D O C K I N G D E L L A M O L E C O L AN 6 - C I C L O E S I L - N E C A N E L

R E C E T T O R E A 3 A D E N O S I N I C O1

gioacchino riccardo volpe8

Università di Pisa

Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche

2 ottobre 2009

1 Laboratorio di Modellazione Molecolare – Prof. A. Martinelli.

I N D I C E

1 docking manuale 1

1.1 Scopo della Tesina 1

1.2 Parte Sperimentale 1

1.3 Risultati e Discussione 7

1.4 Elenco files creati 9

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E L E N C O D E L L E F I G U R E

Figura 1 N6-cicloesil-NECA. vFigura 2 Risultato docking manuale. 3

Figura 3 complessononmini.mae. 4

Figura 4 Dinamica minimizzata. 6

Figura 5 I due ligandi, pre- e post-dinamica minimizzata,sovrapposti e messi a confronto. 7

Figura 6 Sovrapposizione delle due α-eliche. 8

Figura 7 Visualizzazione interazioni che si instaurano nelcomplesso dopo la dinamica minimizzata. 8

Figura 8 L ’ autore. 11

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A B S T R A C T

La molecola N6-cicloesil-NECA1 è strutturalmente correlabile alla5’-N-etilcarbossamidoadenosina, o NECA, un potente agonista non se-lettivo dell’adenosina. L’adenosina agisce come un’importante moleco-la regolatrice, grazie all’attivazione di recettori specifici di membranaaccoppiati a G-proteine (di tipo stimolatorio o inibitorio), costituitida una singola catena polipeptidica che attraversa 7 volte la mem-brana plasmatica, e classificati in A1, A2a, A2b e A3. Questi recet-tori adenosinici interagiscono con enzimi importanti come l’adenilato-ciclasi o la fosfolipasi C o con altre importanti strutture cellulari comei canali del calcio o i canali del potassio. Nell’insieme, i recettoriper l’adenosina sono ampiamente distribuiti a livello dei vari organie tessuti; l’A3 è particolarmente abbondante in testicolo, cuore, rene,polmone e, in misura minore, nel cervello.

Il sottotipo A3 è stato l’ultimo ad essere clonato (Zhou et al. 1992).In letteratura risulta che si ha un’elevata sovraespressione dei recettoriA3, ma non degli altri sottotipi adenosinici, nei tessuti tumorali con-frontati con le rispettive mucose sane, e si è inoltre osservato che lecellule del sangue riflettono lo stato di alterazione presente a livello deltessuto “target” con un notevole aumento dei livelli di questi recettoriconfrontati con quelli presenti in neutrofili e linfociti prelevati da sogget-ti volontari sani. A livello dei linfociti in condizioni di attivazione cellu-lare, si assiste ad un aumento dell’espressione dei recettori A3; a questocorrisponde una maggiore capacità di diminuire l’attività dell’enzimaadenilato ciclasi ed un aumento della quantità di calcio intracellularerilasciato dal recettore. I linfociti sono stati quindi separati nelle 2

principali sottopopolazioni importanti da un punto di vista funzionaleper le risposte umorali e cellulo-mediate ed hanno rivelato che le cel-lule responsabili per l’up-regulation dei recettori A3 corrispondono alfenotipo dei CD4+. E’ stata inoltre dimostrata la capacità degli agonistiA3 di inibire la produzione di anione superossido con importanti impli-cazioni terapeutiche a livello anti-infiammatorio. Dalla mutagenesi siricava che i residui aminoacidici del recettore importanti per l’inter-azione con il ligando sono: Ser60-His147, che interagiscono mediantelegame idrogeno con il ribosio, e Leu127, che interagisce con il cicloesilemediante forze di dispersione.

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Figura 1: N6 - cicloesil - NECA.

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1D O C K I N G D E L L A M O L E C O L A N6 - C I C L O E S I L - N E C AN E L R E C E T T O R E A 3 A D E N O S I N I C O

indice

1.1 Scopo della Tesina 11.2 Parte Sperimentale 11.3 Risultati e Discussione 71.4 Elenco files creati 9

1.1 scopo della tesina

Lo scopo della tesina è studiare le interazioni tra la molecola N6-cicloesil-NECA ed il recettore A3 adenosinico. A tale proposito il tipodi calcolo che si è scelto di adoperare è un docking. Il docking hala funzione di individuare quelle molecole che possono occupare unospecifico sito di legame in una macromolecola e di studiarne la dis-tribuzione spaziale. Questa ultima tecnica richiede la conoscenza dellastruttura del sito di legame, che può essere acquisita tramite tecnichecristallografiche a raggi X, NMR e/o modellazione per omologia construtture note. I metodi di docking posizionano un ligando nel sitodi legame di una proteina mediante ottimizzazione della complemen-tarità sterica, idrofobica ed elettrostatica e, in alcuni casi, mediante lastima dell’energia libera d’interazione (scoring).

Nella parte sperimentale si utilizzerà la meccanica molecolare pereseguire la minimizzazione e l’analisi conformazionale del ligando, peril docking manuale, per determinare le cariche dei residui aminoacidici delcomplesso e per la dinamica e minimizzazione del complesso; si utilizzerà in-vece la meccanica quantistica solo per determinare le cariche del ligan-do, in quanto essa non è applicabile a macromolecole come le proteine,a causa dell’elevata potenza di calcolo che sarebbe necessaria.

Al termine dello studio ci si attende di individuare nel complessoquelle interazioni ligando-recettore indicate dalla mutagenesi: Ser 60-His 147, che interagiscono mediante legame idrogeno con il ribosio, eLeu 127, che interagisce con il cicloesile mediante forze di dispersione.

1.2 parte sperimentale

Sotto sistema operativo Linux, si costruisce la molecola con Mae-stro, usando il modulo Edit/Build, e si salva con Project/Export comeligandonuovo.mae.

Di seguito, attraverso il modulo Project/Delete Project e Project/Im- Minimizzazione delligando.port Structure, si carica la molecola. Si esegue quindi una minimiz-

zazione con il modulo MacroModel/Minimization, impostando comeForce Field MMFFs e come metodo di minimizzazione PRCG a 5000

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Docking manuale 1.2. PARTE SPERIMENTALE

step, lasciando gli altri parametri impostati di default. Si ottiene cosìil ligando minimizzato (N6cicloesilNECAmini.mae).

Sulla molecola minimizzata si esegue l’analisi conformazionale usando Analisi conformazionaledel ligando.il modulo MacroModel/Conformational Search, impostando “energy

window for saving structures” a 10 kJ/mol nel modulo Perform Au-tomatic Setup, e nominando il Job “analisiconformazionale”, mentregli altri parametri rimangono di default, compresi i 500 step di PRCG.Terminata l’analisi conformazionale, si importa (Project/Import Struc-tures) il file analisiconformazionale-out.mae dal quale si seleziona la con-formazione pi˘ stabile disattivando Import all Structures e ponendoStart uguale a 1. Viene salvato quindi il ligando sia come file diMaestro sia in formato PDB (conformstabile.mae e conformstabile.pdb).

Attraverso il modulo Project/Delete Project e Project/Import Struc- Docking manuale.

ture si importa il recettore A3 (A3receptor.pdb); successivamente si ag-giunge la conformazione più stabile del ligando (conformstabile.mae)togliendo la conferma “Replace Workspace” del modulo Import Struc-ture: viene così posizionato il ligando nel recettore, in modo che possaessere eseguito un docking manuale al fine di far interagire il ligandocon i residui aminoacidici indicati dalla mutagenesi (Ser 60-His 147,che interagiscono mediante legame idrogeno con il ribosio, e Leu 127,che interagisce con il cicloesile mediante forze di dispersione). Per fa-cilitare il lavoro con il solo ligando e i residui interessati, nel moduloDisplay/Display-Undisplay Atoms si evidenzia la voce “Display On-ly/Pick” e sul workspace si clicca sul ligando; di seguito attraverso ilmodulo Display/Display-Undisplay Atoms/Also Display/Pick/Selec-t/Residue si inseriscono i numeri dei residui indicati dalla mutagenesi(60,127,147), così da mantenere anche questi soli aminoacidi;questi ultimi sono stati inoltre colorati (es. modulo Display/Atom Col-oring/Atom Color/(azzurro)/Select/Residue/“Atom Number in En-try” 60/Add/OK), nominati e numerati (modulo Display/Atom La-bels/Composition/si seleziona solo “Residue Name” e “Residue Num-ber”, deselezionando tutto il resto/Pick: si clicca quindi nelworkspace su un punto dell’aminoacido/). Per spostare il ligando trai tre residui indipendentemente da essi, viene attivato il modulo Ad-vanced Transformations attraverso il relativo pulsante (Local transfor-mation) collocato nella barra degli strumenti, e tenendolo premuto siscorre nel men˘ a finestra fino a selezionare Global/Local; nella fines-tra “Advanced Transformations” si deve attivare Pick, Molecole, ShowMarkers e Local: si è così in grado di muovere il ligando (ora eviden-ziato) indipendentemente dai residui per collocarlo al meglio al finedi realizzare quelle interazioni definite dalla mutagenesi. Il dockingmanuale va eseguito tenendo presente il range entro cui necessita checadano le interazioni idrofobiche che devono verificarsi tra la Leu 127

e il cicloesile (3,5-5 Å), e la distanza di 2,5 Å per i legami idrogeno(impostata di default nel modulo Analysis/Measurements/H-Bonds//“Max.Distance” 2,50): attraverso quindi il modulo Analysis/Measure-ments/Distances/Pick, Atom, Show Markers, si evidenzia la distanzaal momento più piccola tra un carbonio del cicloesile e un carboniodella Leu 127 e la si ottimizza portandosi nel range previsto; di se-guito, attraverso il modulo Analysis/Measurements/H-Bonds/AtomSet 1/All, si permette la visualizzazione dei legami idrogeno, così dapoter muovere la molecola in maniera opportuna perché si realizzi-

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Docking manuale 1.2. PARTE SPERIMENTALE

no, badando a conservare anche la distanza richiesta per l’interazioneidrofobica del cicloesile. Completato il docking manuale2, per tornarea muovere ligando e recettore in blocco, si seleziona la funzione Globalnel modulo Advanced Transformations.

Figura 2: Risultato docking manuale.

Una volta che il ligando è posizionato nel sito recettoriale, per torna- Creazione complessoligando-recettore.re alla visualizzazione in toto del complesso si evidenzia la voce “Al-

so Display/Pick/ All” nel modulo Display/Display-Undisplay Atoms.A questo punto si crea il complesso con Project/“Create entry fromworkspace” e si salva (Project/Export) come file di Maestro(complessononmini.mae3). Su questo complesso si studia se esistono an-che altri aminoacidi che interagiscono con il ligando, oltre a quelliindicati dalla mutagenesi: risultano altri tre aminoacidi (Val 36, cheinteragisce con l’ossigeno 2604 del ribosio, Ala 32, che interagiscecon l’idrogeno 2647 dell’amide, Ser 146, che interagisce con l’azoto2610 dell’adenina) interessati da legami idrogeno col ligando, e seiaminoacidi (Thr 57 e Ile 61, che interagiscono con l’adenina, Ile 143,che interagisce con il cicloesile, e Ile 8, Val 36, Ala 12 che interagisconocon l’etile) interessati da interazioni idrofobiche.

Sul file complessononmini.mae3, dal modulo MacroModel, si de- Determinazione caricheresidui aminoacidici.terminano le cariche elettrostatiche dei residui mediante un calcolo

di Current Energy, impostando come Force Field Amber*, CostanteDielettrica uguale a 4 e Trattamento Elettrostatico “distance depen-dant”: viene rilevato un problema per gli idrogeni e i lone pairs noncompatibili con il Force Field impiegato; si risolve andando nel mod-ulo Edit/Build/Hydrogen Treatment, indicando come treatments “AllAtoms with No-Lp”/All. Si ripete quindi il calcolo di Current Energye si ottiene il file di output (caricheresiduinew-out.mae), nel quale le

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Docking manuale 1.2. PARTE SPERIMENTALE

Figura 3: complessononmini.mae: residui aminoacidici che danno ulteriori in-terazioni con il ligando. In verde quelli dettati dalla mutagenesi,in azzurro quelli che instaurano legami a idrogeno e in marronequelli che danno interazioni idrofobiche. La Val 36 instaura ancheun’interazione idrofobica.

ultime due colonne riportano le cariche elettriche.A questo punto si determinano le cariche del ligando tramite un Determinazione cariche

ligando.calcolo quantomeccanico HF/6-31G* sul ligando già in precedenzaminimizzato con la meccanica molecolare (conformstabile.pdb1.2, prece-dentemente salvato): sempre sotto sistema operativo Linux, tramitecomando gv viene aperto GView e da esso il file ligando.pdb; alla do-manda posta di volere o no aggiungere gli idrogeni, si sceglie la voceNO. Di seguito, attraverso il modulo Calcolate/Gaussian si esegue unsettaggio con Job Type “Energy”, metodo “Hartree-Fock”, set di base“ST03G”; digitando Edit per visualizzare il file di input, viene chiestodi salvare il “Gaussian input file”: si seleziona quindi SI e si salvacome file “.com” [è anche possibile scegliere se visualizzare il file diinput con coordinate cartesiane (x, y, z), o mediante Z-matrix: si de-cide di non selezionare “Write Cartesians”, così da avere un file diinput con geometria descritta da una Z-matrix.]. Creato il file di in-put (ligando.com) si lancia il calcolo con Gaussian 98; ottenuto il filedi output (ligando.log), in esso è possibile leggere le cariche parzialidel ligando visualizzabili anche tramite GView: aperto il file di out-put (File/Open. . . /ligando.log), attraverso il modulo Results/Chargesviene evidenziata la voce “Show Charge Numbers” per visualizzarele cariche dei singoli atomi del ligando; volendo numerare gli atomidel ligando, è sufficiente cliccare col tasto destro del mouse nell’in-torno del ligando e selezionare la voce “Labels”. Dopo questa ese-cuzione del calcolo quantomeccanico, ti torna su Maestro e si impor-

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Docking manuale 1.2. PARTE SPERIMENTALE

ta il file caricheresiduinew-out.mae. Di seguito attraverso il modu-lo Display/Display-Undisplay Atoms si attiva l’opzione Display On-ly/Pick e si clicca nel workspace su un punto del ligando cosicché siail solo visualizzato. A questo punto vengono quindi numerati gli atomidel ligando attraverso il modulo Display/Atom Labels evidenziandola sola voce Atom Number; si fa un confronto tra la numerazione delligando ottenuta in Maestro e quella del GView (sono uguali, con lasola differenza che in GView la numerazione va da 1 a 54, mentre inMaestro va da 2601 a 2654, per la presenza degli atomi della proteinanel complesso), e si sfrutta questo riferimento per andare a sostituirenel file caricheresiduinew-out.mae i valori delle cariche parziali del lig-ando generate da MacroModel (che sono a 6 cifre significative e ripar-tite in duplice copia sulle ultime due colonne) con quelle provenientidal calcolo quantomeccanico (che sono a 7 cifre significative: quindi sidovrà fare un arrotondamento sull’ultima cifra per inserirle nel file diMaestro, controllando alla fine che la carica netta del ligando continuia risultare zero come da calcolo quantomeccanico; a tale proposito,risulta necessario correggere gli arrotondamenti, e si è operato sugliatomi 2608, 2616, 2630, 2631), e il file così modificato viene salvato erinominato in modo che MacroModel lo riconosca come file di inputper Maestro (caricheresiduinewmodificato.mae).

A questo punto, attraverso il modulo Project/Delete Project e Projec- Dinamica del complesso.

t/Import Structure, si importa il file caricheresiduinewmodificato.maee si lancia una dinamica attraverso il modulo MacroModel/Dynam-ics, impostando come Force Field Amber*, Trattamento Elettrostatico“distance dependant”, Costante Dielettrica uguale a 4 e Charges from“structure file”; viene settato il Simulation time a 50 ps, e vengono an-che messi dei costraints di 100 kJ/mol sui Cα della proteina attraver-so il percorso Costraint/Atoms/Select/PDB Type/CA/Add/OK, cosìda bloccare il backbone della proteina e vedere solo il ligando e lecatene laterali della proteina interessate dalla dinamica; tutti gli altriparametri vengono lasciati impostati di default e si nomina il file comedinamicanewnonmini.

Terminato il calcolo, si importa il file dinamicanewnonmini-out.mae, Minimizzazione delcomplesso.e su di esso si esegue una minimizzazione attraverso il modulo Macro-

Model/Minimization, con 20000 step di PRCG, mantenendo i costraintssui Cα e nominando il file (dinamicanewmini).

Finito il calcolo, si apre il file finale (dinamicanewmini-out.mae4). Si Preparazione all’analisidei risultati.analizza quindi il risultato per vedere se sono state mantenute quelle

interazioni dettate dalla mutagenesi e viste nel filecomplessononmini.mae3, e per confrontare la posizione finale del lig-ando con quella iniziale5: per quest’ultimo proposito, sono stati ap-positamente creati e salvati due files di cui uno sulla base del filecomplessononmini.mae3 (modificato nella visualizzazione del solo lig-ando, che viene colorato in azzurro e rappresentato a tubo: confron-tonuovo.mae), e l’altro sulla base del file dinamicanewmini-out.mae4

(modificato anch’esso nel tipo di rappresentazione del ligando, scegli-endo anche qui una rappresentazione a tubo, senza però interveniresul colore del ligando: confronto2post.mae) per una migliore visionegrafica al momento della sovrapposizione, e di seguito sono stati im-portati contemporaneamente gli stessi files (confronto2post.mae e con-frontonuovo.mae, deselezionando la voce “Replace Workspace” del

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Docking manuale 1.2. PARTE SPERIMENTALE

Figura 4: Dinamica minimizzata: tutte le interazioni viste nel filecomplessononmini.mae3 sono state perse.

modulo Project/Import Structure per il secondo file da importare), perpoi sovrapporli mediante il modulo Analysis/Superposition (Superim-pose)/All. Nel workspace vengono visualizzati i soli ligandi attraversoil modulo Display/Display-Undisplay Atoms/Display Only/Pick/Se-lect/Atom/2601-2654.

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Docking manuale 1.3. RISULTATI E DISCUSSIONE

Figura 5: I due ligandi, pre- e post-dinamica minimizzata, sovrapposti e messia confronto. In azzurro il ligando pre-dinamica.

1.3 risultati e discussione

Le α-eliche del complesso sono state mantenute dopo la dinamicaminimizzata: si sovrappongono bene infatti6 con quelle del comp-lesso pre-dinamica minimizzata. La posizione del ligando N6-cicloesil-NECA assunta però al termine della dinamica e minimizzazione delcomplesso risulta lontana da quella iniziale ottenuta col docking man-uale [dopo la dinamica minimizzata, infatti, la distanza minima ril-evata per un’interazione idrofobica del cicloesile del ligando (atomo2629) con la Leu 127 (atomo 2065) è di 5,806 Å, mentre le interazionidi tipo legame a idrogeno diventano rispettivamente di 10,822 Å perl’interazione del ribosio (atomo 2618) con la Ser 60 (atomo 941), e di7,616 Å per l’interazione sempre del ribosio (atomo 2646) con la His147 (atomo 2413)], ed è tale per cui non si hanno più quelle interazioninecessarie, dettate anche da studi di mutagenesi, che vedono interes-sati i residui aminoacidici Ser 60, Leu 127 e His 147, che definiscono ilsito recettoriale del recettore A3 adenosinico. La molecola N6-cicloesil-NECA sembra quindi incapace di occupare lo specifico sito di legamenel recettore; risulta invece7 che instauri due interazioni di tipo legami aidrogeno (di cui una tra l’azoto 2614 dell’adenina e l’idrogeno 2138 del-la Asn 131, e l’altra tra l’idrogeno 2619 dell’adenina e l’ossigeno 2132

dell’Asn 131), e sette interazioni idrofobiche con i residui aminoacidiciLeu 54, Ile 130, Ile 134, Tyr 135 e Leu 139 (con distanze comprese tra3,994 Å e 4,959 Å).

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Docking manuale 1.3. RISULTATI E DISCUSSIONE

Figura 6: Sovrapposizione delle due α-eliche: in verde i residui pre-dinamica.

Figura 7: Visualizzazione delle interazioni che si instaurano nel complessodopo la dinamica minimizzata.

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Docking manuale 1.4. ELENCO FILES CREATI

1.4 elenco files creati e inseriti nella cartella

files_finali_volper

1. ligandonuovo.mae: file di input del mio ligando costruito con ilmodulo Edit/Build di Maestro e salvato1.2;

2. N6cicloesilNECAmini-out.mae: file di output della minimizzazionedel ligando1.2;

3. analisiconformazionale.log: file relativo ai calcoli di analisi confor-mazionale del ligando minimizzato1.2;

4. analisiconformazionale-out.mae: file di output dell’analisi confor-mazionale del ligando minimizzato1.2;

5. conformstabile.pdb: file del ligando dopo minimizzazione ed anal-isi conformazionale1.2;

6. complessononmini.mae: file di input del complesso ottenuto con ildocking manuale del ligando nel recettore1.2,3;

7. dinamicanewnonmini.log: file relativo ai calcoli di dinamica mole-colare pre-minimizzazione1.2;

8. dinamicanewmini.log: file relativo ai calcoli di minimizzazionepost-dinamica1.2;

9. dinamicanewmini-out.mae: file di output della minimizzazione delcomplesso dopo la dinamica1.2,4;

10. ligando.log: file di output delle cariche del ligando ottenuto concalcolo quantomeccanico (G98)1.2.

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colophon

La presente Tesina è stata scritta dall’autore con LATEX usando lo stileClassicThesis di André Miede, associato al pacchetto Fancyhdr per gestireil layout di pagina. Il lavoro è stato composto con il font Palatino, diHermann Zapf .

Gioacchino Riccardo Volpe

riccardo_volpe@hotmail.com

Versione finale: Pisa, 2 ottobre 2009.

Figura 8: Gioacchino Riccardo Volpe