UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PISA LAUREA IN INGEGNERIA BIOMEDICA CORSO DI ANALISI E MODELLI DI SEGNALI...

UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PISA

LAUREA IN INGEGNERIA BIOMEDICA

CORSO DI ANALISI E MODELLI DI SEGNALI BIOMEDICI

Erika Melissari

Microarray a DNA: tecnologie di costruzione dei vetrini Microarray a cDNA

- lunghezza delle sonde: 200-400 mer

- sonde sintetizzate prima dell’ancoraggio al vetrino

- spotted microarray

Microarray ad oligonucleotidi- sonde sintetizzate direttamente sul vetrinosintetizzazione in situ

- oligonucleotidi corti; lunghezza delle sonde: 20-40 mer (Affymetrix GeneChip)

- oligonucleotidi lunghi; lunghezza delle sonde: 60 mer (Agilent)

I microarray: la tecnologia

““Spotted” ArraySpotted” Array

Affymetrix GeneChipAffymetrix GeneChip®®

AgilentAgilent®®

I microarray: la tecnologia

Microarray per l’analisi dell’espressione genica Centinaia di copie monofilamento di regioni specifiche del

gene formano uno SPOT

Fase “wet” di un esperimento microarray

Estrazione mRNA Retrotrascrizione e

Marcatura Ibridazione Scansione

Analisi dei dati

Quantizzazione dei dati

Verifica biologica ed interpretazione del risultato

Pre-trattamento dei dati

Estrazione dei dati di espressione differenziale

Immagine 16-bit formatoTIFF

Normalizzazione


Scansione del vetrino

Scansione

Scansione del vetrino

Scanner a due laser Lunghezze d’onda di eccitazione/assorbimento dei fluorocromi

635 nm - Red532 nm - Green

Canali separati in acquisizione formazione di due immagini

Codifica su 16 bit 2^16 = 65536 livelli di colore

Occupazione di memoria 250 MB c.a.


• “Gridding” dell’immagine

• Segmentazione: spaziale; per intensità;

Segnale

Background

GAL fileSegmentazione spazialeSegmentazione per intensità

• Estrazione delle intensità del foreground (segnale proveniente da ibridizzazione specifica) e del background (rumore). Per ciascuno spot:

media dei pixel; mediana dei pixel.

Analisi dei dati




Normalizzazione




per sottrazione dal segnale utile del suo valore calcolato su aree dedicate esterne allo spotsegnale netto

Fenomeni che generano rumore:

“legame del campione marcato al microarray in aree esterne allo spot

spotting” scorretto;

legami aspecifici del campione con il supporto;

fluorescenza propria di reagenti non eliminati con il lavaggio.

Pre-trattamento dei dati• Correzione del background

• Applicazione di indicatori di qualità agli spot per la selezione dei geni giudicati idonei per la successiva analisi

SNR = Mediana del segnale netto / SD del rumore

Analisi dei dati




NormalizzazioneNormalizzazione



Normalizzazione (1)

Quantità iniziali diverse di RNA ibridizzato sul vetrino; Diversa efficienza di incorporazione dei due fluorocromi durante

il processo di marcatura; Diversa efficienza dello scanner nell’eccitazione dei due

fluorofori; Diversa efficienza dei due fluorofori nell’emissione dell’energia

acquistata; Diversa efficienza dello scanner nell’acquisizione dei due canali.

DEF: Correzione dell’effetto sistematico di fonti di variabilità che possono influenzare i risultati di un esperimento microarray.

Tali fonti possono essere generate da:

Validità delle correzioni operate sui dati dal processo di normalizzazione

Ipotesi: i geni la cui espressione viene significativamente influenzata dalla condizione sperimentale studiata sono “pochi” rispetto alla totalità dei geni presenti sul vetrino

N.B.: valida solo su vetrini dove è possibile indagare l’intero trascrittoma di un organismo

Normalizzazione (2)

Fold Change

A =½ log (R*G)

M = log (R/G)

Def: Fold-Change: Rapporto fra il valore di espressione del gene x nel campione trattato vs espressione del gene x nel campione di controllo

Esperimento Self-Self: visualizza la presenza di errori sistematici. Due aliquote dello stesso campione vengono marcate con i due fluorofori e ibridizzate sul vetrino

Perché si usa il log del Fold-Change?

Intervalli di rappresentatività dell’espressione differenziale

Normalizzazione (3)Il processo di normalizzazione è necessario anche per confrontare (mettere insieme) dati provenienti da repliche

Repliche sperimentaliRepliche sperimentali: l’mRNA estratto da ogni individuo viene diviso in aliquote, marcato e ibridizzato su almeno tre vetrini insieme a un altro campione marcato con l’altro fluoroforomiglioro la qualità delle osservazioni su ciascun individuo, ma ciò non è sufficiente per quantificare l’espressione media di un gene in una popolazione di individui dello stesso tipo

Repliche biologicheRepliche biologiche: l’mRNA proviene da campioni biologici dello stesso tipo ma distinti (ad esempio individui diversi). Ciascuno di essi viene marcato e ibridizzato una o al più due volte su rispettivamente uno o due vetrini miglioro l’accuratezza nella stima della media di popolazione, ma peggioro quella del singolo individuo

1. Le repliche migliorano l’accuratezza della misura. Più repliche abbiamo, meglio riusciamo ad osservare la quota random degli errori

Come disegno un esperimento efficiente?

“Posso comprare solo 10 array (non ho problemi a reperire campioni).”

“Ho solo 10 campioni (non ho problemi a comprare array).”

DEF: Efficienza ~ 1/varianza delle stime

…a seconda dell’obiettivo dell’esperimento

2. Non è sempre possibile realizzare esperimenti con il massimo livello di replicazioneBisogna stabilire qual è il disegno sperimentale più EFFICIENTE rispetto al quesito biologico che si vuole indagare e al budget a disposizione

Normalizzazione (4)

• Normalizzazione Normalizzazione within array within array per correggere errori sistematici su ciascun per correggere errori sistematici su ciascun array separatamentearray separatamente

• Normalizzazione Normalizzazione between arraysbetween arrays per correggere errori sistematici per correggere errori sistematici che possono

rendere eterogenei array biologicamente simili

(copie sperimentali o biologiche)copie sperimentali o biologiche)

Normalizzazione within array1.1. Normalizzazione globale -> Centraggio della distribuzioneNormalizzazione globale -> Centraggio della distribuzione

R = K * G

log2 R/G - - - -> log2 R/G – c = log2 R/(KG)

c = log2

K

Normalizzazione within array

2.2. Normalizzazione intensità-dipendenteNormalizzazione intensità-dipendente

Interpolazione (fitting) LO(W)ESS (LOcally WEighted polynomial regreSSion) globale

-Fisso l’ampiezza della finestra di dati

-Calcolo la curva di smooting reale attraverso l’interpolazione polinomiale dei dati contenuti nella finestra

-Sposto la finestra e ri-calcolo la curva di smooting al suo interno

-“Raccordo” i pezzi in modo che non vi siano discontinuità e ricostruisco la curva di smooting reale complessiva “spazzolando” tutta la distribuzione dei dati

- Per ciascuna finestra calcolo lo scostamento fra smooting reale e smooting ideale

- “Sposto” i dati contenuti nella finestra in modo da azzerare lo scostamento

Normalizzazione scale riscalatura della dispersione dei log-fold-change fra array per equilibrare i valori di M fra array

Normalizzazione between arrays

scale

Analisi dei dati




Normalizzazione




Estrazione dei dati di espressione genica

Metodi statistici- t-statistic, ANOVA (ANalysis Of VAriance), Bayesian-statistic, S-score e test su permutazione dei dati

Lista di geni differenzialmente espressi

- A ciascun gene è associato un p-value e un valore di log(fold-change) medio, rappresentativo della differenza di espressione rilevata fra il gruppo di soggetti che formano il campione sperimentale e il gruppo dei soggetti di controllo

Lista di geni differenzialmente espressiRank GeneSymbol

Accession Number (Transcript)

DescriptionDifferential expression

(Up- or Down-regulation)P-value

1 DUSP1 NM_004417ref|Homo sapiens dual specificity phosphatase 1

(DUSP1), mRNA0.7606655 0.0004

2 SRGAP1 BC029919gb|Homo sapiens SLIT-ROBO Rho GTPase

activating protein 1, mRNA1.0329521 0.00038

3 HES1 NM_005524ref|Homo sapiens hairy and enhancer of split 1,

(Drosophila) (HES1), mRNA0.7117039 0.00026

4 SMAD3 U68019gb|Homo sapiens mad protein homolog

(hMAD-3) mRNA, complete cds-0.4286814 0.00021

5 RHEBL1 NM_144593ref|Homo sapiens Ras homolog enriched in

brain like 1 (RHEBL1), mRNA-0.5070915 0.00018

7 FZD10 NM_007197ref|Homo sapiens frizzled homolog 10

(Drosophila) (FZD10), mRNA-0.6491815 0.00015

8 RGS16 NM_002928ref|Homo sapiens regulator of G-protein

signaling 16 (RGS16), mRNA0.6270794 0.00012

9 GPR56 NM_201525ref|Homo sapiens G protein-coupled receptor 56

(GPR56), transcript variant 3, mRNA-0.3310189 0.0001

10 ZNF831 NM_178457ref|Homo sapiens zinc finger protein 831

(ZNF831), mRNA0.3905212 0.008

11 TFPI NM_001032281ref|Homo sapiens tissue factor pathway inhibitor

(lipoprotein-associated coagulation inhibitor) (TFPI), transcript variant 2, mRNA

-0.5849317 0.0075

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

2500 BTG1 NM_001731ref|Homo sapiens B-cell translocation gene 1,

anti-proliferative (BTG1), mRNA -0.3668739 0.05

Analisi dei dati




Normalizzazione



Verifica biologica ed interpretazione dei risultati

Verifica biologica ed Interpretazione dei risultati

Validare un sottoinsieme di geni differenzialmente espressi attraverso metodiche alternative (real time RT-PCR)

Analizzare la lista dei geni DE per formulare ipotesi sul fenomeno biologico indagato informazioni sui singoli genisingle-gene analysis reti biochimiche (pathway) di trasmissione del segnale

pathway analysis caratterizzazione ontologicagene ontology analysis

Interpretazione biologica e single gene analysis

Rank GeneSymbolAccession Number

(Transcript)Description

Differential expression (Up- or Down-regulation)

P-value

1 DUSP1 NM_004417ref|Homo sapiens dual specificity phosphatase 1

(DUSP1), mRNA0.7606655 0.0004

2 SRGAP1 BC029919gb|Homo sapiens SLIT-ROBO Rho GTPase

activating protein 1, mRNA1.0329521 0.00038

3 HES1 NM_005524ref|Homo sapiens hairy and enhancer of split 1,

(Drosophila) (HES1), mRNA0.7117039 0.00026

4 SMAD3 U68019gb|Homo sapiens mad protein homolog

(hMAD-3) mRNA, complete cds-0.4286814 0.00021

5 RHEBL1 NM_144593ref|Homo sapiens Ras homolog enriched in

brain like 1 (RHEBL1), mRNA-0.5070915 0.00018

7 FZD10 NM_007197ref|Homo sapiens frizzled homolog 10

(Drosophila) (FZD10), mRNA-0.6491815 0.00015

8 RGS16 NM_002928ref|Homo sapiens regulator of G-protein

signaling 16 (RGS16), mRNA0.6270794 0.00012

9 GPR56 NM_201525ref|Homo sapiens G protein-coupled receptor 56

(GPR56), transcript variant 3, mRNA-0.3310189 0.0001

10 ZNF831 NM_178457ref|Homo sapiens zinc finger protein 831

(ZNF831), mRNA0.3905212 0.008

11 TFPI NM_001032281ref|Homo sapiens tissue factor pathway inhibitor

(lipoprotein-associated coagulation inhibitor) (TFPI), transcript variant 2, mRNA

-0.5849317 0.0075

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

2500 BTG1 NM_001731ref|Homo sapiens B-cell translocation gene 1,

anti-proliferative (BTG1), mRNA -0.3668739 0.05

Banche dati Banche dati NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

- GeneInfo sui geni- Nucleotide Info sui trascritti- PubMedRicerca di pubblicazioni scientifiche di ambito medico- ….

Kegg http://www.genome.jp/kegg/- Kegg GenesInfo sui geni e sui trascritti- Kegg PathwayInfo sulle reti di trasduzione del segnale genico (pathway)

Gene Ontology http://www.geneontology.org/Informazioni sulla classificazione ontologica dei geni\prodotti genici

Per sapere qualcosa in più su un gene: Banche dati per l’annotazione dei geni

Banche dati NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

- GeneInfo sui geni- Nucleotide Info sui trascritti- Homologene Info sugli omologhi- OMIMInfo su malattie Mendeliane- PubMedRicerca di pubblicazioni di ambito medico/scientifico- ….

Banca dati GeneNome (GeneSymbol) del genepuò essere identico per organismi differenti

Banca dati NucleotideCodice del trascrittoè specifico per ogni organismo

“Portale”di informazioni bio-molecolari

GeneCards http://www.genecards.org/

…ma le interazioni?

Interpretazione biologica della lista dei geni differenzialmente espressi: pathway e ontological analyses

Utilizzare le informazioni contenute in:- reti di interazione biochimica e di trasduzione del segnale genomico

(pathway) pathway analysis- Ontologie functional analysis

relative a gruppi di geni differenzialmente espressi per ipotizzare quale sia l’effetto a livello molecolare del fenomeno biologico indagato

Per sapere qualcosa in più sulle interazioni fra geni: Banche dati di pathway e ontologie

Kegg http://www.genome.jp/kegg/ contiene:- Kegg GenesInfo sui geni e sui trascritti- Kegg PathwayInfo sulle reti di trasduzione del segnale genico (pathway)

Gene Ontology http://www.geneontology.org/ contiene:Informazioni sulla classificazione ontologica dei geni\prodotti genici

KEGG http://www.genome.jp/kegg/General pathway Human Pathway

Ogni scatolina rappresenta un gene

rappresenta un’attivazione fra due geni

--| rappresenta una inibizione fra due geni

Gene Ontology http://www.geneontology.org/

Ontologia genica: un vocabolario unico, indipendente dall’organismo, da utilizzare per la descrizione dettagliata dei geni attraverso i loro prodotti genici (proteine)

• possibilità di “trasferimento” delle informazioni funzionali fra organismi differenti a parità di complessità del genoma

• possibilità di “trasferimento” delle informazioni funzionali da organismi “meno complessi” ad organismi “più complessi”

• univocità nella descrizione delle caratteristiche di un gene

Consorzio che si occupa della definizione delle ontologie geniche per la classificazione dei geni attraverso i loro

prodotti genici (Proteine)

Tre ontologie• Funzione molecolare -> funzione biochimica di un prodotto genico

- enzima, lega gli ioni calcio, lega i nucleotidi, etc

• Processo biologico -> processo di co-regolazione all’interno del quale il prodotto genico può essere inserito

- metabolismo di una molecola, glicolisi, ciclo della cellula, apoptosi

• Componente cellulare -> “luogo” della cellula nel quale un determinato prodotto genico può agire

- membrana cellulare, reticolo endoplasmatico

Struttura gerarchica -> DAG (grafi aciclici diretti)

DAGOntologie

Categorie ontologiche

Categorie ontologiche o GO term: tutti i sottolivelli di un’ontologia-> A ciascun GO term è associata una definizione e un insieme di geni che in esso vengono annotati per ciascun organismo

Software per l’analisi di pathway e di ontologie

Pathway Analysis- Pathway-Express

Functional Analysis- Onto-Express

NB: questi software ricevono come input la lista dei geni differenzialmente espressi

PathwayExpress : http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htmImpact Analysis: mappatura dei geni differenzialmente espressi nei

pathway molecolari e valutazione della propagazione della perturbazione della trasduzione del segnale genico provocata dalla variazione di espressione genica

PathwayExpress : http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm

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L’Impact Factor è formato da tre contributi:- Numero di geni differenzialmente espressi mappati in un pathway rispetto al numero di geni che formano il pathwaylivello di rappresentatività della lista dei geni DE nel pathway- Fold-change dei geni differenzialmente espressi mappatientità della perturbazione del pathway provocata dai geni differenzialmente espressi- Posizione dei geni differenzialmente espressi all’interno del pathwayun gene posizionato a monte (p.es. sulla membrana cellulare o su un nodo cui fa capo una sottorete) di una cascata di segnale è “più importante” di un gene posizionato a valle

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OntoExpress: http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm

Molecular FunctionBiological Process

Cellular Component

Over-representation analysis: ci sono dei gruppi di geni differenzialmente espressi rappresentati in maniera “sproporzionata” in qualche GO term?Questa rappresentatività “sproporzionata” è statisticamente significativa rispetto al totale dei geni che vengono annotati in quel GO term?

Info

Ospedale S. Chiara, edificio 43, secondo piano Ospedale S. Chiara, edificio 43, piano terra, c/o

Laboratorio Dott.ssa Pellegrini

[email protected]

Erika Melissari

http://131.114.94.135/lezioni/bioingegneria

Materiale

Iscrizione all’esame e date appelli www.ing.unipi.it

Prenotazione esami

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