Università degli Studi di Napoli Federico II Master II ... 2013_2014... · Attuabile con...

Università degli Studi di Napoli Federico IIMaster II livello - REACH

Tecniche avanzate diSpettrometria di Massa per la

Caratterizzazione delle Sostanze Chimiche

Sergio Fasan+39 347 5907720

[email protected]

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Tecniche avanzate diSpettrometria di Massa per la

Caratterizzazione delle Sostanze Chimiche

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SPETTROMETRIA DI MASSA: COS’E’?SPETTROMETRIA DI MASSA: COS’E’?

Tecnica analitica in grado di separare una misceladi ioni in base al loro rapporto massa/carica (m/z)

SPETTROMETRO DI MASSASPETTROMETRO DI MASSA -- COMPONENTICOMPONENTI

Interfacce: transfer line, raccordi e connessioni tracromatografo e sorgente.

Sorgenti: Electronic Impact (EI)Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)Atmospheric Pressure Photoionization (APPI)Electrospray (ESI)Matrix Assisted Laser Desorbtion (MALDI)Plasma (ICP)Bombardamento con atomi veloci (FAB)

Analizzatori: magnetico;quadrupolare;a trappola ionica;a tempo di volo (TOF);ibrido e/o composto;

Sorgenti: Electronic Impact (EI)Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)Atmospheric Pressure Photoionization (APPI)Electrospray (ESI)Matrix Assisted Laser Desorbtion (MALDI)Plasma (ICP)Bombardamento con atomi veloci (FAB)

Detector: EM; PM

RANGE DI APPLICAZIONE TECNICHE LC/MSRANGE DI APPLICAZIONE TECNICHE LC/MS

Fonte: Agilent Technologies

SORGENTE APSORGENTE AP--ESI (modalità positiva)ESI (modalità positiva)(Atmospheric Pressure(Atmospheric Pressure –– ElectroSpray Ionization)ElectroSpray Ionization)

1) Gli analiti e la fase mobile (es. metanolo, acqua, acetonitrile e loro miscele contenente unbassa concentrazione di acido organico come ac. formico o acetico) vengono nebulizzatiutilizzando un flusso di gas caldo (azoto, T = ca 300°C);

2) La fase mobile evapora dalle microgoccioline (desolvatazione);3) La densità di carica delle microgocce aumenta fino a portare alla loro esplosione (esplosione

di Coulomb) con formazione di goccioline ancora più piccole;4) sotto l’influenza del campo elettromagnetico ad alto potenziale (variabile in funzione

dell'analita) gli ioni vengono desorbiti dalle microgocce e indirizzati verso l’analizzatore.

SORGENTE ESISORGENTE ESI -- IONIZZAZIONE POSITIVA E NEGATIVAIONIZZAZIONE POSITIVA E NEGATIVA

SORGENTE ESISORGENTE ESI -- PRO E CONTROPRO E CONTRO

VANTAGGI- natura "soft" (a basso trasferimento di energia) del processo di ionizzazione, che

consente di conservare intatti ioni molecolari di molecole anche molto labili;- alta sensibilità della tecnica nei confronti di analiti a polarità medio-alta;- capacità di formare ioni a cariche multiple con biopolimeri ad alto peso molecolare

(aumentando il range di applicazione);- facilità di manutenzione della sorgente.

SVANTAGGI- forte influenza della chimica della soluzione sul processo di ionizzazione (gli analiti

sono desorbiti da goccioline di solvente proveniente dal sistema LC)- scarsa sensibilità per analiti a bassa polarità (con bassa capacità di ionizzazione in

soluzione)- possibilità di formazione di diversi ioni addotti con alcune specie (questo può

complicare notevolmente l'interpretazione spettrale),- diminuzione della sensibilità ad alti flussi (a causa della scarsa nebulizzazione,

carica delle gocce inadeguata e/o calore insufficiente per desolvatare le goccerapidamente)

VANTAGGI- natura "soft" (a basso trasferimento di energia) del processo di ionizzazione, che

consente di conservare intatti ioni molecolari di molecole anche molto labili;- alta sensibilità della tecnica nei confronti di analiti a polarità medio-alta;- capacità di formare ioni a cariche multiple con biopolimeri ad alto peso molecolare

(aumentando il range di applicazione);- facilità di manutenzione della sorgente.

SVANTAGGI- forte influenza della chimica della soluzione sul processo di ionizzazione (gli analiti

sono desorbiti da goccioline di solvente proveniente dal sistema LC)- scarsa sensibilità per analiti a bassa polarità (con bassa capacità di ionizzazione in

soluzione)- possibilità di formazione di diversi ioni addotti con alcune specie (questo può

complicare notevolmente l'interpretazione spettrale),- diminuzione della sensibilità ad alti flussi (a causa della scarsa nebulizzazione,

carica delle gocce inadeguata e/o calore insufficiente per desolvatare le goccerapidamente)

SORGENTE APCI (modalità positiva)SORGENTE APCI (modalità positiva)(Atmospheric Pressure Chemical Ionization)(Atmospheric Pressure Chemical Ionization)

1) Gli analiti e la fase mobile vengono nebulizzati in un nebulizzatore ad alta T (ca500°C) utilizzando un flusso di gas (azoto);

2) La gocce vengono vaporizzate;3) Il gas e le molecole della fase mobile vengono ionizzati nella zona adiacente

all’ago Corona;4) Gli analiti vengono ionizzati dagli ioni delle fase mobile.

SORGENTE APCISORGENTE APCI -- IONIZZAZIONE POSITIVA E NEGATIVAIONIZZAZIONE POSITIVA E NEGATIVA

SORGENTE APCISORGENTE APCI -- PRO E CONTROPRO E CONTRO

VANTAGGI- Complemetare alla tecnica ESI per analiti poco polari- Buona sensibilità per composti con polarità e MW intermedi;- Meno sensibile ad effetti legati alla composizione chimica della soluzione;- Tollera flussi più alti senza diminuzione della sensibilità.

SVANTAGGI- Poco idoena per composti termosensibili;- È necessario che gli analiti presentino una certa volatilità.

VANTAGGI- Complemetare alla tecnica ESI per analiti poco polari- Buona sensibilità per composti con polarità e MW intermedi;- Meno sensibile ad effetti legati alla composizione chimica della soluzione;- Tollera flussi più alti senza diminuzione della sensibilità.

SVANTAGGI- Poco idoena per composti termosensibili;- È necessario che gli analiti presentino una certa volatilità.

ANALIZZATORI MAGNETICIANALIZZATORI MAGNETICITrace GC 200 series / Finnigan MAT 95 XL HRMS Thermo Finnigan

bassa risoluzioneGC/MS

alta risoluzioneGC/HRMS

ANALIZZATORI QUADRUPOLARIANALIZZATORI QUADRUPOLARI

GC/MS o LC/MS

GC 5890 / MS 5973 Agilent

ANALIZZATORI A TRAPPOLA IONICAANALIZZATORI A TRAPPOLA IONICA

GC/MS LC/MSGC/MS/MSGC/MSn

LC/MS/MSLC/MSn

ANALIZZATORI A TRAPPOLA IONICA QUADRUPOLAREANALIZZATORI A TRAPPOLA IONICA QUADRUPOLARE

Agli elettrodi è applicata una tensione a corrente continua (DC) o alternata aradiofrequenza (RF).3 modalità di funzionamento:1) Tensione costante RF e nessuna tensione DC: tra gli elettrodi rimarranno gliioni al di sopra di un certo rapporto m/z, aumentando RF aumenta il limiteinferiore di m/z e si espellono gli ioni (modalità a instabilità di massa selettiva)2) Tensione DC tra le calotte: c'è un limite inferiore e uno superiore di m/z3) Tensione DC tra le calotte + campo oscillante ausiliario: gli ioni selezionatipossono aumentare la propria energia cinetica e collidere, usato nellaspettrometria di massa tandem

Agli elettrodi è applicata una tensione a corrente continua (DC) o alternata aradiofrequenza (RF).3 modalità di funzionamento:1) Tensione costante RF e nessuna tensione DC: tra gli elettrodi rimarranno gliioni al di sopra di un certo rapporto m/z, aumentando RF aumenta il limiteinferiore di m/z e si espellono gli ioni (modalità a instabilità di massa selettiva)2) Tensione DC tra le calotte: c'è un limite inferiore e uno superiore di m/z3) Tensione DC tra le calotte + campo oscillante ausiliario: gli ioni selezionatipossono aumentare la propria energia cinetica e collidere, usato nellaspettrometria di massa tandem

HPLC 1100 / MSD Trap XCT (Agilent Technologies)

ANALIZZATORI A TRAPPOLA IONICAANALIZZATORI A TRAPPOLA IONICA

ANALIZZATORI A TEMPO DI VOLO TOF (TIME OF FLIGHT)ANALIZZATORI A TEMPO DI VOLO TOF (TIME OF FLIGHT)

GC/TOFLC/TOF

accuratezza di massa ≤ 5 ppmrisoluzione: ca 6.000


Waters MicromassUPLC/PDA/ESI-TOF

cromatografo

1°rivelatore

sorgente analizzatore

2°rivelatorespettrometro di massa

- Doppio quadrupolo (es. Agilent, Waters, AB);

ANALIZZATORI COMPOSTI E/O "IBRIDI"ANALIZZATORI COMPOSTI E/O "IBRIDI"

- Triplo quadrupolo (es. Thermo, Varian);- Quadrupolo - TOF (Q-TOF o TOF-Q);

- Quadrupolo - Trappola ionica (Q-Trap);- Quadrupolo - Trappola ionica (Q-Trap);

- Orbi-Trap;

- ...;

ANALIZZATORI COMPOSTI A DOPPIO QUADRUPOLOANALIZZATORI COMPOSTI A DOPPIO QUADRUPOLOLC/MS/MS e GC/MS/MSLC/MS/MS e GC/MS/MS

UPLC / Quattro Premier XE Waters Micromass

Quattro Micro GCGC 5890 Agilent Technologies / Quattro Micro

MS/MS Waters Micromass

ANALIZZATORE COMPOSTO A TRIPLO QUADRUPOLOANALIZZATORE COMPOSTO A TRIPLO QUADRUPOLO

NB: Modelli LC/MS/MS costituti effettivamente da un analizzatori a TRIPLOQUADRUPOLO sono prodotti da Thermo e Varian (ora Agilent).

Gli altri produttori (es. Agilent, Waters/Micromass) propongono modelli aDOPPIO QUADRUPOLO mentre come cella di collisione vengono utilizzatidispositivi diversi in funzione del produttore (OTTAPOLO da Agilent, T-WAVE / Tri-WAVE Waters, ecc.) anche se per scopi puramente"commerciali" vengono denominati come tripli quadrupoli (cfr. "QQQ"Agilent, "Triple Quad" Waters)

ANALIZZATORE COMPOSTO QANALIZZATORE COMPOSTO Q--TOFTOF

Fonte: Waters (www.waters.com)

CELLA DI COLLISIONE TRI-WAVE UTILIZZATA IN PRODOTTI WATERS

Fonte: Waters (http://www.waters.com/waters/nav.htm?cid=10099686)

ANALIZZATORE COMPOSTO ORBITRAPANALIZZATORE COMPOSTO ORBITRAP

Fonte: Thermo Scientific (www.thermo.com)


- Full Scan MSScansione completa nel range m/z selezionato.La tecnica ha una bassa sensibilità ad eccezione per analizzatori tipo Ion Trap in cuigli ioni sono raccolti per tempi più lunghi mantenendo tutte le informazioni.In questo caso è possibile estrarre in tempo reale il tracciato relativo a qualsiasi ionecompreso nel range selezionato.

MODALITA’ DI ACQUISIZIONE DEI DATI (1)MODALITA’ DI ACQUISIZIONE DEI DATI (1)

- Selected/Multiple Ion Monitoring (SIM/MIM)Vengono rilevati solo uno o più ioni m/z selezionati e caratteristici della sostanza.La tecnica garantisce un’elevata sensibilità e specificità a discapito del numero diinformazioni ricavabili.

- Selected/Multiple Ion Monitoring (SIM/MIM)Vengono rilevati solo uno o più ioni m/z selezionati e caratteristici della sostanza.La tecnica garantisce un’elevata sensibilità e specificità a discapito del numero diinformazioni ricavabili.

- Product Ion / Daughters Scan (MS/MS o MSn)Uno ione m/z selezionato, trasmesso dal primo analizzatore (Q1, se quadrupolare)viene frammentato nella cella di collisione (Q2) generando caratteristici ioni chevengono rilevati dal terzo analizzatore (Q3) che opera in Full Scan MS fornendo lospettro completo dello ione selezionato da Q1.

MODALITA’ DI ACQUISIZIONE DEI DATI (2)MODALITA’ DI ACQUISIZIONE DEI DATI (2)

- Selected/Multiple Reaction Monitoring (SRM/MRM)Gli ioni precursori selezionati dal primo analizzatore vengono fatti frammentare nelsecondo analizzatore producendo uno o più ioni prodotto (Product Ions) che vengonoaccumulati nel terzo analizzatore (secondo stadio) che isola solo lo/gli ione/i prodottoche presenta/no il rapporto m/z prescelto producendo uno spettro di massa SRM/MRM.

- Neutral Loss Scan (NL)Attuabile con analizzatori a triplo quadrupolo, sia il Q1 che il Q3 lavorano in Full scan macon una differenza costante tra i range di scansione corrispondente al valore di perditaneutra selezionato, mentre nella cella di collisione (Q2) avviene la frammentazione. Lospettro risultante indica quali ioni frammentandosi perdono una specie neutra uguale alladifferenza Q1-Q3.Viene utilizzato nell’analisi specifica di classi di composti che hanno gruppi funzionali ocaratteristiche strutturali in comune.

- Neutral Loss Scan (NL)Attuabile con analizzatori a triplo quadrupolo, sia il Q1 che il Q3 lavorano in Full scan macon una differenza costante tra i range di scansione corrispondente al valore di perditaneutra selezionato, mentre nella cella di collisione (Q2) avviene la frammentazione. Lospettro risultante indica quali ioni frammentandosi perdono una specie neutra uguale alladifferenza Q1-Q3.Viene utilizzato nell’analisi specifica di classi di composti che hanno gruppi funzionali ocaratteristiche strutturali in comune.

- Precursor Ion Scan (PIS)Q1 lavora in modalità Full Scan, Q2 funge da cella di collisione, mentre Q3 opera in SIM,permettendo di evidenziare la presenza di tutti i composti presenti in una miscelacomplessa il cui ione molecolare frammenta producendo un determinato ione frammentoselezionato preventivamente. Utile per rivelare composti strutturalmente simili aventi unframmento comune (es. metaboliti)

Unità di massa atomica (amu) o Dalton: unità di misura utilizzata permisurare la massa su scala atomica definita come 1/12 della massa diun atomo di Carbonio-12 (12C).

Massa molecolare: massa di una specifica molecola espressa in amu

Massa molecolare media: massa molecolare calcolata prendendo perciascun elemento la massa atomica media, cioè la media ponderaledelle masse esatte degli isotopi presenti in natura di quel particolareelemento, che corrisponde numericamente al Peso Atomico riportatonella tabella periodica degli elementi. Viene espressa in amu.

Peso molecolare o Massa molecolare relativa: massa molecolare divisaper 1 amu. E’ un numero adimensionale numericamente equivalentealla massa molecolare media.

Isotopi: atomi aventi stesso numero atomico (Z) ma diverso numero dineutroni.

MASSA ESATTA E MASSA ACCURATA (DEFINIZIONI)MASSA ESATTA E MASSA ACCURATA (DEFINIZIONI)

Unità di massa atomica (amu) o Dalton: unità di misura utilizzata permisurare la massa su scala atomica definita come 1/12 della massa diun atomo di Carbonio-12 (12C).

Massa molecolare: massa di una specifica molecola espressa in amu

Massa molecolare media: massa molecolare calcolata prendendo perciascun elemento la massa atomica media, cioè la media ponderaledelle masse esatte degli isotopi presenti in natura di quel particolareelemento, che corrisponde numericamente al Peso Atomico riportatonella tabella periodica degli elementi. Viene espressa in amu.

Peso molecolare o Massa molecolare relativa: massa molecolare divisaper 1 amu. E’ un numero adimensionale numericamente equivalentealla massa molecolare media.

Isotopi: atomi aventi stesso numero atomico (Z) ma diverso numero dineutroni.

Massa esatta: massa molecolare di una molecola calcolataconsiderando, per ciascun elemento, la massa dei singoli isotopi degliatomi dell’elemento considerato.E’ un valore teorico che può essere calcolato utilizzando strumentidisponibili on-line (es. http://library.med.utah.edu/masspec/mole.htm)

Massa monoisotopica: massa esatta di una molecola calcolataconsiderando per ciascun elemento la massa esatta dell’isotopo piùabbondante presente in natura

Massa accurata: massa molecolare misurata sperimentalmente. E’ unaapprossimazione della massa esatta monoisotopica.

MASSA ESATTA E MASSA ACCURATA (DEFINIZIONI)MASSA ESATTA E MASSA ACCURATA (DEFINIZIONI)

Massa esatta: massa molecolare di una molecola calcolataconsiderando, per ciascun elemento, la massa dei singoli isotopi degliatomi dell’elemento considerato.E’ un valore teorico che può essere calcolato utilizzando strumentidisponibili on-line (es. http://library.med.utah.edu/masspec/mole.htm)

Massa monoisotopica: massa esatta di una molecola calcolataconsiderando per ciascun elemento la massa esatta dell’isotopo piùabbondante presente in natura

Massa accurata: massa molecolare misurata sperimentalmente. E’ unaapprossimazione della massa esatta monoisotopica.

MASSA AD ALTA RISOLUZIONE (HRMS)MASSA AD ALTA RISOLUZIONE (HRMS)

Potere risolutivo: capacità di separare tra di loro ioni di uguale massanominale ma diversa massa esatta misurata secondo la formula:R = M1 / (M2-M1)misurati per convenzione su coppie di segnali di intensitàequivalente separati tra di loro da una valle (h) alta il 10% dell'altezza(H).


Delta (D): differenza tra massa accurata e massa esatta espressa inmmu (millimass unit).

Errore o accuratezza: rapporto tra il Delta e la massa esatta espressoin ppm

(Eppm) = D / mesatta x 106

Errore quadratico medio (RMS): errore medio calcolato sulla base diun numero ripetuto di misure effettuate su uno ione m/z di un picco(m/z) di riferimento

Delta (D): differenza tra massa accurata e massa esatta espressa inmmu (millimass unit).

Errore o accuratezza: rapporto tra il Delta e la massa esatta espressoin ppm

(Eppm) = D / mesatta x 106

Errore quadratico medio (RMS): errore medio calcolato sulla base diun numero ripetuto di misure effettuate su uno ione m/z di un picco(m/z) di riferimento

PESO ATOMICOPESO ATOMICO -- Esempio (idrogeno)Esempio (idrogeno)

Peso atomico dell'Idrogeno riportato nella Tabella Periodica:

Il peso atomico dell’idrogeno, pari a 1,00794 è ottenuto consideranto che1 grammoatomo di H è costituito dal 99,985% di 1H e 0,015% di 2H(Deuterio), mentre 3H (Trizio) è radioattivo e decade molto velocemente.Di conseguenza per la determinazione del peso atomico dell'idrogeno (H)bisognerà calcolare la media ponderata considerando la percentualerelativa e il peso atomico esatto dei 2 isotopi stabili 1H e 2H.

Peso atomico dell'Idrogeno riportato nella Tabella Periodica:

Il peso atomico dell’idrogeno, pari a 1,00794 è ottenuto consideranto che1 grammoatomo di H è costituito dal 99,985% di 1H e 0,015% di 2H(Deuterio), mentre 3H (Trizio) è radioattivo e decade molto velocemente.Di conseguenza per la determinazione del peso atomico dell'idrogeno (H)bisognerà calcolare la media ponderata considerando la percentualerelativa e il peso atomico esatto dei 2 isotopi stabili 1H e 2H.

PESO MOLECOLARE RELATIVO E MASSA ESATTAPESO MOLECOLARE RELATIVO E MASSA ESATTA

Esempio: composto dello zincoFormula bruta: C45H28N4OZnPeso molecolare relativo (tavola periodica): 706.1324Massa esatta: 704.1555 amu

Questa differenza tra le due misure è dovuta al fatto che lo zinco possiede5 isotopi naturali, il più abbondante dei quali pesa 63.9291 amu.

Questo è il valore impiegato nel calcolo della massa esatta anche sel'isotopo ha una abbondanza in natura pari al 48.6%.Gli altri 4 isotopi, meno abbondanti ma più pesanti, contribuisconosignificativamente alla differenza tra il peso atomico dello zinco e quellodell’isotopo più abbondante influendo in modo determinante sulladifferenza tra PM e massa esatta della molecola considerata.

Esempio: composto dello zincoFormula bruta: C45H28N4OZnPeso molecolare relativo (tavola periodica): 706.1324Massa esatta: 704.1555 amu

Questa differenza tra le due misure è dovuta al fatto che lo zinco possiede5 isotopi naturali, il più abbondante dei quali pesa 63.9291 amu.

Questo è il valore impiegato nel calcolo della massa esatta anche sel'isotopo ha una abbondanza in natura pari al 48.6%.Gli altri 4 isotopi, meno abbondanti ma più pesanti, contribuisconosignificativamente alla differenza tra il peso atomico dello zinco e quellodell’isotopo più abbondante influendo in modo determinante sulladifferenza tra PM e massa esatta della molecola considerata.


Per effettuare misurare sperimentali di massa accurata è necessarioutilizzare SPETTROMETRI DI MASSA AD ALTA RISOLUZIONE (HRMS)

Il livello di informazione che è possibile ottenere da uno spettrometro dimassa dipende dal suo potere risolutivo/accuratezza e dalla massa esattadelle sostanze di interesse.

Gli spettrometri ad alta risoluzione permettono di determinare la massa conun potere risolutivo fino a 100.000.

Formula bruta Massa esatta M2-M1 (mmu) Potere risolutivo min.

Per effettuare misurare sperimentali di massa accurata è necessarioutilizzare SPETTROMETRI DI MASSA AD ALTA RISOLUZIONE (HRMS)

Il livello di informazione che è possibile ottenere da uno spettrometro dimassa dipende dal suo potere risolutivo/accuratezza e dalla massa esattadelle sostanze di interesse.

Gli spettrometri ad alta risoluzione permettono di determinare la massa conun potere risolutivo fino a 100.000.

Formula bruta Massa esatta M2-M1 (mmu) Potere risolutivo min.C12H11 156.08132 12,7 12.400

C11H10N 156.09390

C49H69N13O12 516.76671 18,2 56.700C50H73N13O11 516.78490

Spettri di massa di peptidi isobarici ottenuti con risoluzioni differenti

MASSA AD ALTA RISOLUZIONE E RISOLUZIONEMASSA AD ALTA RISOLUZIONE E RISOLUZIONE

Fonte: Brochure LTQ-FT Thermo Scientific

La determinazione spettrale della massa accurata è uno strumentoessenziale per lo studio strutturale delle sostanze nel settore chimico ebiochimico.

L’utilizzo delle informazioni relative alla massa accurata delle sostanzeconsente di:- confermare con certezza l‘identità di sostanze note;- stimare la composizione elementare di sostanze incognite (es.impurezze, prodotti di degradazione, metaboliti, ecc.);- confermare reazioni metaboliche

Per l'identificazione di sostanze sconosciute è necessario eseguire ladeterminazione della massa accurata con la massima risoluzionepossibile per abbassare la probabilità di falsi positivi.

MASSA ACCURATA E IDENTIFICAZIONE STRUTTURALEMASSA ACCURATA E IDENTIFICAZIONE STRUTTURALE

La determinazione spettrale della massa accurata è uno strumentoessenziale per lo studio strutturale delle sostanze nel settore chimico ebiochimico.

L’utilizzo delle informazioni relative alla massa accurata delle sostanzeconsente di:- confermare con certezza l‘identità di sostanze note;- stimare la composizione elementare di sostanze incognite (es.impurezze, prodotti di degradazione, metaboliti, ecc.);- confermare reazioni metaboliche

Per l'identificazione di sostanze sconosciute è necessario eseguire ladeterminazione della massa accurata con la massima risoluzionepossibile per abbassare la probabilità di falsi positivi.


La figura seguente elenca il numero di possibili formule brute assegnabili in funzionedell’accuratezza di massa per lo ione [m+2H]2+ della [Val5]-Angiotensina 11.Le formule brute possibili sono state calcolate in base alla lista degli elementi eall’intervallo di valori (nr. di atomi/molecola) assegnato per ciascuno elemento.E’ evidente come vi sia una riduzione di circa un ordine di grandezza nel numeroteorico di formule brute quando l’accuratezza aumenta da 10 a 1 ppm.

Fonte: Brochure LTQ-FT Thermo Scientific


Effetto dell’aumento della accuratezza ai fini dell’identificazioneunivoca di sostanze a peso molecolare diverso.

Fonte: Quenzer, T.L., Robinson, J.M., Bolanios, B., Milgram, E. and Greig, M.J., Automated accurate mass analysis usingFTICR mass spectrometry, Proceedings of the 50th Annual Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Orlando, FL,2002.

HPLC (UV/ELSD/DAD/FLD):HPLC (UV/ELSD/DAD/FLD): 3030

HPLCHPLC--MS (MS (IonIon Trap/SingleTrap/Single QuadQuad):): 77

UHPLC (UV/ELSD/DAD/FLD):UHPLC (UV/ELSD/DAD/FLD): 66

UHPLC/MS/UHPLC/MS/MSMS (Triple(Triple QuadQuad):): 1616

UHPLC/HRMS (TOF/UHPLC/HRMS (TOF/OrbiTrapOrbiTrap):): 22

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Sistemi LC:Sistemi LC: 6060

CROMATOGRAFIA LIQUIDA IN CHELABCROMATOGRAFIA LIQUIDA IN CHELAB

HPLC (UV/ELSD/DAD/FLD):HPLC (UV/ELSD/DAD/FLD): 3030

HPLCHPLC--MS (MS (IonIon Trap/SingleTrap/Single QuadQuad):): 77

UHPLC (UV/ELSD/DAD/FLD):UHPLC (UV/ELSD/DAD/FLD): 66

UHPLC/MS/UHPLC/MS/MSMS (Triple(Triple QuadQuad):): 1616

UHPLC/HRMS (TOF/UHPLC/HRMS (TOF/OrbiTrapOrbiTrap):): 22

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Sistemi LC:Sistemi LC: 6060

1997 – LC/MS (Single QUAD) – LCQ Thermo

2001 – LC/MS (Ion Trap) - LC/MSD Agilent

2004 – UPLC-MS/MS (Triple Quad) – Quattro Premier Waters/Micromass

2007 – UPLC-ESI/MS (TOF) – LCT Waters

2010 – UPLC-MS/MS (ORBITRAP) – EXACTIVE Thermo

2012 – Q-TOF?

EVOLUZIONE DELLA CROMATOGRAFIA LIQUIDAEVOLUZIONE DELLA CROMATOGRAFIA LIQUIDAACCOPPIATA ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA IN CHELABACCOPPIATA ALLA SPETTROMETRIA DI MASSA IN CHELAB

1997 – LC/MS (Single QUAD) – LCQ Thermo

2001 – LC/MS (Ion Trap) - LC/MSD Agilent

2004 – UPLC-MS/MS (Triple Quad) – Quattro Premier Waters/Micromass

2007 – UPLC-ESI/MS (TOF) – LCT Waters

2010 – UPLC-MS/MS (ORBITRAP) – EXACTIVE Thermo

2012 – Q-TOF?

Slow (HPLC)Colonne 25 cm x 4,6 mm x 5 µmColonne 15 cm x 4,6 mm x 5 µmColonne 10 cm x 4,6 mm x 5 µm

Fast (HPLC)Colonne 15 cm x 2,1 mm x 3.5 µmColonne 10 cm x 2,1 mm x 3.5 µmColonne 10 cm x 2,1 mm x 2.6-2.7 µm (Poroshell Technologies)Colonne 7,5 cm x 2,1 mm x 2.6-2.7 µm (Poroshell Technologies)Colonne 5 cm x 2,1 mm x 2.6-2.7 µm (Poroshell Technologies)

Ultra-Performance (UPLC)Colonne 10 cm x 1.9-2.1 mm x 1.7-1.9 µmColonne 5 cm x 1.9-2.1 mm x 1.7-1.9 µm

Run time: 25-40 min

Run time: 10-25 min

METODIMETODI

Slow (HPLC)Colonne 25 cm x 4,6 mm x 5 µmColonne 15 cm x 4,6 mm x 5 µmColonne 10 cm x 4,6 mm x 5 µm

Fast (HPLC)Colonne 15 cm x 2,1 mm x 3.5 µmColonne 10 cm x 2,1 mm x 3.5 µmColonne 10 cm x 2,1 mm x 2.6-2.7 µm (Poroshell Technologies)Colonne 7,5 cm x 2,1 mm x 2.6-2.7 µm (Poroshell Technologies)Colonne 5 cm x 2,1 mm x 2.6-2.7 µm (Poroshell Technologies)

Ultra-Performance (UPLC)Colonne 10 cm x 1.9-2.1 mm x 1.7-1.9 µmColonne 5 cm x 1.9-2.1 mm x 1.7-1.9 µm

Run time: 3-15 min

LCLCFastFast--LCLC

UltraFastUltraFast--LCLCUltraPerformanceUltraPerformance--LCLC

Come orientarsi?Come orientarsi?

Variabili da considerare/definire:Variabili da considerare/definire:

-- ResolutionResolution//RunRun TimeTime

-- SpeedSpeed DetectorDetector

-- Target dell’analisiTarget dell’analisi -- SampleSample PreparationPreparation

RESOLUTION vs RUN TIMERESOLUTION vs RUN TIME

ResolutionResolution:: UPLC = HPLCUPLC = HPLCRunRun TimeTime:: UPLC = HPLC/4UPLC = HPLC/4

RESOLUTION vs RUN TIMERESOLUTION vs RUN TIME

3a3a 3b3b 4a4a 4b4b3a+3b3a+3b

4a+4b4a+4bUPLCUPLC HPLCHPLC

DETECTOR SPEEDDETECTOR SPEED

HighHigh

LowLow

LowLow

DETECTOR SPEEDDETECTOR SPEED

HighHigh

TargetTarget analysisanalysis--SampleSample PreparationPreparation: Analisi: AnalisiQuantitativa FitofarmaciQuantitativa Fitofarmaci MultiresidualeMultiresiduale

QuEChERSQuEChERS -- UNI EN 15662UNI EN 15662

Esempio UPLC/MS/Esempio UPLC/MS/MSMS (Fast)(Fast) -- MandipropamideMandipropamide..RecuperoRecupero ee RipetibilitaRipetibilita’’

Esempio UPLC/MS/Esempio UPLC/MS/MSMS (Fast)(Fast) -- MandipropamideMandipropamide..LinearitaLinearita’’ ee CampoCampo di applicazionedi applicazione

Esempio UPLC/MS/Esempio UPLC/MS/MSMS (Fast)(Fast) -- MandipropamideMandipropamide..DefinizioneDefinizione valori LOD edvalori LOD ed LOQ (UNI EN 17025)LOQ (UNI EN 17025)

Esempio UPLC/MS/Esempio UPLC/MS/MSMS (Fast)(Fast) -- MandipropamideMandipropamide..Definizione valori LOD ed LOQ (UNI EN 17025)Definizione valori LOD ed LOQ (UNI EN 17025)

TargetTarget analysisanalysis: Farmacocinetica Quantitativa Determinazione: Farmacocinetica Quantitativa DeterminazioneUPLC/MS/UPLC/MS/MSMS didi AmlodipinaAmlodipina in plasmain plasma

RetentionRetention timetime 1.281.28--1.29 min1.29 minTotalTotal runrun timetime: 3.50 min: 3.50 min

Esempi di metodi LCEsempi di metodi LC--ESI/MS/ESI/MS/MSMS convalidati in GMP c/oconvalidati in GMP c/ola Divisionela Divisione PharmaPharma di CHELABdi CHELAB

a)a) Sostanze stupefacentiSostanze stupefacenti in matrici biologiche:in matrici biologiche:•• Oppiacei e metabolitiOppiacei e metaboliti•• Cocaina e metabolitiCocaina e metaboliti•• AmfetamineAmfetamine•• CannabinoidiCannabinoidi

b)b) OppiaceiOppiacei in matrici Erboristiche (in matrici Erboristiche (Codeina, Morfina, Noscapina, Papaverina, TebainaCodeina, Morfina, Noscapina, Papaverina, Tebaina))

c)c) Inibitori della FosfodiesterasiInibitori della Fosfodiesterasi ((Sildenafil, Tadalafil, Vardenafil e Omologhi sinteticiSildenafil, Tadalafil, Vardenafil e Omologhi sintetici))

d)d) Melammina e Acido cianuricoMelammina e Acido cianurico

e)e) MicotossineMicotossine ee AflatossineAflatossine in estratti secchi erboristiciin estratti secchi erboristici

f)f) PesticidiPesticidi in estratti secchi erboristiciin estratti secchi erboristici

g)g) CleaningCleaning ValidationValidation -- Determinazione diDeterminazione di ββ--lattamicilattamici

h)h) JamaicinaJamaicina,, ProtopinaProtopina ee FormononetinaFormononetina in Soluzione Schoumin Soluzione Schoum

i)i) FtalatiFtalati

j)j) Impurezze Genotossiche (es.Impurezze Genotossiche (es. TosilatiTosilati))

a)a) Sostanze stupefacentiSostanze stupefacenti in matrici biologiche:in matrici biologiche:•• Oppiacei e metabolitiOppiacei e metaboliti•• Cocaina e metabolitiCocaina e metaboliti•• AmfetamineAmfetamine•• CannabinoidiCannabinoidi

b)b) OppiaceiOppiacei in matrici Erboristiche (in matrici Erboristiche (Codeina, Morfina, Noscapina, Papaverina, TebainaCodeina, Morfina, Noscapina, Papaverina, Tebaina))

c)c) Inibitori della FosfodiesterasiInibitori della Fosfodiesterasi ((Sildenafil, Tadalafil, Vardenafil e Omologhi sinteticiSildenafil, Tadalafil, Vardenafil e Omologhi sintetici))

d)d) Melammina e Acido cianuricoMelammina e Acido cianurico

e)e) MicotossineMicotossine ee AflatossineAflatossine in estratti secchi erboristiciin estratti secchi erboristici

f)f) PesticidiPesticidi in estratti secchi erboristiciin estratti secchi erboristici

g)g) CleaningCleaning ValidationValidation -- Determinazione diDeterminazione di ββ--lattamicilattamici

h)h) JamaicinaJamaicina,, ProtopinaProtopina ee FormononetinaFormononetina in Soluzione Schoumin Soluzione Schoum

i)i) FtalatiFtalati

j)j) Impurezze Genotossiche (es.Impurezze Genotossiche (es. TosilatiTosilati))

OBIETTIVO: Caratterizzazione spettrale (MS) sostanza monocostituente

IDENTIFICAZIONE SOSTANZA:Nome sostanza: [2-(acryloyloxy)ethyl]trimethylammonium chlorideEC#: 256-176-6CAS#: 44992-01-0Formula molecolare: C8H16NO2ClPeso molecolare: 193,7Purezza: >99% (HPLC)Formula di struttura:

CASE STUDY 1:CASE STUDY 1:ANALISI MS/MS SOSTANZA MONOCOSTITUENTEANALISI MS/MS SOSTANZA MONOCOSTITUENTE

(Sale d’ammonio quaternario)(Sale d’ammonio quaternario)

OBIETTIVO: Caratterizzazione spettrale (MS) sostanza monocostituente

IDENTIFICAZIONE SOSTANZA:Nome sostanza: [2-(acryloyloxy)ethyl]trimethylammonium chlorideEC#: 256-176-6CAS#: 44992-01-0Formula molecolare: C8H16NO2ClPeso molecolare: 193,7Purezza: >99% (HPLC)Formula di struttura:

CH3N+

OCH2

O CH3

CH3

Cl-

CONDIZIONI OPERATIVE

Preparazione campione: soluzione 1% in acquaModalità di iniezione: iniezione diretta in sorgenteModalità di ionizzazione: positivaModalità di acquisizione dati: Full scan + Product Ion Scan

CASE STUDY 1:CASE STUDY 1:ANALISI MS/MS SOSTANZA MONOCOSTITUENTEANALISI MS/MS SOSTANZA MONOCOSTITUENTE

(Sale d’ammonio quaternario)(Sale d’ammonio quaternario)

CONDIZIONI OPERATIVE

Preparazione campione: soluzione 1% in acquaModalità di iniezione: iniezione diretta in sorgenteModalità di ionizzazione: positivaModalità di acquisizione dati: Full scan + Product Ion Scan

CASE STUDY 1:CASE STUDY 1:CONDIZIONI OPERATIVE ANALISI MS/MSCONDIZIONI OPERATIVE ANALISI MS/MS

CASE STUDY 1:CASE STUDY 1:SPETTRO IN FULL SCAN E PRODUCT IONSSPETTRO IN FULL SCAN E PRODUCT IONS

OBIETTIVO: Identificazione impurezze non noteIDENTIFICAZIONE SOSTANZA:Nome sostanza: d-AllethrinEC#: 209-542-4CAS#: 584-79-2Formula molecolare: C19H26O3

Purezza: >97% p/p (somma di isomeri cis e trans)Peso Molecolare Relativo: 302.41Formula di struttura:

CASE STUDY 2:CASE STUDY 2:ANALISI HRMS SOSTANZA MONOCOSTITUENTEANALISI HRMS SOSTANZA MONOCOSTITUENTE

(D(D--Alletrina)Alletrina)

OBIETTIVO: Identificazione impurezze non noteIDENTIFICAZIONE SOSTANZA:Nome sostanza: d-AllethrinEC#: 209-542-4CAS#: 584-79-2Formula molecolare: C19H26O3

Purezza: >97% p/p (somma di isomeri cis e trans)Peso Molecolare Relativo: 302.41Formula di struttura:

L’identificazione delle impurezze non note (isomeri) della d-Alletrina è stataeffettuata mediante il seguente sistema accoppiato:- GC Thermo Quest CE instruments Trace GC 2000 series- Spettrometro di massa ad alta risoluzione (HRMS) Thermo Quest FinnigamMAT 95 XL.

Lo studio è stato eseguito in due fasi:

A. Determinazione della massa accurata della d-Alletrina analizzando unasoluzione concentrata (10%p/p) in modalità Full Scan;

B. Conferma dell’identità delle impurezze (isomeri della d-Alletrina) dellasostanza in esame mediante analisi HRMS di una soluzione diluita (1%p/p) inmodalità SIM (Single Ion Monitoring)

CASE STUDY 2:CASE STUDY 2:STRATEGIA DI TESTINGSTRATEGIA DI TESTING

L’identificazione delle impurezze non note (isomeri) della d-Alletrina è stataeffettuata mediante il seguente sistema accoppiato:- GC Thermo Quest CE instruments Trace GC 2000 series- Spettrometro di massa ad alta risoluzione (HRMS) Thermo Quest FinnigamMAT 95 XL.

Lo studio è stato eseguito in due fasi:

A. Determinazione della massa accurata della d-Alletrina analizzando unasoluzione concentrata (10%p/p) in modalità Full Scan;

B. Conferma dell’identità delle impurezze (isomeri della d-Alletrina) dellasostanza in esame mediante analisi HRMS di una soluzione diluita (1%p/p) inmodalità SIM (Single Ion Monitoring)

CASE STUDY 2:CASE STUDY 2:ANALISI GCANALISI GC--HRMS FULL SCANHRMS FULL SCAN

Determinazione della massa accurata della d-Alletrina effettuata sulla soluzioneconcentrata (10%p/p) in modalità Full Scan.

Figura A - Tracciato SIM relativo allo ionem/z = 302,09-302,29

Massa accurata misurata sul picco a RT 19,75

CASE STUDY 2:CASE STUDY 2:MASSE ACCURATE DEI COMPONENTI PRINCIPALIMASSE ACCURATE DEI COMPONENTI PRINCIPALI

Fase A - Determinazione della massa accurata degli isomeri trans della d-Alletrina effettuata sulla soluzione concentrata (10%p/p).

Nr. di scansione(Fig. A)

Massa esatta(m/z)

Massa accurata(m/z)

Delta (mmu) Formula bruta

66 (trans) 302,1876 302,1879 0,29 C19H26O3

70 (trans) 302,1876 302,1881 0,50 C19H26O3

media 302,1880

Nella fase B si è proceduto con un’analisi della soluzione diluita in modalitàSIM utilizzando lo ione 302,19 ± 0,05 m/z (range di precisione 302,14 - 302,24,accuratezza: 165 ppm) corrispondente alla massa accurata del componenteprincipale (trans-alletrina)

CASE STUDY 2:CASE STUDY 2:CONFERMA IDENTITA’ IMPUREZZE SCONOSCIUTECONFERMA IDENTITA’ IMPUREZZE SCONOSCIUTE

isomers

Fase B - Analisi della soluzione diluita in modalità SIM utilizzando lo ione302,1880 ± 0,05 m/z (range di precisione: 302,14 - 302,24)

isomers

L’analisi GC-HRMS ha dimostrato che le impurezze sconosciute in esameaventi tempo di ritenzione relativo compreso tra 1,02 e 1,06 (vedasi zoom)corrispondono a isomeri (4) della d-Alletrina.

ESERCITAZIONE:CASE STUDY 3

IDENTIFICAZIONE DI UNA

IMPUREZZA INCOGNITA

IN UN PROTTO FARMACEUTICO

IDENTIFICAZIONE DI UNA

IMPUREZZA INCOGNITA

IN UN PROTTO FARMACEUTICO

CASE STUDY 3:CASE STUDY 3:IDENTIFICAZIONE IMPUREZZA NON NOTA IN PRODOTTOIDENTIFICAZIONE IMPUREZZA NON NOTA IN PRODOTTO

FARMACEUTICOFARMACEUTICO

DESCRIZIONE DEL CASO:le analisi in fase di CQ di una specialità farmaceutica (compresse)hanno evidenziato la presenza di 2 impurezze non note checomportano un risultato OOS rispetto ai limiti di specifica delprodotto

INFORMAZIONI A DISPOSIZIONE- Composizione prodotto farmaceutico- Metodo HPLC-UV utilizzato in fase di CQ- Tracciati HPLC-UV forniti dal cliente

DESCRIZIONE DEL CASO:le analisi in fase di CQ di una specialità farmaceutica (compresse)hanno evidenziato la presenza di 2 impurezze non note checomportano un risultato OOS rispetto ai limiti di specifica delprodotto

INFORMAZIONI A DISPOSIZIONE- Composizione prodotto farmaceutico- Metodo HPLC-UV utilizzato in fase di CQ- Tracciati HPLC-UV forniti dal cliente


FARMACEUTICOFARMACEUTICO –– STRATEGIA DI TESTINGSTRATEGIA DI TESTING

STEP 1Analisi HPLC-UV/DAD secondo metodo utilizzato in fase di CQ

Riprodurre il profilo cromatografico ottenuto dallo Sponsor




STEP 2Ricerca condizioni operative LC ESI MS compatibili

Sviluppare un metodo cromatografico senza l’utilizzo di tamponi fosfato e/oacido fosforico (non compatibili con analizzatori MS) che permetta la massima

risoluzione tra le 2 con il minor livello di soppressione ionica possibile

Cromatogrammi ottenuti con le condizioni operative MS compatibili

CASE STUDY 3:Step 2: Ricerca condizioni operative LC ESI MS compatibili

CASE STUDY 3:IDENTIFICAZIONE IMPUREZZA NON NOTA IN PRODOTTO

FARMACEUTICO – STRATEGIA DI TESTING



STEP 3Caratterizzazione impurezze incognite mediante:

A. LC/MS (UPLC/TUV/MS/MS Quattro Premier XE Waters Micromass)

B. LC/MS/MS (UPLC/TUV/MS/MS Quattro Premier XE Waters Micromass)

C. LC-ESI/TOF (UPLC/DAD/ESI/TOF Premier XE Waters Micromass)



STEP 3Caratterizzazione impurezze incognite mediante:

A. LC/MS (UPLC/TUV/MS/MS Quattro Premier XE Waters Micromass)

B. LC/MS/MS (UPLC/TUV/MS/MS Quattro Premier XE Waters Micromass)

C. LC-ESI/TOF (UPLC/DAD/ESI/TOF Premier XE Waters Micromass)

A. Determinazione ione molecolare in quadrupolo (accuratezza = 0,1 m/z)B. Studio frammentazione impurezzeC. Determinazione massa accurata impurezze e stima formula bruta

(accuratezza = 0,001 m/z, tolleranza: 5 ppm)

Spettri di massa ottenuti LC/MS e LC/MS/MS in modalità positiva conacquisizione Full Scan e Daugthers Scan (Product Ions)

CASE STUDY 3:Step 3A/3B: Caratterizzazione impurezze incognite mediante LC/MS e LC/MS/MS

Massa accurata ottenuta mediante analizzatore TOFmassa accurata: 234,2224 m/zformula bruta: C16H28Nerrore associato: 0,9 ppmi-Fit (1): 0,2 (criterio di accettabilità: <10)

CASE STUDY 3:CASE STUDY 3:Step 3C: Caratterizzazione impurezze incognite mediante LC-ESI/TOF

(1) Fitting tra pattern isotopico misurato e quello teorico definito in base alla formula bruta proposta.





STEP 3Caratterizzazione impurezze incognite mediante LC/MS, LC/MS/MS, LC-ESI/TOF

STEP 4Ipotesi di struttura e prove a supporto di tale ipotesi





Determinare la possibile struttura delle impurezze incognite e identificare ipossibili meccanismi di formazione in base alle informazioni disponibili sulla

formula bruta e sulla composizione del prodotto (materie prime)

Materie prime compatibili con i risultati ottenuti dall'analisi MS/TOF

CASE STUDY 3CASE STUDY 3Step 4: Ipotesi di struttura e prove a supporto di tale ipotesiStep 4: Ipotesi di struttura e prove a supporto di tale ipotesi

N-vinilpirrolidone (presente come monomero libero nel PVP) chepuò subire una riduzione a N-vinil-2-pirrolina in presenza di agenti riducenti

(es. metabisolfito):

Limonene (contenuto nell'aroma)


Struttura ipotizzata per le impurezze incognite(2 isomeri: cis + trans)


Strutture compatibili con i frammenti m/z dello spettro MS/MS delleimpurezze incognite







STEP 5Analisi GC/MS della distribuzione quali-quantitativa dei composti volatili

aromatizzanti (profilo aromatico)





STEP 5Analisi GC/MS della distribuzione quali-quantitativa dei composti volatili

aromatizzanti (profilo aromatico)

Confermare ipotesi formulate sull’origine e struttura delle impurezze incognite

Risultati ottenuti dall'analisi quali-quantitativa della frazione volatile(risultati espressi in mg/kg come limonene)

CASE STUDY 3CASE STUDY 3Step 5: Analisi GC/MS del profilo aromaticoStep 5: Analisi GC/MS del profilo aromatico

CASE STUDY 3:CASE STUDY 3:CONCLUSIONICONCLUSIONI

La struttura seguente ipotizzata per le impurezze incognite in esame:

è confermata da:- massa accurata (TOF)- spettro di massa dello ione molecolare (MS/MS)- diminuzione limonene nella frazione aromatica (GC/MS)

La struttura seguente ipotizzata per le impurezze incognite in esame:

è confermata da:- massa accurata (TOF)- spettro di massa dello ione molecolare (MS/MS)- diminuzione limonene nella frazione aromatica (GC/MS)

Università degli Studi di Napoli Federico II Master II ... 2013_2014... · Attuabile con...

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