Metodi alternativi Colture cellulari - MASTER REACH 2013_2014/EcotossicologiaVerde/06... ·...

Metodi alternativiColture cellulari

Università degli Studi di Napoli Federico II Master II livello REACHDott.ssa Teresa Rosaria Verde

6. Metodi alternativi6. Metodi alternativi

Uno degli obiettivi peculiari della ricerca ecotossicologica, è lavalutazione degli effetti delle sostanze chimiche a livello di popolazioni edecosistemi che, per alcune decadi, è stata realizzata principalmenteattraverso studi in vivo.

Tuttavia, l’entrata in vigore (1 giugno 2007) del Regolamento REACH(Registration, Evalutation and Authorisazion of Chemicals), CE n.1907/2006, che disciplina la produzione, l’uso e l’importazione dellesostanze chimiche in ambito comunitario, ha dato un nuovo impulsoallo sviluppo dei metodi alternativi in vitro, anche in ambitoecotossicologico.


Università degli Studi di Napoli Federico II Master II livello REACH



I metodi alternativi sono stati proposti in sostituzione dei testsull’animale per la identificazione del profilo tossicologico e

ecotossicologico dei composti chimici

Al momento nessun test alternativo, preso singolarmente, puòritenersi sufficientemente predittivo per sostituirsi completamente

all’informazione complessa che si ricava dai dati sperimentalisull’animale


Lo sviluppo di metodi alternativi in vitro costituisce uno degli obiettividel Regolamento REACH sulle sostanze chimiche.

Lo sviluppo di metodi alternativi in vitro costituisce uno degli obiettividel Regolamento REACH sulle sostanze chimiche.

Al momento nessun test alternativo, preso singolarmente, puòritenersi sufficientemente predittivo per sostituirsi completamente

all’informazione complessa che si ricava dai dati sperimentalisull’animale

Tuttavia l’integrazione di approcci innovativi sia che richiedanosaggi di laboratorio o si basino su metodologie computed-

assisted possono fornire strumenti potenti in grado di identificarela pericolosità di composti chimici, individuarne il meccanismod’azione e consentirne la classificazione ai fini regolamentativi.



Possono essereincubate a

temperaturaambiente(20±2

°C) e in atmosferanormale

Possono essereesposte a matrici

liquide didifferenteosmolarità

(caratteristichemorfologiche egenotipiche) e

l’assenza dacontaminazioni.

Alcuni vantaggi delle Linee cellulari continue di pescerispetto a mammifero


Alcune di loropossono essereconservate perlunghi periodi

(fino a 2 anni) a4°C

Possono essereacquistate pressoEnti certificati chene garantisconorigorosi controlli

di qualità


Le colture cellulari, oltre il loro potenziale di sostituzione e/oriduzione del numero di animali nei saggi di tossicità, hanno

altri vantaggi:

La valutazione rapida, diun elevato numero di

sostanzepotenzialmente

tossiche, con l’analisispettrofluorimetrica inpiastre multi-pozzetto.

La possibilità distudiare i meccanismi

d’azione delle sostanzetossiche.


La notevolediminuzione di quantità

di sostanzapotenzialmente tossica

impiegatanell’esecuzione dei

saggi e, di conseguenza,di rifiuti prodotti dalla

sperimentazione.

L’opportunità dirisparmiare anche il

sacrificio dell’animaledonatore, se vengono

utilizzate le lineecellulari continue


Obiettivo ReachObiettivo Reach

Utilizzare modelli cellulari in vitro, rappresentativi diorgani bersaglio, approcci di tossicogenomica e

metodologie QSAR per sviluppare un metodo alternativoper la predizione della tossicità dei composti chimici, con

particolare riferimento alla tossicità a dose ripetuta


Utilizzare modelli cellulari in vitro, rappresentativi diorgani bersaglio, approcci di tossicogenomica e

metodologie QSAR per sviluppare un metodo alternativoper la predizione della tossicità dei composti chimici, con

particolare riferimento alla tossicità a dose ripetuta


Tossicità a dose-ripetutaTossicità a dose-ripetuta

Comprende gli effetti tossicologici generali che si verificano inconseguenza di un'esposizione quotidiana ripetuta a una sostanza peruna parte della durata della vita

• esposizione sub-acuta– Test sull’animale a 28 giorni

• esposizione sub-cronica– Test sull’animale a 90 giorni– Per la maggior parte della durata della vita

• esposizione cronica– Test sull’animale roditore per 12-24 mesi


Comprende gli effetti tossicologici generali che si verificano inconseguenza di un'esposizione quotidiana ripetuta a una sostanza peruna parte della durata della vita

• esposizione sub-acuta– Test sull’animale a 28 giorni

• esposizione sub-cronica– Test sull’animale a 90 giorni– Per la maggior parte della durata della vita

• esposizione cronica– Test sull’animale roditore per 12-24 mesi


Il Regolamento REACH e le guide tecniche relative ai processi e aimetodi previsti, raccomandano che le informazioni da raccogliere inmerito alla tossicità ed ecotossicità delle sostanze chimiche venganoacquisite ricorrendo, ove possibile, a mezzi diversi dai test su animalivertebrati (REACH art. 13), che devono quindi essere considerati comeultima risorsa (REACH art. 25), adottando tutte le disposizioni possibiliper limitare ripetizioni inutili dei test.

La strategia delle “3R alternatives” (Russell e Burch, 1959),che fa riferimento atutte quelle procedure che riducono (Reduce) drasticamente il numero dianimali utilizzati negli esperimenti, alleviano o minimizzano (Refine) lesofferenze loro inflitte e sostituiscono (Replacement) in modo parziale ocompleto gli animali vertebrati con diverse tipologie di colture cellulari,costituisce, nell’era REACH, un impegno per tutti i ricercatori e va implementata,come indicato nel VII World Congress ALTernative to animal EXperimentation(Roma 30 agosto – 3 settembre 2009),con le R di: Reliable, Relevant, Ready-to-use e Robust,proprie dei metodi alternativi in vitro (Weighardt)


La strategia delle “3R alternatives” (Russell e Burch, 1959),che fa riferimento atutte quelle procedure che riducono (Reduce) drasticamente il numero dianimali utilizzati negli esperimenti, alleviano o minimizzano (Refine) lesofferenze loro inflitte e sostituiscono (Replacement) in modo parziale ocompleto gli animali vertebrati con diverse tipologie di colture cellulari,costituisce, nell’era REACH, un impegno per tutti i ricercatori e va implementata,come indicato nel VII World Congress ALTernative to animal EXperimentation(Roma 30 agosto – 3 settembre 2009),con le R di: Reliable, Relevant, Ready-to-use e Robust,proprie dei metodi alternativi in vitro (Weighardt)


In particolare, gli obblighi introdotti dalla normativa REACH inmerito ai saggi con specie ittiche per la valutazione di pericolositàdelle sostanze chimiche riguardano: il saggio di tossicità a brevetermine con pesci giovanili e con pesci nelle fasi embrionali e diavannotto; il saggio di tossicità a lungo termine con pesci adulti; ilsaggio di accrescimento con pesci in fase giovanile e il saggio dibioaccumulo (REACH: allegati VIII, IX e X).




Test tossicologici/ecotossicologici di base fino ad1 tonnellata/anno


Tossicologia su mammifero(ratto)

Ecotossicologia

Tossicità acuta orale Tossicità acuta su pesce

Tossicità acuta Tossicità acuta su DaphniaTossicità acuta inalatoria Inibizione di crescita algale-


Tossicità acuta inalatoria Inibizione di crescita algale-Sensibilizzazione cutanea BiodegradazioneTossicità subacuta (18 giorni) Degradazione abioticaTest di Ames-MutagenesiMutagenesi (micronucleo)


Test tossicologici di base fino ad 10 tonnellata/anno

Tossicologia su mammifero(ratto)

Ecotossicologia

Studio di fertilità Tossicità cronica su pesce

Teratogenesi (su una specie) Tossicità cronica su DaphniaTossicità subcronica Accumulo nel pesce


Tossicità subcronica Accumulo nel pesceTossicità subacuta (18 giorni) Tossicità nella piantaTest supplementari diMutagenesi

Tossicità su lombrico

Studi prolungati dibiodegradazione


Test tossicologici di base fino ad 100 tonnellata/anno

Tossicologia su mammifero EcotossicologiaTossicità cronica Tossicità cronica su pesce

Test di cancerogenesi Riproduzione nel pesce

Tossicità acuta e subacuta in altraspecie

Tossicità acuta e subacuta negliuccelli

Teratogenesi su non roditori Studi supplementari dibiodegradaziione e accumulo


Teratogenesi su non roditori Studi supplementari dibiodegradaziione e accumulo

Test di fertilità su 3 generazione Tossicocinetica ambientale

Tossicocinetica Test flessibile a vari livelli(catene alimentari a livello dicomunità su microcosmi)

Test tossicologici (GLP!) irritazione (corros.) cutanea “in vitro” irritazione oculare “in vitro” sensibilizzazione cutanea (LLNA) test di reversione batterica (Ames) tossicità acuta orale

Test ecotossicologici (GLP) tossicità acuta daphnia tossicità acuta alga biodegradazione


ALLEGATO VIII

Test tossicologici (GLP!) irritazione (corros.) cutanea “in vitro” irritazione oculare “in vitro” sensibilizzazione cutanea (LLNA) test di reversione batterica (Ames) tossicità acuta orale

Test ecotossicologici (GLP) tossicità acuta daphnia tossicità acuta alga biodegradazione


ALLEGATO VIII –Informazioni aggiuntive

Test tossicologici (GLP!)

- irritazione (corrosione) cutanea “in vivo”- irritazione oculare “in vivo”- mutagenesi- test di citogenetica/ Test di mutazione genica- tossicità acuta (orale, dermale, inalatoria)- tossicità a dosi ripetute (28 gg)(No se il rischio di esposizione è limitato)- tossicità riproduttiva/ tossicocinetica

Test ecotossicologici (GLP!)

- tossicità acuta su pesce- studio di inibizione respiratoria su fanghi- degradazione abiotica-screening (HPLC) dell’assorbimento/desorbimento

nel terreno


Test tossicologici (GLP!)

- irritazione (corrosione) cutanea “in vivo”- irritazione oculare “in vivo”- mutagenesi- test di citogenetica/ Test di mutazione genica- tossicità acuta (orale, dermale, inalatoria)- tossicità a dosi ripetute (28 gg)(No se il rischio di esposizione è limitato)- tossicità riproduttiva/ tossicocinetica

Test ecotossicologici (GLP!)

- tossicità acuta su pesce- studio di inibizione respiratoria su fanghi- degradazione abiotica-screening (HPLC) dell’assorbimento/desorbimento

nel terreno


ALLEGATO IX –Informazioni aggiuntive fino 100 tonnellate


Test tossicologici (GLP!)-mutagenesi-test “in vivo” (opzionale)-tossicità a dosi ripetute (28-90 gg) (opzionale)-tossicità riproduttiva: studio di fertilità su due generazioni (opzionale)

Test ecotossicologici (GLP!)-tossicità prolungata su pesce e Daphnie-identificazione dei prodotti di degradazione-studio di bioaccumulo nel pesce e studi speciali su pesci giovani-effetti sugli organismi del suolo (lombrichi, microorganismi, piante)


Test tossicologici (GLP!)-mutagenesi-test “in vivo” (opzionale)-tossicità a dosi ripetute (28-90 gg) (opzionale)-tossicità riproduttiva: studio di fertilità su due generazioni (opzionale)

Test ecotossicologici (GLP!)-tossicità prolungata su pesce e Daphnie-identificazione dei prodotti di degradazione-studio di bioaccumulo nel pesce e studi speciali su pesci giovani-effetti sugli organismi del suolo (lombrichi, microorganismi, piante)

ALLEGATO X –Informazioni aggiuntive-oltre 100 fino a1000 tonnellate


Test tossicologici (GLP!)-mutagenesi-studi supplementari-tossicità a dosi ripetute (12 mesi) (opzionale)-cancerogenesi (una specie)

Test ecotossicologici (GLP!)-altri studi di degradazione biotica-altri studi sul destino ambientale (accumulo nel suolo, etc)-tossicità a lungo termine su: -lombrichi-invertebrati-piante/ organismi deisedimenti-uccelli


Test tossicologici (GLP!)-mutagenesi-studi supplementari-tossicità a dosi ripetute (12 mesi) (opzionale)-cancerogenesi (una specie)

Test ecotossicologici (GLP!)-altri studi di degradazione biotica-altri studi sul destino ambientale (accumulo nel suolo, etc)-tossicità a lungo termine su: -lombrichi-invertebrati-piante/ organismi deisedimenti-uccelli


I pesci sono la principale specie di vertebrati impiegata per valutazioniecotossicologiche nella sorveglianza ambientale,nel monitoraggio e nellaricerca.

Il saggio con pesci maggiormente effettuato è quello di tossicità a brevetermine che, sulla base del metodo riportato nella linea guida OCSE n° 203(1992), richiede il sacrifici di un numero elevato (da 126 a 180) di animali per lavalutazione di un solo composto chimico.



Le colture di cellule sono un sistema di facile impiego per valutazionipreliminari di composti tossici.

Progetto ISPRA riguarda l’uso di linee cellulari di pesce per valutazioniecotossicologiche, gli aspetti metodologici sviluppati in merito al mantenimentoe alle caratteristiche di crescita della linea cellulare RTG-2(Rainbow TroutGonad).


Progetto ISPRA riguarda l’uso di linee cellulari di pesce per valutazioniecotossicologiche, gli aspetti metodologici sviluppati in merito al mantenimentoe alle caratteristiche di crescita della linea cellulare RTG-2(Rainbow TroutGonad).

Uno dei sistemi in vitro proposto per ridurre l’utilizzo di pesci èrappresentato dalle cellule di pesce in coltura

Uno dei sistemi in vitro proposto per ridurre l’utilizzo di pesci èrappresentato dalle cellule di pesce in coltura


In ambito ecotossicologico sono stateimpiegate sia colture primarie che lineecellulari stabilizzate (o continue).

Queste ultime rappresentano unsistema armonizzato e di facileimpiego con una variabilitàrelativamente bassa. Il loro uso èconveniente da un punto di vistaeconomico e meno laboriosorispetto sia agli animali che allecolture primarie,sebbene talesistema cellulare risulti scarsamentecaratterizzato dal punto di vista delleproprietà cellulari e funzionali.


Attualmente, esistono più di 150linee cellulari stabilizzate di pesce(Castaño et al., 2003). La maggiorparte sono di tipo fibroblastico oepiteliale, crescono quindi aderenti alsubstrato e hanno avuto origine datessuti di salmonidi e ciprinidi


Le linee cellularistabilizzate dipesce hannoalcuni indubbivantaggi tecnici:

- alcune di essepossono essereincubate atemperaturaambiente (20°C) ein atmosferanormale (quindinon è necessariol’incubatore a CO2come per le celluledi mammifero);

- possono essereconservate perlunghi periodi a 4°C per cui ilcongelamento inazoto liquido puòessere evitato;

- possono essereesposte a variematrici liquide condifferentiosmolarità


Da molti anni, i ricercatori propongono, per valutare la pericolosità deicomposti chimici, l’uso dei saggi di citotossicità basale con cellule di pesce.Alcuni tra i metodi più frequentemente utilizzati sono: il Test del RossoNeutro (NRU, Neutral Red Uptake) e il test MTT (Tetrazolium salt reductionassay).

Da molti anni, i ricercatori propongono, per valutare la pericolosità deicomposti chimici, l’uso dei saggi di citotossicità basale con cellule di pesce.Alcuni tra i metodi più frequentemente utilizzati sono: il Test del RossoNeutro (NRU, Neutral Red Uptake) e il test MTT (Tetrazolium salt reductionassay).



Nonostante la risposta citotossica in vitro possa variare tra le diverse lineecellulari in funzione di differenze nell’attività metabolica o di variazioni

metodologiche(composizione del siero, tempo di esposizione, temperaturad’incubazione, modalità di esecuzione dei saggi), molti studi hanno

mostrato una buona correlazione con i risultati della tossicità acuta in vivo.In particolare, la sensibilità delle linee cellulari di pesce nel valutare la

tossicità delle sostanze chimiche, è stata studiata analizzando lacorrelazione tra i valori di EC50 in vitro (ottenuti con i diversi saggi di

citotossicità basale) e i valori di LC50 in vivo (ottenuti nel saggio acuto conpesci).


Infatti molti studievidenziano per lamaggior parte deigruppi di sostanzechimiche sottoposte avalutazione, uncoefficiente dicorrelazione

r ≥ 0,80 (correlazionelineare positiva).

Sebbene questi risultatidimostrino unacomparabilità tra i sistemiin vitro con linee cellularidi pesce e il test acuto invivo con pesci, tuttavia, intermini assoluti, i valori diEC50 in vitro sono, inmedia, più elevati di 1-2ordini di grandezza, deicorrispondenti valori diLC50 in vivo.

Questo significa che,per indurre un effettotossico misurabile, lecolture cellulari invitro richiedonoconcentrazioni(nominali) di sostanzachimica più elevaterispetto a quellenecessarie nei saggi invivo (Fent, 2001;Kramer, 2009)


Sebbene questi risultatidimostrino unacomparabilità tra i sistemiin vitro con linee cellularidi pesce e il test acuto invivo con pesci, tuttavia, intermini assoluti, i valori diEC50 in vitro sono, inmedia, più elevati di 1-2ordini di grandezza, deicorrispondenti valori diLC50 in vivo.

Questo significa che,per indurre un effettotossico misurabile, lecolture cellulari invitro richiedonoconcentrazioni(nominali) di sostanzachimica più elevaterispetto a quellenecessarie nei saggi invivo (Fent, 2001;Kramer, 2009)

(Bols et al., 1985; Babich et al., 1990; Castaño et al. 1994, 2003; Lange et al., 1995; Saito et al., 1991, 1993, 1994; Segner,2004; Schirmer, 2006)

Il problema della minore sensibilità è una peculiarità di tutti i sistemi in vitro in quanto tali.Infatti è stato dimostrato (Clemedson et al., 1998a, 1998b) che la sensibilità delle linee

cellulari stabilizzate di pesce è confrontabile, con quella delle cellule umane e dimammifero in coltura

Il problema della minore sensibilità è una peculiarità di tutti i sistemi in vitro in quanto tali.Infatti è stato dimostrato (Clemedson et al., 1998a, 1998b) che la sensibilità delle linee

cellulari stabilizzate di pesce è confrontabile, con quella delle cellule umane e dimammifero in coltura


Recentemente, diversi autori hannostudiato alcune modalità per

aumentare la sensibilità dei saggi dicitotossicità con cellule di pesce,

attraverso:

la sostituzione/riduzione dellapercentuale di Siero Fetale Bovinoaddizionato al terreno di crescita

(Teneva et al., 2003; Schirmer et al.,2004; Dayeh et al., 2005)

la valutazione della concentrazioneeffettiva di composto chimico che

viene a contatto con le cellule(Gülden and Seibert, 1997; 2005;

2007)

Colture cellulari


la selezione di endpoint citotossiciappropriati (Schirmer et al., 2000;

Shuilleabhain et al., 2004; Davorenet al., 2005; Jos et al., 2005, 2009;

Zurita et al., 2007)

l’utilizzo di batterie di saggi dicitotossicità;

l’uso combinato di diverse lineecellulari di pesce che rappresentino i

vari siti bersaglio(fegato, gonadi,branchie, cervello) dell’animale

(Knauer et al., 2007; Kramer et al.,2009)


In linea con le indicazioni del Regolamento REACH in merito allapromozione dei metodi alternativi in vitro e con gli adempimentiprevisti per ISPRA dal DM 22 novembre 2007, il Servizio diMetrologia Ambientale di ISPRA, ha avviato un progetto (approvatodal Comitato Tecnico di Coordinamento REACH), triennale (2010-2012), dal titolo:

“Applicazione e armonizzazione di metodi in vitro pervalutazioni ecotossicologiche delle sostanze chimiche ai

fini del Regolamento REACH: utilizzo della lineacellulare stabilizzata di pesce RTG-2

(Rainbow Trout Gonad)”





Colture cellulari











Monostrato di cellule RTG-2 in coltura (ingrandimento 40 X).


Scopo del suddetto progetto è la diffusione presso i laboratori delle AgenzieRegionali e Provinciali per la Protezione dell’Ambiente (ARPA/APPA) dei saggidi citotossicità basale con linee cellulari stabilizzate di pesce, in alternativa alsaggio di tossicità a breve termine con pesci .

Scopo del suddetto progetto è la diffusione presso i laboratori delle AgenzieRegionali e Provinciali per la Protezione dell’Ambiente (ARPA/APPA) dei saggidi citotossicità basale con linee cellulari stabilizzate di pesce, in alternativa alsaggio di tossicità a breve termine con pesci .

Monostrato di cellule RTG-2 in coltura (ingrandimento 40 X).


La corretta applicazione del Regolamento REACH prevede l’organizzazione di unsistema di controllo e vigilanza, che nel nostro Paese è stato adeguato direcente, attraverso l’Accordo tra Stato, Regioni e Province autonome di Trentoe Bolzano (29 ottobre 2009, G.U. del 7 dicembre 2009). Le regioni e provinceautonome, nell'ambito della propria organizzazione e legislazione, hanno ilcompito di individuare l'Autorità per i controlli sul REACH, e di nominare i propriesperti per il “Gruppo tecnico”, provenienti dai ruoli delle medesime Regioni/Province o delle Aziende Sanitarie Locali, ASL, o delle AgenzieRegionali/Provinciali per la Protezione Ambientale, ARPA/APPA.


La corretta applicazione del Regolamento REACH prevede l’organizzazione di unsistema di controllo e vigilanza, che nel nostro Paese è stato adeguato direcente, attraverso l’Accordo tra Stato, Regioni e Province autonome di Trentoe Bolzano (29 ottobre 2009, G.U. del 7 dicembre 2009). Le regioni e provinceautonome, nell'ambito della propria organizzazione e legislazione, hanno ilcompito di individuare l'Autorità per i controlli sul REACH, e di nominare i propriesperti per il “Gruppo tecnico”, provenienti dai ruoli delle medesime Regioni/Province o delle Aziende Sanitarie Locali, ASL, o delle AgenzieRegionali/Provinciali per la Protezione Ambientale, ARPA/APPA.

Viene inoltre stabilito che le regioni e le province autonome, debbanoindividuare, sulla base delle strutture analitiche già esistenti, i laboratori cheeseguiranno le analisi chimiche e i saggi tossicologici ed ecotossicologici suicampioni prelevati durante le attività di controllo


Da questo punto di vista, il progetto REACH, portato avanti dal Servizio diMetrologia Ambientale, si prefigge lo scopo di promuovere e diffondere pressoi laboratori ARPA/APPA le colture cellulari di pesce il cui uso, oltre ad aprirepossibilità di rinnovamento scientifico, potrebbe alleggerire l’impegnorichiesto alle Agenzie che si troveranno a dover eseguire i saggiecotossicologici, in particolare il saggio acuto in vivo con pesci.

Da questo punto di vista, il progetto REACH, portato avanti dal Servizio diMetrologia Ambientale, si prefigge lo scopo di promuovere e diffondere pressoi laboratori ARPA/APPA le colture cellulari di pesce il cui uso, oltre ad aprirepossibilità di rinnovamento scientifico, potrebbe alleggerire l’impegnorichiesto alle Agenzie che si troveranno a dover eseguire i saggiecotossicologici, in particolare il saggio acuto in vivo con pesci.

Il progetto prevede coinvolte direttamente : ARPA Veneto, ARPASicilia, ARPA Marche, ARPA Campania:


Il progetto prevede coinvolte direttamente : ARPA Veneto, ARPASicilia, ARPA Marche, ARPA Campania:


La linea cellulare RTG-2 è stata originariamente sviluppata dalle gonadi ditrota arcobaleno

Le cellule RTG-2 possono sopportare ampie variazioni di temperatura (4 - 26°C), e possono crescere con diverse formulazioni di terreno in funzione dellemodalità d’incubazione delle cellule.

Colture cellulari


Le cellule RTG-2 possono sopportare ampie variazioni di temperatura (4 - 26°C), e possono crescere con diverse formulazioni di terreno in funzione dellemodalità d’incubazione delle cellule.

Per studiare le condizioni ottimali di crescita (terreno e siero), la durata dellafase di latenza (lag) e il Population Doubling Time (PDT) della linea cellulareRTG-2, incubata in atmosfera normale, sono state effettuate curve di crescitacon differenti formulazioni di terreno e concentrazioni di siero, utilizzandofiasche.


25 cm2

25 cm2 25 cm2

Split 1:2

FRIGO 4°C75 cm2

Split 1:2

6 gg di crescita

1 settimana di crescita

1 settimana di crescita

75 cm275 cm2

Semina in fiasca grande


Distacco con try+ 20,5 ml di terreno

Distacco con try+ 20,5 ml di terreno

Conta 0,5 + 19,5Miscelare in un’unica fiasca(volume tot. 40 ml) = SCp

SM

75 cm275 cm2

In beuta:110 ml con 400,000 ±

50,000 cells/ml

3 Conte1+ 19 Foglio Excell:

400,000 ± 50,000

SIINOCULO nelle 20 fiaschette

e inizio crescita

NO

Aggiustamenti SM eripetizione delle 3 conte


Curve di crescita cellulare: I fase disperimentazione



Curva di crescitaTerreno: E-MEM (con sali di Hank’s, NEAA e L-Glu)senza sodio bicarbonato, siero FBS 10%, P/S 50UI/50µg/ml; Contenitori: Piastre multipozzetto da 24;PDT: 2,5 giorni

Curva di crescitaTerreno: E-MEM (sali di Earle) senza sodiobicarbonato,siero FBS 10%, Neomicina solfato 5g/L, NEAA 1%;Contenitori: piastre multipozzetto 24; PDT: 2,1 giorni





Curva di crescitaTerreno: E-MEM (sali di Earle) senza sodiobicarbonato,siero FBS 10%, Neomicina solfato 5g/L;Contenitori: fiasche da 25 cm2; PDT: 2,1

giorni

Curva di crescitaTerreno: E-MEM (con sali di Hank’s, NEAA e L-Glu)senza sodio bicarbonato, siero FBS 10%, P/S 50UI/50µg/ml; Contenitori: Piastre multipozzetto da 24;PDT: 2,5 giorni

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