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UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PADOVA

Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali

SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN BIOSCIENZE

INDIRIZZO BIOLOGIA CELLULARE

CICLO XXI

Il recettore olfattivo e la formazione dei circuiti nel

sistema olfattivo: meccanismi molecolari associati al

recettore sul cono di crescita.

Direttore della Scuola : Ch.mo Prof. Tullio Pozzan

Supervisore : Dr.ssa Claudia Lodovichi

Dottoranda : Micol Maritan

2

3

Indice

SUMMARY pag. 7 SOMMARIO pag. 9 1. INTRODUZIONE

1.1 Lolfatto. pag. 11

1.2 Il sistema olfattivo principale. pag. 11

1.3 Lepitelio olfattivo. pag. 12

1.4 I recettori olfattivi. pag. 14

1.5 Via di trasduzione del segnale odoroso. pag. 16

1.6 Componenti molecolari della via di trasduzione del segnale pag. 17

odoroso.

1.6.1 Le adenilato ciclasi. pag. 17

1.6.2 Le fosfodiesterasi. pag. 19

1.6.3 I canali associati a nucleotidi ciclici. pag. 20

1.7 Il codice combinatoriale. pag. 21

1.8 Il bulbo olfattivo. pag. 22

1.9 Organizzazione dellepitelio olfattivo e del bulbo olfattivo. pag. 26

1.9.1 Organizzazione dellepitelio olfattivo. pag. 27

1.9.2 Organizzazione del bulbo olfattivo. pag. 27

1.9.3 Formazione dei glomeruli. pag. 30

1.9.4 Colonna olfattiva. pag. 31

1.9.5 Ruolo del RO nella convergenza assonale e nella pag. 32

formazione dei circuiti intra- ed inter-bulbari.

4

1.10 Axon guidance. pag. 34

1.11 Formazione della mappa sensoriale nel sistema olfattivo. pag. 38

1.12 Il progetto di ricerca. pag. 47

1.13 Sensori per il cAMP. pag. 48

1.14 Espressione di Gs e Golf. pag. 51

2. MATERIALI E METODI

2.1 Colture primarie di neuroni sensoriali olfattivi. pag. 53

2.2 Trasfezione di neuroni sensoriali olfattivi. pag. 54

2.3 Imaging di cAMP in neuroni sensoriali olfattivi isolati. pag. 54

2.4 Traslocazione nucleare della subunit catalitica di PKA. pag. 56

2.5 Ca2+ imaging in neuroni sensoriali olfattivi isolati. pag. 56

2.6 Ca2+ imaging ex vivo. pag. 57

2.7 Immunocitochimica per OMP. pag. 58

2.8 Immunoistochimica per Gs. pag. 58

2.9 Stimoli su neuroni sensoriali olfattivi isolati. pag. 59

2.10 Stimoli su preparati di emiteste. pag. 60

2.11 Terreni e soluzioni utilizzate pag.60

5

3. RISULTATI

3.1 Progetto di ricerca pag. 63

3.2 Colture primarie di neuroni sensoriali olfattivi pag. 63

3.3 Trasfezione di neuroni sensoriali olfattivi in coltura pag. 64

3.4 Dinamiche spazio-temporali di cAMP in neuroni pag. 65

sensoriali olfattivi isolati.

3.4.1 Effetto dello ione Cl- sullemissione di fluorescenza pag. 65

di CFP e YFP.

3.4.2 Dinamiche spazio-temporali di cAMP in neuroni pag. 67

sensoriali olfattivi trattati con stimoli farmacologici.

3.4.3 Dinamiche spazio-temporali di cAMP in neuroni pag. 69

sensoriali olfattivi in seguito a stimolazione odorosa.

3.5 Dinamiche spazio-temporali di Ca2+ in neuroni sensoriali pag. 73

olfattivi isolati.

3.6 Traslocazione nucleare della subunit catalitica di PKA pag. 76

3.7 Dinamiche spazio-temporali di Ca2+ ex vivo. pag. 79

3.8 Espressione di Gs pag. 83

4. DISCUSSIONE pag. 87

BIBLIOGRAFIA pag. 93

RINGRAZIAMENTI pag.103

6

7

Summary

A unique feature in the topographic organization of the olfactory system is the

dual role of the odorant receptor (OR). The OR is involved in the transduction

of chemical signals (odors), but it plays also an instructive role in the glomerular

convergence of the olfactory sensory neuron (OSN) axons. The OR is indeed

expressed on the cilia and on the axon termini-growth cone of OSN. The OR is a

G-protein coupled receptor that upon binding of the odorant ligand at the cilia

activates an adenylyl cyclase to synthesize cAMP. The molecular mechanism

underpinning the role of the OR at the axon termini-growth cone remains to be

established. If the OR acts through the generation of cAMP at the growth cone is

not known.

To elucidate the functional properties and intracellular signalling coupled to the

OR on the OSN axon termini, we have investigated the dynamics and the

intracellular distribution of the second messenger cAMP in living OSN of rat in

culture transfected with a genetically encoded, FRET based sensor for cAMP.

Upon treatment with pharmacological agents such as forskolin (a generic activator

of adenylyl cyclases) or IBMX (a non specific inhibitor of phosphodiesterases),

cAMP rises throughout OSN including the axon termini-growth cone. By

analyzing the spatial distribution and the temporal dynamics of cAMP, we found

that the cAMP increase is faster at the neurites than at the soma level.

To assess whether the OR at the axon termini-growth cone is a functional receptor

we challenged the OSN with odor mixture. Odors puff applied to the axon

termini-growth cone produces a rise in cAMP limited exclusively to the growth

cone.

Exposure of OSN to odors stimulates the influx of Ca2+ through cAMP gated

channels (CNG) in the cilia. To assess whether this signalling cascade takes place

at the axon termini-growth cone, we measured Ca2+ signals at the axon termini-

growth cone in OSN loaded with Ca2+ indicator (FURA-2-AM). Odors puff

applied at the growth cone gives rise to a rapid Ca2+ increase limited exclusively

to the axon termini-growth cone.

8

Taken together the present data demonstrate that the OR on the axon termini-

growth cone is a functional receptor, whose activation generates a local rise in

cAMP and Ca2+.

To assess whether the phenomena observed in primary culture of OSN in vitro

take place with analogous dynamics in vivo, we performed Ca2+ imaging

experiments on hemi head explants preparation. In this preparation the mouse

head is cut sagitally and the connections between the olfactory epithelium, the

bulb and the brain are maintained along the medial axis.

OSN were loaded with the Ca2+ indicator Calcium Green dextran and the cells

resulted entirely labeled, from the cilia to the axon termini.

We stimulated labeled glomeruli with pharmacological (forskolin) and with

physiological stimuli (odor mix). In both cases we found a significant increase in

fluorescence, indicating a rise in Ca2+ concentration in the presynaptic terminals at

the glomeruli level.

The influx of Ca2+ is due to cAMP-induced CNG chanell opening, since it is

abolished in the presence of the adenylyl cyclase blocker SQ22536.

We demonstrated that in isolated neurons as in the intact olfactory bulb the

olfactory receptor at the axon termini-growth cone is functional and coupled to

localized cAMP and Ca2+ increases.

9

Sommario

Lelemento caratterizzante lorganizzazione topografica del sistema olfattivo il

duplice ruolo del recettore olfattivo (RO). Esso coinvolto nella trasduzione del

segnale odoroso, ma svolge anche un ruolo istruttivo nella convergenza degli

assoni dei neuroni sensoriali olfattivi (NSO) al corretto glomerulo target a livello

del bulbo olfattivo. Questa duplice funzione corroborata dalla duplice

localizzazione di tale recettore: esso infatti presente sia sulle cilia dei NSO sia

sullassone terminale-cono di crescita.

Il RO un recettore accoppiato a proteine G, il quale, in seguito al legame

dellodore alle cilia, induce lattivazione di unadenilato ciclasi, che porta alla

sintesi di cAMP.

I meccanismi molecolari che sottendono al ruolo del recettore olfattivo sul cono di

crescita rimangono tuttora sconosciuti. Non noto se il RO in questa posizione sia

attivo e se agisca tramite la sintesi di cAMP.

Per studiare le propriet funzionali ed il signalling intracellulare associato al

recettore olfattivo sul cono di crescita abbiamo analizzato le dinamiche temporali

e la distribuzione intracellulare del secondo messaggero cAMP in neuroni

sensoriali olfattivi di ratto in coltura, trasfettati con una sonda geneticamente

codificata per il cAMP, basata su FRET.

In seguito al trattamento con stimoli farmacologici (forscolina, un generico

attivatore delle adenilato ciclasi, ed IBMX, un inibitore aspecifico delle

fosfodiesterasi), si registra un incremento di cAMP nellintero neurone sensoriale

olfattivo, compreso lassone terminale-cono di crescita. Analizzando la

distribuzione spaziale e le dinamiche temporali del segnale cAMP, abbiamo

osservato che lincremento di cAMP si verifica pi velocemente nei neuriti

rispetto al soma.

Per stabilire se il RO a livello del terminale assonico-cono di crescita un

recettore funzionale, abbiamo stimolato i NSO con una miscela di odori.

Lapplicazione diretta di un puff odoroso allassone terminale-cono di crescita

induce un aumento di cAMP localizzato esclusivamente al cono di crescita.

10

Lesposizione dei NSO agli odori porta ad un influsso di Ca2+ attraverso i canali

CNG nelle cilia.

Per stabilire se la stessa cascata di signalling si verifichi allassone terminale-cono

di crescita, abbiamo misurato il segnale Ca2+ a livello del terminale assonico in

NSO caricati con un indicatore del Ca2+ (FURA-2-AM). Un puff di odori

applicato allassone terminale-cono di crescita induce un rapido aumento di Ca2+

circoscritto esclusivamente al terminale assonico.

I dati ottenuti dimostrano che il recettore olfattivo allassone terminale-cono di

crescita un recettore funzionale, la cui attivazione genera incrementi locali di

cAMP e di Ca2+.

Per valutare se i risultati ottenuti in vitro non fossero dovuti alle condizioni di

coltura ed allisolamento dei neuroni, ma fossero presenti nel bulbo olfattivo

intatto, abbiamo effettuato esperimenti di imaging del Ca2+ sul sistema olfattivo

integro, utilizzando particolari preparati, definiti espianti di emiteste. In questi

preparati la testa di un topo tagliata sagittalmente e le connessioni tra lepitelio

olfattivo, il bulbo ed il cervello sono mantenute lungo lasse mediale. I neuroni

sensoriali olfattivi sono caricati con un indicatore del Ca2+ (Calcium Green

dextran) e le cellule risultano marcate completamente, dalle cilia fino al terminale

assonico.

I glomeruli marcati sono stati stimolati con stimoli farmacologici (forscolina) e

fisiologici (mix di odori). In entrambi i casi si osservato un significativo

aumento nella fluorescenza, indicante un incremento della concentrazione di Ca2+

nei terminali pre-sinaptici a livello dei glomeruli. Linflusso di Ca2+ dovuto

allapertura dei canali CNG indotta dal cAMP, poich il segnale Ca2+ abolito in

presenza dellinibitore delle adenilato ciclasi SQ22536.

Abbiamo quindi dimostrato che sia in neuroni sensoriali olfattivi isolati sia nel

bulbo olfattivo integro il recettore olfattivo al terminale assonico-cono di crescita

un recettore funzionale ed accoppiato ad aumenti locali di cAMP e Ca2+.

11

1. Introduzione

1.1 Lolfatto.

I mammiferi sono in grado di riconoscere e distinguere migliaia di odori diversi

presenti nellambiente anche a bassissime concentrazioni, che influenzano il loro

comportamento e forniscono informazioni essenziali per la loro sopravvivenza. Il

sistema olfattivo coinvolto infatti in molteplici meccanismi fisiologici, quali

risposte emozionali (ansia, paura, piacere), funzioni riproduttive (comportamenti

sessuali e materni) e relazioni sociali (riconoscimento di individui della stessa

specie o famiglia, delle prede e dei predatori). Per svolgere queste funzioni cos

diverse i mammiferi possiedono due organi olfattivi anatomicamente e

funzionalmente distinti. Il sistema olfattivo principale, costituito dallepitelio

olfattivo, dal bulbo olfattivo principale e dalle aree corticali e non, correlate,

permette il riconoscimento di molecole odorose volatili. Il sistema olfattivo

accessorio, costituito dallorgano vomeronasale, dal bulbo olfattivo accessorio e

dalle aree corticali e non, correlate, invece specializzato nel rilevamento dei

feromoni, sostanze secrete da un organismo, che regolano risposte fisiologiche e

comportamentali degli individui della stessa specie.

In questa sede ci limiteremo a trattare il sistema olfattivo principale.

1.2 Il sistema olfattivo principale.

La percezione olfattiva ha inizio nei neuroni sensoriali olfattivi (NSO) presenti

nellepitelio nasale. Questi neuroni trasmettono poi il segnale al bulbo olfattivo

principale e da qui passa alla corteccia cerebrale. Iniziamo quindi a trattare pi

dettagliatamente i diversi componenti del sistema olfattivo principale.

12

1.3 Lepitelio olfattivo.

L epitelio olfattivo un epitelio colonnare pseudostratificato, che riveste strutture

cartilaginee convolute dette turbinati, poste nella parte posteriore delle cavit

nasali. Lepitelio olfattivo costituito da tre tipi cellulari principali: i neuroni

sensoriali olfattivi, le cellule sustentacolari di sostegno e le cellule staminali basali

(1,2). I neuroni sensoriali olfattivi rappresentano il 70-80% della popolazione

cellulare totale dellepitelio olfattivo e rigenerano costantemente durante la vita

dellorganismo con unemivita di circa 60-90 giorni. Essi hanno una tipica

morfologia bipolare, con un unico dendrite non arborizzato, che si porta verso la

superficie dellepitelio, a contatto con le cavit nasali, e lassone amielinico che

proietta al bulbo olfattivo nel cervello (fig.1). Il dendrite termina con

unespansione globosa, detta knob, da cui si dipartono numerose cilia, estensioni

filiformi che protrudono nella cavit nasale e su cui si trovano i recettori olfattivi

(RO).

Fig.1: rappresentazione di un neurone sensoriale olfattivo. E possibile osservare la tipica morfologia bipolare: un unico dendrite non arborizzato che termina con unespansione globosa (knob), da cui dipartono numerose cilia, ed un unico assone. (3)

Le cilia sono immerse nel muco secreto dalle cellule sustentacolari dellepitelio

olfattivo e dalle ghiandole di Bowman (fig.2). Si ritiene che le specifiche

caratteristiche biochimiche del muco siano rivolte a creare lambiente ideale per la

percezione degli odori. Il muco contiene proteine leganti gli odori (olfactory

binding protein, OBP), che sono secrete dalla ghiandola nasale laterale; esse

hanno la funzione di legare gli odoranti idrofobici, permettendo il loro passaggio

13

alla soluzione acquosa che costituisce il muco. Sono presenti pi forme di OBP

nellepitelio nasale, nel ratto ne sono state identificate quattro (1).

Gli odori si dissolvono nel muco dellepitelio olfattivo per raggiungere e legarsi ai

recettori olfattivi presenti sulle cilia ed innescare una catena di segnali

intracellulari, che culmina con la generazione del potenziale dazione e la

trasmissione del segnale al bulbo olfattivo nel cervello.

Le cellule sustentacolari di sostegno svolgono diverse funzioni: isolano

elettricamente i neuroni sensoriali olfattivi, secernono le componenti del muco

che riveste la superficie dellepitelio olfattivo e fattori di crescita importanti per lo

sviluppo dei neuroni sensoriali olfattivi e contengono enzimi detossificanti che

inattivano gli odori.

Le cellule basali di tipo globoso, che costituiscono la lamina basale al di sotto

dellepitelio olfattivo, rappresentano i precursori dei neuroni sensoriali olfattivi.

Fig.2: rappresentazione dellepitelio olfattivo. Si distinguono i tre tipi cellulari: i neuroni sensoriali olfattivi, le cui cilia sono esposte verso il lume della cavit nasale e sono immerse nel muco, le cellule di supporto sustentacolari, e le cellule staminali basali. Sulle cilia dei NSO sono espressi i recettori olfattivi che legano le molecole odorose e originano la cascata di trasduzione del segnale odoroso. (4)

14

1.4 I recettori olfattivi

Gli odori sono piccole molecole organiche, che si differenziano tra loro per

numerosi parametri, tra cui la struttura stereochimica della catena idrocarbonica, il

tipo e la posizione dei gruppi funzionali laterali, le dimensioni e la carica. La

percezione di un dato odore dipende dalla struttura della molecola odorosa, ma

influenzata anche da altri parametri, quali la concentrazione della sostanza

odorosa e la variabilit soggettiva. Per esempio la molecola di indolo viene

percepita come un odore putrido ad alte concentrazioni, mentre a basse

concentrazioni come un odore floreale. Landrostenedione, invece, a basse

concentrazioni percepito come odore di urina da alcuni individui, come odore

mediamente piacevole da altri e non percepito per niente da altri ancora (5).

Le molecole odorose vengono riconosciute e legate a livello delle cilia dei NSO

dai recettori olfattivi (RO). Lesistenza di tali recettori stata dimostrata nel 1991

da R.Axel e L.Buck (6) , valendo loro il premio Nobel per la Medicina nel 2004.

Questi recettori appartengono ad una grande famiglia multigenica che nei

mammiferi comprende pi di 1000 membri, arrivando ad occupare fino al 2% del

genoma nel topo (6,7). I geni codificanti per i RO sono raggruppati in cluster

presenti nella maggior parte dei cromosomi (7,8). Da un punto di vista evolutivo,

il numero degli pseudogeni nellambito della famiglia dei RO andato

aumentando. Essi sono infatti solo il 20% nei roditori, che contano quindi un

repertoire molto pi vasto rispetto ai mammiferi superiori, specie luomo, in cui

circa il 60% dei geni codificanti per i RO sono pseudogeni (7-10). Lespressione

di questi geni ristretta ai neuroni sensoriali olfattivi maturi ed inizia durante la

vita embrionale, prima che lassone raggiunga il bulbo olfattivo (4) .Per

distinguere i NSO maturi da quelli immaturi viene utilizzata lolfactory marker

protein (OMP). Questa una proteina citoplasmatica, di funzione non nota,

espressa tipicamente ed esclusivamente dai neuroni sensoriali olfattivi maturi.

Essa inizia ad essere espressa intorno al giorno embrionale 13-14 (E13-E14) nel

topo e al giorno 18 (E18) nel ratto e viene considerata un marker caratteristico dei

NSO maturi (11,12). Ogni neurone olfattivo esprime un solo tipo di RO, cosicch

ciascun neurone sensoriale olfattivo distinto funzionalmente ed identificato

15

molecolarmente dal tipo di recettore espresso, dando luogo alla regola: un

recettore-un neurone (13-15).

I RO sono espressi in modo monoallelico: in ciascun NSO lespressione del

recettore olfattivo deriva esclusivamente da un allele (15). Questo meccanismo

sembra assicurare che un solo tipo di recettore sia presente in ogni neurone

sensoriale.

Da un punto di vista strutturale, la regione codificante dei RO lunga circa 1kb ed

priva di introni. I RO appartengono alla famiglia dei recettori associati a

proteine G e ne condividono le caratteristiche principali, quali la presenza di sette

domini transmembrana legati da loop intracellulari ed extracellulari di varia

lunghezza e numerose sequenze brevi altamente conservate. Tuttavia presentano

anche tratti peculiari dei recettori olfattivi, quali un secondo loop extracellulare

insolitamente lungo con residui di cisteina altamente conservati. Il grado di

omologia nella sequenza dei RO varia tra il 40 ed il 96%. Da notare la presenza di

regioni ipervariabili, in cui la sequenza fortemente diversa tra un recettore e

laltro, nella terza, quarta e quinta regione transmembrana. Nei modelli

tridimensionali di recettori associati a proteine G, questi tre tratti formano una

tasca che molto probabilmente costituisce il sito di legame per le molecole

odorose (fig.3) (4). Nei neuroni sensoriali olfattivi sono espressi molteplici tipi di

proteine G. In particolare sono presenti due tipi di proteine G stimolatorie, Gs e

Golf (G olfactory protein), ciascuna capace di attivare ladenilato ciclasi (16). Nei

NSO maturi, Golf maggiormente espressa ed associata al RO posto sulle cilia nel

processo di trasduzione del segnale odoroso. Topi knock out per Golf presentano

infatti una drammatica riduzione delle risposte agli odori. Gs, invece, espressa

soprattutto nel corso dello sviluppo embrionale e nelle fasi precoci di sviluppo

post-natale (17).

16

Fig.3: struttura di un recettore olfattivo. I residui aminoacidici pi conservati sono rappresentati nelle tonalit del blu, mentre quelli caratterizzati da una maggiore variabilit sono rappresentati nelle tonalit del rosso (4).

1.5 Via di trasduzione del segnale odoroso.

La cascata di trasduzione del segnale attivata dal legame delle molecole odorose

ai recettori olfattivi presenti sulle cilia dei NSO ben nota e coinvolge come

principali secondi messaggeri il cAMP ed il Ca2+ (18-20).

Una volta entrati nella cavit nasale, gli odori si disciolgono nel muco che ricopre

la superficie dellepitelio olfattivo e si legano ai recettori olfattivi sulle cilia dei

neuroni sensoriali olfattivi. In seguito a tale legame si ha lattivazione della

proteina G stimolatoria Golf (21), che a sua volta attiva ladenilato ciclasi di tipo 3

(AC3) (22), portando ad un incremento della concentrazione di cAMP allinterno

della cellula. Il cAMP si lega alla porzione intracellulare dei canali CNG,

causandone lapertura (20). Questi canali permettono lingresso sia di Ca2+ che di

Na+. Laumento della concentrazione di Ca2+ nelle cilia in seguito allapertura dei

canali CNG regola sia lattivazione sia la desensitizzazione dei neuroni sensoriali

olfattivi. Infatti laumentata concentrazione di Ca2+ induce una corrente uscente di

Cl- e quindi unulteriore depolarizzazione, che porta allinsorgenza di un

potenziale dazione (23,24). Il Ca2+ ha anche un effetto di feedback negativo a

vari livelli della catena di trasduzione del segnale. Il Ca2+, legando la calmodulina,

forma un complesso Ca2+-calmodulina (Ca2+-CaM) che si associa direttamente ai

canali CNG, riducendone laffinit per il cAMP e quindi la probabilit di apertura

17

dei canali stessi (fig.4) (25). Il Ca2+ ha inoltre unazione inibitoria sulladenilato

ciclasi, bloccando la sintesi di cAMP, ed unazione attivatoria sulle fosfodiesterasi

di tipo 1C2, aumentando la degradazione di cAMP.

Fig.4: trasduzione del segnale odoroso nelle cilia dei neuroni sensoriali olfattivi (26). In seguito al

legame con la molecola odorosa, il recettore olfattivo attiva la proteina Golf che a sua volta attiva

ladenilato ciclasi di tipo 3. Lincremento di cAMP che ne segue porta allapertura dei canali

CNG, con conseguente influsso di Ca2+ e Na+. Laumento di Ca2+ permette lapertura dei canali

per il Cl- ,che porta alla fuoriuscita di Cl- dalla cellula ed ulteriore depolarizzazione.

1.6 Componenti molecolari della via di trasduzione del segnale

odoroso.

Diversi studi hanno permesso di identificare i componenti molecolari della via di

signalling attivata dal recettore olfattivo sulle cilia dei NSO, quali: le adenilato

ciclasi (AC), le fosfodiesterasi (PDE) e i canali associati ai nucleotidi ciclici

(CNG). Analizziamo ora pi dettagliatamente i vari elementi della via di

trasduzione del segnale odoroso.

1.6.1 Le adenilato ciclasi.

Le adenilato ciclasi sono delle ATP-pirofosfato liasi che convertono lATP in

adenosina monofosfato ciclico (cAMP) e pirofosfato. Al momento sono note 10

18

isoforme differenti di AC, di cui nove associate alla membrana (AC1-9), mentre la

decima una proteina solubile (27). Tutte le isoforme associate alla membrana

sono attivate dal legame con la proteina Gs, mentre ladenilato ciclasi solubile

attivata da HCO3- (28) e da Ca2+ (29). La tabella 1.1 riporta alcune propriet delle

AC di membrana.

Tabella 1.1: propriet regolatorie delle adenilato ciclasi associate alla membrana (27). Le AC di

membrana sono regolate da molteplici effettori, tra i quali i principali sono: le proteine G (Gs,

G, Gi, z, o) la proteine chinasi A e C (PKA e PKC rispettivamente), la calmodulina (CaM) e le

chinasi dipendenti da questa (CaMK). Vi sono poi altri regolatori secondari, come: RGS2

(regolatore del signalling delle proteine G); PAM (proteina associata a Myc); Ric8a (fattore

scambiatore di nucleotidi guaninici per le proteine G); Snapin: (membro del complesso

SNAP25/Snare nei neuroni ippocampali); PP2a (proteina fosfatasi 2a).

Le adenilato ciclasi associate alla membrana possono essere classificate in quattro

gruppi principali, definiti in base alle loro propriet regolatorie. Il gruppo I

formato dalle AC stimolate dal Ca2+, il gruppo II comprende le AC stimolate dalle

subunit delle proteine G; il gruppo III consiste delle AC inibite da Gi/Ca2+,

mentre lultimo gruppo rappresentato dalla AC9, che insensibile alla

forscolina, un attivatore generico delle altre AC.

Nei NSO stata dimostrata la presenza delle adenilato ciclasi 2, 3 e 4 (30,31). Le

isoforme 2 e 4 sono espresse a livello delle cilia; dati recenti mostrano che l AC3

espressa anche a livello dellassone terminale ed in piccole concentrazioni,

appena rilevabili con saggi di immunoistochimica, nel soma (32). E stato

dimostrato che ladenilato ciclasi 3 accoppiata ai recettori olfattivi sulle cilia ed

quindi fondamentale per la trasduzione del segnale olfattivo. Infatti, topi knock

19

out per lAC3 non mostrano risposte elettrofisiologiche ad unampia gamma di

odori. Inoltre si osservato che in queste linee di animali transgenici la mappa

sensoriale fortemente alterata (vedi 1.11) questi risultati indicano che lAC3

necessaria per la trasduzione del segnale odoroso a livello delle cilia ed inoltre

svolge un ruolo nella formazione della mappa sensoriale a livello dellassone

terminale.

1.6.2 Le fosfodiesterasi.

Le fosfodiesterasi sono fosfoidrolasi che catalizzano lidrolisi dei nucleotidi

ciclici cAMP e cGMP. Controllando la velocit di degradazione di questi

importanti secondi messaggeri, le PDE giocano un ruolo critico nel signalling

intracellulare. Esistono 11 famiglie differenti di PDE, ciascuna comprendente a

sua volta varie isoforme (33-35).

Tabella 1.2: classificazione delle 11 famiglie di fosfodiesterasi (34). Le PDE 4, 7 e 8 sono

specifiche per il cAMP, mentre le PDE 5, 6 e 9 idrolizzano il cGMP. Le PDE 1, 2, 3, 10 e 11

presentano infine una doppia specificit per entrambi i nucleotidi ciclici. Alcune famiglie sono

regolate dal cGMP, altre dal complesso Ca2+-calmodulina, altre ancora da PKA o PKG. IBMX

un inibitore farmacologico generico delle PDE, il Rolipram un inibitore specifico per le PDE4.

Le transducine sono proteine G specifiche della retina.

20

Come si pu osservare in tabella 1.2, le famiglie di fosfodiesterasi presentano

specificit di substrato (cAMP e cGMP) diverse e differenti propriet regolatorie.

Si possono distinguere tre gruppi principali, costituiti dalle famiglie di enzimi che

idrolizzano specificamente il cAMP, il cGMP o che presentano una doppia

specificit. Inoltre le PDE si differenziano per le loro propriet regolatorie; tra i

principali modulatori della loro attivit troviamo il cGMP stesso (che pu fungere

sia da attivatore che da inibitore), il complesso Ca2+-calmodulina e le proteine

chinasi PKA e PKG.

Nei NSO sono stati identificati tre tipi di fosfodiesterasi:1, 2 e 4. Le PDE1

presentano alti livelli di espressione nelle cilia, mentre le PDE2 sono espresse

nelle cilia, nel soma e negli assoni; le PDE4, infine, localizzano nel knob

dendritico, nel soma e negli assoni (1,36).

Le fosfodiesterasi di tipo 1 sono regolate dal Ca2+ via calmodulina ed idrolizzano

sia il cAMP che il cGMP, anche se la specificit varia a seconda delle isoforme.

Nei NSO la forma predominante la PDE1C2, che presenta affinit simili per

entrambi i nucleotidi ciclici (37).

Le PDE2 sono anchessi enzimi a doppia specificit, che risultano stimolati

allostericamente dal legame del cGMP.

Le PDE4, infine, sono specifiche esclusivamente per il cAMP. E stato dimostrato

che la fosforilazione da parte di PKA aumenta lattivit delle PDE4 (38).

1.6.3 I canali associati a nucleotidi ciclici.

I canali associati a nucleotidi ciclici (CNG) sono stati identificati inizialmente nei

bastoncelli e nei coni della retina (39).

I CNG presenti nelle cilia dei NSO sono canali cationici permeabili sia al Ca2+ che

al Na+. Essi presentano un elevato grado di omologia con i CNG della retina (pi

del 80% di identit di sequenza aminoacidica) e sono strutturalmente omologhi. I

CNG olfattivi sono tetrameri costituiti da tre diverse subunit: 2 A2, 1 A4 e 1

B1b. Le ultime due subunit svolgono un ruolo modulatorio: aumentano la

sensibilit al cAMP e permettono la regolazione via Ca2+-calmodulina (fig.5). La

struttura di ciascuna subunit simile a quella dei canali cationici dipendenti dal

potenziale: esse presentano sei domini transmembrana, con un loop tra il quinto

21

ed il sesto dominio che forma il poro centrale del canale, e le regioni N- e C-

terminali intracellulari (40,41).

Fig.5: rappresentazione dei canali CNG olfattivi e delle tre subunit che li formano. In blu sono indicati i siti di legame per il cAMP, mentre in giallo ed in nero i siti di legame per la calmodulina (40).

I CNG del sistema olfattivo presentano unaffinit maggiore per il cGMP rispetto

al cAMP come mostrano i valori di kM (concentrazione richiesta per raggiungere

met dellattivazione massima): 3 M per il cAMP e 1.6 M per il cGMP (42).

Laffinit per i ligandi modulata dal legame Ca2+-CaM, da fosforilazione e da

cationi bivalenti (43,44).

1.7 Il codice combinatoriale

Abbiamo precedentemente detto che ogni NSO esprime un solo tipo di RO. Il

recettore espresso definisce il molecular receptive range del neurone, cio

determina il range di odori che quel singolo NSO in grado di legare e

riconoscere (5). Ogni recettore olfattivo riconosce una specifica caratteristica

strutturale della molecola odorosa (odotopo). Le due principali classi di odotopi

che differenziano i diversi odori sono: la struttura stereochimica della catena

idrocarbonica, il tipo e la posizione dei gruppi funzionali laterali. Poich ogni

molecola odorosa pu presentare al suo interno pi odotopi, ciascun odore potr

essere riconosciuto da diversi recettori olfattivi che riconoscono i diversi epitopi

di cui costituito. Ogni singolo RO per in grado di riconoscere molecole

odorose diverse che presentano lo stesso odotopo. In questo modo ciascun odore

sar codificato dallattivazione di una particolare combinazione di recettori

olfattivi, ma ogni singolo recettore pu essere una delle componenti del codice di

22

diversi odori. Questo viene definito codice combinatoriale e permette al sistema

olfattivo di riconoscere un numero enorme di odori (fig.6).

Fig.6: modello di codice combinatoriale. A sinistra sono rappresentate varie molecole odorose con i vari odotopi raffigurati in colori diversi. A destra sono rappresentati nei corrispondenti colori i RO attivati da tali epitopi. Lidentit dei diversi odori codificata perci da diverse combinazioni di recettori. Tuttavia ciascun recettore pu fungere da componente del codice combinatoriale per odori diversi. Dato il numero immenso di possibili combinazioni di RO, questo schema permette di discriminare un numero enorme di diversi odori (5).

1.8 Il bulbo olfattivo

Il bulbo olfattivo costituisce la prima stazione di ritrasmissione dellinformazione

olfattiva. Come altre aree cerebrali presenta tre tipi di neuroni: i neuroni afferenti,

i neuroni efferenti e gli interneuroni.

I neuroni sensoriali olfattivi costituiscono le afferenze sensoriali del bulbo

olfattivo. Lassone dei NSO un processo sottile (0.2 m di diametro),

amielinico, non ramificato, che dopo aver attraversato losso cribriforme

raggiunge il bulbo olfattivo (fig.7).

23

Fig.7: rappresentazione di una sezione sagittale di naso di topo (4). La freccia indica il punto di ingresso dellaria e delle molecole odorose. Lepitelio olfattivo (OE) riveste le strutture dei turbinati ed suddiviso in quattro zone, rappresentate nei diversi colori. Gli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi proiettano al bulbo olfattivo (MOB, main olfactory bulb), dove formano i glomeruli.

Il bulbo olfattivo fa parte del prosencefalo ed costituito da due strutture ovoidali

simmetriche che si trovano immediatamente sopra le cavit nasali. Esso ha una

caratteristica struttura laminare, suddivisa in: strato del nervo olfattivo (ONL),

strato glomerulare (GL), strato plessiforme esterno (EPL), strato delle cellule

mitrali (MCL), strato plessiforme interno (IPL) e strato delle cellule dei granuli

(GCL) (fig.8). Ognuno di tali strati contiene tipi cellulari diversi.

Fig.8 : immagine di sezione di bulbo olfattivo in seguito a colorazione di Nissl. E possibile

osservare i diversi strati che caratterizzano il bulbo olfattivo: lo strato dei glomeruli (GL); lo strato

plessiforme esterno (EPL), che contiene i corpi cellulari delle cellule tufted; lo strato delle cellule

mitrali (MCL); lo strato plessiforme interno (IPL) e lo strato delle cellule dei granuli (GCL).

24

Lo strato del nervo olfattivo formato dagli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi,

che attraversano la lamina basale dellepitelio olfattivo e losso cribriforme per

raggiungere infine il bulbo olfattivo.

Nello strato glomerulare gli assoni dei NSO stabiliscono sinapsi eccitatorie,

glutamatergiche, con i dendriti delle cellule post-sinaptiche del bulbo olfattivo

(cellule mitrali, tufted e periglomerulari), dando origine ai glomeruli. I glomeruli

sono strutture sferiche di neuropilo, di dimensioni variabili tra gli 80 ed i 160 m

di diametro (nel topo da 30 a 50 m, nel coniglio e nel gatto da 100 a 200 m),

disposte su tutta la superficie esterna dei bulbi. Sono costituiti dalla ramificazione

terminale degli assoni dei NSO, che contraggono sinapsi con i dendriti delle

cellule post-sinaptiche del bulbo, nonch con le cellule periglomerulari, poste

tutto intorno ai singoli glomeruli. I glomeruli sono inoltre circondati dalle cellule

gliali (45,46).

I neuroni post-sinaptici del bulbo sono rappresentati dalle cellule mitrali e dalle

cellule tufted. Queste cellule costituiscono la via efferente del bulbo olfattivo e

formano il tratto olfattivo laterale. Le cellule mitrali sono neuroni glutamatergici

che presentano i corpi cellulari disposti a formare un unico strato, lo strato delle

cellule mitrali. I corpi cellulari delle cellule tufted si trovano invece a diversi

livelli nello strato plessiforme esterno ed in base a tale posizione vengono distinte

in esterne, medie ed interne. Sia le cellule mitrali che le cellule tufted presentano

un unico dendrite primario, che penetra in un unico glomerulo nel quale forma

unestesa arborizzazione. Presentano inoltre dendriti secondari che decorrono

orizzontalmente nellEPL e contraggono sinapsi dendro-dendritiche con le cellule

dei granuli. Gli assoni delle cellule mitrali e delle cellule tufted si portano fuori

dal bulbo olfattivo, formando il tratto laterale olfattorio, che trasmette

linformazione olfattiva ad altre stazioni cerebrali. Le cellule tufted esterne

rientrano negli interneuroni. Anche da un punto di vista biochimico, le cellule

tufted si presentano come una popolazione eterogenea, che si avvale di diversi

neurotrasmettitori quali la colecitochinina (CCK), il GABA, il fattore rilasciante

la corticotropina (CRF), il polipeptide intestinale vasoattivo (VIP) (45,46).

Al di sotto dello strato delle cellule mitrali si trova lo strato plessiforme interno,

molto sottile, costituito da pochi corpi cellulari, prevalentemente appartenenti a

cellule ad assone corto e cellule dei granuli. Gli interneuroni del bulbo sono

25

rappresentati dalle cellule periglomerulari e dalle cellule dei granuli. Le cellule

periglomerulari (PG) includono diversi tipi di cellule, quali le cellule

periglomerulari, le cellule ad assone corto e le cellule tufted esterne. Le cellule PG

contraggono sinapsi con i dendriti delle cellule mitrali e delle cellule tufted, oltre

che con i terminali assonali dei NSO. Le cellule PG sono una popolazione

eterogenea non solo morfologicamente, ma anche biochimicamente. Esse infatti

esprimono diversi neurotrasmettitori quali: il GABA, lossido nitrico, il NADPH,

le dopamine ed il neuropeptide Y. Pertanto, le sinapsi che le cellule PG formano

con le cellule pre- e post-sinaptiche del bulbo non hanno solamente funzione

inibitoria, ma in senso pi ampio modulatoria.

Le cellule dei granuli sono neuroni gabaergici, il cui corpo cellulare si trova nello

strato dei granuli, che immediatamente al di sotto dello strato plessiforme

interno, ed occupa la parte centrale del bulbo olfattivo. Esse formano sinapsi

inibitorie dendro-dendritiche con i dendriti secondari delle cellule mitrali e delle

cellule tufted. Mancano di assone (fig.9).

Le cellule PG e le cellule dei granuli rigenerano costantemente durante tutta la

vita dellindividuo. Esse originano dalla zona sub ventricolare (SVZ) intorno ai

ventricoli laterali e da qui si portano attraverso uno specifico processo di

migrazione lungo la rostral migratory stream (RMS). Una volta giunte al bulbo

olfattivo, migrano radicalmente e si differenziano in interneuroni bulbari (45,46).

26

Fig.9: diagramma dei circuiti base che riassume lorganizzazione sinaptica del bulbo olfattivo. Due moduli (rosa e blu) rappresentano due diversi tipi di RO. Le cellule mitrali (M) e tufted (T) sono i neuroni efferenti del bulbo, le cellule dei granuli (Gr) e le cellule periglomerulari (PG) sono interneuroni locali (47).

1.9 Organizzazione dellepitelio olfattivo e del bulbo olfattivo.

La specificit delle connessioni tra i neuroni pre- e post-sinaptici essenziale per

il normale funzionamento del sistema nervoso centrale. Lo sviluppo ed il

mantenimento dei circuiti neuronali regolato da molecole espresse in tempi e

sedi specifici nel corso dello sviluppo e da meccanismi dipendenti dallattivit

neuronale.

Nei sistemi sensoriali, i neuroni sensoriali presenti nelle strutture anatomiche pi

periferiche sono ordinati in maniera tale che i neuroni che decodificano

caratteristiche simili dello stimolo sono disposti secondo un preciso ordine

spaziale. I neuroni sensoriali a loro volta indirizzano il loro assone in specifici

target del sistema nervoso centrale, mantenendo i rapporti spaziali presenti nelle

strutture periferiche, dando luogo a mappe topografiche. Le mappe topografiche

permettono di tradurre il mondo esterno in una rappresentazione interna, in

termini di rappresentazione neuronale.

27

Il sistema olfattivo si differenzia per varie ragioni da altri sistemi sensoriali.

Innanzitutto privo di unorganizzazione spaziale periferica. Inoltre i neuroni

sensoriali rigenerano costantemente nel corso della vita dellindividuo, per cui i

circuiti neuronali si riformano continuamente.

1.9.1 Organizzazione dellepitelio olfattivo.

Nellepitelio olfattivo i neuroni sensoriali non sono disposti secondo un preciso

ordine spaziale, ma sono distribuiti in modo pressocch casuale. Analisi della

distribuzione spaziale dei neuroni esprimenti recettori olfattivi diversi, tramite

ibridazione in situ, hanno rivelato che i NSO che esprimono un dato recettore

sono ristretti ad una delle quattro zone (in direzione dorso-ventrale) in cui viene

suddiviso lepitelio olfattivo. Tuttavia, allinterno di ciascuna zona, i neuroni

esprimenti recettori diversi sono frammisti fra loro in modo casuale (14,48).

1.9.2 Organizzazione del bulbo olfattivo.

La situazione completamente diversa a livello del bulbo olfattivo, dove

presente una mappa topografica ben precisa ed altamente conservata. Le

proiezioni assonali di neuroni esprimenti lo stesso recettore convergono con

squisita precisione a formare glomeruli in specifiche posizioni sul lato mediale e

sul lato laterale di ciascun bulbo olfattivo.

Questo stato dimostrato con metodiche di ibridazione in situ da Ressler (49) e da

Vassar (50). La disposizione dei glomeruli riceventi fibre esprimenti lo stesso RO

risulta simmetrica nei due bulbi ed costante in animali diversi della stessa

specie. Fu avanzata quindi lipotesi che gli odori possano essere codificati da un

pattern specifico di glomeruli attivati. Questo dato sar poi confermato da

esperimenti di imaging in vivo condotti in studi successivi (51,52).

Nel 1996 Mombaerts e coll. furono in grado di visualizzare i singoli neuroni

sensoriali olfattivi, e quindi la convergenza dei singoli assoni, grazie

allelaborazione di una nuova strategia genetica (53).

Questa metodica molecolare prevede la modifica del locus del gene codificante

per i recettori olfattivi, in modo che tale locus codifichi per un RNA messaggero

bicistronico, per cui il RO co-espresso con uno specifico marker (tau-LacZ). La

sostituizione del gene endogeno con il costrutto si ottiene mediante

28

ricombinazione omologa, per cui alla fine si ottengono linee di topi geneticamente

modificate, in cui uno specifico recettore co-espresso con il marker. Un esempio

dato dal recettore P2. Nei topi geneticamente modificati (P2-IRES-tau-LacZ) il

recettore P2 co-espresso con tau-LacZ; pertanto, in seguito a colorazione con X-

gal, i neuroni esprimenti P2 risultano marcati nella loro interezza, dalle cilia sino

alle ramificazioni dellarborizzazione terminale assonica (fig.10). In questo modo

tali neuroni possono essere facilmente identificati nellepitelio e nel bulbo. Inoltre

possibile seguire il destino di ogni singola fibra esprimente un dato recettore

olfattivo e quindi visualizzare la mappa sensoriale del bulbo olfattivo. Questi

esperimenti hanno inoltre confermato quanto osservato precedentemente da

Ressler e Vassar tramite le ibridazioni in situ. I neuroni esprimenti il recettore P2

proiettano a due glomeruli posti uno sul lato mediale ed uno sul lato laterale di

ciascun bulbo olfattivo. I glomeruli P2 presentano una struttura omogenea,

risultando composti esclusivamente da fibre esprimenti solo il recettore P2.

Fig.10: immagine dei turbinati e del lato mediale del bulbo di un topo ingegnerizzato P2-IRES-tau-LacZ, dopo colorazione con X-gal. Tutti i neuroni sensoriali olfattivi esprimenti il recettore olfattivo P2 esprimono anche LacZ ed in seguito a colorazione con X-gal risultano cos marcati. Si osserva come tutti questi neuroni convergano in un unico glomerulo mediale nel bulbo (53).

In studi successivi il marcatore LacZ stato spesso sostituito con GFP, che offre il

vantaggio di essere immediatamente visualizzabile anche in animali in vivo

(54,55). Questa nuova tecnica ha permesso di analizzare nel dettaglio la

formazione dei glomeruli relativi a NSO che esprimono un dato recettore.

Nel bulbo olfattivo si possono distinguere due livelli di organizzazione

topografica: gli assoni di tutti i neuroni sensoriali olfattivi esprimenti lo stesso RO

29

convergono a formare lo stesso glomerulo ed i glomeruli occupano posizioni

specifiche simmetriche tra i due bulbi ed identiche tra animali diversi della stessa

specie.

Le quattro zone in cui stato suddiviso lepitelio olfattivo corrispondono

allincirca a quattro zone nel bulbo olfattivo, in senso dorso-ventrale (47,50).

Pertanto gli assoni dei neuroni sensoriali localizzati in una data zona dellepitelio

proiettano alla zona corrispondente nel bulbo olfattivo (fig.11). Per esempio i

neuroni che si trovano nella zona pi dorsale dellepitelio formano glomeruli nella

zona pi dorsale del bulbo, mentre i neuroni localizzati pi ventralmente

proiettano a formare glomeruli nella zona pi ventrale del bulbo.

Fig.11: schema che illustra il pattern di convergenza assonale tra lepitelio olfattivo ed il bulbo. Nel topo lepitelio olfattivo diviso in quattro zone, definite dal pattern di espressione di determinati RO. I NSO di una data zona proiettano a glomeruli localizzati nella zona corrispondente del bulbo olfattivo. Assoni di NSO esprimenti lo stesso recettore (blu e rosso) convergono in pochi glomeruli definiti (47).

Nonostante i NSO rigenerino costantemente nel corso della vita di un individuo,

la specificit della convergenza assonale, e quindi la mappa glomerulare,

perfettamente conservata (56).

In base alla modalit di convergenza degli assoni dei NSO, il concetto di codice

combinatoriale pu essere esteso anche al bulbo olfattivo. Infatti, poich ciascun

odore viene codificato dallattivazione di una particolare combinazione di

recettori olfattivi, a livello del bulbo questo si riflette nellattivazione dei

corrispondenti glomeruli. Pertanto un odore rappresentato da una specifica

combinazione spaziale di glomeruli attivati (mappa funzionale), che presenta una

simmetria bilaterale nei due bulbi dello stesso animale e rimane invariata in

30

animali diversi. Ciascun glomerulo pu invece far parte di mappe diverse,

corrispondenti ad odori differenti (51).

1.9.3 Formazione dei glomeruli.

Innanzitutto opportuno sottolineare che i glomeruli non rappresentano una

popolazione omogenea che si sviluppa in modo sincrono ed influenzata nel

corso della sua formazione e del suo mantenimento dalle stesse molecole e nella

stessa misura dallattivit neuronale evocata o spontanea. Questi elementi

controllano la formazione dei glomeruli in modo diverso a seconda del recettore

espresso dai neuroni convergenti a formare quel dato glomerulo (57).

Si possono tuttavia rintracciare tappe comuni che portano alla formazione dei

glomeruli, sebbene siano appunto percorse in tempi diversi dai glomeruli

esprimenti recettori olfattivi differenti e influenzate da molteplici fattori.

Gli assoni dei NSO, una volta passato losso cribriforme, raggiungono il bulbo

olfattivo (intorno a E13), attraversano lo strato del nervo olfattivo e giungono

infine allo strato glomerulare (58,59). In un primo tempo i neuroni che esprimono

lo stesso recettore proiettano ad unarea del bulbo olfattivo. Progressivamente gli

assoni si riuniscono in unarea sempre pi stretta e definita, in modo da formare

glomeruli veri e propri. Inizialmente per ogni lato, mediale e laterale, di ciascun

bulbo olfattivo si formano molteplici glomeruli connessi tra loro da fasci di

assoni. Con il procedere dello sviluppo le connessioni tra glomeruli omogenei

(formati da fibre esprimenti lo stesso recettore) vengono eliminate, come pure si

riduce il numero dei glomeruli soprannumerari, per arrivare al termine dello

sviluppo ad uno o due glomeruli per ciascun lato di ogni bulbo (60). In una prima

fase di sviluppo i glomeruli non sono omogenei, vale a dire innervati da neuroni

esprimenti solo lo stesso tipo di recettore, ma possono presentare innervazione da

parte di fibre esprimenti recettori diversi (eterogenei). Questi glomeruli misti

scompaiono con il progredire dello sviluppo per riarrangiamento ed eliminazione

delle scorrette proiezioni assonali (61).

Riportiamo due esempi relativi allo sviluppo di glomeruli formati da NSO

esprimenti recettori diversi.

Gli assoni dei neuroni sensoriali esprimenti il recettore P2 proiettano allo strato

del nervo olfattivo al giorno embrionale 14.5 (E14.5) e a E15.5 questi assoni

31

terminano nello strato glomerulare presuntivo. Nei cinque giorni successivi si

organizzano in strutture discrete simili ai glomeruli olfattivi. In molti casi si

osservano due glomeruli appaiati collegati inizialmente da fasci di assoni P2.

Questa connessione viene persa entro il giorno post-natale (PD) 7.5. Durante il

primo periodo post-natale si osservano assoni aberranti di NSO P2 entrare in

glomeruli non appropriati o continuare la crescita oltre lo strato glomerulare.

Questi neuroni non sono pi visibili nellanimale adulto (58).

Gli assoni esprimenti M72 iniziano a formare proto-glomeruli in una fase molto

pi tardiva, nei primi giorni di sviluppo post-natale, PD2-PD3. Fino a PD10

molteplici glomeruli sono presenti su ogni lato di ciascun bulbo. Tra PD10 e

PD40 si assiste ad un processo di progressiva eliminazione dei glomeruli

sopranumerari, cosicch nella maggior parte dei casi da PD40 in poi solo singoli

glomeruli sono osservabili sul lato mediale e laterale di ciascun bulbo. E

importante sottolineare che i glomeruli M72 inizialmente possono essere innervati

anche da fibre M71. La sequenza di questi due recettori, infatti, presenta un alto

grado di omologia (96%). Tuttavia, con il corso dello sviluppo i glomeruli misti

vengono eliminati (60). Per valutare leffetto dellattivit neuronale evocata sulla

formazione dei glomeruli, lo sviluppo di glomeruli M71 e M72 stato osservato

in animali in cui stata attuata occlusione nasale al momento della nascita. In

questi animali, a differenza dei controlli, persiste la presenza di glomeruli multipli

su ogni lato del bulbo olfattivo. Ciascun bulbo presenta dunque un numero

maggiore di glomeruli rispetto ai controlli. Analizzando la struttura dei glomeruli

sopranumerari, si visto che questi sono eterogenei. Sembra quindi che lassenza

di attivit evocata impedisca il processo di rifinitura delle proiezioni assonali ed in

particolare leliminazione di glomeruli eterogenei. La convergenza assonale non

sembra invece significativamente influenzata dallassenza di attivit evocata

(60,62).

1.9.4 Colonna olfattiva.

In ciascun glomerulo convergono gli assoni di NSO esprimenti un unico tipo di

recettore, che formano sinapsi con uno specifico gruppo di cellule mitrali e tufted.

Ogni glomerulo viene a definire ununit funzionale detta colonna olfattiva, in

analogia alle colonne presenti nella corteccia visiva primaria. Ciascuna colonna

32

olfattiva costituita da un gruppo specifico di cellule mitrali, tufted,

periglomerulari, che ricevono input da uno specifico gruppo di neuroni sensoriali,

e dalle cellule dei granuli che sono ad esse connesse. Le colonne olfattive

associate allo stesso recettore olfattivo sono dette isofunzionali o omologhe (45).

1.9.5 Ruolo del RO nella convergenza assonale e nella formazione dei

circuiti intra- ed inter-bulbari.

Come precedentemente detto, gli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi esprimenti

lo stesso tipo di recettore proiettano, per ciascun bulbo olfattivo, a due glomeruli

distinti, uno in posizione mediale ed uno in posizione laterale. Il bulbo olfattivo

presenta pertanto due mappe speculari e simmetriche di glomeruli isofunzionali.

E stato dimostrato che queste due mappe di glomeruli omologhi presenti in ogni

bulbo non sono indipendenti, ma reciprocamente connesse in modo estremamente

preciso da un link inibitorio dovuto alle cellule tufted esterne (63). Gli assoni delle

cellule tufted esterne connesse ad un dato glomerulo formano sinapsi eccitatorie

con i dendriti delle cellule dei granuli nella parte opposta del bulbo. Queste

ultime, a loro volta, formano sinapsi inibitorie con le cellule tufted esterne del

glomerulo omologo (fig 12).

Queste connessioni sono reciproche. In tal modo le colonne odorose isofunzionali

vengono integrate in ununica mappa funzionale.

33

Fig.12: rappresentazione schematica del circuito inibitorio che connette le colonne odorose

isofunzionali nelle due met di ciascun bulbo. Gli assoni delle cellule tufted esterne (ETC),

connessi con un dato glomerulo, formano sinapsi eccitatorie (+) con i dendriti delle cellule dei

granuli (GC) in unarea ristretta dello strato plessiforme interno sul lato opposto del bulbo

olfattivo. Queste cellule dei granuli, a loro volta, formano sinapsi inibitorie (-) con le cellule tufted

esterne connesse al glomerulo omologo. Queste connessioni sono reciproche. OSN: neuroni

sensoriali olfattivi. GL: strato glomerulare. EPL: strato plessiforme esterno. GCL: strato delle

cellule dei granuli.

Non solo i due glomeruli omologhi appartenenti allo stesso bulbo sono

interconnessi, ma anche i glomeruli isofunzionali presenti nei due bulbi sono

collegati tra loro (64). E stato mostrato che le cellule mitrali e tufted associate ad

uno specifico glomerulo proiettano topograficamente ad una regione esterna dei

nuclei olfattivi anteriori (NOApE), dove i neuroni a loro volta proiettano alle

cellule dei granuli alla base dei glomeruli isofunzionali omologhi sullaltro bulbo.

Il bulbo olfattivo appare quindi come una struttura dotata di almeno tre livelli di

organizzazione topografica: i) NSO esprimenti lo stesso recettore olfattivo

convergono con i loro assoni a formare glomeruli simmetrici allinterno di ciascun

bulbo; ii) i due glomeruli omologhi appartenenti allo stesso BO sono collegati da

un circuito intrabulbare inibitorio; iii) i glomeruli isofunzionali presenti nei due

bulbi olfattivi sono collegati da un circuito interbulbare. Da quanto detto emerge

che lelemento attorno a cui ruota lorganizzazione topografica del BO il

recettore olfattivo.

34

Rimangono ancora da chiarire i meccanismi che sottendono alla formazione di tali

circuiti.

1.10 Axon guidance.

Il sistema nervoso formato da circuiti neuronali molto complessi, per la

formazione dei quali essenziale che i diversi neuroni proiettino i loro assoni

verso i corretti target. Il cono di crescita una struttura localizzata allestremit

terminale degli assoni, dotata di grande motilit, che permette di rilevare e

rispondere ai segnali dellambiente circostante che guidano gli assoni verso il

target appropriato. Il cono di crescita costituito da lamellipodia, formati da un

network di filamenti di actina, e da filipodia, strutture tensili composte da fasci di

F-actina, che sondano lambiente extracellulare. Questo network di filamenti di

actina associato a sua volta a microtubuli nella parte distale dellassone.

Lavanzamento e la ritrazione del cono di crescita dipendono dalla

polimerizzazione e depolimerizzazione dellactina nei filipodia e nei lamellipodia

e dalla velocit di flusso retrogrado della F-actina allinterno di queste strutture

(65). Le proteine Rho della famiglia delle GTPasi sono degli importanti regolatori

di tali processi di modificazione del citoscheletro (fig.13).

Il cono di crescita in grado di rilevare molecole extracellulari, dette segnali

guida, che dirigono la crescita degli assoni. Tali segnali guida possono avere un

effetto attrattivo o repellente e ciascun tipo pu agire a corto o lungo raggio (65). I

segnali guida a corto raggio sono molecole non diffusibili, che si trovano sulla

superficie delle cellule o nella matrice extracellulare, ed agiscono con meccanismi

mediati da contatto cellula-cellula. I segnali guida a lungo raggio sono invece

rappresentati da molecole secrete. Inoltre alcune molecole possono avere sia un

effetto repulsivo che attrattivo. Questa bifunzionalit dipende da diversi fattori, tra

cui lo stato intracellulare del cono di crescita, lespressione differenziale di

complessi di recettori e linterazione tra diverse cascate di signalling

intracellulare.

35

Fig.13: rappresentazione grafica del cono di crescita. I lamellipodia contengono un denso reticolo di actina, i filipodia si estendono e si ritraggono attraverso la regolazione dei processi di polimerizzazione e depolimerizzazione dei filamenti di F-actina (65).

Sono stati individuati diversi tipi di molecole guida a corto o lungo raggio.

Le molecole di adesione cellulare (CAM), i recettori tirosina chinasi (RPTK), le

efrine, i recettori tirosina fosfatasi (RPTP), le molecole della matrice

extracellulare (ECM) ed i loro recettori, rappresentano tutti segnali guida a corto

raggio.

Le netrine e le neurotrofine, invece, agiscono a lungo raggio. Le semaforine sono

una classe a parte, poich comprendono sia molecole secrete che di superficie.

Le molecole di adesione cellulare si dividono in tre classi: la superfamiglia delle

immunoglobuline (Ig), delle caderine e delle integrine. Diversi membri delle

prime due famiglie possono mediare adesioni omofiliche, agendo quindi sia come

ligando che come recettore. Alcune proteine CAM, invece, formano legami

eterofilici, fungendo da ligandi o recettori per altre molecole di adesione o per

molecole della matrice extracellulare. Le Ig CAM meglio caratterizzate nel

sistema nervoso sono le CAM neurali (NCAM). Le caderine sono recettori di

adesione dipendenti dal Ca2+ e nel sistema nervoso si distinguono le N-caderine.

Alcune di queste molecole sono collegate allactina citoscheletrica tramite la

proteina catenina. Infine le integrine sono recettori eterodimerici, che fungono da

legame tra le molecole della matrice extracellulare ed il citoscheletro.

36

I recettori tirosina chinasi comprendono la famiglia dei recettori Eph per le efrine

e dei recettori Trk per le neurotrofine.

I recettori Eph si dividono in due classi: i recettori EphA che legano le efrine-A,

ancorate alla membrana plasmatica cellulare attraverso il glicosilfosfatidil

inositolo (GPI), ed i recettori EphB che sono specifici per le efrine-B

transmembrana. Le interazioni tra le efrine ed i loro recettori richiedono quindi un

contatto cellula-cellula. I complessi Eph/efrina trasducono il segnale

bidirezionalmente, sia nella cellula esprimente il recettore sia nella cellula

esprimente il ligando. Questo tipo di signalling gioca un ruolo critico durante lo

sviluppo del sistema nervoso.

I recettori Trk riconoscono e legano le diverse neurotrofine, quali NGF, BDNF,

NT-3 e NT-4. Questi fattori, oltre al loro ruolo chiave nella sopravvivenza e nel

differenziamento neuronale, svolgono anche una funzione di molecole guida per

la crescita degli assoni. Leffetto repulsivo o attrattivo delle neurotrofine

influenzato dal livello di nucleotidi ciclici nel cono di crescita (66-68). Ad

esempio stato dimostrato che il NGF ha un effetto attrattivo a basse

concentrazioni di cAMP, mentre il BDNF nelle stesse condizioni ha un effetto

repulsivo. Inoltre, le neurotrofine sono anche in grado di modulare la risposta del

cono di crescita assonale ad altre molecole guida, come le semaforine.

I recettori tirosina fosfatasi ed i loro ligandi sono i meno conosciuti. Si pensa che

alcuni tipi di RPTP leghino molecole CAM.

Le molecole della matrice extracellulare sono numerose: laminina, tenascina,

collagene, fibronectina, vibronectina e diversi proteoglicani. I recettori per le

ECM sono in genere integrine, membri della famiglia di recettori Ig e altri

proteoglicani.

Le netrine appartengono ad una piccola famiglia di proteine secrete ed hanno sia

una funzione attrattiva che repulsiva sulla crescita assonale. Questo duplice effetto

dipende sia dai recettori attivati sia da diverse cascate di signalling intracellulare

che regolano in modo differente i livelli citosolici di cAMP. E stato dimostrato

infatti che il recettore DCC/UNC-40 media la risposta attrattiva degli assoni alle

netrine, mentre il recettore UNC-5 determina leffetto repulsivo (65). Inoltre

lazione della Netrina-1 dipende dalla presenza di altri segnali che modulano i

livelli citosolici sia di cAMP che di Ca2+ (67,69). Il cAMP pu dunque agire come

37

interruttore molecolare, andando ad attivare diversi target intracellulari e

determinando cos diverse risposte del cono di crescita alle molecole guida.

La famiglia delle semaforine comprende sia proteine secrete che proteine

associate alla membrana cellulare e queste possono avere sia un effetto repulsivo

che attrattivo nellaxon guidance (65,70). Sono stati identificati almeno cinque

classi di semaforine. Tutti i membri di tale famiglia possiedono un dominio Sema

conservato nella regione extracellulare N-terminale. I recettori per le semaforine

sono in realt dei complessi formati da pi molecole. Le plexine sono proteine

transmembrana che si associano alla Neuropilina-1 o Neuroplina-2 (Npn-1 e Npn-

2), un altro tipo di proteine transmembrana che fungono da co-recettori, dal

momento che le loro corte code citoplasmatiche non hanno alcuna funzione

catalitica. Il complesso plexina-neuropilina pu in tal modo legare le semaforine

della classe 3 (Sema-3). La risposta specifica dei neuroni ai diversi membri della

classe Sema-3 dipende dal pattern di espressione delle neuropiline, dal tipo di

neuropilina espressa (Npn-1 o Npn-2) ed anche dal pattern neuronale di

espressione delle plexine durante lo sviluppo del sistema nervoso. Inoltre, come

gi detto precedentemente, la risposta dei neuroni alle semaforine modulata

anche dalle neurotrofine. E stato provato che alte concentrazioni di NGF nel

terreno di crescita dei neuroni dei gangli della radice dorsale riducono leffetto

inibitorio sulla crescita assonale della Sema-3A (71).

Come gi accennato nel caso delle netrine e delle neurotrofine, varie prove

sperimentali hanno dimostrato limportanza del cAMP e del Ca2+ nellaxon

guidance (67,72). Ad esempio, alcune molecole guida determinano nel cono di

crescita segnali Ca2+ che regolano lattivit di altre proteine, coinvolte

nellorganizzazione del citoscheletro e nei movimenti dei filamenti di actina. Il

Ca2+ pu mediare sia una risposta di tipo attrattivo che repulsivo. Si pensa che la

polarit della risposta dipenda pi dalla grandezza del gradiente Ca2+ che dalla sua

direzione. Ad esempio, un piccolo gradiente di Ca2+ induce repulsione nel cono di

crescita neuronale, mentre un gradiente maggiore induce un effetto attrattivo. E

stato dimostrato che le vie di segnalazione del cAMP e del Ca2+ interagiscono

nella regolazione dellaxon guidance. Linibizione della PKA determina un

cambiamento dellazione attrattiva indotta dal Ca2+ in repulsione e viceversa.

38

Tuttavia i meccanismi alla base di queste interazioni cAMP-Ca2+ sono ancora

sconosciuti (67,72).

1.11 Formazione della mappa sensoriale nel sistema olfattivo.

Come possibile passare da una mancanza di organizzazione spaziale dei diversi

neuroni olfattivi a livello dellepitelio olfattivo ad una mappa topografica

estremamente precisa nel bulbo olfattivo? Non solo gli assoni dei neuroni

sensoriali olfattivi che esprimono il medesimo recettore convergono a formare gli

stessi glomeruli, ma anche la localizzazione di questi glomeruli conservata in

individui della stessa specie.

E stato dimostrato che il recettore olfattivo gioca un ruolo istruttivo nella

convergenza dei neuroni sensoriali verso il corretto glomerulo target. Questo dato

emerso da una serie di esperimenti genetici che hanno dimostrato come

modificazioni della sequenza codificante per i recettori olfattivi porti ad

unalterazione della mappa sensoriale.

Nei neuroni sensoriali olfattivi esprimenti il recettore P2, leliminazione del gene

codificante tale recettore (knock down) impedisce la convergenza degli assoni di

tali neuroni a livello del bulbo olfattivo. In questa circostanza gli assoni si

dirigono in maniera casuale a vari glomeruli (73). Studi successivi hanno

dimostrato che leliminazione genetica di un dato recettore olfattivo porta

allattivazione casuale di un gene codificante per un altro RO (74). Poich la

scelta del recettore espresso casuale per ciascun neurone, gli assoni convergono

in differenti glomeruli. Se invece si sostituisce il gene codificante per il recettore

olfattivo normalmente espresso con un diverso RO (swap genico), gli assoni di

tali neuroni convergono a formare glomeruli in una posizione diversa rispetto a

quella occupata dai glomeruli target dei neuroni esprimenti il RO sostituito e di

quelli esprimenti il RO sostitutivo. Lentit della distanza dipende da vari fattori:

dal grado di omologia di sequenza tra i geni codificanti i recettori considerati, dal

cluster di appartenenza dei due geni, dalla zona epiteliale in cui i recettori sono

espressi, dal livello di espressione del recettore. Anche nelle condizioni di

39

massima analogia dei vari parametri analizzati, e.g. stesso cluster sullo stesso

cromosoma, stessa zona epiteliale ed alto grado di omologia di sequenza, persiste

una certa distanza tra il glomerulo nuovo (risultato dello swap genetico) e quelli

originali. Per esempio, i recettori olfattivi P2 e P3 presentano il 75% di identit di

sequenza aminoacidica, i geni che li codificano risiedono sullo stesso cromosoma

e vengono espressi da NSO presenti nella stessa zona dellepitelio olfattivo. In

esperimenti di swap genetico tra questi due RO (P3P2) i nuovi glomeruli sono

adiacenti ai glomeruli wild type P3 ed anteriori rispetto ai glomeruli wild type P2

(73). Questi dati indicano che il recettore olfattivo gioca un ruolo istruttivo nella

convergenza assonale, ma non lunico determinante. I dati ottenuti da questi

esprimenti di swap genetico suggeriscono inoltre che il recettore olfattivo

determini la posizione del glomerulo lungo lasse antero-posteriore del bulbo

olfattivo, mentre la zona dellepitelio in cui si trovano i neuroni esprimenti quel

dato RO determini la posizione del glomerulo lungo lasse dorso-ventrale del BO

(53,73,75).

Studi successivi hanno messo in evidenza il coinvolgimento di varie molecole

guida nella formazione della mappa sensoriale nel bulbo olfattivo, tra cui le efrine,

le semaforine e le neuropiline (68,76,77). E stato dimostrato, ad esempio, che

neuroni esprimenti recettori olfattivi diversi esprimono diversi livelli di efrina-A3

ed efrina-A5 sui loro assoni, mentre le cellule post-sinaptiche corrispondenti

esprimono i recettori EphA (68). Alterazioni dei livelli di espressione di queste

molecole alterano la mappa glomerulare, in particolare modificano la posizione

dei glomeruli in senso antero-posteriore nel BO. Topi geneticamente modificati,

che non esprimono n efrina-A3 n efrina-A5, sono stati incrociati con topi P2-

IRES-tau-LacZ e con topi SR1-IRES-tau-LacZ, per poter visualizzare i NSO

esprimenti il recettore P2 o SR1 e valutare come la convergenza assonale di tali

neuroni a livello del bulbo sia influenzata dallalterato livello di espressione delle

efrine. In topi mutanti, privi sia di efrina-A3 che di efrina-A5, neuroni che

esprimono il recettore olfattivo P2 o il recettore olfattivo SR1 mostrano una

posteriorizzazione nella formazione dei corrispondenti glomeruli. Invece,

laumento del livello di efrina-A5 risulta in un anteriorizzazione della posizione

dei glomeruli dei neuroni analizzati (P2-IRES-efrinaA5-IRES-tau-lacZ). I dati

ottenuti sembrano indicare che le efrine cooperano con il RO nella formazione

40

della mappa glomerulare ed in particolare regolano la posizione dei glomeruli

lungo lasse antero-posteriore del bulbo olfattivo.

Serizawa e coll. hanno osservato che nei NSO esprimenti recettori diversi

vengono espresse molteplici molecole, non solo le efrine-A5, ma anche le EphA5

e le molecole di adesione omofilica Kirrel-2 e Kirrel-3 (76). Lespressione di tali

molecole si verifica in modo complementare: neuroni esprimenti un dato recettore

presentano alti livelli di Kirrel-2 e bassi livelli di Kirrel-3, mentre per neuroni

esprimenti recettori diversi il pattern di espressione invertito, bassi livelli di

Kirrel-2 ed alti livelli di Kirrel-3. Lo stesso fenomeno avviene per efrina-A5 e

EphA5. Questa complementariet presente a livello dei neuroni sensoriali

dellepitelio e nei corrispettivi glomeruli a livello del bulbo olfattivo. Estato

dimostrato inoltre che la trascrizione di questi geni attivit- dipendente. Nei topi

knock out per la subunit A2 dei canali CNG, in cui linflusso di Ca2+ attraverso

tali canali abolito, lespressione di Kirrel-2 ed EphA5 risulta ridotta, mentre

lespressione di Kirrel-3 ed efrina-A5 aumentata. Lespressione attivit-

dipendente di questi geni stata dimostrata anche in seguito ad occlusione nasale:

nei NSO esprimenti MOR28 lespressione di efrina-A5 e Kirrel-3 risulta

incrementata in seguito ad occlusione nasale, mentre lespressione di EphA5 e

Kirrel-2 ridotta. In questo studio stato dimostrato che i geni Kirrel-2, Kirrel-3,

efrina-A5, EphA5, i cui livelli di espressione sono correlati con il RO espresso,

sono trascritti in modo complementare ed attivit-dipendente (76).

Tra le altre molecole coinvolte nella formazione di una corretta mappa

glomerulare ricordiamo anche la Semaforina-3A, che viene espressa nel bulbo

olfattivo. Un sottogruppo di NSO esprimono la Neuropilina-1, che rappresenta il

ligando della Semaforina-3A e la loro interazione di tipo repulsivo. Gli assoni

dei neuroni sensoriali che esprimono la Neuropilina-1 formano glomeruli nella

regione mediale e laterale del BO, evitando selettivamente la regione di

espressione della Semaforina-3A. In topi knock out per questa molecola, gli

assoni di NSO esprimenti Neuropilina-1 proiettano anche nelle regioni del bulbo

che negli animali wild type presentano unespressione della Semaforina-3A. (77).

Linsieme di questi esperimenti suggerisce che i neuroni esprimenti recettori

diversi co-esprimono molecole segnale diverse, che cooperano con il recettore

nella formazione della mappa glomerulare. Ancora oggi, tuttavia, rimangono da

41

chiarire i meccanismi molecolari che collegano lidentit di un dato RO con i

diversi tipi e/o livelli di espressione di molecole guida.

A rinforzare il ruolo del RO nel processo di convergenza assonale esperimenti di

immunoistochimica condotti da Barnea e coll. (78) e da Strotmann e coll. (57)

hanno dimostrato la presenza del recettore olfattivo sulla porzione pi distale

dellassone e sul cono di crescita. Il recettore olfattivo risulta quindi espresso non

solo sulle cilia ma anche sullassone terminale-cono di crescita. Tuttavia i

meccanismi molecolari che sottendono al ruolo del recettore olfattivo sul cono di

crescita rimangono ancora da chiarire.

Ci si chiesti quindi in quale modo elementi molecolari della via di signalling

intracellulare accoppiata al RO influenzino la trasduzione del segnale odoroso e la

formazione della mappa sensoriale. Per rispondere a questa domanda sono state

create una serie di linee di topi transgenici, in cui elementi del signalling

intracellulare associato al RO sono stati geneticamente modificati. I canali CNG

sono una componente centrale dellapparato di trasduzione del segnale odoroso.

Topi knock out per tali canali sono anosmici, cio non esibiscono risposte

elettrofisiologiche evocate dagli odori in risposta ad un ampio range di stimoli

diversi. Lincrocio di queste linee con topi P2-IRES-tau-LacZ e la successiva

analisi dei bulbi di questi animali hanno permesso di esaminare la posizione

relativa di glomeruli P2 e M50 (questi ultimi visualizzati con metodiche di

ibridazione in situ). Il relativo spaziamento e lordine dei glomeruli sono

mantenuti anche in topi knock out per CNG. Sembra perci che lattivit evocata

non sia necessaria per la formazione di una corretta mappa glomerulare (79).

Questo dato sostenuto anche dai risultati ottenuti in topi geneticamente

modificati mancanti di Golf (17). Questa proteina associata al RO e permette la

trasduzione del segnale odoroso attivando ladenilato ciclasi 3. Bench Golf sia

molto pi abbondante di Gs nellepitelio olfattivo di topi adulti, entrambe le

molecole potrebbero contribuire alla trasduzione del segnale evocato dallodore.

Topi knock out per Golf sono anosmici, mostrano una forte riduzione delle risposte

elettrofisiologiche associate alla somministrazione di un gran numero di odori.

Incrociando queste linee con topi P2-IRES-tau-LacZ stato possibile osservare se

la convergenza dei NSO esprimenti P2 fosse alterata. Gli assoni di tali neuroni

sensoriali olfattivi convergono correttamente a formare un unico glomerulo P2

42

mediale e laterale. La posizione di entrambi i glomeruli costante in tutti gli

animali analizzati. Questi studi sembrano quindi avvalorare lipotesi che lattivit

odore-evocata non sia necessaria per la formazione di una corretta mappa

topografica. Tali esperimenti sono stati condotti in condizioni in cui lattivit

odore-dipendente inibita in tutta la popolazione di neuroni sensoriali olfattivi e

perci non escludono un ruolo dellattivit evocata in un ambiente competitivo.

Zhao e Reed (80) hanno sfruttato la localizzazione del gene della subunit

OCNC1 dei canali CNG sul cromosoma X per creare un modello di studio del

ruolo dellattivit nello sviluppo del sistema olfattivo in un contesto competitivo.

Hanno generato due linee di topi in cui un allele OCNC1 stato sostituito con il

reporter tau-LacZ o tau-EGFP, rendendo possibile la marcatura dei neuroni che

non esprimono quel gene. Nelle femmine eterozigoti, sfruttando il fenomeno

dellinattivazione casuale del cromosoma X, si crea una situazione unica in cui

due diverse popolazioni cellulari coesistono. In queste linee di animali

geneticamente modificati, si assiste inizialmente ad una normale formazione dei

glomeruli e successivamente, nel corso della vita dellanimale, la popolazione di

neuroni OCNC1- viene eliminata dallepitelio olfattivo. Questa eliminazione dei

neuroni inattivi dipende dallesposizione agli odori. Infatti, in seguito ad

occlusione nasale, si osserva una drastica riduzione della perdita dei neuroni

sensoriali olfattivi OCNC1- sia a livello dellepitelio olfattivo che a livello del

bulbo. Questi risultati indicano che la deplezione dei NSO OCNC1- dipende

dallattivit evocata dallodore. Viene perci suggerito che lattivit evocata

contribuisca alla sopravvivenza dei neuroni sensoriali olfattivi in un ambiente

competitivo. Nei bulbi olfattivi di questi animali, tuttavia, si osserva un pattern

inusuale di innervazione dei glomeruli da parte degli assoni OCNC1- e OCNC1+.

Nella maggior parte dei glomeruli la competizione molto efficiente e nei

glomeruli vengono rinvenute solo le fibre attive. Tuttavia alcuni glomeruli

presentano una forte innervazione sia da parte delle cellule inattive sia da parte di

cellule attive. Inoltre la posizione di questi glomeruli rimane invariata tra

individui della stessa specie. Questi risultati indicano che lattivit evocata

conferisce un grosso vantaggio alle fibre attive nel processo di convergenza e di

mantenimento delle proiezioni assonali nella maggior parte, ma non in tutti, i

glomeruli. Questa ipotesi avvalorata anche dai risultati ottenuti da Zheng e coll.

43

(81). Tramite mutagenesi specifica del gene OCNC1 hanno generato unaltra linea

di topi mancante dei canali CNG e pertanto priva di risposte evocate dagli odori.

Queste linee sono state incrociate con topi in cui neuroni che esprimono un dato

recettore esprimono anche LacZ o GFP. I neuroni marcati da LacZ o GFP sono

facilmente individuabili nel bulbo ed possibile seguire la convergenza di questi

assoni. Gli assoni di NSO esprimenti M72 non convergono correttamente nel

bulbo olfattivo: gi dopo la prima settimana post-natale si osserva la formazione

di glomeruli sopranumerari, disposti pi ventralmente rispetto agli originari e

variabili per numero e grandezza. Gli assoni dei neuroni sensoriali esprimenti il

recettore P2, invece, convergono normalmente. Inoltre in questo studio hanno

utilizzato un triplo mutante (M72-IRES-tau-GFP-IRES-ONCN1 eterozigote,

M72-IRES-tau-LacZ eterozigote, OCNC1- eterozigote) che, sfruttando

lespressione monoallelica del recettore olfattivo e linattivazione casuale del

cromosoma X, presenta tre popolazioni di NSO che esprimono il recettore

olfattivo M72: GFP/OCNC1+, LacZ/OCNC1+, LacZ/OCNC1-. E stato osservato

che NSO esprimenti M72 proiettano i loro assoni in glomeruli separati, a seconda

che siano OCNC1+ o OCNC1-. Questi risultati suggeriscono che la formazione

della mappa glomerulare influenzata in parte da meccanismi che si basano

sullattivit neuronale evocata. Come si pu vedere dallinsieme dei dati raccolti,

finora la situazione molto complessa ed il ruolo dellattivit evocata nella

formazione dei glomeruli continua ad essere oggetto di dibattito. Unaltra

molecola base nella cascata di trasduzione del segnale odoroso ladenilato

ciclasi 3 (AC3). Tramite saggi di immunoistochimica stata osservata la sua

presenza non solo a livello delle cilia, ma anche lungo gli assoni dei NSO (32).

Topi knock out per questa proteina sono anosmici e presentano una mappa

glomerulare fortemente alterata. Le proiezioni assonali in questi animali sono

fortemente disorganizzate e spesso i glomeruli risultano innervati da assoni

esprimenti recettori diversi. Nella porzione dorso-caudale del bulbo si assiste alla

completa mancanza di glomeruli. Inoltre la formazione dei glomeruli alterata in

modo variabile a seconda dei diversi recettori analizzati. Nel caso di P2, non si

osservano i glomeruli corrispondenti negli animali mutati. Il fenomeno si associa

ad una drastica riduzione dei neuroni esprimenti P2 nellepitelio. Per quanto

concerne i NSO esprimenti M72, ai normali glomeruli si associano glomeruli

44

sopranumerari non presenti negli animali wild type di controllo. Si osserva inoltre

uno spostamento della normale posizione dei glomeruli lungo lasse antero-

posteriore del bulbo. Infine, la deplezione della ciclasi comporta la mancata

espressione di Neuropilina-1, una molecola segnale nei processi di allungamento

assonale (32,82). Per quanto concerne il ruolo dellattivit spontanea nella

formazione dei glomeruli, si visto che essa svolge un ruolo chiave. In animali

sovraesprimenti i canali Kir 2.1 nei neuroni sensoriali, che risultano cos

iperpolarizzati e privi di attivit spontanea (ed evocata), la mappa glomerulare

fortemente alterata. Si ha un forte ritardo dellinnervazione del bulbo ed i

glomeruli, anche quando si formano, sono abnormi per dimensioni e struttura.

Ancora una volta neuroni esprimenti recettori diversi sono affetti in maniera

diversa (83) ma tutti risultano comunque influenzare negativamente la formazione

della mappa glomerulare.

Come detto in precedenza, manipolazioni genetiche che aboliscono la sintesi di

cAMP hanno effetti drammatici sullorganizzazione topografica del bulbo

olfattivo, mentre manipolazioni che mantengono la sintesi di cAMP, quali

alterazioni dei canali CNG e di Golf, permettono la formazione di una normale

mappa glomerulare. Questi risultati hanno portato ad ipotizzare che il segnale

cAMP svolga un ruolo chiave nella formazione della mappa sensoriale.

Gli esperimenti di Imai e coll. (84) hanno dimostrato che il segnale cAMP

collegato al RO svolge un ruolo critico nella formazione dei glomeruli. E stato

creato il mutante I7-RDY, in cui il RO I7 mutato nel sito di legame con le

proteina G (la tripletta DRY modificata in RDY). A seguito di questa mutazione

il recettore non in grado di associarsi con le proteine G, con conseguente

abolizione della sintesi di cAMP. Nei topi I7(RDY), che esprimono il recettore

mutato, gli assoni sensoriali non solo non convergono nella formazione di alcun

glomerulo, ma non riescono nemmeno a penetrare nello strato glomerulare del

bulbo. Il fenotipo viene completamente recuperato dallespressione della proteina

Gs costitutivamente attiva nei neuroni I7-RDY(I7(RDY)-IRES-caGs). Il fenotipo

difettivo viene inoltre recuperato anche tramite lespressione di PKA

costitutivamente attiva. Se per il costrutto I7(RDY) viene co-espresso con CREB

costitutivamente attivo (cAMP response element-binding protein), che un fattore

di trascrizione attivato da PKA, gli assoni formano strutture glomerulari, ma non

45

si osserva una convergenza completa. E stato inoltre analizzato leffetto

dellespressione di Gs costitutivamente attiva in NSO esprimenti il recettore I7

wild type. In questo caso i neuroni presentano un eccesso di produzione di cAMP:

i glomeruli si formano in posizione posteriore rispetto ai wild type. Lespressione

di una PKA dominante negativa, invece, anteriorizza la posizione dei glomeruli

corrispondenti. Questi risultati dimostrano che il segnale cAMP collegato al RO

necessario per la convergenza glomerulare ed inoltre laumento o la diminuzione

dei livelli di cAMP modifica la posizione dei glomeruli target dei NSO lungo

lasse antero-posteriore del bulbo olfattivo. Infine, tramite analisi di microarray e

di RT-PCR sono stati determinati i geni i cui livelli di espressione sono correlati al

segnale cAMP. Uno dei geni cos identificati codifica per la Neuropilina-1. Tale

proteina risulta essere espressa dai NSO che esprimono Gs costitutivamente attiva

e dunque presentano alti livelli di cAMP, mentre non espressa nei neuroni

I7(RDY), dove il segnale cAMP bloccato. Si osservato precedentemente (32)

che lespressione di questa molecola abolita nei mutanti di AC3. Questi dati

suggeriscono che lo stesso segnale cAMP mediato da Gs regoli la trascrizione di

geni codificanti per proteine coinvolte nellaxon guidance, che a loro volta

partecipano al processo di formazione della mappa glomerulare. Questi risultati

sono convalidati anche dai dati ottenuti da Chesler e coll. (85). Questi autori

hanno utilizzato un approccio di gain-of-function basato su iniezioni di vettori

retrovirali nellepitelio olfattivo embrionale. Hanno dimostrato che lespressione

di un recettore funzionale necessaria e sufficiente a indurre la formazione di

glomeruli. Lespressione ectopica del recettore OR17 (OR17-IRES-EGFP) si

rivelata infatti sufficiente per la convergenza glomerulare, mentre lespressione

dello stesso recettore mutato (MycOR17-IRES-EGFP) non funzionante non

permette la coalescenza degli assoni, che entrano in glomeruli diversi. Inoltre

hanno osservato che lespressione ectopica di Golf costitutivamente attiva

sufficiente perch gli assoni dei NSO che la esprimono convergano. I risultati

ottenuti hanno portato ad ipotizzare un modello in cui lattivazione da parte del

RO di una proteina G stimolatoria induce la convergenza degli assoni. Questa

ipotesi convalidata dai dati ottenuti da Feinstein e coll. (86). Sostituendo il

recettore olfattivo M71 con il recettore adrenergico 2 (2AR-IRES-tau-LacZ),

che si accoppia a proteine Gs, hanno osservato la formazione di glomeruli

46

funzionali sia mediali che laterali. Se invece si sostituisce il RO con il recettore

vomeronasale V1rb2, che non si accoppia a proteine Gs, non si osserva la

formazione di glomeruli. Poich topi knock out per la proteina Golf non mostrano

alterazioni della mappa glomerulare, Chesler e coll. (85) hanno ipotizzato che la

proteina G coinvolta nella formazione della corretta mappa sensoriale olfattiva sia

Gs. A sostegno di questa ipotesi c il diverso pattern di espressione delle due

proteine G. Gs viene espressa a livello embrionale dalle cellule progenitrici, dai

neuroni olfattivi immaturi e da quelli maturi. A PD5, quando molti glomeruli si

sono gi formati, Gs ancora fortemente espressa dalle cellule progenitrici, ma

solo debolmente da alcuni neuroni immaturi e non rilevabile nei neuroni maturi.

Golf invece presenta un diverso pattern temporale di espressione: sembra infatti

essere espressa solo dai neuroni maturi, perci a E15 viene espresso dai pochi

neuroni maturi presenti e dunque la sua espressione totale a livello dellepitelio

molto bassa, mentre a PD5 la sua espressione molto pi consistente in quanto

gran parte dei neuroni sono maturi. Gs sembra pertanto essere espressa durante lo

sviluppo embrionale e dai neuroni che stanno rigenerando, mentre Golf viene

espressa soltanto dai neuroni maturi (esprimenti OMP) (16,17). Linsieme di

questi risultati suggerisce che Golf sia associata al recettore olfattivo nella

trasduzione del segnale odoroso, mentre Gs