Il concetto di aplotipoIl concetto di aplotipo

Un aplotipo è una combinazione di alleli a diversi Un aplotipo è una combinazione di alleli a diversi siti polimorfici sullo stesso cromosoma.siti polimorfici sullo stesso cromosoma.

•I siti possono essere SNPs, microsatelliti o qualsiasi tipo di polimorfismo.

•Il numero di aplotipi differenti per un sistema aploide non ricombinante è pari a

1+n dove n è il numero di siti biallelici considerati.

•Il numero di aplotipi differenti in un sistema diploide ricombinante è pari a

n2 (siti biallelici)

Dal genotipo all’aplotipoDal genotipo all’aplotipo

1.1. Determinazione per separazione fisicaDeterminazione per separazione fisica

Dal genotipo all’aplotipoDal genotipo all’aplotipo

2.2. Studi di pedigreeStudi di pedigree

3.3. Metodi statisticiMetodi statistici

Misure di variabilità Misure di variabilità geneticagenetica

Eterozigosità Eterozigosità H= (1-H= (1-xxii22))

– xxii è la frequenza del iesimo allele ad un locus è la frequenza del iesimo allele ad un locus

Diversità aplotipicaDiversità aplotipica H= (1-H= (1-XXii22))

– XXii è la frequenza delliesimo aplotipo è la frequenza delliesimo aplotipo

Diversità nucleotidicaDiversità nucleotidica– Vedi dia successivaVedi dia successiva

Diversità tra popolazioni: FstDiversità tra popolazioni: Fst– Lezioni successiveLezioni successive

1. Numero medio di differrenze tra sequenze

N

i

N

ijijnn ]2/)1([

1

2. Normalizzazione per la lunghezza delle sequenze (L)

L

π: la diversità nucleotidica

1. ACAGCATTAGCA2. ATAGCAATAGCT3. ATAGCAATACCT

(1/3)*(3+1+4) = 8/3(8/3)/12 = 0.222In media ci sono 22.2% differenze tra le sequenze

esempio:

#di coppie #di differenze tra

sequenze

Quanto simili sono due sequenze prese a caso in una popolazione?

Diversità nucleotidica nel DNA nucleare umano

Przeworski, M., et al. (2000) Trends Genet 16, 296-302.

Chr - chromosomen - Number of samples examinedbp - Number of basepairs sequencesS - Number of polymorphic sites - Nucleotide divergence

In media ~ 0.1%

Tecniche di laboratorio per lo studio della Tecniche di laboratorio per lo studio della variabilità geneticavariabilità genetica

Bisogna fare una distinzione tra:Bisogna fare una distinzione tra:

1) metodi per identificare nuove mutazioni1) metodi per identificare nuove mutazioni

numero limitato di tecnichenumero limitato di tecniche

2) metodi per la tipizzazione di mutazioni note2) metodi per la tipizzazione di mutazioni note

molte tecniche diversemolte tecniche diverse

Metodi: identificazione di nuove Metodi: identificazione di nuove mutazionimutazioni

• Sequenziamento:Vantaggi: identifica qualsiasi tipo di mutazione; 100% di mutazioniSvantaggi: relativamente costoso• SSCP: Vantaggi: poco costosoSvantaggi: non tutti i tipi di polimorfismo sono identificabili Non tutti gli SNPs (80%) vengono identificati. Processo laborioso da mettere a punto• DHPLCVantaggi: 99% degli SNPS identificabiliSvantaggi: la strumentazione (ma non la singola tipizzazione) è molto costosa.I microsatelliti non vengono identificati chiaramente

Identificazione di nuove mutazioni: Identificazione di nuove mutazioni: sequenziamentosequenziamento

Identificazione di nuove mutazioni: Identificazione di nuove mutazioni: sequenziamentosequenziamento

Identificazione di nuove mutazioni: SSCPIdentificazione di nuove mutazioni: SSCP(single strand conformational (single strand conformational

polymorphism)polymorphism)

Principio: in condizioni non denaturanti il DNA a singola elica ha una conformazione ripiegata determinata da interazioni intramolecolari e quindi dalla sua sequenza.

Alleli diversi assumeranno conformazioni diverse, e avranno una differente mobilità in PAGE

Protocollo sperimentale: 1. Marcatura terminale con polinucleotide kinasi di entrambi i primers2. Amplificazione del target (100-400 basi) tramite PCR3. Denaturazione del DNA a doppia elica con calore e formamide4. Elettroforesi su gel di poliacrilammide 6% non denaturante 10-20W5 Essiccamento del gel ed autoradiografia

Identificazione di nuove mutazioni: DHPLCIdentificazione di nuove mutazioni: DHPLC(denaturing high performance liquid chromatography)(denaturing high performance liquid chromatography)

Principio: molecole eteroduplex (con mismatch) hanno un diverso tempo di ritenzione rispetto agli omoduplex in una colonna cromatografica in condizioni parzialmente denaturanti

Eterozigoti formeranno etero- ed omoduplex, omozigoti formeranno solo omoduplex dopo denaturazione e rinaturazione

Protocollo sperimentale: 1. Amplificazione del target (100-600 basi tramite PCR)2. Denaturazione del DNA a doppia elica a 95 °C per 5’3. Raffreddamento lento (30’) da 95 a 60 °C = formazione di etero- ed omoduplex4. Caricamento su colonna ad una certa temperatura (dipende dal frammento)5. Eluizione con tampone appropriato

ricerca di SNPs noti in ricerca di SNPs noti in databasedatabase

Oltre 9 milioni di SNPs sono raccolti in appositi database. La maggior parte di questi SNPs sono stati identificati mediante sovrapposizione di sequenze durante le fasi del progetto genoma umano o successivamente (progetto HAPMAP, dedi lezioni successive)

Alcuni database di SNPs

•dbSNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html

•Human Genome Variation Database (HGVbase) http://hgvbase.cgb.ki.se/

TSC: The SNP Consortiumhttp://snp.cshl.org/

Tipizzazione di mutazioni (SNPs) note:Tipizzazione di mutazioni (SNPs) note:basi molecolaribasi molecolari

1. Ibridazione oligo (ASO)2. PCR allele specifica (ASA)3. Minisequencing4. Test della ligasi5. Taglio con enzimi di restriz.

Tipizzazione di mutazioni (SNPs) note:Tipizzazione di mutazioni (SNPs) note:metodimetodi

Principio Strumentazione

Identificazione e tipizzazione di Identificazione e tipizzazione di microsatellitimicrosatelliti

L’identificazione dei microsatelliti avveniva in passato mediante ibridazione di sonde ripetitive su library di DNA e successivo subclonaggio e sequenziamento dei cloni positivi.

Oggi i microsatelliti vengono identificati “in silico” nei database di sequenze genomiche con il software “tandem repeats finder”

La tipizzazione richiede PCR, con primers che fiancheggiano il microsatellite ed elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante. Possibilità di multiplex