Università degli Studi di Roma “La Sapienza” Dottorato di Ricerca in Chirurgia

XVIII Ciclo

Coordinatore Prof. Vincenzo Stipa

Tesi di Dottorato di Ricerca

Valutazione dell’immunità antitumorale attraverso lo studio dell’infiltrato linfoplasmacellulare con anticorpi monoclonali e definizione di nuovi fattori prognostici nei pazienti affetti da

cancro gastrico.

Relatore Dottorando Chiar.mo Prof. Dott. Apostolos BARBAROSOS Antonio BOLOGNESE

Dipartimento di Chirurgia “Pietro Valdoni”

INDICE Introduzione ..................................................................... pag. 3

Materiali e metodi............................................................. pag. 9

Immunoistochimica.................................................. pag. 10

Analisi statistica....................................................... pag. 12

Risultati .......................................................................... pag. 14

Caratteristiche dei pazienti ...................................... pag. 14

Infiltrato linfoplasmacellulare e sottopopolazioni...... pag. 15

Le cellule CD8+ (linfociti citotossici) ........................ pag. 16

Le cellule CD57+ (natural killer)............................... pag. 17

Le cellule CD68+ (macrofagi) .................................. pag. 18

Discussione.................................................................... pag. 19

Tabelle e Figure ............................................................. pag. 24

Bibliografia ..................................................................... pag. 36

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Introduzione

Il carcinoma dello stomaco è una patologia di grande peso

mondiale, sociale ed economico, considerando che è la seconda

causa di morte per neoplasia dopo quella polmonare, la quarta per

incidenza e ne vengono diagnosticati circa un milione di nuovi casi

l’anno1.

La sopravvivenza dei pazienti sottoposti ad intervento chirurgico

dipende principalmente dallo stadio tumorale (infiltrazione del

tumore primitivo, stato dei linfonodi regionali, metastasi a distanza,

residuo tumorale), mentre per l’impatto prognostico di alcune

modificazioni genetiche sono in corso alcune ricerche 2, 3.

I primi studi di immunoistochimica, effettuati prevalentemente su

tumori del colon retto, hanno quantificato le cellule immunitarie su

sezioni tessutali colorate con ematossilina-eosina sottostimando il

vero numero di leucociti presenti nel tessuto tumorale. Con tale

metodica, inoltre, non è possibile caratterizzare morfologicamente le

singole sottopopolazioni dell’infiltrato linfoplasmacellulare ed in

particolare i T-helper, i T-citotossici, i Natural Killer ed i macrofagi

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considerando il ruolo importante che esse giocano nell’immunità

dell’ospite contro il tumore 4, 5.

Vari studi hanno ormai messo in chiaro le modalità delle interazioni

tra le cellule linfoplasmacellulari e l’importanza che esse hanno

nella sorveglianza anti-tumorale e nei processi di invasione e

diffusione del cancro. Tale caratteristica anti-tumorale dipende

molto dall’immunogenicità del tumore che a sua volta è subordinata

dalla quantità di mutazioni presenti nel tumore. Tumori come quelli

del colon retto sembrano avere numerose mutazioni

prevalentemente correlate all’instabilità microsatellitare, mentre i

tumori dello stomaco ne sarebbero poveri e pertanto capaci di

sfuggire alla sorveglianza immunitaria “dell’ospite” 6-9.

Considerando singolarmente il ruolo delle diverse sottopopolazioni

linfocitarie nella sorveglianza antitumorale, i macrofagi (TAM, tumor-

associated macrophage), riconosciuti per la presenza dell’antigene

CD68 sulla superficie, sono responsabili direttamente o

indirettamente dell’effetto soppressore nei confronti delle cellule T

attivate contro le cellule tumorali. La valutazione quantitativa dei

macrofagi nel contesto del tumore ha dimostrato che una bassa

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rappresentanza è correlata ad una migliore sopravvivenza dei

pazienti 10. Questo è dovuto alla creazione di un microambiente che

favorisce la neovascolarizzazione e la reazione fibrotica mediante

produzione di fattori angiogenici quali il VEGF (vascular endothelial

growth factor), il bFGF (basic fibroblast growth factor) e il TNF-�

(tumor necrosis factor – �). In vitro, invece, i macrofagi hanno

un’attività prevalentemente anti-tumorale attraverso un contatto

cellula-cellula e non mediato da una attività immunologica. In vivo

l’infiltrazione dei macrofagi è correlata positivamente con la

profondità di infiltrazione, lo stato linfonodale e lo stadio clinico con

una sopravvivenza a 5 anni peggiore nel gruppo di pazienti con un

infiltrato maggiore. I macrofagi, inoltre, secernono citochine

immunosoppressive ed influiscono indirettamente sui linfociti

infiltranti il tumore. In un recente studio, suddividendo la

popolazione dei macrofagi in due sottogruppi, uno periferico ed uno

nel contesto del tumore, è stato dimostrato che nel gruppo con un

numero di macrofaci intratumorali superiore la sopravvivenza è

risultata essere migliore11.

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Il numero di cellule dendritiche (DC) CD83+ presenti nel contesto

della neoplasia è inversamente correlato con la profondità di

invasione e le metastasi linfonodali. Un ridotto numero di DC è

correlato con una prognosi peggiore 12.

La presenza di cellule T regolatrici CD4+/CD25+ hanno un effetto

inibente nei confronti della risposta immunitaria mediata dalle cellule

CD4+/CD25- e CD8+ in quanto non producono INFγ e secernono in

grandi quantità IL-10, un fattore responsabile dell’effetto

immunosoppressore 13.

Le cellule NK sono cellule del sistema immunitario che agiscono in

modo non specifico nei confronti del tumore. È stato descritto che le

cellule NK (CD57+), negli early gastric cancer, sono meno

numerose nel contesto del tumore e maggiormente rappresentate

intorno alla neoplasia rispetto ai tumori di grandi dimensioni ed

infiltrativi nei quali sono poco numerose anche in periferia 12.

È stato dimostrato inoltre, che pazienti con alto numero di NK

infiltrati sono affetti da un maggior numero di early gastric cancer,

meno metastasi linfonodali e ridotta infiltrazione linfatica rispetto ai

pazienti con ridotto infiltrato di NK. L’infiltrazione di cellule NK è

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inversamente correlata con la profondità di invasione tumorale, lo

stadio clinico ed l’invasione venosa. Anche la sopravvivenza è

sembrata significativamente migliore nei pazienti in cui l’infiltrazione

di cellule NK era più numerosa 10, 14-16.

Considerando separatamente il tipo diffuso da quello intestinale si è

visto che le cellule citotossiche (CD8+) sono maggiormente

rappresentate nei tumori di tipo intestinale dando importanza

all’effetto immunosoppressore dei tumori di tipo diffuso e al ruolo

che giocano le cellule CD8+ nel limitare la diffusione tumorale 13.

È stato riportato, d’altro canto, che non esiste una differenza

significativa di prognosi considerando solamente l’entità globale

dell’infiltrato linfoplasmacellulare.

Una caratteristica molto importante, evidenziata da studi recenti, è

quella della localizzazione delle cellule immunitarie rispetto al

tessuto tumorale, diversificate in intratumorali, intraepiteliali,

peritumorali o dello stroma. Naito et al. hanno dimostrato che le

cellule CD8+ localizzate nello stroma tumorale o lungo il margine

tumorale non hanno nessun effetto sulla prognosi, mentre invece un

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effetto prognostico positivo lo hanno solo le cellule CD8+ localizzate

nell’epitelio tumorale 17.

L’obiettivo di questo studio è stato quello di quantificare le diverse

sottopopolazioni linfocitarie in pazienti affetti da cancro gastrico e

correlarle con le singole caratteristiche isto-patologiche del tumore

valutando l’effetto prognostico.

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Materiali e metodi

È stato analizzato retrospettivamente l’archivio del Dipartimento di

Chirurgia “Pietro Valdoni” considerando i pazienti sottoposti ad

intervento chirurgico a scopo curativo per cancro gastrico. I criteri di

inclusione sono stati la presenza di carcinoma gastrico (sia di tipo

intestinale che di tipo diffuso), allo stadio iniziale (T1 e T2), in

assenza di metastasi linfonodali (N0) o in meno di 8 linfonodi (N1) e

assenza di metastasi a distanza (M0), stadio I e II. In base a questi

criteri sono stati individuati 73 pazienti. Per la valutazione corretta

della sopravvivenza sono stati presi in considerazione gli interventi

chirurgici eseguiti a scopo curativo con asportazione di almeno 15

linfonodi. Di questi pazienti sono stati cercati i blocchetti del tumore

primitivo incluso in paraffina, sezionati in fette con uno spessore di 4

�m e sono stati sottoposti, in collaborazione con il servizio di

Istopatologia del Dipartimento di Chirurgia “Pietro Valdoni” diretto

dal Prof. Pietro Mingazzini, a rilevazione immunoistochimica con

anticorpi monoclonali per l’identificazione delle sottopopolazioni

linfocitarie CD20+ (linfociti B), CD4+ (linfociti T helper), CD8+

(linfociti T citotosici), CD68+ (macrofagi) e CD57+ (natural killer) per

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lo studio delle sottopopolazioni dell’infiltrato linfoplasmacellulare.

Per la colorazione dei vetrini è stata utilizzata la diaminobenzidina.

È stato contato il numero delle cellule marcate con un

ingrandimento 400x in 15 diversi campi e sono stati suddivisi i

pazienti in due sottopopolazioni in base ad un basso o alto numero

di cellule. L’infiltrato linfoplasmacellulare è stato suddiviso in

perilesionale ed intralesionale/intraepiteliale. Attraverso una raccolta

dati è stato possibile valutare il follow up di 20 pazienti (intervento

chirurgico, stadio, chemioterapia pre- e post-operatoria, recidiva,

causa di morte, curve di sopravvivenza).

Immunoistochimica

Per l’analisi immunoistochimica sono stati utilizzati i seguenti

anticorpi: anti CD4 (monoclonale, clone 4B12, diluizione 1:20,

Novocastra), anti CD8 (monoclonale, clone 1A5, diluizione 1:20,

Novocastra), anti CD20 (monoclonale, clone L26, diluizione 1:400,

Novocastra), anti CD57 (monoclonale, clone NK-1, diluizione 1:50,

Novocastra) ed anti CD 68 (monoclonale, clone KP1, diluizione

1:400, Novocastra).

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Lo studio immunoistochimico è stato effettuato su sezioni di 4 µm di

spessore di tessuto fissato in formalina ed incluso in paraffina.

Le sezioni sono state raccolte su vetrini portaoggetti a carica

positiva e poste in stufa per 5 minuti a 50 °C e quindi sono state

sparaffinate in xilolo e reidratate utilizzando alcool a scalare fino a

giungere all’acqua corrente.

E’ stato quindi effettuato il blocco delle perossidasi endogene con

un bagno di 5 minuti in acqua ossigenata al 3%, mentre per

l’anticorpo anti CD4 il blocco delle perossidasi endogene è stato

eseguito con un bagno di 5 minuti in acqua ossigenata/metanolo

allo 0.5%.

I siti antigenici sono stati messi in evidenza mediante trattamento al

calore utilizzando il forno a microonde a 750 W, per 3 cicli da 5

minuti ciascuno, in una soluzione di tampone citrato, a ph 6 per tutti

gli anticorpi, seguito poi da un periodo di raffreddamento di 20

minuti a temperatura ambiente.

Dopo risciacquo con acqua distillata le sezioni sono state ricoperte

con siero normale diluito (R.T.U. Normal Horse Serum, Vector), per

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10 minuti e poi incubate con 100 µl di anticorpo primario per 60

minuti a temperatura ambiente.

Ogni vetrino, dopo risciacquo con PBS (Phosphate buffered saline,

Tampone Fosfato in soluzione salina), per 2 volte da 5 minuti

ciascuna, é stato messo ad incubare per 30 minuti con due/tre

gocce di anticorpo secondario biotilinato (R.T.U. Biotinylated

Universal Antibody, Vector) e dopo risciacquo con PBS é stato

messo ad incubare per 30 minuti con due/tre gocce di siero

contenente il complesso Avidina/Biotina (R.T.U. VECTASTAIN®

Elite ABC Reagent, Vector)

Le sezioni nuovamente risciacquate con PBS, per 2 volte da 5

minuti ciascuna, sono state incubate per 5-10 minuti con soluzione

di substrato cromogeno, diaminobenzidina (DAB) ed infine le

sezioni sono state controcolorate in ematossilina di Meyer

(MERCK), per 7 secondi, deidratate in serie alcolica crescente,

chiarificate in xilolo e montate in resina sintetica.

Analisi statistica

Come già detto in precedenza le sottopopolazioni linfocitarie

intratumorali e lungo il margine di infiltrazione sono state suddivise

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in 2 gruppi di alta o bassa densità cellulare scegliendo come valore

di riferimento la mediana di ciascun gruppo. Infine, con l’utilizzo di

test statistici computerizzati è stata eseguita una valutazione

univariata con l’ausilio del χ2-test e del test t di Student. È stato

valutato l’impatto prognostico delle varie sottopopolazioni linfocitarie

attraverso il metodo di Kaplan-Meier e del log-rank test. La

significatività statistica è stata considerata nei casi di p < 0.05.

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Risultati

Caratteristiche dei pazienti

Dal 1998 al 2002 sono stati ricoverati ed operati per neoplasia

gastrica presso il Dipartimento di Chirurgia “Pietro Valdoni” 164

pazienti. In base ai criteri di selezione sono stati individuati 73

pazienti, e sono stati recuperati e tagliati i blocchetti dei pezzi

operatori di 27 pazienti, 15 maschi e 12 femmine, di un’età

compresa tra i 42 e gli 88 anni (maschi 50 – 75 anni, età media

64.73 anni, femmine 42 –88 anni, età media 63.55 anni). Le

caratteristiche istopatologiche dei pazienti sono riassunte nella

tabella 1.

In base ai dati rilevati dalle cartelle cliniche è stato possibile

effettuare il follow up di 20 pazienti, 11 maschi (59 – 76 anni, età

media 67.36 anni) e 9 femmine (42 – 88 anni, età media 66.77

anni). Sono deceduti 7 pazienti (3 maschi e 4 femmine, 35%), 3

(15%) per recidiva della neoplasia e/o per la comparsa di metastasi

e 4 (20%) per cause non correlate alla neoplasia (sopravvivenza

media 9.85 mesi, 1-24 mesi, età media maschi 65 anni, femmine

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75.75 anni, totale 71.14 anni). Tredici pazienti (65%) sono vivi al

momento del follow-up e nessuno presenta segni o sintomi di

ripresa della malattia (8 maschi e 5 femmine età media 64.92 anni,

maschi 68.65 anni, femmine 59.6 anni). Tre paziente sono stati

sottoposti a chemioterapia post-operatoria, 1 deceduto dopo 24

mesi dalla data dell’intervento, mentre gli altri 2 sono vivi dopo 85 e

88 mesi di follow-up. Il follow-up medio è stato di 57.53 mesi (min

38 mesi, max 88 mesi).

Infiltrato linfoplasmacellulare e sottopopolazioni

L’infiltrato linfoplasmacellulare è stato caratterizzato in base agli

anticorpi utilizzati in CD4+, CD8+, CD20+, CD57+ e CD68+ e

suddiviso in intratumorale/intraepiteliale e peritumorale (Figure 1-5).

Dopo valutazione del numero delle cellule marcate con un

ingrandimento 400x in 15 diversi campi, sono stati suddivisi i

pazienti in due gruppi in base ad un basso o alto numero di cellule

rispetto alla mediana (n) di ciascuna sottopopolazione (Gruppo A <

n, Gruppo B � n) (tabella 2). La conta delle cellule CD4+ è stata

resa impossibile a causa della cross reazione con i macrofagi,

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invece la conta delle cellule CD20+ si è rivelata molto bassa e

quando presenti erano associate ai tessuti MALT (mucosal

associated lymphoid tissue) e non in prossimità del tumore.

Pertanto lo studio è stato focalizzato sulle cellule CD8+, CD57+ e

CD68+. In alcuni casi di tumore di tipo diffuso è stato reso difficile

valutare le cellule a distribuzione intratumorale e non sono stati

presi in considerazione nella valutazione di alcuni parametri.

La distribuzione delle cellule CD8+, CD57+ e CD68+ in intra e

peritumorali è stata confrontata in base all’età dei pazienti, il tumore

primitivo, la presenza di metastasi linfonodali, il grado di

differenziazione, la classificazione di Lauren, la presenza di cellule

ad anello con castone (tabella 3) ed in base ai 2 gruppi di valori

(tabella 4). Le stesse distribuzioni sono state poi confrontate in

base ai dati di sopravvivenza (tabella 5). È stata costruita la curva

di sopravvivenza dei pazienti in base al metodo di Kaplan – Meier

(figura 6) e sono state confrontate le curve di sopravvivenza dei

gruppi A e B delle singole sottopopolazioni linfocitarie intra e

peritumorali con il Log-Rank test (figura 7).

Le cellule CD8+ (linfociti citotossici)

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La maggior parte delle cellule CD8+ sono distribuite lungo il

margine di invasione tumorale, invece sono poche quelle presenti

nel contesto tumorale (media: 214.65 cellule per 15 campi vs

18.26). L’analisi statistica ha rivelato una distribuzione

significativamente maggiore delle cellule CD8+ peritumorali nei

pazienti con tumore pT1 (p = 0.022) e al limite della significatività

nei tumori scarsamente differenziati (G3) (p = 0.053). Nessuna

significatività statistica, invece, è stata evidenziata nei confronti

degli altri fattori presi in considerazione sia per le cellule distribuite

lungo il margine tumorale sia per quelle intratumorali.

Le cellule CD57+ (natural killer)

Anche per le cellule CD57+ la distribuzione è stata maggiore lungo

il margine di infiltrazione (66.6 cellule per 15 campi vs 6.47). Il

numero delle cellule CD57+ intraepiteliali è risultato maggiore nel

sesso femminile (p = 0.039) e nei casi con tumori caratterizzati dalla

presenza di cellule ad anello con castone (p = 0.022).

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Le cellule CD68+ (macrofagi)

Nonostante lo schema di distribuzione delle cellule CD68+ segua

quello delle CD8+ e CD57+, non è stata dimostrata una preferenza

per una delle caratteristiche prese in esame.

Prendendo come valore cut-off la mediana di ciascuna

sottopopolazione linfocitaria non è stata trovata nessuna differenza

significativa confrontando i sottogruppi A e B. Comparando, invece,

le curve di sopravvivenza dei singoli sottogruppi, nonostante

l’assenza di significatività statistica, è stato evidenziato un migliore

outcome nei pazienti con bassa rappresentanza di cellule CD68+

peritumorali rispetto il gruppo B (figura 6 – diagramma VI).

- 19 -

Discussione

Da questo studio, come evidenziato anche da altri recenti studi, le

cellule immunitarie non sono distribuite solo lungo il margine di

infiltrazione del tumore ma anche nel suo contesto. Comunque, il

numero assoluto delle singole sottopopolazioni dell’infiltrato

linfoplasmacellulare è nettamente inferiore nel contesto tumorale

rispetto al margine. Esiste una correlazione tra grandezza del

tumore e grado di infiltrazione con la presenza di cellule CD8+

citotossiche lungo il margine di infiltrazione che potrebbe indicare

un valore importante di queste cellule nel limitare l’invasione

tumorale. La scarsa differenziazione tumorale, inoltre, metterebbe in

evidenza antigeni tumorali capaci di stimolare la risposta cellulo-

mediata.

L’effetto delle cellule citotossiche è correlato alla presenza dei

macrofagi. I macrofagi hanno la funzione di presentazione

dell’antigene alle cellule citotossiche con induzione della risposta da

parte di queste ultime. Come evidenziato da questo studio, e come

dimostrato anche da Ohno et al., il grado di infiltrazione delle cellule

CD8+ intratumorali è direttamente correlato con il numero dei

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macrofagi intratumorali in pazienti affetti da cancro gastrico 11.

Ishigami et al. hanno dimostrato una alta aggressività clinica di un

tumore gastrico in pazienti con un elevato numero di macrofagi

associati al tumore (TAM) senza però distinguere le cellule

intratumorali da quelle peritumorali 10. Nel nostro studio un peggior

outcome dei pazienti è stato evidenziato nei casi con elevato

numero di TAM lungo il margine di infiltrazione del tumore. Questo

risultato è in accordo con altri studi dove un alto numero di TAM è

associato ad un’alta probabilità di coinvolgimento linfonodale, ad

una infiltrazione tumorale più profonda ed uno stadio clinico più

avanzato in vari tipi di cancro. Leek et al. hanno dimostrato una

correlazione tra TAM e angiogenesi in pazienti affetti da cancro

della mammella con riduzione della sopravvivenza libera da malattia

e quella globale indicando i CD68+ come fattore prognostico

indipendente18. Il comportamento aggressivo del cancro gastrico

potrebbe, pertanto, essere riportato all’effetto angiogenico dei TAM

come si può vedere attraverso un aumento dei microvasi e

l’espressione della timidina fosforilasi da parte delle cellule tumorali.

Un aumento della secrezione di citochine immunosoppressive,

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inoltre, da parte dei TAM può influenzare indirettamente l’azione

delle cellule citotossiche con deterioramento del segnale di

trasduzione della risposta immunologia antitumorale da parte delle

cellule T 10, 19-24. Questi risultati stabiliscono pertanto che le cellule

TAM, lungo il margine di invasione tumorale e vicino ad aree di

necrosi, contribuiscono alla neoangiogenesi e sono correlate ad una

cattiva prognosi 25, 26. Dati discrepanti arrivano, invece, da Ohno et

al. che, prendendo in considerazione solamente i TAM intratumorali,

hanno dimostrato una stretta correlazione tra il numero di questi e la

frequenza di apoptosi delle cellule tumorali, nonché una maggior

sopravvivenza libera da malattia. Tale correlazione non è stata

confermata anche per i TAM distribuiti lungo il margine tumorale 11.

I dati dei vari studi non sono confrontabili in quanto la conta delle

cellule non segue delle regole ben precise (ingrandimento

microscopico, numero campi visionati, distinzione tra cellule

peritumorali, intratumorali ed intraepiteliali) e molti di questi studi

non ha preso in considerazione le cellule intratumorali/intraepiteliali.

Come dimostrato da vari studi, l’immunità cellulo-mediata dell’ospite

contro il tumore è soppressa da vari fattori come la scarsa

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presentazione degli antigeni, a causa di una sotto-regolazione dei

recettori MHC-I, la riduzione o perdita completa degli epitopi delle

cellule T sulle cellule tumorali, la secrezione di fattori

immunosoppressivi da parte delle cellule tumorali e la disfunzione

delle cellule T nei pazienti affetti da neoplasie da riportare ad una

riduzione delle molecole-segnale per le cellule T o ad una induzione

dell’apoptosi delle cellule T 13. Nonostante ciò non sono chiari i

meccanismi di questa regolazione delle cellule linfocitarie nel

contesto dell’immunosorveglianza tumorale. In questo contesto un

ruolo importante potrebbe giocare il background ormonale del

paziente, come da noi è stato evidenziato con un maggior numero

di natural killer nel tessuto tumorale in pazienti di sesso femminile.

Lo studio dell’immunogenicità del tumore ha un fondamentale ruolo

nei processi di comprensione dei meccanismi antitumorali. Come

già detto il cancro gastrico ha una scarsa immunogenicità,

probabilmente dovuta al basso contenuto di mutazioni, che in altri

tumori come quelli del colon retto danno alla luce antigeni non

riconoscibili dall’ospite e pertanto ad alto potere immunogenico

antitumorale. Dal nostro studio un aspetto importante è quello

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evidenziato dall’alta rappresentanza di cellule CD57+ (natural killer)

nel contesto di tumori contenenti cellule con aspetto ad anello con

castone. La presenza di mucina o di qualche fattore legato a questa

potrebbe essere lo stimolo di una risposta immunitaria cellulo-

mediata aspecifica come quella mediata dai natural killer.

Il contatto tra i macrofagi, i granulociti, i linfociti e le plasmacellule

costituisce un ricorrente quadro ultrastrutturale che suggerisce una

intensa interazione intercellulare. Attraverso questa interazione i

leucociti ricevono o inviano messaggi regolatori polarizzando in tal

modo la secrezione delle citochine ed di altri fattori regolatori.

Questa interazione potrebbe rivelarsi importante nella risposta

dell’ospite nei confronti del cancro gastrico, specie in uno stadio

iniziale. Sono necessari però ulteriori studi per esaminare fino in

fondo questa interazione, base essenziale per costruire una

immunoterapia con fattori stimolanti la risposta immunitaria

antitumorale.

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Tabelle e Figure

Tabella 1

Caratteristiche istopatologiche dei pazienti (totale 27)

Caratteristiche Pazienti n (%) Sesso Maschi Femmine

15 (55.6) 12 (44.4)

Tumore T1 T2 T3

7 (25.9) 19 (70.4) 1 (3.7)

Linfonodi N- N+

14 (51.9) 13 (48.1)

Differenziazione G1 G2 G3

1 (3.7) 12 (44.4) 14 (51.9)

Infiltrato linfoplasmacellulare Scarso Moderato Marcato

8 (29.6) 9 (33.3) 10 (37.1)

Classificazione sec Lauren Intestinale Diffuso Misto

21 (77.8) 4 (14.8) 2 (7.4)

Cellule ad anello con castone Si No

9 (33.3) 18 (66.7)

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Tabella 2

Immunoistochimica: suddivisione in gruppi in base alla

localizzazione delle cellule marcate in intratumorale e peritumorale

e i singoli valori (somma di 15 campi del conteggio delle cellule per

campo a 400x di ingrandimento)

min max mediana media Derivazione standard (DS)

CD8 peritumorale 31 486 224 214.65 122.1 intratumorale 1 114 10 18.26 27.97

CD57 peritumorale 1 143 63 66.6 42.23 intratumorale 1 31 5 6.47 6.99

CD68 peritumorale 5 435 273 269.27 117.53 intratumorale 1 28 8.5 10.42 8.04

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Tabella 3

Distribuzione delle cellule CD8+, CD57+ e CD68+ e caratteristiche

clinico-patologiche dei pazienti (media ± deviazione standard

(mediana), * test t di Student) CD8+

Intra Peri Variabili (n) p* p*

Età (anni) < 65 27.57 ± 40.9 (10) 207.2 ± 130.69 (213.5) � 65 9.86 ± 9.44 (8)

0.286 261.09 ± 114.89 (244)

0.327

Sesso Maschi 21.27 ± 35.18 (10) 216.71 ± 122.6 (221.5) Femmine 14.13 ± 14.51 (10.5)

0.597 212.25 ± 126.92 (224)

0.928

Tumore pT1 24.25 ± 12.23 (22) 314.17 ± 108.27 (273) pT2 16.67 ± 31 (2) 183.89 ± 114.64 (152) pT3

0.644 202

0.022

Differenziazione G1 220 G2 16.23 ± 21.28 (8) 160.55 ± 102.43 (110) G3 20 ± 33.99 (11)

0.784 256.79 ± 127.32 (252)

0.053

Linfonodi Negativi 26 ± 38.11 (12.5) 251.92 ± 96.88 (249) Positivi 12.64 ± 17.59 (8)

0.318 177.38 ± 136.62 (146)

0.122

Classificazione di Lauren Intestinale 21.47 ± 30.78 (10) 194.45 ± 126.02 (200.5) Diffuso 11 ± 1.41 (11) 285.25 ± 105.65 (307) Misto 1.5 ± 0.71 (1.5)

0.386 275.5 ± 44.55 (275.5)

0.193

Infiltrato Linfoplasmacellulare Scarso 34 ± 41.61 (10) 193.63 ± 113.49 (190) Moderato 7 ± 9.34 (2) 198.78 ± 107.74 (199) Marcato 11.17 ± 9.62 (10.5)

0.150 249.22 ± 147.12 (244)

0.401

Cellule ad anello con castone Si 17.8 ± 15.17 (12) 238 ± 138.68 (249) No 18.43 ± 31.82 (5)

0.967 202.29 ± 114.93 (202)

0.489

CD57+ CD68+ Intra Peri Intra Peri Variabili (n)

p* p* p* p* Età (anni) < 65 9.86 ± 10.4 (5) 78.4 ± 40.53 (80.5) 15 ± 11.27 (9) 254 ± 152.92 (268) � 65 5.38 ± 3.2 (5)

0.266 68.6 ± 48.01 (65.5)

0.628 8.89 ± 6.83 (5)

0.274 262.67 ± 99.91 (273)

0.899

Sesso Maschi 4 ± 2.52 (4.5) 55.29 ± 37.06 (44) 14.67 ± 838 (13.5) 248.57 ± 145.59 (300) Femmine 10.71 ± 10.08 (8)

0.039 81 ± 45.68 (89)

0.134 6.17 ± 4.62 (4.5)

0.063 270.57 ± 86.37 (268)

0.737

Tumore pT1 10.17 ± 11.46 (5) 87 ± 52.6 (96) 10.33 ± 7.09 (9) 246 ± 67.73 (268) pT2 4.77 ± 2.92 (5) 60.16 ± 37.77 (47) 10 ± 9.23 (6.5) 269.36 ± 133.36 (273) pT3

0.120

0.180 14

0.957 338

0.779

Differenziazione G1 5 138 4 170 G2 7.13 ± 10.01 (4) 66.7 ± 44.09 (56) 6.6 ± 5.03 (5) 260.8 ± 54.4 (268) G3 6.1 ± 4.36 (5)

0.772 61.43 ± 39.06 (55)

0.760 14.67 ± 8.8 (13.5)

0.104 285 ± 145.39 (315)

0.730

Linfonodi Negativi 8.56 ± 9.57 (5) 79.42 ± 42.89 (80.5) 7.2 ± 4.97 (8) 257.25 ± 136.67 (265) Positivi 4.6 ± 2.84 (5)

0.227 54.77 ± 39.55 (41)

0.148 12.71 ± 9.34 (9)

0.260 283 ± 100.13 (300)

0.688

Classificazione di Lauren Intestinale 7.13 ± 7.58 (5) 69.26 ± 42.08 (63) 9.22 ± 6.69 (8) 247.6 ± 113.36 (265) Diffuso 3 ± 2.83 (3) 64 ± 43.99 (56.5) 28 380 ± 56.79 (405) Misto 5 ± 5.66 (5)

0.467 46.5 ± 64.35 (46.5)

0.490 7 ± 2.83 (7)

0.667 211.5 ± 152.03 (211.5)

0.083

Infiltrato Linfoplasmacellulare Scarso 9.67 ± 10.78 (6) 73.50 ± 43.45 (68) 13.5 ± 9.68 (9) 270.8 ± 109.4 (268) Moderato 5 ± 5.13 (4) 65.22 ± 42.67 (47) 8.33 ± 10.21 (4) 200 ± 177.25 (180) Marcato 5 ± 3.16 (5)

0.333 61.25 ± 45.34 (54.5)

0.590 9.2 ± 6.38 (5)

0.524 314.17 ± 63.17 (309.5)

0.177

Cellule ad anello con castone Si 12.4 ± 11.78 (9) 84.44 ± 42.49 (89) 12.67 ± 6.35 (9) 326.4 ± 141.07 (405) No 4.36 ± 2.56 (5)

0.022 56.56 ± 39.89 (40)

0.115 9.67 ± 8.73 (5)

0.600 240.7 ± 99.6 (267.5)

0.193

- 27 -

Tabella 4

Suddivisione in gruppi della distribuzione delle cellule CD8+, CD57+ e CD68+ e caratteristiche clinico-patologiche dei pazienti. (*Chi quadro test)

CD8 Peritumorale Intraepiteliale Variabili

A B Tot p* A B Tot p* Età (anni) < 65 5 5 10 3 4 7 � 65 4 7 11 4 3 7 Totale 9 12 21

0.850 7 7 14

1.000

Sesso Maschi 7 7 14 5 6 11 Femmine 6 6 12 4 4 8 Totale 13 13 26

0.694 9 10 19

0.788

Tumore pT1 1 5 6 0 4 4 pT2 11 8 19 9 6 15 pT3 1 0 1 0 0 0 Totale 13 13 26

0.126

9 10 19

0.116

Differenziazione G1 1 0 1 0 0 0 G2 7 4 11 5 4 9 G3 5 9 14 4 6 10 Totale 13 13 26

0.228

9 10 19

0.827

Linfonodi Negativi 5 8 13 3 5 8 Positivi 8 5 13 6 5 11 Totale 13 13 26

0.433 9 10 19

0.788

Classificazione di Lauren Intestinale 12 8 20 7 8 15 Diffuso 1 3 4 0 2 2 Misto 0 2 2 2 0 2 Totale 13 13 26

0.150

9 10 19

0.134

Infiltrato Linfoplasmacellulare Scarso 4 4 8 2 5 7 Moderato 6 3 9 4 2 6 Marcato 3 6 9 3 3 6 Totale 13 13 26

0.368

9 10 19

0.386

Cellule ad anello con Castone Si 3 6 9 1 4 5 No 10 7 17 8 6 14 Totale 13 13 26

0.410 9 10 19

0.365

CD57 CD68

Peritumorale Intraepiteliale Peritumorale Intraepiteliale Variabili

A B Tot p* A B Tot p* A B Tot p* A B Tot p* Età (anni) < 65 3 7 10 2 5 7 3 2 5 2 1 3 � 65 5 5 10 2 6 8 4 6 10 5 4 9 Totale 8 12 20

0.082 4 11 15

0.668 7 8 15

0.855 7 5 12

0.735

Sesso Maschi 8 6 14 6 6 12 3 5 8 2 4 6 Femmine 4 7 11 1 6 7 4 3 7 4 2 6 Totale 12 13 25

0.529 7 12 19

0.287 7 8 15

0.809 6 6 12

0.564

Tumore pT1 2 4 6 2 4 6 2 1 3 1 2 3 pT2 10 9 19 5 8 13 5 6 11 5 3 8 pT3 0 1 1 0 1 1 Totale 12 13 25

0.722

7 12 19

0.767

7 8 15

0.506

6 6 12

0.400

Differenziazione G1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 G2 5 5 10 4 4 8 3 2 5 3 2 5 G3 7 7 14 3 7 10 3 6 9 2 4 6 Totale 12 13 25

0.618

7 12 19

0.502

7 8 15

0.343

6 6 12

0.393

Linfonodi Negativi 4 8 12 3 6 9 5 3 8 3 2 5 Positivi 8 5 13 4 6 10 2 5 7 3 4 7 Totale 12 13 25

0.313 7 12 19

0.861 7 8 15

0.422 6 6 12

1.000

Classificazione di Lauren Intestinale 9 10 19 5 10 15 6 4 10 5 4 9 Diffuso 2 2 4 1 1 2 0 3 3 0 1 1 Misto 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 Totale 12 13 25

0.994

7 12 19

0.828

7 8 15

0.187

6 6 12

0.574

Infiltrato Linfoplasmacellulare Scarso 3 5 8 1 5 6 3 2 5 1 3 4 Moderato 5 4 9 4 3 7 3 1 4 2 1 3 Marcato 4 4 8 2 4 6 1 5 6 3 2 5 Totale 12 13 25

0.751

7 12 19

0.313

7 8 15

0.148

6 6 12

0.465

Cellule ad anello con Castone Si 2 7 9 1 4 5 2 3 5 0 3 3 No 10 6 16 6 8 14 5 5 10 6 3 9 Totale 12 13 25

0.129 7 12 19

0.712 7 8 15

0.855 6 6 12

0.182

CD57 CD68

Peritumorale Intraepiteliale Peritumorale Intraepiteliale Variabili

A B Tot p* A B Tot p* A B Tot p* A B Tot p* Età (anni) < 65 3 7 10 2 5 7 3 2 5 2 1 3 � 65 5 5 10 2 6 8 4 6 10 5 4 9 Totale 8 12 20

0.082 4 11 15

0.668 7 8 15

0.855 7 5 12

0.735

Sesso Maschi 8 6 14 6 6 12 3 5 8 2 4 6 Femmine 4 7 11 1 6 7 4 3 7 4 2 6 Totale 12 13 25

0.529 7 12 19

0.287 7 8 15

0.809 6 6 12

0.564

Tumore pT1 2 4 6 2 4 6 2 1 3 1 2 3 pT2 10 9 19 5 8 13 5 6 11 5 3 8 pT3 0 1 1 0 1 1 Totale 12 13 25

0.722

7 12 19

0.767

7 8 15

0.506

6 6 12

0.400

Differenziazione G1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 G2 5 5 10 4 4 8 3 2 5 3 2 5 G3 7 7 14 3 7 10 3 6 9 2 4 6 Totale 12 13 25

0.618

7 12 19

0.502

7 8 15

0.343

6 6 12

0.393

Linfonodi Negativi 4 8 12 3 6 9 5 3 8 3 2 5 Positivi 8 5 13 4 6 10 2 5 7 3 4 7 Totale 12 13 25

0.313 7 12 19

0.861 7 8 15

0.422 6 6 12

1.000

Classificazione di Lauren Intestinale 9 10 19 5 10 15 6 4 10 5 4 9 Diffuso 2 2 4 1 1 2 0 3 3 0 1 1 Misto 1 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1 2 Totale 12 13 25

0.994

7 12 19

0.828

7 8 15

0.187

6 6 12

0.574

Infiltrato Linfoplasmacellulare Scarso 3 5 8 1 5 6 3 2 5 1 3 4 Moderato 5 4 9 4 3 7 3 1 4 2 1 3 Marcato 4 4 8 2 4 6 1 5 6 3 2 5 Totale 12 13 25

0.751

7 12 19

0.313

7 8 15

0.148

6 6 12

0.465

Cellule ad anello con Castone Si 2 7 9 1 4 5 2 3 5 0 3 3 No 10 6 16 6 8 14 5 5 10 6 3 9 Totale 12 13 25

0.129 7 12 19

0.712 7 8 15

0.855 6 6 12

0.182

- 28 -

Tabella 5

Distribuzione delle cellule CD8+, CD57+ e CD68+ e sopravvivenza

(Log-Rank test)

CD8 CD57 CD68 Peri Intra Peri Intra Peri Intra

A B A B A B A B A B A B media di

sopravvivenza in mesi

(n° pazienti)

42.43 (7)

34.3 (10)

37.18 (11)

38.5 (6)

29.71 (7)

43.2 (10)

29.71 (7)

43.2 (10)

45.64 (11)

23 (6)

40.45 (11)

32.5 (6)

p 0.491 0.713 0.228 0.141 0.077 0.302

- 29 -

Figura 1

Schematizzazione di un adenocarcinoma e della distribuzione

dell’infiltrato linfoplasmacellulare. Le cellule intratumorali (per il tipo

diffuso) e/o intraepiteliali (per il tipo intestinale sono indicate come

“Nest”; le cellule peritumorali e/o marginali sono indicate come

“Margin”. Molte cellule sono distribuite lungo il margine del tumore e

in zone con segni di necrosi (“Hot spot”), invece sono poche quelle

presenti nel contesto del tumore.

- 30 -

Figura 2

Immunoistochimica di adenocarcinoma gastrico con anticorpi anti

CD8 (ingrandimento 400x), cellula intraepiteliale (freccia).

- 31 -

Figura 3

Immunoistochimica di adenocarcinoma gastrico con anticorpi anti

CD8 (ingrandimento 200x), Linfociti CD8+ intratumorali.

- 32 -

Figura 4

Immunoistochimica di adenocarcinoma gastrico con anticorpi anti

CD57 (ingrandimento 400x), Linfocita CD57+ (freccia)

- 33 -

Figura 5

Immunoistochimica di adenocarcinoma gastrico con anticorpi anti

CD68 (ingrandimento 400x), Linfocita CD68+ (freccia)

- 34 -

Figura 6

Curva di sopravvivenza calcolata secondo

il metodo di Kaplan – Meier.

- 35 -

Figura 7

Confronto tra curve di sopravvivenza dei gruppi A (numero cellule < mediana) e B (numero cellule � mediana) delle sottopopolazioni linfocitarie CD8 intratumorali (diagramma I), CD8 peritumorali (II), CD57 intratumorali (III), CD57 peritumorali (IV), CD68 intratumorali (V) e CD68 peritumorali (VI). (p calcolato con Log Rank test)

- 36 -

Bibliografia

1. Crew KD, Neugut AI. Epidemiology of gastric cancer. World J

Gastroenterol 2006; 3(12):354-362.

2. Di Giorgio A, Sammartino P, Di Lauro G, Della Casa U, Giuliani

A, Stipa V. Extended total gastrectomy in cancer: oncological

and prognostic significance. Minerva Chir. 1985 Mar

31;40(6):295-303.

3. Stipa S, Di Giorgio A, Ferri M, Botti C. Results of curative

gastrectomy for carcinoma. J Am Coll Surg 1994

Nov;179(5):567-572.

4. Di Giorgio A, Botti C, Tocchi A, Mingazzini P, Flammia A. The

influence of tumor lymphocytic infiltration on long term survival

of surgically treated colorectal cancer patients. Int Surg. 1992

Oct-Dec; 77(4):256-260.

5. Di Giorgio A, Botti C, Mingazini P, Arnone P, Canavese A,

Cardini C, Consolo S. The effect of the degree of lymphocytic

infiltration on the long-term survival of patients undergoing

surgery for the exeresis of gastric cancer. Minerva Chir 1994

- 37 -

Jan-Feb;49(1-2):7-13.

6. Popponen KM, Eskelinen MJ, Lipponen PK, Alhava E, Kosma

VM. Prognostic value of tumour-infiltrating lymphocytes (TILs)

in colorectal cancer. J Pathol 1997 Jul;182(3):318-324.

7. Svennevig JL, Lunde OC, Holter J, Bjorgsvik D. Lymphoid

infiltration and prognosis in colorectal carcinoma. Br J Cancer.

1984 Mar;49(3):375-377.

8. Menon AG, Janssen – van Rhijn CM, Morreau H, Putter H,

Tollenaar RA, de Velde CJH, Fleuren GJ, Kuppen PJK.

Immune system and prognosis in colorectal cancer: a detailed

immunohistochemical analysis. Lab Inv 2004;84,493-501.

9. Ben Baruch A. Inflammation-associated immune suppression

in cancer: The roles played by cytokines, chemokines and

additional mediators. Sem Cancer Biol 2005 in printing.

10. Ishigami S, Natsugoe S, Tokuda K, Nakajo A, Okumura H,

Matsumoto M, Miyazono F, Hokita S, Aikou T. Tumor-

associated macrophage (TAM) infiltration in gastric cancer.

Anticancer Res. 2003 Sep-Oct;23(5A):4079-4084.

11. Ohno S, Inagawa H, Dhar DK, Fujii T, Ueda S, Tachibana M,

- 38 -

Suzuki N, Inoue M, Soma G, Nagasue N. The degree of

macrophage infiltration into the cancer cell nest is a significant

predictor of survival in gastric cancer patients. Anticancer Res.

2003, 23: 5015-5022.

12. Caruso RA, Vitullo P, Modesti A, Inferrera C. Small early

gastric cancer with special reference to macrophage infiltration.

Mod Pathol 1999; 12(4): 386-390.

13. Ichihara F, Kono K, Takahashi A, Kawaida H, Sugai H, Fujii H.

Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood

and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with gastric and

esophageal cancers. Clin Cancer Res. 2003 Oct 1;9(12):4404-

8.

14. Canoz O, Belenli O, Patiroglu TE. General features of gastric

carcinomas and comparison of HSP70 and NK cell

immunoreactivity with prognostic factors. Pathol Oncol Res.

2002;8(4):262-9. Epub 2003 Feb 11.

15. Ishigami S, Natsugoe S, Tokuda K, Nakajo A, Xiangming C,

Iwashige H, Aridome K, Hokita S, Aikou T. Clinical impact of

intratumoral natural killer cell and dendritic cell infiltration in

- 39 -

gastric cancer. Cancer Lett. 2000 Oct 16;159(1):103-8.

16. Ishigami S, Natsugoe S, Tokuda K, Nakajo A, Che X, Iwashige

H, Aridome K, Hokita S, Aikou T. Prognostic value of

intratumoral natural killer cells in gastric carcinoma. Cancer.

2000 Feb 1;88(3):577-83.

17. Naito Y, Saito K, Shiiba K. CD8+ T cells infiltrated within cancer

cell nests as a prognostic factor in human colorectal cancer.

Cancer Res 1998;58:3491-3494.

18. Leek RD, Lewis CE, Whitehouse R, Greenall M, Clarke J,

Harris AL: Association of macrophage infiltration with

angiogenesis and prognosis in invasive breast carcinoma.

Cancer Res 1996;56: 4625-4629.

19. Dhar DK, Kubota H, Kotoh T, Tabara H, Watanabe R,

Tachibana M, Kohno H, Nagasue N: Tumor vascularity predicts

recurrence in differentiated thyroid carcinoma. Am J Surg

1998;176: 442-447.

20. Takanami I, Takeuchi K and Kodaira S: Tumor-associated

macrophage infiltration in pulmonary adenocarcinoma:

association with angiogenesis and poor prognosis. Oncology

- 40 -

1999;57: 138-142.

21. Makitie T, Summanen P, Tarkkanen A and Kivela T: Tumor-

infiltrating macrophages (CD68(+) cells) and prognosis in

malignant uveal melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:

1414- 1421.

22. Salvesen HB, Akslen LA: Significance of tumour- associated

macrophages, vascular endothelial growth factor and

thrombospondin-1 expression for tumour angiogenesis and

prognosis in endometrial carcinomas. lnt J Cancer 1999;84:

538-543.

23. Koga J, Kakeji Y, Sumiyoshi Y, Kimura Y, Shibahara K, Emi Y,

Maehara Y, Sugimachi K. Angiogenesis and macrophage

infiltration in Borrmann type IV gastric cancer. Fukuoka Igaku

Zasshi. 2001 Sep;92(9):334-9.

24. Saito H, Tsujitani S, Ikeguchi M, Maeta M, Kaibara N.

Relationship between the expression of vascular endothelial

growth factor and the density of dendritic cells in gastric

adenocarcinoma tissue. Br J Cancer. 1998 Dec;78(12):1573-

1577.

- 41 -

25. Leek RD: The prognostic role of angiogenesis in breast cancer.

Anticancer Res 2001;21: 4325-4332.

26. Saito H, Tsujitani S: Angiogenesis, angiogenic factor

expression and prognosis of gastric carcinoma. Anticancer Res

2001;21: 4365-4372.