1000

64935

a

b

c

Figura 7. Studio dell’ inattivazione del cromosoma X. (a) Femmina F2affetta da miopatia miotubulare legata all’ X (XLMTM) con pattern diinattivazione sbilanciato. (b) Femmina sana con pattern di inattivazionecasuale. (c)Maschio di controllo.

permesso di stabilire la sua origine nella gametogenesi del nonno

materno (Figura 8).

L’analisi delle varianti evidenziate nell’esone 11 hanno permesso

di identificare il polimorfismo (1314+3)A→G (41) (Figura 9) che

nella nostra popolazione presenta una frequenza di 0.50. Nello

stesso esone sono state identificate due mutazioni missenso, G378R

e G421R, (Figura 9) che sostituiscono due residui aminoacidici

all'interno del sito "consensus" per l'attività tirosina fosfatasica. È

possibile pertanto che queste sostituzioni determinano la perdita di

funzione del sito catalitico della miotubularina.

DXS8377

DXS7423 2

3 2

1

II:2

I:2

II:1

III:1

I:1

DXS8377

DXS7423

3

2 1

1 2

1

DXS8377

DXS7423

3

2

*

Figura 8. Analisi di segregazione della mutazione R253X con i marcatoriDXS8377 e DXS7423, fiancheggianti il gene MTM1. (*) Allele mutato.III:1 probando, II:1 madre portatrice, I:1 nonno materno sano.

La mutazione nonsenso R37X è stata identificata nell’esone 3 e

corrisponde ad una transizione C→T nel sito CpG (Figura 10).

La mutazione (191-11)T→A, individuata nella paziente F6, attiva

un sito di splicing criptico nell'introne 4 (Figura 10). La stessa

mutazione, riportata precedentemente in letteratura, (41) provoca

l’eliminazione dell’esone 4 durante il processo di maturazione

dell'RNA messaggero. Anche in questo caso l'espressione della

malattia era associata all’inattivazione sbilanciata del cromosoma

X.

L'analisi dell'esone 14 ha permesso di identificare una inserzione

(1644+2)insG, (Figura 10) che elimina il sito donatore di splicing

nell'introne 14. L’effetto di questa mutazione sul trascritto maturo

è in corso di studio. Questa mutazione risulta associata ad un

fenotipo lieve della malattia.

WT (1314+3) G A1186G AG378R

1321C GG421R

Figura 9. Profili di eluizione DHPLC dell’ esone 11 .

È stata condotta un’analisi di linkage sulla famiglia 1 inclusa nella

nostra casistica. I risultati ottenuti erano compatibili con un

coinvolgimento del gene MTM1 (lod score=1,99 per θ=0,

marcatore DXS548) (Figura 11). Tuttavia la ricerca di mutazioni

nella regione codificante del gene non ha permesso di identificare

alcuna variante nucleotidica.

Nessuna mutazione e/o polimorfismi sono stati evidenziati negli

altri esoni esaminati.

WT (1644+2)insG

c

WT (191-11)T A

b

a

WT 163C TR37X

Figura 10. Profili di eluizione DHPLC degli esoni 3, 4 e 14 .

I:1 I:2

II:1DXS548DXS1113DXS8377DXS7423DXS1684

II:2 II:4 II:52 31 14 14 22 2

II:62 31 14 14 22 2

II:7II:8

III:12 41 14 34 12 1

II:32 31 14 14 22 2

III:22 41 14 24 12 1

III:33 41 11 32 12 1

III:43 41 11 32 12 1

III:52 41 14 34 12 1

III:631531

DXS548

DXS548

DXS1113

DXS1113

DXS8377

DXS8377

DXS7423

DXS7423

DXS1684

DXS1684

IV: 1 IV: 2IV: 321442

III:732233

IV: 421442

III:8

IV: 5

III:932641

IV: 63 42 16 34 11 1

IV: 7 IV: 8

II:9

III:10III:112 11 24 34 32 1

III:122 11 24 34 32 1

III:1332731

IV: 921442

IV: 102 31 24 74 32 1

III:14

IV: 11

III:15

IV: 12 IV: 13

II:10

III:16 III:172 31 24 44 32 2

III:182 31 24 44 32 2

III:19

IV: 14

II:11

III:20III:21 III:222 3? ?4 44 42 2

III:23

IV: 15

III:24

IV: 162?442

Figura 11. Analisi della segregazione degli aplotipi della regione Xq28 dellafamiglia 1. In nero è indicato il cromosoma associato alla malattia.

DISCUSSIONE

La miopatia miotubulare legata all’X è una patologia muscolare congenita,

caratterizzata da una grave ipotonia e debolezza muscolare generalizzata nei

maschi affetti. La maggior parte dei pazienti sono casi sporadici

senza una precedente storia familiare e muore nel primo anno di

vita per complicazioni respiratorie. La somiglianza clinica con

altre patologie è spesso il motivo principale della difficoltà a

formulare una diagnosi clinica certa. Il gene responsabile di questa

malattia, MTM1, è costituito da 15 esoni che si estendono per una

regione gnomica di 100 Kb e mutazioni nei due domini noti della

miotubularina sembrano coinvolte nel meccanismo di arresto della

differenziazione dei miociti ad uno stadio “fetale”,

L’individuazione delle mutazioni è importante nella consulenza

genetica e nella diagnosi prenatale, a sostegno della diagnosi

istopatologica e istoenzimatica.

Il protocollo di diagnosi molecolare attualmente utilizzato è basato

sulla combinazione dell’analisi dei polimorfismi di conformazione

(SSCP) e del sequenziamento diretto.

La Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) è una

metodologia di recente sviluppo, applicata all’analisi di mutazioni, al

rilevamento di SNPs e alla caratterizzazione di alleli negli studi di cancro,

malattie ereditarie ed evoluzione genomica.

Allo scopo di sviluppare un metodo semplice, senza rischi legati all’uso di

sostanze chimiche o radioattive, sensibile e specifico e al tempo stesso rapido

ed economico, in questa tesi abbiamo valutato l’applicabilità della DHPLC per

l’analisi di mutazioni e/o polimorfismi del gene umano MTM1

Abbiamo studiato 10 pazienti con diagnosi clinica di miopatia miotubulare

legata all’X e sono state identificate 9 differenti mutazioni in 10 casi (100%) ed

una variante polimorfa comune. Molte delle mutazioni missenso sono

raggruppate tra gli esoni 8 e 12, intorno al sito attivo PTP

codificato dall’esone 11, mentre altre sostituiscono aminoacidi nel

sito PTP e nel dominio SID. Non abbiamo invece identificato

mutazioni nella famiglia in esame. È attualmente in corso

un’analisi di mutazioni nel promotore o nelle regioni introniche o

negli esoni 1 e 15, in cui sono state riportate solo rare mutazioni.

La sensibilità dell’analisi mediante DHPLC è dipendente dalle

condizioni di corsa del prodotto di PCR nella colonna

cromatografia. Per alcuni esoni è stato necessario provare tre o

quattro temperature in quanto l’amplificato corrispondente

presentava più domini di denaturazione. Tuttavia il caricamento

semiautomatico dei campioni in una micropiastra da 96 pozzetti è

un vantaggio della fase di messa a punto delle condizioni

sperimentali: l’analisi procede anche per un’intera notte senza

l’intervento fisico dell’operatore.

Va sottolineato che nel concetto di sensibilità è compresa l’analisi

dell’elettroferogramma: ogni deviazione dal profilo di eluizione del

campione di DNA di un soggetto sano deve essere considerata una

potenziale mutazione. L’elettroferogramma corrispondente alla

mutazione R253X nell’esone 9 (Figura 8) mostra la presenza di una “spalla”

aggiuntiva rispetto al profilo di eluizione dello stesso prodotto di PCR in un

soggetto sano.

Nella nostra analisi di mutazioni non abbiamo osservato falsi

positivi: la successiva analisi per sequenziamento diretto ha

evidenziato la presenza di una mutazione o di un polimorfismo in

tutti i casi riportati. Riportiamo invece un caso di falso negativo

per l’esone 11: l’elettroferogramma del paziente M8 era simile a

quello corrispondente al polimorfismo (1314+3)A→G nel sito

donatore di splicing dell’introne 11. Il sequenziamento diretto ha

identificato anche la mutazione G421R, oltre alla variante polimorfa. La

mutazione è stata evidenziata in un momento successivo quando la

reazione di PCR è stata eseguita con il primer antisenso 11a

(Tabella 1), disegnato sulla base della sequenza esonica a monte

del sito di splicing.

Un altro vantaggio di questa metodologia è data dalla possibilità di analisi di

mutazioni in soggetti emizigoti semplicemente miscelando i prodotti di PCR di

un maschio malato e di un maschio sano. Il profilo di eluizione è esattamente

sovrapponibile a quello di un soggetto eterozigote per la stessa mutazione.

Tra gli svantaggi dell’analisi di mutazioni mediante DHPLC è da contemplare

il costo iniziale dell’acquisto della strumentazione che, tuttavia, non è superiore

a quello di un sequenziatore automatico standard. I costi di una singola corsa

sono invece sensibilmente bassi (circa 1$): la reazione di PCR non richiede

reagenti speciali come primers biotinilati o fluorescenti o dannosi come

radioisotopi, né enzimi in una fase di manipolazione successiva.

L’analisi di mutazioni mediante DHPLC è applicata di routine per geni

complessi quali BRCA1/2, TSC1/2. È verosimile ritenere che, tra gli sviluppi

futuri dell’applicazione della tecnica, c’è l’analisi di SNPs su grandi segmenti

genomici per la ricerca di polimorfismi di suscettibilità a malattie complesse,

per l’identificazione di marcatori in disequilibrium e per studi evolutivi (52,

53).

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INDICE

PREMESSA 1

INTRODUZIONE 2

MIOPATIA MIOTUBULARE X-LINKED 2Clinica 2Quadro istopatologico 3Gene MTM1 e miotubularina 3Mutazioni e polimorfismi del gene MTM1 5Diagnosi molecolare di miopatia miotubulare legata all’X 6Denaturing High Performance liquid Chromatography 7

MATERIALI E METODI 9Casistica analizzata 9Estrazione del DNA 9DHPLC 10Sequenziamento diretto 20Studio dell’inattivazione del cromosoma X 20

RISULTATI 22

DISCUSSIONE 25

BIBLIOGRAFIA 28

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