1

6RPPDULR�

,QWURGX]LRQH��/R�VSHWWUR�GL�PDVVD�GHO�PHWDQROR BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBB�

&RQFHWWL�IRQGDPHQWDOL�GL�VWUXPHQWD]LRQH BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBB�� Strumentazione di base _________________________________________________10 La sorgente ___________________________________________________________11

Interazione elettronica: EI (HOHFWURQ�LRQLVDWLRQ���LPSDFW) _____________________11 Ionizzazione chimica: CI (FKHPLFDO�LRQLVDWLRQ)_____________________________13 Ionizzazione di campo: FI (ILHOG�LRQLVDWLRQ) _______________________________17 Desassorbimento di campo: FD (ILHOG�GHVRUSWLRQ) __________________________18 Ionizzazione chimica per desassorbimento: DCI (GHVRUSWLRQ�FKHPLFDO�LRQLVDWLRQ) _19 Ionizzazione con atomi veloci: FAB (IDVW�DWRP�ERPEDUGPHQW) ________________20

L’analizzatore _________________________________________________________23 Sistemi a deflessione magnetica_________________________________________23 Analizzatori a tempo di volo ___________________________________________27 Analizzatori quadrupolari _____________________________________________28 Trappola ionica______________________________________________________33

Rivelatori ____________________________________________________________34 Sistema di introduzione _________________________________________________37 Sistema da vuoto ______________________________________________________40

/DFFRSSLDPHQWR�FRQ�OH�WHFQLFKH�FURPDWRJUDILFKH BBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBBB�� I problemi tecnici che sorgono nell’accoppiare i due strumenti GC e MS: __________42 Le informazioni ottenibili da uno spettrometro di massa come rivelatore di un gascromatografo possono essere distinte in due categorie: ______________________48 /D�FRUUHQWH�LRQLFD�WRWDOH��7,&� �WRWDO�LRQ�FXUUHQW�� _________________________48 /D�ULYHOD]LRQH�VHOHWWLYD�GL�LRQL��6,0�R�6,'�VHOHFWHG�LRQ�PRQLWRULQJ�R�GHWHFWLRQ�� __48 /HVSORUD]LRQH�ULSHWXWD�GL�PDVVH�VHOH]LRQDWH_______________________________51 ,O�FURPDWRJUDPPD�ULFRVWUXLWR�GDO�FDOFRODWRUH�R�FRUUHQWH�LRQLFD�ULFRVWUXLWD ______52 ,O�FURPDWRJUDPPD�GL�PDVVD��0&� �PDVV�FKURPDWRJUDP�� ___________________53 &URPDWRJUDPPL�ULVROWL�R�ULVROX]LRQH�GHL�SLFFKL�JDVFURPDWRJUDILFL�SHU�IRUQLUH�VSHWWUL��SXOLWL�� ___________________________________________________________54 VSHWWUL�GL�PDVVD��SXOLWL�� ____________________________________________54 SLFFKL�JDVFURPDWRJUDILFL�ULVROWL� ______________________________________55

Sviluppo di una analisi mediante gascromatografia spettrometria di massa (GC/MS) "gasmassa" ___________________________________________________________57 Linee essenziali della GC/MS qualitativa.___________________________________58 Linee essenziali della GC/MS quantitativa __________________________________60

La scelta dello standard interno e tecnica di diluizione isotopica._______________62 La scelta degli ioni da selezionare _______________________________________64 Processi di formazione del derivato ______________________________________65 Analisi quantitativa __________________________________________________66

2

/&�06��ODEELQDPHQWR�FURPDWRJUDILD�OLTXLGD�H�VSHWWURPHWULD�GL�PDVVDBBBBBBBBBB�� L’interfaccia __________________________________________________________69 Introduzione diretta di liquidi (DLI= direct liquid introduction) __________________69 Trasporto meccanico "nastro trasportatore" (MB=moving belt) __________________70 Formazione di aerosol (PB particle beam)___________________________________72 Flusso continuo in bombardamento con atomi veloci (CF-FAB o f-FAB continuous flow fast atom bombardment) ________________________________________________72 Termonebulizzazione (TSP=thermospray) __________________________________74 Elettronebulizzazione (ES electrospray) ____________________________________76 Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI)__________________________79

/DFFRSSLDPHQWR�HOHWWURIRUHVL�FDSLOODUH�VSHWWURPHWULD�GL�PDVVD�&=(�06 BBBBBBBB��

3

Università degli Studi di Pavia Corso di laurea in Chimica

Appunti del corso di Metodi fisici

in chimica organica.

Spettrometria di massa

Appunti e copie riservate alla circolazione interna per uso didattico

Giorgio Mellerio Centro Grandi Strumenti

Laboratorio di Spettrometria di massa

4

Nunc age, quo motu genitalia materiai corpora res varias gignant genitasque resolvant, et qua vi facere id cogantur, quaeque sit ollis reddita mobilitas magnum per inane meandi, expediam: tu te dictis praebere memento.

Su pertanto! qual moto sospinga i vivaci primordi della materia a tutte formare le cose, e formate a dissolverle poi, da qual causa ciò faccian costretti, qual vorticosa corsa li lanci pel vuoto infinito, ti insegnerò: tu porgi attento al mio dire l'orecchio.

T. Lucreti Cari de rerum natura II, 62 - 66

5

Introduzione. Lo spettro di massa del metanolo E' comune uso trattare assieme le tecniche spettroscopiche, così assieme a spettroscopia ultravioletta (UV), infrarossa (IR) e di risonanza magnetica nucleare (NMR) viene illustrata la spettrometria di massa (MS); essa però è fondamentalmente diversa dalle precedenti. Queste infatti trattano della interazione della radiazione elettromagnetica con le molecole, cioè sono misure "fisiche": le molecole dei composti investigati sono eccitate dalla radiazione elettromagnetica, a seconda dei gruppi funzionali presenti nelle molecole investigate sono assorbite soltanto radiazioni di energia ben definita; la "misura" avviene su queste energie, dopo il composto può essere recuperato immutato. In spettrometria di massa le molecole sono pure eccitate ma per mezzo di elettroni. Se un elettrone "passa attraverso" una molecola, la sua energia viene trasferita, la molecola viene ionizzata e spesso anche eccitata in modo tale da rompersi in frammenti. Quindi il composto originale non può essere recuperato intatto: la spettrometria di massa è tecnica affine all'analisi elementare, è una tecnica distruttiva. E' una vera e propria reazione tra la molecola gassosa e gli elettroni per dare dei prodotti (di decomposizione) che devono essere separati e rivelati. La logica che ispira la spettrometria di massa nella determinazione della struttura di una sostanza incognita è simile a quella usata un tempo in chimica organica: degradare con reazioni note le molecole incognite fino ad arrivare a molecole sufficientemente piccole da poter esser facilmente identificate anche per confronto con sostanze già note. Altra differenza rispetto alle altre "spettroscopie" è che la qualità ed addirittura il tipo di informazioni ottenibili dipendono essenzialmente della strumentazione usata. L'urto con gli elettroni ionizza la molecola, il movimento degli ioni così formati (atomici e molecolari) attraverso campi magnetici e/o elettrici fa in modo che detti ioni si separino in funzione del loro rapporto massa su carica (m/z). Il dato che si ottiene è uno "spettro di massa" cioè un diagramma delle quantità relative degli ioni (prodotti dalla sorgente e "contati" dal rivelatore) in funzione del rapporto m/z (misurato dall’analizzatore). La traccia ottenuta dal registratore è lo spettro di massa, un grafico delle particelle rivelate in funzione del rapporto m/z. Gli ioni oggetto della forma più comune di spettrometria di massa sono ioni positivi ottenuti per rimozione di un elettrone. Lo ione ottenuto per semplice rimozione di un elettrone dalla molecola è detto ione molecolare. L'energia richiesta per rimuovere un elettrone da un atomo o da una molecola è il suo potenziale di ionizzazione (P.I.). I composti organici hanno un potenziale di ionizzazione compreso fra gli 8 e i 15 eV (1eV equivale a 96,487 kJ mole-1 che equivale a 23,06 kcal mole-1). Però il raggio di elettroni non ha quella efficienza necessaria ad ottenere spettri riproducibili fino a quando non raggiunge un potenziale tra 50 e 70 eV. Questo raggio è così potente da rompere alcuni legami nella molecola producendo così una serie di frammenti molecolari. Questi frammenti hanno una carica positiva e vengono accelerati, separati, e registrati con valori corrispondenti alle loro rispettive masse. Ioni frammento sono originati anche quando la molecola, perdendo

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un elettrone, si trova in una situazione così instabile che si disintegra prima di essere accelerata (tempo di vita minore di 10-6 sec.).

7

m/z intensità relativa12 1,1113 2,614 5,615 26,47

15,5 0,216 0,9617 2,3518 2,6119 0,2620 0,0126 0,0227 0,2128 10,629 78,9330 10,4531 10032 79,4933 1,76

12 1314

15

15,5 16 17 1819 20 26 27

28

29

30

31

32

33

0

20

40

60

80

100

12 13 14 15 15,5 16 17 18 19 20 26 27 28 29 30 31 32 33

P�]

LQWHQVLWj�UHODWLYD

Figura 1: spettro del metanolo

Lo ione formato nella camera di ionizzazione in maggiore abbondanza dà il picco più elevato nello spettro di massa. Questo picco viene chiamato picco base. Le abbondanze relative di tutti gli altri picchi nello spettro vengono riportate come percentuali dell'abbondanza del picco base, lo spettro così ottenuto viene detto normalizzato. Lo spettro di massa mostra la massa della molecola e le masse dei pezzi della molecola. E' importante ricordare che il valore di un qualsiasi ione accelerato nello spettrometro di massa è la sua vera massa e non il suo peso molecolare ottenuto usando i pesi atomici chimici. La scala chimica dei pesi atomici è basata sulla media pesata dei pesi di tutti gli isotopi di un dato elemento. Naturalmente lo spettrometro è in grado di distinguere tra le masse delle particelle. Di conseguenza le masse osservate per lo ione molecolare sono le masse delle molecole in cui ciascun atomo è presente con il suo isotopo più comune ed i segnali sono sempre accompagnati da ioni isotopici. Per lo meno nel suo asse delle x (scala m/z) lo spettro di massa è di facile comprensione; prendiamo ad es. lo spettro del metanolo (Figura 1):

CH3OH+e- →CH3OH+. +2e- m/z 32 IONE MOLECOLARE CH3OH+. →CH2OH+ +H. m/z 31 →CH3

+ +OH. m/z 15 CH2OH+ →CHO+ + H2 m/z 29

Lo ione m/z 31 è particolarmente stabile, la sua struttura può sopportare due cariche:

5,152

31

z

m = , è uno ione con doppia carica m++.

Si noti nei grafici la necessità di un esteso intervallo dinamico di registrazione. Amplificando ulteriormente il segnale inoltre si potrebbe registrare su carta fotosensibile un picco allargato, detto "metastabile", attorno ai valori di massa 26,8÷27,3; l'origine di questo segnale è data dal processo seguente.

8

La rottura da m/z 31 a m/z 29 implica la perdita di una molecola di idrogeno, si rompono due legami e se ne forma uno, un atomo di idrogeno migra per potersi legare all'altro, è un processo di trasposizione. Questo processo è più "lento" della rottura semplice e può avvenire non solo in sorgente ma anche durante il volo dalla sorgente al rivelatore di uno spettrometro di massa basato su analizzatore a campo

magnetico. Quindi nel nostro caso m*=2931

27,1292

= . Il segnale che si origina dalla

rottura durante il volo è detto metastabile e la sua massa apparente è data dal valore

PPP

* = 22

1

per il processo P P1 2+ +→ + neutro.

Le reazioni di frammentazione in spettrometria di massa possono essere razionalizzate con successo o persino predette partendo dall'assunzione che la reazione è iniziata o dal sito radicalico (rottura α) o dal sito che porta la carica (rottura i) (McLafferty 1966). Secondo questo concetto l'inizio della reazione al sito radicalico scaturisce dalla forte tendenza all'appaiamento degli elettroni: l'elettrone spaiato è donato per formare un nuovo legame verso un atomo adiacente ed il processo è accompagnato dalla rottura del legame α

H-CH2-OH CH2=OH+H+. +

. (m/z 31)

In alternativa l'inizio di una reazione di frammentazione da parte della carica implica l'attrazione di un doppietto di elettroni e comporta la rottura del legame adiacente al sito portante la carica (l'eteroatomo di solito) accompagnata dalla migrazione della carica

CH3-OH CH3 +OH+ . + .

(m/z 15) L'inizio da parte del sito radicalico (rottura α) è il meccanismo più importante ed è stato spesso riportato come "concetto della localizzazione della carica" (Budzikiewicz 1967). Per spiegare i processi di frammentazione preferiti adotteremo quindi il formalismo illustrato precedentemente. Nello ione molecolare si assume che i siti di localizzazione della carica e dell'elettrone spaiato si originino dalla perdita dell'elettrone con la minor energia di ionizzazione, in analogia con le transizioni elettroniche per gli spettri UV, la ionizzazione avverrà nell'ordine per gli elettroni n, π, σ. La rottura di un solo legame in uno ione molecolare (ione ad elettroni dispari ED=OE in inglese) produce una specie ad elettroni pari (EP =EE in inglese) ed un radicale neutro. La rottura di due legami in uno ione molecolare (ED) produce uno ione ad elettroni dispari (ED) tra i prodotti. Il processo di spostamento di un elettrone, omolisi, verrà indicato con una freccia "ad amo", mentre frecce normali indicheranno il processo di spostamento di una coppia di elettroni, eterolisi. Riassumendo avremo ioni: molecolari, isotopici, frammento dovuti a rotture semplici, frammento dovuti a trasposizioni, metastabili. Questi ioni ottenuti alle normali pressioni di uno spettrometro (~ 10-6 mbar) sono formati in processi monomolecolari; come conseguenza la loro abbondanza è direttamente

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proporzionale alla pressione nella camera di ionizzazione. In sorgente può avvenire però che uno ione (esempio molecolare) collida con una molecola neutra, cioè si abbia una reazione ione-molecola, a seguito di questo fenomeno si formano specie a massa più alta del peso molecolare con abbondanza relativa dipendente dal quadrato della pressione. Ovviamente questo fenomeno è di solito sgradito e si opera in modo da evitarlo, però la tecnica della ionizzazione chimica si basa appunto su questo processo.

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Concetti fondamentali di strumentazione Strumentazione di base Nella sua forma più semplice (Figura 2) lo spettrometro di massa attua tre funzioni essenziali:

1. le molecole sono soggette ad un bombardamento da parte di un flusso di elettroni ad alta energia che converte alcune di esse in ioni, "strappando" un elettrone; questi ioni sono accelerati in un campo elettrico;

2. gli ioni accelerati sono separati a seconda del loro rapporto massa su carica in un campo magnetico o elettrico;

3. gli ioni con un particolare rapporto massa su carica sono rivelati da un sistema che è capace di contare il numero di ioni che lo colpiscono. L'uscita del rivelatore è amplificata ed alimenta un registratore.

Figura 2: schema di uno spettrometro di massa (a settore magnetico)

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La sorgente La necessaria trasformazione del campione neutro in ioni avviene nella cosiddetta sorgente ionica, essa è pregiudiziale per i risultati finali essendo ovvio che questi ultimi dipendano da come il campione originale venga ionizzato. Se lo spettrometro di massa può essere considerato un laboratorio analitico per particelle cariche, è attraente per un chimico pensare alla sorgente ionica come a un reattore chimico, perché in qualche modo un mutamento chimico avviene nel campione quando diviene un gas ionizzato, prima di entrare nell'analizzatore. Ciascuna sorgente ionica è una differente specie di recipiente per reazione chimica e deve essere scelta appropriatamente rispetto al campione ed alle operazioni che vorremmo fare. Criteri generali ispiratori potranno essere, con diverso peso a seconda dei casi: sensibilità, riproducibilità, informazioni specifiche strutturali, soluzioni tecniche soddisfacenti. Una classificazione "pratica" è tra metodi di ionizzazione comuni e metodi di ionizzazione più sperimentali. La interazione elettronica è la tecnica più usata. Interazione elettronica: EI (electron ionisation - impact) Principi di funzionamento Elettroni di appropriata energia possono dar origine, interagendo con una molecola organica allo stato gassoso, a due processi: estrazione di uno o più elettroni (1 e 2) e assunzione di un elettrone nella molecola (3: cattura di risonanza, 4: attacco dissociativo, 5: produzione di coppie ioniche).

potenziali esemplificativi in eV 1. AB + e- → AB.+ + 2e- 10 2. AB + e- → ABn+ + (n+1)e- 3. AB + e- → AB- 2 4. AB + e- → A. + B- 3 1. AB + e- → A+ + B- + e- 9

condotto dal sistema di introduzione

alloggiamento della sorgente

filamentomolecole del campione allo stato vapore

anodo - raccoglitore di elettroni

piastre di focalizazione degli ioni

all’analizzatore di masse

piastra di accelerazionecamera di ionizzazione

al sistema di pompaggio

raggio di elettroni

Figura 3: schema di sorgente ad interazione elettronica

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AB.+ sono ioni precursore, un tempo detti padre o genitore (indicati con M+.), ABn+ sono ioni a carica multipla e AB- e B- sono ioni negativi. In condizioni normali il rapporto tra ioni positivi e negativi è 104 : 1 (dipende dalla energia degli elettroni). Per comodità ignoreremo d'ora in poi gli ioni negativi. Il processo 1. è causato dal passaggio di un elettrone entro circa 1/2 Å da uno degli elettroni della molecola. Un elettrone ionizzante dotato di energia 50 eV si calcola abbia una velocità di 4 . 108 cm/sec, il tempo impiegato da quell'elettrone per "attraversare" una molecola di 10Å è circa 2.10-16 sec. Questo tempo è molto più breve del periodo vibrazionale molecolare (1.10-14 sec) di conseguenza i nuclei atomici potranno essere considerati "fermi" durante il processo di ionizzazione (distanza nucleare invariata, principio di Frank e Condon) ed i successivi riassestamenti elettronici in cui la carica positiva viene ripartita tra tutti i legami saranno così rapidi che l'indebolimento dei legami è simultaneo. Questo avviene se l'elettrone ionizzante porta energia appena superiore al potenziale di ionizzazione della molecola. Se invece l'elettrone ionizzate porta energia che eccede il P.I. lo ione molecolare dovrà ridistribuire anche questo eccesso e lo farà tra i suoi vari modi vibrazionali tramite una serie di transizioni "buie" tra i vari stati elettronici. Lo ione padre, con i legami indeboliti e vibrazionalmente eccitati, si trova quindi in condizione di frammentarsi non appena l'energia assimilata supera quella del legame più debole. Un progressivo aumento dell'energia degli elettroni bombardanti provocherà un corrispondente aumento dell'eccitazione vibrazionale di tutti i diversi legami che potranno scindersi uno dopo l'altro via via che verrà raggiunta l'energia necessaria. Si può quindi pensare allo ione padre come un sistema isolato con un grande ma definito numero di gradi di libertà, ogni reazione di decomposizione avrà quindi una propria costante di velocità.

1. Entrata del campione 2. Raggio di elettroni diretto

perpendicolarmente al piano 3. Elettrodi di accelerazione e

focalizzazione (ad es. ad un potenziale di 2kV)

4. Elettrodo repulsore “repeller” (ad esempio ad un potenziale +2V)

5. Raggio di ioni 6. Analizzatore 7. Sorgente ionica (il blocco ad es. è

posto a 0V) Sistema da vuoto (conduttanza 30-100 l/s)

Figura 4: schema di sorgente “chiusa” (conduttanza 0,3-2 l/s) da McFadden, ridis.

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Aumentando l’energia degli elettroni lo spettro si arricchirà di segnali di ioni dovuti alle frammentazioni, con elettroni attorno al 70 eV vengono prodotti parecchi ioni in quantità differenti, aumentando ulteriormente l'energia degli elettroni l'aspetto qualitativo dello spettro rimane invariato e quello quantitativo cambia di pochissimo; si comprende quindi l'uso standard di questo valore. Campioni: qualsiasi campione volatile Costruzione della sorgente Gli elettroni sono prodotti per emissione termoionica di un filamento di W o Rh riscaldato (∼2000 °C) elettricamente e sono accelerati per mezzo di una caduta di potenziale (anodo) (ddp 70V ⇒ 70 eV di energia); inoltre sono presenti elettrodi per accelerare gli ioni positivi, fenditure collimanti, altri elettrodi per la risoluzione ottimale (vedi figure 3 e 4). Limitazioni - 70 eV sono un metodo estremamente drastico per creare ioni molecolari, come

risultato una notevole quantità di eccitazione (elettronica e vibrazionale) è posseduta dallo ione molecolare; esso pertanto è in molti casi condannato alla distruzione (cioè non si vede!).

- il processo richiede che il campione sia allo stato di vapore esiste quindi un contributo di energia termica alla frammentazione.

Ionizzazione chimica: CI (chemical ionisation)

Principi di funzionamento Un gas di reazione è introdotto nella sorgente a EI ad elevata pressione (60-199 Pa). La ionizzazione primaria avviene nella maniera solita (EI), gli ioni formati reagiscono con le molecole neutre del gas. Le risultanti reazioni ione-molecola producono ioni secondari che sono specie chimiche caratterizzate da una propria reattività ed un proprio comportamento come acidi o basi di Lewis. Questi prodotti sono i reagenti che possono reagire con il campione, gassoso, introdotto come piccolissima impurezza. Gli spettri dei campioni rappresentano i prodotti della reazione chimica delle molecole neutre del campione con gli ioni provenienti dalle reazioni ione-molecola del gas. Il più comune tipo di reazione è il trasferimento di idrogeno ("reazione acido-base"). Per il metano da reazioni ione-molecola si hanno i seguenti prodotti:

CH5+(48%), C2H5

+(41%) C3H5+(6%)

questo mazzo di ioni ("il plasma") reagisce con la molecola M da investigare: M + CH5

+ → MH+ + CH4 M + 1 M + C2H5

+ → [M + C2H5]+ M + 29 M + C3H5

+ → [M + C3H5]+ M + 41 M + C2H5+ → [M - H]+ + C2H6 M - 1 (nel caso di idrocarburi)

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Abbiamo cioè delle reazioni "acido-base", l'affinità protonica della base coniugata sarà una misura della forza del gas reagente

hard CH4 126 Kcal/mole CH5+

H2O 169 " H3O+ CH3OH 182 " CH3OH2

+ isoC4H10 193 " t-C4H9

+ soft NH2 201 " NH4

+

15

Figura 5: spettri della terpina registrati in interazione elettronica (EI) e in ionizzazione chimica (CI) con diversi gas reagenti

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Dall’esame degli spettri registrati con diversi reagenti si arriva alla conclusione che, oltre all’informazione sul peso molecolare, si possono anche ottenere informazioni sulla frammentazione, mediante una oculata scelta del gas reagente (figura 5). Campioni Sono gli stessi esaminabili con la sorgente EI. Costruzione della sorgente La sorgente è la stessa dell'EI, un po' più chiusa per ottenere una maggior pressione, richiede una maggiore potenza del sistema da vuoto nella zona circostante per evitare aumenti di pressione nel resto del sistema (vedi figura 6). Limiti Le condizioni di elevata pressione possono portare a scariche; la natura dei gas reagenti può far sorgere problemi tecnici (gli idrocarburi sporcano, NH3 dà reazione con argento e rame, H2O è difficile da eliminare, etc.); il campione deve essere allo stato gassoso. Questa volta si hanno i pesi molecolari ma le informazioni sulla struttura, o meglio gli ioni frammento, sono più difficili da interpretare.

Camera di ionizzazione

Sonda per l’introduzione diretta

Sistemadi focalizzazione

All’analizzatore

Al sistema dipompaggioCollegamento con il GC

(può essere rientrante) in mancanza “tappo”

Entrata del gas reagente

Figura 6: Schema di una sorgente CI; i valori tipici di una sorgente CI sono:

pressione in camera: 40-133 Pa energia elettroni emessi: 150-200 eV corrente: 250-350 µA tempo di soggiorno degli ioni in sorgente: ∼10-100 µs (EI: 1µs) libero cammino medio : 2x10-4 mm (EI: 200mm)

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Ionizzazione di campo: FI (field ionisation) Principi di funzionamento La ionizzazione di campo avviene quando un atomo o molecola è sottoposto ad un campo elettrico dell'ordine di 108 V/cm. La rimozione di un elettrone da una molecola tramite un elevato campo elettrico è basata sull'effetto "tunnel" quanto meccanico, (si può pensare ad una deformazione della curva di potenziale che caratterizza lo stato) ne consegue uno ione positivo con piccolissima energia interna nella forma di eccitazione elettronica o vibrazionale; esso viene di solito rivelato come ione molecolare stabile. Campioni Sono eguali all'EI Costruzione della sorgente Fattore critico e differenziante questa sorgente dalla EI è il disegno ed il materiale dell'elemento ionizzante. Questo consiste in una punta metallica aguzza o affilata come anodo mentre catodo è la fenditura di uscita della camera di ionizzazione. Un potenziale di 5-20 kV è applicato tra questi elementi molto ravvicinati (mm) (vedi figura 7). Limiti Costruttivi: facilità di scariche, fragilità dell'elemento ionizzante; sensibilità di almeno un ordine di grandezza inferiore all'EI e dipendente dal tipo di composto. Anche in questa tecnica la sostanza deve essere allo stato gassoso.

� �

Primo elettrodo (estrattore)

Elettrodo focalizzatore

Elettrodo accelerante

Fenditura di sorgente

Raggio ionico all’analizzatore di masse

Potenziale di focalizzazione (+)EI FIPosizione

Potenzialedi accelerazione

Porta elettrodo emittente

Elettrodo repulsore per il funzionamento in EI

“Blocco”(scatola della sorgente)

Condotto di introduzione del campione

Figura 7: schema di sorgente a ionizzazione di campo utilizzabile anche per ionizzazione elettronica

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Desassorbimento di campo: FD (field desorption) Principi Sono gli stessi della FI ma la ionizzazione avviene allo stato solido; il campione è adsorbito su un filo di tungsteno emittente opportunamente attivato ed introdotto per mezzo di una sonda portacampione nella sorgente ionica. Con questo metodo possono essere registrati spettri di composti non volatili o molto polari (sali). Molto spesso si trova l'attacco di un H+ (M+1) o di un catione alcalino (+23 per Na + 39 per K) Campioni Indicata per solidi non volatili e/o polari. Costruzione della sorgente Come FI, la cura è posta nell'elettrodo emittente che deve essere opportunamente attivato facendo "crescere" su di esso ciuffi di carbonio "arborescenti" (vedi figura 8). E' un'operazione che richiede degli specialisti. Limiti Fluttuazione della corrente (per cui è utile solo in analisi qualitativa); fragilità dell'emettitore.

5mm

3mm

Figura 8 Particolare di porta elettrodo emittente per desassorbimento di campo (FD), la freccia mostra il filo di tungsteno (10 µm) con gli aghi carboniosi.

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Ionizzazione chimica per desassorbimento: DCI (desorption chemical ionisation) Principi Tecnica di compromesso tra la CI e la FD, la DCI è una delle tecniche "in raggio" introdotte per limitare al massimo i processi di trasformazione del campione prima della ionizzazione. Il campione disciolto in soluzione viene depositato su di un elettrodo emittente simile a quello usato per FD; dopo aver lasciato evaporare il solvente, l'elettrodo, tramite una sonda, viene introdotto nel bel mezzo del plasma formato allo stesso modo della CI. Riscaldando rapidamente l'elettrodo emittente si ottengono spettri in alcuni aspetti paragonabili a quelli ottenuti con la tecnica del desassorbimento di campo. Ciò perché il rapido riscaldamento permette alla temperatura di raggiungere un valore dove la vaporizzazione è favorita rispetto alla decomposizione della molecola. Si pensa che la DCI (detta anche direct chemical ionisation) non sia in realtà una ionizzazione "diversa" ma soltanto un metodo rapido di vaporizzazione (Figura 9). Un gas reagente "morbido" fornisce di solito migliori risultati. Campioni Solidi non volatili e/o polari. Costruzione della sorgente Sorgente CI convenzionale; la sonda per introdurre i campioni deve essere modificata rispetto a quella convenzionale (vedi figura 9). Limiti Le condizioni sperimentali hanno effetti pesantissimi (posizione della sonda, stato della superficie emittente) e gli spettri sono fortemente dipendenti anche dal tempo.

e- e-

molecole di campione in fase solida

sorgente per EI o CImolecole neutre vaporizzate e prodotti di decomposizione

VRQGD�FRQYHQ]LRQDOH³VROLGV�SUREH´

VRQGD�³HVWHVD´³GLUHFW�H[SRVXUH�SUREH´

Figura 9: tipi di sonda, convenzionale ed “estesa” o “in raggio”

20

Ionizzazione con atomi veloci: FAB (fast atom bombardment) La ionizzazione ha preso origine come tecnica dalla spettrometria di massa a ioni secondari (SIMS secondary ion mass spectrometry) in cui le molecole di campione, trattenute su una superficie, sono urtate da ioni con elevata energia traslazionale. Nella tecnica FAB un raggio di particelle neutre con elevata energia è diretto in modo da urtare una pellicola di campione stesa su un supporto metallico pulito. L'urto produce un intenso e repentino aumento termico la cui energia viene dissipata attraverso gli strati più esterni della superficie del campione. Originariamente venivano usati atomi neutri di gas argon o xenon; in seguito l'impiego di un raggio primario di ioni cesio (Cs+) ha aumentato la sensibilità. L'analisi degli ioni secondari emessi quando una superficie viene bombardata con un raggio ionico (primario) energetico è un metodo da tempo utilizzato nell'esame degli strati superficiali di materiali inorganici come metalli, leghe, semiconduttori ... I danni che possono essere provocati da un simile bombardamento su molecole organiche costringono all'uso di raggi primari a bassissima intensità con conseguente scarsa sensibilità della tecnica. E' il metodo che assicura il rinnovarsi della superficie l'idea vincente del FAB, permettendo l'impiego di intensi raggi primari costituiti sia da atomi neutri (FAB, fast atom bombardment) sia da ioni (FIB oppure LSIMS, liquid SIMS). La matrice liquida usata, rinnova in continuo lo strato superficiale della molecola in contatto diretto con il raggio bombardante, prolunga così il periodo della produzione degli ioni, riduce il grado di distruzione del campione ed aiuta la stabilizzazione dello ione. Come risultato finale si hanno raggi di ioni secondari con intensità sufficiente per strumenti a scansione, come ad esempio a settore magnetico, e una loro produzione prolungata anche per venti minuti. L'energia impartita agli ioni molecolari, di solito protonati, deprotonati o in addotti con la matrice, è spesso sufficiente per dare origine a rotture di legami e produrre così ioni frammento; l'estensione del fenomeno però varia con il tipo di composti. La teoria che spiega la produzione di ioni in FAB non è stata ancora ben chiarita; la prima idea che si trattasse di desassorbimento di ioni pre-formati in soluzione (della matrice) è chiaramente una semplificazione anche se gli ioni pre-formati sono desorbiti di preferenza. I meccanismi di protonazione o di rimozione di un idrogeno possono avvenire all'interno della matrice oppure in un denso strato gassoso immediatamente sopra la superficie (selvedge) con reazioni ione-molecola come nella ionizzazione chimica. La cascata di collisioni che ha origine dall'impatto dell'atomo veloce causa abbondanti ionizzazioni nella matrice.

ioni primari ioni secondari

raggio ionico “energetico” ioni di superficie “divelti”

superficie del campione

trasferimento di energia

Figura 10: processi SIMS

21

θ angolo di incidenzaraggio di atomi veloci

soluzione dell’analita in glicerina

superficie della sonda

Figura 11: visione pittorica del bombardamento con atomi veloci sulla superficie della soluzione (dispersione) di glicerina con produzione di ioni positivi e negativi dell’analita come pure di specie neutre (N) e ioni di glicerina (G)

Figura 12: principi della sorgente con atomi veloci (FAB)

22

Campioni I vantaggi sopra descritti, tra cui la produzione di abbondanti ioni molecolari, sono sufficienti per fare della tecnica FAB un metodo standard per analisi di campioni polari o labili, in particolare di quelli ad elevato peso molecolare, soprattutto perché non esiste la necessità di vaporizzare il campione. Costruzione della sorgente Un gas nobile, Ar° oppure meglio Xe°, viene usato come sorgente di atomi bombardanti. Un raggio di ioni Xe+, dotati di elevata energia traslazionale (2-10 keV), viene prodotto mediante collisione con elettroni in una sorgente a scarica o a campo a sella, e poi neutralizzato in una densa nube di atomi dello stesso gas xenon per scambio di carica, cattura di elettroni, in modo da produrre un raggio di atomi veloci. Questo insieme viene detto cannone atomico (atom gun). Il raggio di atomi veloci passa nella regione della sorgente ionica (la solita dello spettrometro) per andare a colpire il campione disciolto in una matrice liquida su una piccola superficie metallica "bersaglio" montata su una sonda estraibile che può essere quella normalmente usata per i campioni solidi dopo opportune modifiche. L'angolo di incidenza del raggio primario sulla superficie del campione e l'allineamento del bersaglio rispetto alla fenditura di sorgente sono messe a punto necessarie per rendere massima la sensibilità rispetto agli ioni secondari che devono raggiungere l'analizzatore. Limiti Sebbene il particolare pregio del FAB/LSIMS sia la sua abilità di produrre ioni molecolari (o "quasi") da molecole molto grandi, questa tecnica di ionizzazione non è una tecnica morbida (soft) con il desassorbimento di campo (FD). La natura della matrice è di fondamentale importanza per la ionizzazione FAB. Innanzitutto il campione deve essere solubile nella matrice; di solito però glicerina e tioglicerina sono adatte per la maggior parte dei casi, l'importanza della vischiosità e scarsa volatilità della matrice può essere facilmente intuita; altri materiali o additivi possono fornire dei vantaggi. Le migliori condizioni di analisi per un particolare composto sono il frutto di prove sperimentali e non c'è un procedimento universale. Altri svantaggi dati dalla matrice sono l'elevato livello di rumore di fondo "chimico" che fornisce ioni ad ogni valore di massa ed inoltre la presenza di intensi ioni addotto tra molecole di matrice e campione e tra molecole della matrice stessa. Ciò porta ad una sensibilità molto più bassa rispetto alla ionizzazione per interazione elettronica o alla ionizzazione chimica oltre a complicazioni nell'interpretazione dello spettro. Campioni in miscela danno origine a spettri FAB mischiati; effetti di competizione sulla superficie della matrice possono però portare a ionizzazioni preferenziali di un singolo composto a prescindere dalla sua concentrazione in miscela.

23

L’analizzatore Successivamente gli ioni prodotti devono essere messi in movimento o meglio "lanciati" mediante piastre metalliche poste ad un potenziale negativo variabile (500-8000V) detto potenziale di accelerazione ed introdotti in un analizzatore che ha il compito di separarli. Si ricordi che il potenziale del campo elettrico di accelerazione, il cosiddetto potenziale di accelerazione, ha una notevole importanza in quanto il suo valore determina l’energia cinetica degli ioni: esso varia a seconda del tipo di analizzatore usato, passando ad esempio da poche decine di Volt per un analizzatore quadrupolare a diversi kV per un analizzatore magnetico. La zona di accelerazione fa parte del blocco della sorgente. Esistono vari tipi di analizzatore, possono essere suddivisi in due categorie fondamentali: 1. analizzatori di quantità di moto, sistemi cioè in grado di separare ioni aventi

valori diversi del prodotto mv. Sono tutti gli strumenti a deflessione magnetica "B" compresi quelli dotati di un settore elettrostatico "E" (storicamente analizzatori "statici")

2. analizzatori dinamici, sistemi nei quali la separazione degli ioni è basata sulla stretta dipendenza dal tempo di uno o più parametri del sistema analizzatore. Sotto gruppi:

a. a tempo di volo (TOF = time of flight) b. a stabilità di percorso (quadrupolari) "Q" c. a bilanciamento di energia (ICR = ion cyclotron resonance)

Sistemi a deflessione magnetica Esaminiamo i principi fisici, detti (Figura 13): m la massa di uno ione z la carica posseduta dallo ione V il potenziale di accelerazione v la velocità acquistata dallo ione dopo l'accelerazione dovuta all'azione del potenziale V B il valore del campo magnetico r il raggio di curvatura della traiettoria dello ione, dovuto all'azione del campo

magnetico B Possiamo scrivere l'equazione dovuta all'energia cinetica

zV = 12

mv2 (1)

ed al fatto che il campo magnetico costringe lo ione a muoversi in un cammino circolare: la forza esercitata dal campo deve essere eguale alla forza centrifuga

zvB = r

mv2 (2)

combinando si ottiene mz

B r2V

2 2

= (3)

24

che rappresenta analiticamente la proprietà di uno spettrometro con analizzatore magnetico di separare ioni di diverso rapporto m/z in funzione di B o di V. Mantenendo costanti B e V, tutte le specie ioniche aventi lo stesso valore m/z andranno ad impressionare lo stesso punto di una lastra fotografica situata sul piano focale (vedi figura 13); lo spettro apparirà costituito da righe, immagini della fenditura usata per definire il raggio (dato che ha una certa apertura a ventaglio). Effettuando una modulazione da zero ad un valore prefissato di B o di V ("scansione") risulta quindi possibile focalizzare attraverso una fenditura "in uscita" dal campo tutte le specie ioniche generate nella sorgente, separate ed ordinate in funzione del loro rapporto m/z. Se ricaviamo dalla (2)

rmvBz

= (2bis)

avremo una relazione che esprime analiticamente il fenomeno fisico per cui tutti gli ioni entranti nel campo magnetico ed aventi la stessa carica e la stessa quantità di moto seguono una traiettoria circolare con eguale raggio di curvatura r, indipendentemente dalla loro massa, mentre ioni con differente quantità di moto seguono traiettorie con differenti raggi di curvatura. Questo tipo di analizzatore, a voler esser precisi, produce uno spettro delle mv degli ioni che si identifica con lo spettro di massa m solo quando tutti gli ioni entrano in B con identica energia, quando cioè ad ogni specie ionica è associata una ben definita velocità. Il settore magnetico soddisfa quindi a due funzioni: I. focalizza gli ioni aventi stessa massa, stessa velocità e piccole differenze di angolo

di incidenza II. separa gli ioni costituenti il fascio secondo il rapporto m/z Riguardo a tale separazione viene definito un parametro detto risoluzione: abilità dello spettrometro di separare ioni di differenti valori di m/z. Detti ioni di massa m1>m2 la risoluzione ℜ

ℜ=+

=m

m m

m

m1

1 2

1

∆

25

FDPSR�PDJQHWLFR

SRWHQ]LDOH�GL�DFFHOHUD]LRQH

IHQGLWXUD�GL�VRUJHQWH

VRUJHQWH

ULYHODWRUH

IHQGLWXUD�FROOHWWULFH

Figura 13: settore magnetico (B)

VRUJHQWH

SLDVWUH�GHO�VHWWRUH�HOHWWURVWDWLFR��(6$�

IHQGLWXUD�GL�GHILQL]LRQH�GHO�UDJJLR

VSHWWUR�GL�HQHUJLH

SRVL]LRQH�GHOODIHQGLWXUD�GLGHILQL]LRQH�GHOOH�HQHUJLH

Figura 14: settore elettrostatico (E)

VRUJHQWH

SRVL]LRQH�GHOODIHQGLWXUD�GL

GHILQL]LRQH�GHOOH�HQHUJLH

VHWWRUH�HOHWWURVWDWLFR�(6$�

VHWWRUH�PDJQHWLFR

SXQWR�GL�GRSSLDIRFDOL]]D]LRQH

Figura 15: strumento a doppio fuoco (EB)

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La risoluzione in uno spettrometro è funzione di parecchi fattori, tra di essi la scarsa monocromaticità del raggio, cioè il fatto che non tutti gli ioni di stesso m/z hanno stessa energia cinetica. Per ovviare a tale problema si pone un filtro energetico (Figura 14) costituito da un campo elettrostatico E direzionato perpendicolarmente a B ; avremo dall'espressione della forza centripeta, ove R = raggio di traiettoria

zEmv

R

2

= (4)

questa combinata con la (1)

R2VE

= (5)

per E costante si avrà una focalizzazione di tutti gli ioni con eguale energia cinetica. Gli strumenti ad analizzatore elettrostatico e magnetico combinati vengono detti a doppio fuoco (Figura 15). Esistono diverse disposizioni e geometrie degli strumenti a doppio fuoco. Ricordiamo le storiche geometrie di Mattauch – Herzog e di Nier – Johnson nelle due forme diretta (elettrostatico – magnetico: EB) e inversa (magnetico – elettrostatico: BE)

27

Analizzatori a tempo di volo Se consideriamo l’eq. (1) ricaviamo

v2zVm

km

= = (1bis)

che indica: la velocità acquistata da uno ione sottoposto ad un campo accelerante V è inversamente proporzionale alla radice quadrata della massa m. Considerando una distanza s=vt si ha

skm

t= ovvero ts m

k= (6)

ioni di identica energia, ma con valori di massa differenti, richiedono differenti intervalli di tempo per percorrere la stessa distanza (Figura 16).

��

�

���

�� ��� �

��

regione di ionizzazioneed accelerazione

griglie di accelerazione

sorgente di elettroni ad alta energia regione di “deriva”

(libera da campi)

rivelatore ed oscilloscopio sincronizzato

Figura 16: schema di un analizzatore a tempo di volo (TOF)

28

Analizzatori quadrupolari Gli analizzatori fin qui esaminati "classici", separano gli ioni disperdendoli o nello spazio, come nel caso degli strumenti a settore magnetico, o nel tempo, come nel caso degli strumenti a tempo di volo. La proprietà di separare le masse (gli ioni) degli analizzatori a quadrupolo si basa sulla stabilità o instabilità intrinseca dello ione all'interno dello strumento. Contrariamente agli strumenti a settore magnetico o elettrico, i quadrupoli separano gli ioni sulla base del loro rapporto massa su carica (m/z) piuttosto che sulla base del momento o della energia cinetica. Di conseguenza lo strumento può conservare la capacità di separare ioni con differenze di un'unità di massa anche quando esamina popolazioni ioniche che hanno estese distribuzioni di velocità. Si dice campo quadrupolare un campo (elettrico) la cui dipendenza lineare dalle coordinate spaziali è

E=E0 (αx+βy+γz) ove α, β, γ, = costanti ed E0 è un fattore indipendente dalla posizione ma che può essere funzione del tempo. Un campo di tal genere si instaura tra quattro elettrodi di sezione iperbolica (vedi Figura 17) quando si applica un potenziale composto da una componente continua (dc) U e una componente a radio frequenza Vcos(ωt) detta (ac-rf). Nella figura 18 è schematizzato uno spettrometro a quadrupolo: l'analizzatore consiste in un insieme di quattro elettrodi a barre, questi elettrodi sono collegati agli alimentatori in modo tale che le coppie opposte di barre sono accoppiate assieme con potenziali a radiofrequenza (rf) e a corrente continua (dc) applicati fra di esse.

�9 ���9 �UI GF

��9 ���9 �U I GF

Figura 17: campo in un quadrupolo

sorgente sistema di barre analizzatore collettore

raggio di elettroni ioni

filamentoU+Vcos tω

+Us

Figura 18: analizzatore e quadrupolo

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Quando gli ioni entrano in questo campo in modo perpendicolare (vz=costante) oscillano nelle direzioni x e y, l’ampiezza di tali oscillazioni dipende dalla frequenza ν del potenziale applicato e dalle masse degli ioni. Se l’oscillazione di uno ione è stabile (=ampiezza costante) in entrambe le direzioni x e y, lo ione passa il campo e giunge al rivelatore. Gli altri ioni, nelle condizioni di transito di quello ione, vengono sottoposti ad oscillazioni instabili e vanno a scaricarsi sugli elettrodi. Solo una massa ben determinata può attraversare il campo per determinati valori di U, V e ν ; modulando ν si può avere uno spettro di massa. L'azione "filtrante" di un analizzatore di masse a quadrupolo viene ottenuta applicando una combinazione di potenziali indipendenti dal tempo (dc) e dipendenti dal tempo (ac). Per comprendere l'azione della struttura degli elettrodi e dei potenziali sulla traiettoria di una particella carica esamineremo i piani X-Z e Y-Z separatamente. Iniziamo dal piano X-Z (vedi figura 19) e consideriamo gli effetti che ha un potenziale dipendente dal tempo (ac) sulle traiettorie degli ioni che viaggiano in quel piano. In assenza di potenziale continuo (dc), durante un singolo periodo della forma d'onda (ac) applicata, gli elettrodi che giacciono sull'asse delle X passeranno metà ciclo a potenziale positivo rispetto al centro degli assi e l'altra metà a potenziale negativo. Quando il potenziale è positivo rispetto al centro, il raggio di ioni positivi sarà accelerato e focalizzato verso l'asse centrale degli elettrodi. Quando il potenziale è negativo invece, il raggio di ioni positivi sarà accelerato verso gli elettrodi (a potenziale negativo). La dinamica del fenomeno sarà governata da diversi fattori tra cui la grandezza istantanea del potenziale negativo applicato agli elettrodi, il periodo di tempo che gli elettrodi trascorrono a potenziale negativo (cioè la frequenza della forma d'onda ac) come pure dalla posizione, velocità, rapporto massa su carica della particella. Ora aggiungiamo al potenziale una componente indipendente dal tempo (dc), ad esempio un potenziale positivo applicato agli elettrodi che giacciono nel piano X-Z. Consideriamo, in senso qualitativo, l'effetto dipendente dalla massa che i due potenziali (dc-ac) combinati hanno sulle traiettorie dei diversi ioni. Se uno ione è molto pesante e/o la frequenza del potenziale è molto rapida, lo ione tenderà a sentire soltanto l'effetto del potenziale medio applicato agli elettrodi, ovvero ioni pesanti tenderanno ad essere influenzati soltanto dal potenziale continuo positivo, ciò vuol dire che questi ioni saranno focalizzati verso il centro degli assi. I piccoli periodi di tempo durante i quali gli elettrodi passano a potenziale negativo avranno effetti trascurabili sulle traiettorie degli ioni pesanti. Al contrario, se uno ione è molto leggero, il suo cammino potrà essere molto influenzato dal potenziale (ac) che varia con rapidità; se infatti uno ione è sufficientemente leggero, esso durante un passaggio a voltaggio negativo può subire un'accelerazione abbastanza intensa da arrivare a collidere con un elettrodo, scaricarsi ed essere pompato via come una particella neutra. Ovvero gli ioni verranno filtrati sulla base del loro rapporto massa su carica. In particolare, ioni sotto un particolare valore critico di m/z saranno filtrati via dal raggio, a causa della velocità con cui essi possono rispondere all'azione defocalizzatrice causata dalla porzione negativa del potenziale alternato; d'altro lato, quegli ioni con massa superiore al valore critico saranno trasmessi attraverso il quadrupolo e raggiungeranno il rivelatore. La struttura degli elettrodi e la natura del potenziale si combinano per formare un filtro di massa passa alto che opera nel piano X-Z (Figura 20a). Consideriamo ora le

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traiettorie degli ioni nel piano Y-Z. In ogni istante il potenziale applicato agli elettrodi che giacciono lungo l'asse Y è eguale in grandezza ma opposto in segno al potenziale applicato agli elettrodi che giacciono lungo l'asse X. Ciò significa che la forma d'onda alternata (rf) applicata agli elettrodi X è 180° sfasata rispetto al potenziale applicato agli elettrodi Y. Più importante però è il fatto che mentre il potenziale continuo applicato agli elettrodi del piano X-Z è positivo, quello applicato agli elettrodi del piano Y-Z è negativo. Nuovamente gli ioni pesanti tenderanno ad essere influenzati soltanto dal valore medio del potenziale applicato ovvero dal potenziale continuo. In questo caso però il potenziale continuo è negativo. Ciò significa che gli ioni relativamente pesanti tenderanno ad essere eliminati dal raggio a causa dell'effetto defocalizzante dato dal potenziale dc negativo. D'altronde, se lo ione è sufficientemente leggero, esso potrà rispondere all'azione focalizzante che si ottiene quando la porzione positiva del campo alternante diviene maggiore del potenziale continuo negativo. Se la frequenza e la grandezza del campo ac sono opportunamente scelte, è corretto pensare che l'azione del campo ac si esplichi nel correggere le traiettorie degli ioni leggeri in modo da impedire il loro urto sugli elettrodi lungo l'asse Y. Gli elettrodi ed i potenziali applicati si combinano per formare un filtro di massa passa basso che opera nel piano Y-Z (Figura 20b). Affinché uno ione voli dalla sorgente al rivelatore, deve chiaramente rimanere stabile in entrambi i piani X-Z e Y-Z. Ciò vuol dire che dovrà essere sufficientemente leggero da non essere eliminato dal filtro passa basso che opera nel piano Y-Z ma non dovrà essere così leggero da essere eliminato dal filtro passa alto che opera nel piano X-Z. Queste condizioni di stabilità reciproca descrivono una filtro passa banda (Figura 20c). L'ampiezza della regione passa banda, che è indicativa della risoluzione delle masse, è governata dal rapporto dei potenziali ac-dc applicati agli elettrodi. Si può dimostrare che la massa corrispondente al centro della regione di stabilità reciproca è determinata dalla grandezza di entrambi i potenziali.

Figura 19

WUDVPLVVLRQH

PDVVD

PDVVD

PDVVD

WUDVPLVVLRQH

WUDVPLVVLRQH

D

E

F

Figura 20: il quadrupolo come filtro passa banda

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Le equazioni del moto Una completa descrizione della traiettoria di un qualsiasi ione in funzione delle sue condizioni iniziali viene data da un insieme di tre equazioni differenziali. La soluzione di una delle tre è banale, indica che la posizione e la velocità di uno ione lungo l'asse delle z non viene influenzata da qualsiasi potenziale applicato agli elettrodi. L'uso di elettrodi di sezione iperbolica porta a equazioni del moto che non contengono termini misti in coordinate. Cioè il moto delle particelle rimane indipendente lungo ciascuno dei tre assi di coordinate. Tenendo presente che u

rappresenta sia x che y e che x=12

wt l'equazione è d ud

a 2q cos2 u 02

2 u uξξ+ − =

con a4zU

r m202=

ω q

2zVr m2

02=

ω

ove x ed y sono le distanze lungo il dato asse delle coordinate, r0 è la distanza tra asse centrale (asse z) e la superficie di ciascun elettrodo, ω è la frequenza angolare (2πf) della forma d'onda della corrente alternata applicata (ac), V è la grandezza della corrente alternata (ac o rf) ed U è la grandezza del potenziale continuo applicato. Ovviamente m ed z sono la massa e la carica dello ione. L'equazione è nella forma canonica dell'equazione differenziale di Mathieu (matematico francese del XIX secolo); per nostra fortuna la comprensione del funzionamento di un quadrupolo non richiede una approfondita conoscenza delle soluzioni. La caratteristica essenziale dell'equazione è che la soluzione per u può

essere espressa come una serie coinvolgente termini della forma eµξ che possono essere (a) oscillatori (quando µ è immaginario) con ampiezze finite in x ed y o (b) esponenziali (quando µ è reale) con ampiezze che aumentano rapidamente con il tempo. Dal momento che µ è una funzione di a e q, le condizioni per traiettorie stabili possono essere identificate da un grafico-diagramma di Mathieu (figura 21) in cui si possono distinguere regioni dello spazio a-q dove le soluzioni alle equazioni del moto sono stabili o instabili. Nei termini del nostro filtro quadrupolare nel caso di soluzioni stabili una particella che entra nel filtro sarà trasmessa attraverso tutto il sistema ed infine registrata dal rivelatore. Al contrario, una soluzione instabile corrisponde al caso in cui la dislocazione radiale della particella aumenterà senza limite. Tali particelle saranno filtrate via dal raggio degli ioni prima che possano raggiungere il rivelatore in quanto collideranno sugli elettrodi. In linea di principio per una qualsiasi massa un quadrupolo può funzionare in un qualsiasi punto dello spazio a-q interno al diagramma. In pratica, i quadrupoli di solito operano in modo tale che i valori dei parametri a e q siano sempre legati da un rapporto semplice. Di solito questa condizione viene raggiunta facendo in modo che il potenziale continuo applicato sia sempre una frazione del potenziale alternato; cioè il rapporto U/V viene mantenuto costante, a prescindere dal valore dei due termini. In termini di diagramma a-q, mantenere U/V costante equivale a restringere le operazioni del filtro di massa ad una serie di punti operativi che giacciano su una retta con intercetta all'origine. Questa linea è conosciuta come linea della scansione di massa o linea d'operazioni (operating line). Dal momento che a e q contengono molti termini in comune l'inclinazione della linea di scansione di massa (a/q) è data dal rapporto 2U/V.

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I punti della regione di stabilità intersecati dalla linea di operazioni determinano la banda passante dello spettrometro. Se, per un momento, si assume che i valori dei parametri z, ω, U e V rimangono fissi, allora un'utile raffigurazione della linea d'operazioni o di scansione di massa è quella di una scala graduata che contiene la massa di tutte le particelle. Se l'inclinazione della retta viene variata (con opportune variazioni del rapporto U/V) si può fare in modo che solo un ristretto intervallo di masse cada nell'intervallo di stabilità del diagramma. La figura 21 illustra il caso in cui solo lo ione di massa m2 passa attraverso il quadrupolo; lo stretto apice della regione di stabilità può essere usato per avere un filtro passante molto selettivo. La regione della banda passante definisce la risoluzione, se il rapporto U/V viene abbassato la risoluzione verrà ridotta (Figura 21 caso R=1). Qualora venisse annullato il potenziale continuo, rimane solo quello alternato ("rf-mode"), il parametro a si annulla, la linea di operazioni nello spazio a-q ha inclinazione zero ed intercetta l'asse a nel punto a=0, un elevato numero di valori di masse cadranno all'interno del diagramma, il sistema è ritornato ad essere un filtro passa alto. (Ricordiamo che la massa m è inversamente proporzionale ad a e q, quindi le masse più basse appariranno a destra nei diagrammi e quelle più alte a sinistra).

Figura 21: zona espansa di un diagramma di stabilità. Le linee di scansione corrispondono alla risoluzione R=100, 10, 1 • m1, m2, m3 rappresentano tre ioni di massa crescente

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Trappola ionica I principi base delle operazioni della trappola ionica possono essere meglio compresi in relazione a quelli di filtro quadrupolare. Se immaginiamo un solido di rivoluzione generato ruotando la struttura delle barre illustrata in figura 22a lungo il suo asse z, la coppia di elettrodi A formerà una superficie simile un iperboloide continuo, mentre gli elettrodi B formeranno delle superfici di due iperboloidi separati ("a tappo") come illustrato in figura 22b. La trappola ionica è quindi un sistema a tre elettrodi e di solito viene configurata in modo che i due elettrodi terminali "a tappo" sono collegati assieme e tenuti a terra mentre i potenziali rf e dc (se presenti) sono applicati soltanto all'elettrodo toroidale. Come per gli analizzatori quadrupolari, gli ioni all'interno del campo elettrico possederanno traiettorie stabili e quindi rimarranno intrappolati, oppure saranno instabili e di conseguenza verranno persi sugli elettrodi. Questo sistema fu per la prima volta descritto da W. Paul nel 1956. Nel 1984 fu introdotta la prima versione commerciale della trappola ionica quadrupolare basata su un nuovo metodo di espulsione selettiva dalla trappola degli ioni dotati di massa su carica (m/z) crescente; scopo di questa versione era di costituire un rivelatore per gascromatografia di poco costo ma sensibile basato sulla spettrometria di massa. Applicando all'elettrodo anulare (Figura 23) un voltaggio rf di appropriata grandezza e frequenza sono intrappolati ioni che coprono un vasto intervallo di massa. Quando si vuole registrare uno spettro di massa viene aumentata l'ampiezza del voltaggio, si ha come conseguenza che gli ioni di m/z sempre più elevato diventano instabili dal momento che il loro moto all'interno della camera aumenta in ampiezza e può portarli al di là dei confini fisici del sistema. A questo punto essi sono espulsi dal sistema in una sequenza di massa attraverso dei fori praticati in un elettrodo terminale. In pratica la trappola funziona allo stesso tempo come sorgente ionica e come analizzatore di massa.

y

x

z

r0

A

AB

B

a

y

z

x

AB B

b

Figura 22: a) quadrupolo; b) trappola ionica generata dalla rotazione di una sua sezione

34

Figura 23: schema di trappola ionica

Rivelatori Dopo essere stati separati gli ioni devono essere rivelati e la loro abbondanza relativa deve essere misurata. Anche qui esistono diversi tipi di sistemi: 1. gabbia di Faraday (Figura 24) 2. moltiplicatore di elettroni (Figura 25a, b) 3. lastra fotografica La differenza tra spettrometro e spettrografo (di massa) risiede proprio nel tipo di rivelatore impiegato: Spettrometro: rivelatore di tipo elettrico (n. 1 e 2), Spettrografo: rivelatore a lastra fotografica (n. 3) Altra differenza fondamentale: rivelatori elettrici: rivelano un singolo valore di m/z per volta (è quindi necessaria

una esplorazione del campo "scansione") rivelatore a lastra: rivelazione e registrazione simultanea di tutti gli ioni emergenti

(dal campo magnetico) Il problema della registrazione si pone solo per i segnali provenienti dal rivelatore elettrico: un normale registratore potenziometrico basterebbe se non fosse per l'inerzia del pennino che richiede tempi di registrazione piuttosto lunghi; si usava normalmente un registratore oscillografico (Figura 26); ora tutto viene trasmesso, tramite un'opportuna interfaccia, ad un calcolatore. Gli spettrografi di massa e le lastre fotografiche appartengono oramai alla storia della scienza.

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analizzatore

raggio di ioni

fenditura del rivelatore

elettrodo soppressore degli ioni

gabbia di Faraday

elettrodo collettore

all’applicatore e registratore

potenziale della camera di ionizzazione

resistenzadi ingressodi riferimento

Figura 24: schema di rivelatore a gabbia di Faraday

a) primo dinodo

raggio di ioni

all’amplificatore

elettroni

b)

segnale

raggio di ioni

superficie conduttrice resistiva

cascata di elettroni

-2kV

Figura 25: a) schema di rivelatore a moltiplicatore di elettroni con dinodi discreti (“SEM”); b) schema di rivelatore a moltiplicatore di elettroni con dinodo continuo (“CDEM”), il gradiente di campo lungo la superficie interna della “cornucopia” attrae gli elettroni verso il preamplificatore

36

Figura 26: schema del funzionamento di un registratore oscillografico

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Sistema di introduzione Poiché lo spettrometro di massa lavora sotto vuoto, è ovvio che la introduzione del campione rappresenti quanto meno un problema di compatibilità con la pressione atmosferica; il sistema di introduzione è quindi un'altra parte vitale dello spettrometro. (In Figura 27 i vari accessi in sorgente) Per i campioni gassosi non esistono problemi, bastano valvole di regolazione del flusso lungo la linea di collegamento. Per campioni liquidi è necessario un serbatoio riscaldato evacuabile, collegato alla sorgente tramite una valvola regolatrice. Il liquido viene introdotto nel volume di espansione con una comune siringa micrometrica passando attraverso un setto di gomma con una operazione identica all'iniezione in un gascromatografo. Spesso il sistema di introduzione per liquidi è tutto costruito in vetro (AGHIS=all glass heated inlet system) (Figura 28). Questo sistema, una volta molto utilizzato, oggi ha perso notevolmente di importanza; in forma più semplificata viene utilizzato per introdurre in sorgente sostanze polifluorurate il cui spettro serve a calibrare la scala delle masse dello spettrometro. I campioni solidi vengono fatti sublimare direttamente in sorgente dopo essere stati depositati in una provettina (crogioletto) posta sulla testa di una sonda riscaldabile (probe) (Figura 29). La sonda viene introdotta in sorgente dopo essere passata attraverso un sistema di compensazione del vuoto (paratie stagne e precamera collegata al sistema di pompaggio). L'operazione viene indicata come introduzione diretta (DIS direct inlet system) e la sonda è spesso abbreviata in DIP (direct inlet (introduction) probe). Il principale vantaggio del sistema di introduzione diretta è che esso riduce il tragitto delle molecole in fase vapore verso la zona di ionizzazione diminuendo così le possibilità di decomposizione. Un'importante caratteristica della spettrometria di massa è la sua estrema sensibilità: con sostanze pure bastano quantità dell'ordine di pochi nanogrammi (10-9g) per ottenere uno spettro completo ed interpretabile.

eventuale entrata del gas reagente per CI

filamento

collegamento con il forno riscaldato

sistema riscaldante

foro di entrata della sonda

foro di collegamento al GC (separatore)

12

3

elettrodo

focalizzatore 3

estrattore 2

repulsore 1

fenditura

apertura per gli elettroni

Figura 27: vari accessi in sorgente

38

volume diespansione

setto

al sistema di pompaggio del vuoto

foro regolatore del flusso “molecolare”

alla sorgente ionica

forno

Figura 28: sistema di introduzione per liquidi

Particolare della testa di sonda

1.punta isolata (ceramica)2.campione solido3.capillare (crogioletto)

porta campione4.camera di ionizzazione

al sistemadi pompaggio del vuoto

valvola a soffiettodi isolamento: assicura

la tenuta atmosfera/vuoto

sorgente(camera di ionizzazione)

spiraleriscaldante

Lo schema mostra la sonda completamente introdotta “in sorgente”

Figura 29: sonda per introduzione di solidi

39

Figura 30: sezione di una pompa rotativa

Figura 31: sezione di una pompa diffusiva

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Sistema da vuoto Per assicurare agli ioni un "volo" senza intoppi è necessario sgombrare il loro percorso, che è dell'ordine del metro. Ciò si ottiene con evacuazione spinta (10-6 – 10-7 mbar) attuata con sistemi di pompaggio adeguati e costruendo tutto lo spettrometro con tecnologia da alto vuoto. In tali condizioni operative il libero cammino medio delle molecole è largamente superiore alla distanza che gli ioni devono coprire; ciò comporta, oltre ad un aumento generale in sensibilità e risoluzione, la conseguenza, determinante per le teorie interpretative sugli spettri, che i processi in sorgente sono praticamente unimolecolari. I motivi per un vuoto così spinto non si esauriscono al libero cammino medio degli ioni: un'elevata pressione, dovuta a gas residui, dà luogo ad uno spettro di massa (del rumore di fondo: background) che interferisce con lo spettro del campione; con elevate pressioni in sorgente possono avvenire reazioni ione-molecola che cambiano l'aspetto dello spettro (vedi ionizzazione chimica). Problemi tecnici legati all'alta pressione sono dati nel caso di vuoto scarso dal verificarsi di scariche elettriche nella sorgente ove vi sono differenze di potenziale del kV; elevata pressione ovvero aria in sorgente comporta significative quantità di ossigeno che può bruciare il filamento emittente. Il sistema di vuoto è costituito non solo dalle pompe necessarie per produrlo, ma anche da un complesso sistema di misuratori, valvole di isolamento, sistemi di protezione in caso di fermate improvvise. Gli strumenti più semplici utilizzano solo una pompa da alto vuoto con la rispettiva pompa rotativa (Figura 30); gli strumenti più complessi invece utilizzano il cosiddetto sistema di pompaggio differenziale. Due gruppi di pompaggio, costituito ognuno da una pompa a diffusione (o turbomolecolare) (Figura 31) e da una pompa rotativa sono collegati rispettivamente alla sorgente ed all'analizzatore. Sorgente ed analizzatore comunicano tra di loro attraverso una piccola apertura che permette soltanto il passaggio degli ioni ed offre elevata resistenza al passaggio dei gas residui. In questo modo eventuali peggioramenti del vuoto in sorgente non influiscono sul vuoto dell'analizzatore. Sono necessarie anche altre pompe rotative supplementari per far funzionare ad esempio il sistema di introduzione diretta o il separatore molecolare per l'accoppiamento GC/MS.

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L’accoppiamento con le tecniche cromatografiche L’idea dell’accoppiamento tra un gascromatografo (GC) ed uno spettrometro di massa (MS) nasce quasi subito, nel 1957 (Holmes e Morrell), pochi anni dopo l'invenzione del gascromatografo (1951), perché entrambi gli strumenti analizzano i campioni in fase gassosa, hanno livelli di sensibilità paragonabili, operano in intervalli di temperature simili, non richiedono eccessive modifiche per essere collegati. L'idea di GC/MS sorge soprattutto perché i singoli componenti svolgono funzioni analitiche complementari: il gascromatografo separa le miscele ma ha difficoltà nella caratterizzazione dei composti, lo spettrometro di massa non è in grado di separare i componenti di una miscela ma fornisce informazioni utili per caratterizzare un composto. L'accoppiamento tra un cromatografo liquido ad alte prestazioni (HPLC) e uno spettrometro di massa è stato tentato già alla fine degli anni sessanta ma bisogna attendere la seconda metà degli anni settanta per vedere apparire qualche lavoro incoraggiante; tuttora non esiste un sistema di accoppiamento unico ed universale tra i due strumenti. Le difficoltà dell'accoppiamento LC/MS provengono dallo stato fisico diverso in cui le sostanze vengono a trovarsi nei due apparecchi, dalle proprietà fisiche diverse per ciascuno dei sistemi di solventi abitualmente usati in HPLC (queste proprietà impediscono infatti di avere un solo tipo di separatore universale) ed inoltre dal fatto di applicare il metodo soltanto a sostanze difficili, molto "fragili" o affatto volatili che non possono essere analizzate "normalmente" per GC/MS. In questa ultima difficoltà risiede anche l'importanza della LC/MS per la sua capacità di trattare composti termicamente e chimicamente labili, oppure a bassa volatilità. Un altro vantaggio della LC/MS è la facile preparazione del campione e di conseguenza una maggiore velocità di analisi. Le difficoltà di accoppiamento tra un cromatografo a fluido supercritico (SFC) ed uno spettrometro di massa (MS) pongono la SFC/MS tra la GC/MS e la LC/MS in parallelo con le caratteristiche fisiche di questo fluido. Esistono per altro sistemi di accoppiamento tra la cromatografia su strato sottile (TLC) e lo spettrometro di massa: TLC/MS con interfacce meccaniche che utilizzano tecniche di ionizzazione di superficie (SIMS, LSIMS-FAB). Schema generale del comune utilizzo della MS a seconda delle sostanze Caratteristiche delle sostanze

Sistemi di ionizzazione Accoppiamenti possibili

volatili EI GC/MS poco polari EI CI GC/MS polari EI CI GC/MS (derivati) molto polari DCI APCI FI (FD) TSP GC/MS derivati LC/MS estremamente polari DCI (APCI) FD FAB ESI LC/MS

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GC/MS: lo spettrometro di massa può essere visto come un rivelatore gascromatografico dotato di alta specificità, sensibilità e versatilità. I problemi tecnici che sorgono nell'accoppiare i due strumenti GC e MS:

1. E’ necessaria una rapidità di esplorazione dell’intervallo di massa da parte

dell’MS (=scansione) per seguire i tempi del GC, specialmente se con colonne capillari, onde evitare la distorsione dell’aspetto dello spettro di massa dovuta alla variazione di concentrazione della sostanza in sorgente durante l’eluizione del picco gascromatografico. Se gli spettri sono sottoposti a scansione molto veloce, il mutare della concentrazione del campione durante la scansione sarà insignificante (Figura 32). Un tempo la richiesta di rapidità di scansione si scontrava con l'isteresi magnetica degli analizzatori e con i problemi di frequenza di risposta dei galvanometri, ora è necessaria soltanto un po' di cura nella velocità di acquisizione del calcolatore.

Spettro registrato“in salita”

“all’apice”

“in discesa”

(esplorazione dello spettrometro da massa bassa a massa alta)

6 periodi di scansione

Figura 32: distorsione dello spettro di massa a seconda del punto del picco gascromatografico in cui viene effettuata la scansione

2. I due strumenti operano a pressioni molto differenti, GC: atmosfera (o più) -

MS: vuoto (10-5 – 10-7 mbar), inoltre la pressione è data da moltissimo gas di trasporto e pochissimo campione che interessa (Figura 33).

Per risolvere questo si utilizza un'interfaccia che idealmente dovrebbe lasciar passare tutto il campione per tutto il tempo dell'analisi senza decomposizione e senza ritardi nei tempi con conseguente peggioramento della risoluzione gascromatografica. Nel caso di colonne capillari l'interfaccia può essere

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omessa e, con bassi flussi di gas (0,5 - 1 ml/min), la colonna può terminare direttamente nella sorgente dello spettrometro; molto spesso però anche con le colonne capillari si usa un'interfaccia a partizione aperta ("open-split") (Figura 34).

Nel caso di colonne impaccate l'interfaccia è costituita da un separatore molecolare, un sistema progettato sulla dinamica dei flussi e/o sulla effusione molecolare che rimuove gran parte del gas di trasporto e lascia passare più campione possibile.

I separatori molecolari (Figura 35) si basano su: - effusione attraverso pori fini o sottile fessura (Watson & Biemann,

Brunée); - diffusione preferenziale attraverso membrana semi-impermeabile, da

parte del gas di trasporto oppure del campione (sostanza organica) (Llewellyn - Littlejohn);

- frazionamento del gas in un flusso a getto in espansione ("jet") (Ryhage - Becker). Nella sua versione a singolo stadio è ancora attualmente usato nel caso di necessità dell’uso di colonne impaccate (Figura 35). Un'altra soluzione all'accoppiamento GC/MS consiste nell'uso di sorgenti a pressione atmosferica (API: atmospheric pressure ionisation); progettata in origine per l'accoppiamento GC/MS, la sorgente API ebbe scarsissime applicazioni, mentre ora ha un grande ritorno nell'accoppiamento LC/MS.

MSSorgente

EI

MSSorgente

EI

0,1-2ml/min

<20ml/min

Sistema pompevuoto

Gas reagente=

Gas trasporto

Gas reagente = Gas trasporto

Separatore

GC2 GC

flusso 0,1-2 ml/min

flusso 10-60 ml/min

Separatore

Figura 33: accoppiamento GC con MS

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GC MS

GC

He

MS

GC MS

Capillare di restrizione

Interfaccia a pressione atmosferica

Interfaccia a partizione aperta( )RSHQ�VSOLW

He He

Figura 34: collegamenti GC/MS per colonne capillari

ugello schiumatore

al vuotomolecole di campione

molecole delgas di trasporto

Figura 35: separatore Jet, singolo stadio

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760 torr 10 torr MS

- 3

GC

760 torr 10 torr MS

- 3

Pompa della sorgente

GC Accoppiamento diretto

760 torr 10 torr MS

- 3

GC

Pompa

Separatore effusivo (Watson-Biemann)

Pompa Pompa

Separatore a orifizio -jet (Ryhage)

Separatore a membrana permeabile (Llewellyn)

Figura 36: collegamenti GC/MS per colonne impaccate

3. Registrazione della corrente ionica, cioè scelta del tempo di scansione; è un problema "storico" risolto dall'avvento dei calcolatori; senza calcolatore veniva risolto utilizzando un'energia di ionizzazione degli elettroni tale che ionizzasse le sostanze organiche ma non l'elio usato come gas di trasporto (cioè 20 eV). La corrente ionica veniva registrata utilizzando il rivelatore di raggio posto tra la sorgente e l'analizzatore magnetico per facilitare le operazioni di accensione e di focalizzazione. Il rivelatore (una griglia) può essere posto in modo da intercettare parte del raggio totale (un tempo una porzione variabile) ed il segnale che ne esce, opportunamente amplificato, può alimentare un registratore potenziometrico che ne fornirà un tracciato in funzione del tempo. L'apparizione di sostanze organiche in sorgente dà origine ad un aumento del segnale del raggio ionico. A 70 eV, siccome la quantità di elio che comunque entra in sorgente è elevata, la corrente dovuta agli ioni del gas è eccessiva rispetto al segnale degli ioni organici, per cui la sensibilità rispetto a queste sostanze è estremamente limitata. L'operatore non è in grado di distinguere nella registrazione della corrente ionica totale, costituita da tutti gli ioni non separati compresi quelli a m/z 4, il punto dove effettuare (manualmente) la registrazione dello spettro, specialmente per sostanze in piccole quantità. Operando sotto il potenziale di ionizzazione

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dell'elio (24 eV) si riduce la sensibilità di un fattore 5-10 e si modifica l'aspetto degli spettri di massa (minore frammentazione) ma si riesce ad avere un tracciato gascromatografico simile a quello ottenuto con un rivelatore a ionizzazione di fiamma e quindi si può distinguere nel tracciato il punto dove effettuare la scansione (di solito l'apice del picco).

4. Controllo della temperatura delle linee di trasferimento evitando punti

freddi e punti caldi, scelta della colonna cromatografica a basso spurgo di fase, sono accorgimenti necessari che il progresso tecnologico di anno in anno rende meno limitanti rispetto ai drammatici esordi in cui bastavano dieci gradi in più o in meno per passare da un'analisi ad un fallimento. Capitoli interi nei testi "pratici" degli anni settanta erano dedicati alla temperatura dell'interfaccia e della linea di trasferimento lunga a volte anche un metro. Ora che la colonna entra direttamente in sorgente tramite una linea sempre più corta, il problema ha perso molta della sua drammaticità, non bisogna però dimenticare il controllo della temperatura di questo punto.

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GC separatore MS sorgente

moltiplicatore

FID TIC

interfaccia(A/D)

sistemaelaboratore

1 FFR analizzatore(magnete)

Rivelatoredella correnteionica totale

rivelatore(GC) a ionizzazionedi fiamma

t scan~t

RS MS SIM MID

m/z m/z t t

% % I

I I

I

I MC(*)

(GC)TIC

RIC

ricostruito dal calcolatore

scan~t

Figura 37: segnali da una GC/MS (*) in questo caso il calcolatore è usato come un registratore FID: flame ionization detector FFR: field-free region TIC: total ion current RIC: reconstructed ion current RS: repetitively scanned (data) MS: mass spectrum SIM: selected (single) ion monitoring MID: multiple ion detection MC: mass chromatogram

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Le informazioni ottenibili da uno spettrometro di massa come rivelatore di un gascromatografo possono essere distinte in due categorie:

(Figura 37) 1. quelle ottenibili per via puramente strumentale (cioè anche senza l'aiuto di un

calcolatore); 2. quelle ottenibili soltanto tramite la logica di un calcolatore. Al giorno d'oggi questa divisione è puramente didattica in quanto praticamente tutti gli spettrometri sono collegati con un elaboratore. Alla prima categoria appartengono:

La corrente ionica totale (TIC = total ion current): misura del numero totale di ioni formati dal materiale eluito dal gascromatografo registrata come funzione temporale; il suo tracciato è paragonabile a quello ottenuto da un rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID flame ionisation detector). Non c'è alcuna differenza nei tempi di ritenzione (nessun tempo in ritardo) se il sistema GC/MS è costruito correttamente. Esistono qua e là alcune differenze nelle risposte dei differenti composti. Abbastanza spesso si nota che il rivelatore a ionizzazione di fiamma non risponde con la stessa efficienza dello spettrometro di massa con composti dai tempi di ritenzione molto lunghi.

In qualsiasi punto della corrente ionica totale si possono prendere gli spettri di massa; un tempo il tracciato TIC serviva proprio per stabilire il momento esatto in cui registrare lo spettro.

La rivelazione selettiva di ioni (SIM o SID selected ion monitoring o detection): le intensità degli ioni preselezionati sono registrate come funzioni del tempo; qualsiasi ione può essere utilizzato in tale sistema: molecolare, frammento, metastabile, dovuto al gas reagente in ionizzazione chimica (Figura 38). Sebbene diverse compagnie commerciali abbiano inventato diversi nomi depositati per questa tecnica, il concetto è chiaramente definito. Supponiamo di predisporre lo spettrometro di massa per registrare un solo ione alla massa definita dal rapporto m/z. Iniettato il campione nel gascromatografo, i vari componenti della miscela verranno separatamente eluiti dalla colonna gascromatografica ed entreranno nella sorgente ionica dello spettrometro di massa dove verranno ionizzati. Ma poiché lo spettrometro è stato predisposto per registrare il solo ione con rapporto massa su carica pari al valore m/z prescelto, non si registrerà alcun segnale finché non verrà eluita dalla colonna gascromatografica una sostanza che dia origine ad uno ione con eguale rapporto m/z.

La rivelazione selettiva di ioni può essere: - a ione singolo: uno ione caratteristico di una classe o di un particolare

composto viene registrato per tutta la eluizione del GC; si può operare a bassa risoluzione registrando la massa arrotondata all'intero, oppure ad alta risoluzione con potere risolutivo circa 10.000, misurando la massa alla quarta cifra decimale;

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Figura 38: Registrazione secondo rivelazione selettiva di ioni preselezionati “frammentografia di massa” di metaboliti della cloropromazina

- a ioni multipli (2 - 4): le intensità di due o più ioni preselezionati sono

registrate come funzione temporale. Lo spettrometro ciclizza tra questi ioni per cui la registrazione si può dire simultanea. Gli ioni possono provenire da composti diversi (classica applicazione è la quantitativa con standard interno marcato da isotopi stabili, di solito trideuterato) oppure dallo stesso composto (in questo caso vi è un aumento di specificità). Di particolare interesse con i composti deuterati è il fatto che, sebbene i due componenti (deuterato e non) possano essere non completamente risolti dal gascromatografo, i loro ioni vengono risolti dallo spettrometro di massa.

L'identificazione di un composto avviene quando: (vedi Figura 39) - il tempo di ritenzione è lo stesso dello standard puro - si innalzano simultaneamente le tracce degli ioni caratteristici prescelti per la

registrazione - le aree (le altezze) dei segnali corrispondenti agli ioni caratteristici stanno tra di

loro in rapporti eguali, entro i termini delle deviazioni sperimentali, a quelli delle abbondanze relative degli ioni dello spettro di massa standard.

- ovviamente quando i picchi sono almeno tre volte più grandi del rumore di fondo

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Masse

Figura 39: Condizioni per l’identificazione di un composto tramite SIM 1. tempo di ritenzione giusto errato errato giusto distorto 2. masse giuste errate giuste giuste giuste 3. intensità relative giuste errate giuste distorte distorte è presente il composto si no no probabile possibile

La rivelazione selettiva di più ioni viene anche chiamata MID (multiple ion detection) o, con un termine non raccomandato dalla IUPAC, frammentografia MF (mass fragmentography). La sensibilità giunge fino a 10-12g (ed ancora meno) e spesso è limitata soltanto da interferenze o adsorbimenti della colonna cromatografica. Operando in rivelazione selettiva di ioni lo spettrometro è paragonabile ad un rivelatore a cattura d'elettroni (ECD electron capture detector) come selettività e sensibilità, ma è superiore ad esso per versatilità, cioè non è limitato ad alcune classi di sostanze (es. alogenati). La selettività del metodo SIM è riflessa dal fatto che il segnale è ottenuto registrando soltanto quegli ioni che sono caratteristici del composto che interessa. Un'elevata sensibilità può essere raggiunta dallo spettrometro se tutto il sistema di registrazione si dedica all'acquisizione della corrente ionica di soltanto alcuni valori di m/z. Il massimo della sensibilità può essere ottenuto con il controllo della corrente ionica di soltanto un singolo valore m/z. In una scansione ripetuta l'insieme spettrometro - sistema di acquisizione spende la gran parte del tempo di analisi campionando le regioni "vuote" dello spettro di massa tra i massimi dei picchi dei singoli ioni. Per questa ragione il sistema SIM in cui il rivelatore si dedica a misurare soltanto pochissimi ioni è circa 1000 volte più sensibile rispetto al sistema di scansione ripetuta. Per mezzo della rivelazione selettiva degli ioni è possibile mettere in evidenza e separare componenti presenti in miscela in piccolissima quantità e per i quali non avrebbe alcun senso la registrazione dello spettro di massa, perché occultato dalla memoria dello spettrometro e dallo spurgo (bleeding) della colonna gascromatografica. Per utilizzare la tecnica della rivelazione selettiva di ioni è necessario conoscere completamente lo spettro (gli spettri) di massa del composto (della classe) oggetto di ricerca. In un certo senso più ioni di una data sostanza vengono registrati e maggiore è la sicurezza che l'operatore ha sulla presenza della sostanza nel campione. D'altro canto rivelando un elevato numero di ioni si ha una scarsa rappresentazione statistica di ciascuno ione singolo; poiché la tecnica SIM viene impiegata in quei casi dove è importante un'elevata sensibilità, vengono seguiti soltanto due o tre ioni per ciascun composto. Si preferisce rivelare almeno due ioni per

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ciascun composto cosicché possa essere eliminata una qualsiasi ambiguità su un solo tracciato di corrente ionica tramite il confronto tra due tracciati che devono indicare simultaneamente dei picchi ad un appropriato tempo di ritenzione. Nella necessità di rivelare un solo ione la miglior scelta è data dalla registrazione dello ione molecolare perché è improbabile che un altro composto dia origine ad uno ione frammento con la stessa composizione elementare; soltanto gli isomeri danno significativi problemi di interferenza ed è importante quindi fare in modo che siano separati in gascromatografia. Comunque il potenziale massimo del SIM è realizzato soltanto se viene presa ogni dovuta cura per evitare l'uso di ioni con valori di massa simili a quelli degli interferenti o del rumore di fondo e se i derivati, formati per aumentare la volatilità dei composti, sono scelti in modo da non essere soggetti a degradazioni o adsorbimenti irreversibili sulla colonna cromatografica. Deve essere ben chiaro che il sistema GC/MS in MID (o SIM) rivela soltanto quello che si vuole cercare, non si possono ottenere altre informazioni al di fuori dei tracciati di corrente degli ioni prefissati a meno di ripetere all'infinito l'analisi. Qualsiasi strumento GC/MS può essere modificato per la rivelazione multipla degli ioni. Comunque, specialmente in origine, la maggior parte degli strumenti magnetici è limitata nell'intervallo di masse e nel numero di ioni che possono essere selezionati. Un intervallo del 20% del campo di masse e 2-4 ioni selezionati sono i tipici valori per un sistema magnetico. Qualsiasi intervallo di massa ed un notevole numero di ioni possono essere invece utilizzati per sistemi quadrupolari e a tempo di volo. Le precedenti osservazioni sulla aumentata sensibilità della tecnica SIM rispetto alla tecnica di scansione ripetuta sono valide per strumenti che esplorano l'intervallo di masse in maniera sequenziale; diminuendo il tempo di esplorazione del campo, a parità di altri fattori, si diminuisce la differenza di sensibilità tra le due tecniche. Con gli attuali strumenti la differenza non è sicuramente più di un fattore 1000 a vantaggio di una sempre più sensibile scansione ripetuta. La rivelazione simultanea di tutti gli ioni prodotti in uno spettrometro di massa annullerebbe la differenza. I processi di produzione e di conseguente separazione di soltanto quegli ioni prodotti in un preciso piccolo intervallo di tempo ripetuti in rapida sequenza (es. 3 cicli in un secondo) di fatto riduce ad un fattore 3-5 l'incremento di sensibilità offerto dal sistema di rivelazione multipla di ioni preselezionati rispetto al sistema di scansione ripetuta; ciò è caratteristico dei rivelatori a trappola ionica (ITD).

L’esplorazione ripetuta di masse selezionate veniva utilizzata su strumenti non in grado di effettuare SIM e consisteva in piccole (5 - 10 daltons) esplorazioni dell'intervallo di masse ripetute in continuazione; può avere ancora qualche utilità per campioni con Cl o Br.

Si ricordi che un qualsiasi tracciato ottenuto da una GC/MS cioè corrente ionica (TIC o RIC, SIM, MID, MC) ha un'area proporzionale alla quantità di sostanza presente in miscela e quindi con opportune curve di taratura si presta ad una analisi quantitativa.

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Prima di passare alla categoria dei dati ottenibili tramite calcolatore ricordiamo che il calcolatore fornisce l’acquisizione automatica degli spettri, la loro normalizzazione, la loro riproduzione anche in forma grafica, la loro ordinata conservazione in poco spazio; pertanto

- non è necessario aspettare che il picco sia all'apice per prendere lo spettro, il sistema registra spettri a ripetizione in pochissimi secondi;

- si può facilmente lavorare con svariate migliaia di spettri, come quelle prodotte da miscele complesse: campioni biologici, ecologici...;

- con un po' di ingegnosità si possono avere medie di spettri, sottrazione di spettri uno dall'altro, "pulizia" del rumore di fondo etc.;

- si possono elaborare i dati sia in tempo reale sia dopo molto tempo dalla esecuzione dell'analisi perché il sistema ha immagazzinato le scansioni precedentemente acquisite.

- si possono avere utili indicazioni sull'identità o quanto meno sulla natura della sostanza perché il sistema elaboratore può inoltre eseguire programmi di ricerca degli spettri incogniti in un archivio di spettri di riferimento ("ricerca in biblioteca").

Attualmente tutte le GC/MS sono interfacciate ad un sistema dati, per cui la vecchia abbreviazione per indicare una gasmassa più calcolatore GC/MS/DS è caduta in disuso perché tutte sono dotate di calcolatore; sopravvivono (nelle università...) sistemi a registrazione analogica per il SIM o MID.

Appartengono alla seconda categoria di segnali da GC/MS quelli ottenibili soltanto tramite calcolatore (vedi Figura 37:

Il cromatogramma ricostruito dal calcolatore o corrente ionica ricostruita (RGC = reconstructed gas chromatogram o RIC=reconstructed ion current); esso è generato (durante l'analisi) sommando le intensità di tutti gli ioni in ciascuno spettro di massa acquisito in scansione ripetuta e ponendo in grafico i valori così ottenuti come funzione nel numero di spettro (=scansione); conoscendo la durata della scansione, la scala data dal numero progressivo di spettro può essere convertita direttamente in scala dei tempi (di ritenzione). Il suo tracciato è analogo al TIC (anzi a volte è così indicato o anche come ioni totali TI=total ions) ma mentre quest'ultimo è registrato prima di separare il fascio ionico, il RIC è dato dalla somma (l'integrale) delle intensità degli ioni dopo la loro separazione. Questo genere di cromatogramma assomiglia ad un cromatogramma di corrente ionica totale (TIC) od a un cromatogramma di rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID), sebbene l'aspetto dei picchi possa risultare distorto se le scansioni non sono state acquisite abbastanza frequentemente. Meno scansioni si registrano durante l'eluizione di un picco GC, meno accurata sarà la sua riproduzione. E' implicito che si possa passare in qualsiasi momento dalla corrente ionica totale (RIC, RGC, ...) allo spettro desiderato, localizzandolo con cursore o con numerazione mostrata all'apice del picco; il calcolatore fornirà lo spettro già normalizzato sia sotto forma grafica (istogramma) sia, a richiesta, sotto forma numerica (tabella, matrice). Il cromatogramma (RIC) serve come utile istogramma dei dati dal momento che correla gli spettri registrati con i componenti del campione; inoltre, poiché

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ciascun punto del grafico corrisponde ad uno spettro di massa memorizzato dal calcolatore come valori di m/z e abbondanza relativa %, l'operatore può usare il sistema per classificare diverse centinaia (migliaia) di spettri.

La GC/MS genera quindi segnali tridimensionali caratterizzati da m/z, abbondanza % relativa , n° scansione cioè tempo di ritenzione gascromatografico (Figura 40).

Intensità

Grafico della corrente ionica totale (ricostruita)

Cromatogramma di massa m/z 143

Cromatogramma di massa m/z 298

Spettro di massa acquisito al n°....

5,&�7,&�

0&

0& m/z

Scan # 275 Numero dello spettro proporzionale

al tempo (di ritenzione)

Figura 40: rappresentazione della natura tridimensionale della informazione contenuta nei dati di una GC/MS

Il cromatogramma di massa (MC = mass chromatogram). Con tutte le scansioni ripetute immagazzinate nel calcolatore, l'intensità di

qualsiasi ione può essere estratta da ciascuna scansione e posta in grafico in funzione del tempo; questo grafico, detto appunto cromatogramma di massa o profilo ionico (ion profile), può essere ottenuto anche in tempo reale e ricorda quello della rivelazione selettiva degli ioni (SID) ma nei suoi confronti è meno sensibile anche di un fattore 104, a causa del tempo di campionamento molto più breve usato nella scansione ripetuta. Il vantaggio di questo segnale è che, tramite una oculata scelta del valore m/z posto in grafico, ottiene la selettività dell'analisi per specifici composti (es. utilizzando lo ione molecolare) o per particolari classi (es. utilizzando ioni chiave come m/z 91 per gli alchil benzeni). I cromatogrammi di massa sono specialmente utili per un rapido

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esame di complessi dati GC/MS onde determinare la presenza ed i tempi di ritenzione di composti contenenti un determinato ione. Sebbene l’altezza del picco gascromatografico diminuisca col porre in grafico soltanto uno ione, anche il rumore di fondo verrà ridotto con conseguente "pulizia" dei tracciati. Se sono conservati tutti gli spettri di massa registrati durante l'analisi, si può generare un cromatogramma di massa per ciascun valore di m/z entro i limiti di scansione dello spettrometro. Ovviamente si possono sommare le intensità degli ioni per un (limitato) intervallo di masse come funzione del tempo; questa variante ha dato prova di utilità specialmente nell'analisi di idrocarburi policlorurati. Un composto come il mirex, che ha 12 clori, conterrà ioni molecolari su valori di 13u. L'intero gruppo di picchi molecolari può essere sommato per fornire una sensibilità aumentata con qualche sacrificio nella specificità.

Cromatogrammi risolti o risoluzione dei picchi gascromatografici per fornire spettri "puliti"; applicazione del cosiddetto algoritmo di Biller e Biemann (1974), ne esistono però altri che attuano le stesse funzioni, ad es. quello Reimendal e Sjövall (1973) o quello di Dromey et al. (1976). In gascromatografia la risoluzione dei picchi è ottenibile per accentuazione della forma e della pendenza dei picchi. Se si usa lo spettrometro di massa come rivelatore gascromatografico si può usare come base per la risoluzione dei picchi la registrazione della crescita e della caduta di intensità di svariati ioni. Come è già stato accennato, i profili delle intensità di due ioni (molecolari o non, basta che non siano comuni ai due composti) sono risolti persino se i due composti non sono completamente separati dal gascromatografo. Sulla base dei tracciati delle correnti dei singoli ioni, cioè sulla base dei cromatogrammi di massa, si può determinare quali intensità ioniche siano rese massime simultaneamente in ogni punto del gascromatogramma (tempo), cioè in quale scansione. Il calcolatore può considerare questo insieme di ioni "in fase " come spettro ed eliminare tutti quegli altri ioni le cui intensità non sono massime nello stesso tempo. Tramite questa elaborazione del calcolatore si possono ottenere automaticamente:

spettri di massa "puliti", liberi da contributi del rumore di fondo (come lo spurgo della fase di colonna) oppure di composti co-eluenti. Una buona sottrazione del rumore di fondo o una risoluzione di uno spettro di miscela è di solito un requisito precedente all'identificazione sia che questa venga eseguita manualmente sia tramite tecniche informatiche. Sfortunatamente non è così facile ottenere uno spettro libero da rumore di fondo con le semplici tecniche di sottrazione spettro a spettro a causa delle fluttuazioni delle intensità degli ioni del rumore di fondo e di campione. Un metodo che può orientare la scelta su come operare la sottrazione utilizza il cromatogramma di massa per localizzare i punti di maggiore o minore concentrazione del composto in esame. Naturalmente l'uso di questa tecnica richiede una certa preventiva

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conoscenza del composto o del tipo di composti da esaminare. Biller e Biemann hanno descritto un sistema di analisi dei dati dei cromatogrammi di massa più automatico e più generale. In questo metodo il sistema dati attua un'analisi del profilo del picco (gascromatografico) sui cromatogrammi di massa di ciascuna massa dell'intero intervallo esplorato. Alla fine di questo processo, la tabella risultante contiene, per ciascun numero di scansione, soltanto quei valori di m/z che divengono massimi in quella scansione, ed inoltre le loro intensità assolute. Ciascuno di questi spettri viene indicato come spettro di massa ricostruito. Sebbene alcuni dei picchi minori vadano persi nell'operazione, le caratteristiche dell'aspetto generale dello spettro sono mantenute e questi spettri "semplificati" possono essere utilmente usati nella ricerca automatica in banca dati. Questo procedimento non solo rimuove efficacemente il contributo degli ioni del rumore di fondo (essi non divengono massimi, sono costanti ... più o meno) ma anche elimina quegli ioni dovuti a sostanze con tempi di eluizione molto ravvicinati e quindi causa di picchi gascromatografici coeluenti. Lo spettro così prodotto viene detto "intensificato" (enhanced). picchi gascromatografici risolti. Il programma di Biller e Biemann identifica tutti i valori di m/z che diventano massimi come abbondanza per ciascuna scansione e toglie via da quella scansione tutti gli altri ioni. In pratica la concentrazione di tutti gli ioni non diviene massima sempre nella stessa scansione a causa delle concentrazioni variabili in sorgente ionica durante la eluizione gascromatografia, quindi il programma considera (e mantiene) i valori m/z qualche scansione avanti e indietro a quella in cui sono massimi. L'uso di questo algoritmo costituisce anche un utile mezzo per migliorare l'apparente risoluzione gascromatografica di una corrente ionica totale. Le correnti degli ioni così estratti (e soltanto quelle) vengono nuovamente sommate per ottenere una nuova corrente ionica ricostruita in cui i componenti di un picco mal risolto cromatograficamente di solito risultano risolti alla linea di base. Questa nuova corrente ionica ricostruita può essere chiamata gascromatogramma risolto tramite le masse (mass resolved gaschromatogram) in quanto il programma che lo produce - detto di Biller e Biemann dagli autori - utilizza i cromatogrammi di massa di tutti i valori m/z nell'intervallo di massa esplorato dallo spettrometro. Il processo può essere anche chiamato deconvoluzione dei picchi (Figura 41).

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Figura 41: Separazione delle singole correnti ioniche in una GC/MS, applicazione dell’algoritmo di Biller e Biemann

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Sviluppo di una analisi mediante gascromatografia spettrometria di massa (GC/MS) "gasmassa" Per ottenere prestazioni soddisfacenti di un sistema GC/MS le operazioni al GC ed al MS devono essere portate ad una condizione o a un risultato che possano essere considerati i migliori possibili. Un tempo in pratica si consideravano per prime le esigenze dell’interfaccia poi quelle dello spettrometro indi quelle del gascromatografo, se venivano prese in considerazione. Ancora oggi le esigenze del GC vengono in secondo ordine. Questa leggerezza deve ovviamente nascere dalla familiarità con questa apparecchiatura piuttosto che da indeterminazioni, pena il fallimento della GC/MS. Cattivi risultati di GC/MS vengono imputati per buona parte a cattive separazioni o condizioni gascromatografiche. Prima di eseguire un'analisi per GC/MS deve essere perfezionata l'analisi per gascromatografia normale; si sceglie la migliore colonna per il massimo di separazione e vengono cercate le migliori condizioni di temperature e flussi. Ora possono essere esaminati gli obiettivi del problema GC/MS: a. quanto campione è disponibile? b. quali picchi sono già stati identificati? c. l'analisi di massa è richiesta per tutti i picchi? d. quale percentuale del campione totale è costituita da solvente? e. ci sono dei residui non volatili che riducono la quantità reale di sostanza volatile? f. è stata effettuata una separazione precedente in classi chimiche? (la separazione

acidi/basi/neutri o per polarità può portare ad arricchimenti da 2 a 3 ordini di grandezza ed è fortemente consigliata in miscele complesse)

Le risposte a queste domande sono né più né meno che la normale conoscenza del campione e del problema di ricerca, ma fino a quando esse non saranno conosciute, né l'analisi gascromatografica né tanto meno quella GC/MS potranno essere eseguite al massimo delle loro capacità. Importante fattore nella determinazione dell'utilizzo del campione in GC/MS è l'acutezza di un picco gascromatografico. Un picco componente di una miscela che è causato da 10-8 gin totale, nello spettrometro di massa per una ampiezza a metà (altezza) del picco di 10 sec. darà un flusso di 10-9g/sec in sorgente mentre il flusso sarà di 10-10g/sec per un picco di corrispondente ampiezza di 100 sec. Con strumenti a scarsa sensibilità e con colonne impaccate questo fattore era di notevole importanza, ora con le capillari la situazione è nettamente migliorata, val la pena però di ricordare alcuni dei fattori che influenzano l'aspetto netto di un picco: 1. la % di carico della fase stazionaria o spessore del film 2. la velocità di flusso del gas di trasporto 3. la temperatura 4. il tipo di colonna o il diametro della colonna.

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Linee essenziali della GC/MS qualitativa. Essenziali ad una analisi seria in GC/MS sono una buona pianificazione e preparazione. Il procedimento illustrato nello schema I include lo scarto di quegli artefatti che spesso costituiscono la peste degli esperimenti GC/MS. L’origine dei contaminanti ed artefatti può essere la vetreria, i solventi, i reagenti, l'iniettore del GC, la colonna GC o l'aria stessa del laboratorio. Quantità in tracce di sostanze organiche provenienti da una di queste sorgenti possono assumere un grande significato dopo l'operazione di concentrazione. Di conseguenza è molto importante comprendere anche l'analisi di opportuni bianchi e di campioni di controllo persino quando si sono prese tutte le precauzioni per evitare la contaminazione. Più operazioni sono coinvolte prima della analisi GC/MS (cioè più il campione viene "maneggiato") e più importante è il ruolo del bianco nello schema analitico. Prima di un'analisi GC/MS è necessario un adeguato procedimento di controllo per assicurare il corretto funzionamento dello strumento. Inoltre il campione dovrebbe essere stato analizzato in precedenza in GC (FID) per stabilire l'opportuna concentrazione del campione, il volume da iniettare e le condizioni analitiche. Dopo aver acquisito i dati GC/MS ed aver raccolto un insieme di spettri sottratti dal rumore di fondo dei componenti di interesse, il procedimento di identificazione può essere migliorato rispetto alle risposte della ricerca automatica. Quando la ricerca in biblioteca sembra aver avuto successo e ha fornito una o più risposte, l'operatore - analista deve paragonare visivamente lo spettro di massa incognito con quelli proposti dalla biblioteca e prendere la decisione finale. L'occhio umano è un ottimo sistema per il riconoscimento e l'accoppiamento di forme. Un paragone tra spettri EI giudicato corretto ed accettato deve essere seguito per completare l'identificazione da un accettabile paragone tra (i tempi) gli indici di ritenzione sulla stessa colonna GC. Gli indici di ritenzione (RI) possono essere determinati tramite iniezione contemporanea di una miscela di n-alcani. Purtroppo questi indici di ritenzione non sono aggiunti alle banche dati commerciali perché non c'è e non può esserci accordo sull'insieme di condizioni o sulla colonna GC di riferimento. Di conseguenza molti laboratori si costruiscono la propria banca dati di spettri e di tempi di ritenzione (o indici). Il punto debole di una analisi automatica GC/MS tramite calcolatore è il procedimento di ricerca in banca dati "biblioteca" per l'identificazione dei componenti; questo procedimento paragona un insieme complesso ma incompleto di dati con un altro usando un algoritmo che si basa su approssimazioni e che utilizza dati semplificati. Il risultato ha un elevato potenziale di errori; possono verificarsi con frequenza imprevedibile "identificazioni" false positive (come pure false negative). Nonostante tutti i suoi limiti, la ricerca in biblioteca è un utilissimo aiuto all'interpretazione ma deve essere considerata soltanto un punto di un rigoroso procedimento di identificazione.

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matricecampione

estrattocampione

GC-FID-...estratto

campionevagliato

bianco estrattobianco

paragone

spettro di massaEI di buona

qualità + tempodi ritenzione

insieme (ridotto)dei dati GC/MS

paragonevisivo

degli spettri

ricerca in biblioteca

paragone conun campione

autentico EI-MS, RI

sintesi del composto

richieste nuove informazioni

−−

−−−

−

spettro CI: PMmassa esatta (composizione elementare)interpretazione ”manuale”ricerca bibliograficaaltri studi sul campione e sua storiacomportamento gascromatografico

struttura ipotizzata

composto identificatoin modo certo

composto ipotizzato composto non identificato

6FKHPD�,��'LDJUDPPD�GL�IOXVVR�ULDVVXQWLYR�GHO�SURFHVVR�GL�DQDOLVL�TXDOLWDWLYD�SHU�*&�06

HVWUD]LRQH�FRQFHQWUD]LRQH

WURYDWRQRQ�

WURYDWR

ULVSRVWD�UHVSLQWD�GDOO¶RSHUDWRUH

QHVVXQD�FRQIHUPD

ULVSRVWDDFFHWWDWD

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RWWHQXWR

QHVVXQD�DOWUD�LQIRUPD]LRQH

QRQ�VRQR�SRVVLELOLTXHL�PLQLPLFULWHUL�GLLQWHUSUHWD]LRQH

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Linee essenziali della GC/MS quantitativa L’utilizzo della gascromatografia spettrometria di massa (GC/MS) nell’analisi quantitativa è collegato all'introduzione negli anni '60 della tecnica di rivelazione selettiva di ioni "Selected Ion Monitoring" (SIM). Come si è già visto nelle pagine precedenti questa tecnica consiste nel focalizzare lo spettrometro di massa su uno o più ioni, l'applicazione analitica quantitativa comporta il confronto dell'intensità della corrente ionica generata dagli ioni della sostanza in esame rispetto a quella prodotta dagli ioni di una sostanza presa come standard di riferimento e aggiunta in concentrazione nota al campione. Si ha quindi il controllo specifico di uno o più ioni di massa m/z caratteristici delle sostanze in esame mentre molecole che non producono ioni a questi valori non vengono rivelate (lo spettrometro in questo caso è utilizzato come rivelatore selettivo del gascromatografo). Rispetto alle tradizionali tecniche gascromatografiche la GC/MS-SIM costituisce un aumento di specificità (in quanto il campione in esame viene identificato sia dal tempo di ritenzione gas-cromatografico che da uno o più ioni specifici selezionati) e di sensibilità (infatti è possibile dosare quantità dell'ordine dei 10-9 – 10-14g). Il seguente schema riassume il protocollo per l'applicazione della GC/MS come tecnica di saggio analitico

campione ← aggiunta dello standard interno

↓ omogeneizzazione, estrazione con solvente estratto É

formazione del derivato ↓ purificazione tramite HPLC, TLC, ... Ë estratto arricchito nel componente

↓ GC/MS rapporto del componente rispetto allo standard interno

↓ paragone con la curva standard concentrazione del componente nel campione Il procedimento appare concettualmente semplice, ma soltanto mediante un'accurata attenzione ai dettagli ed una conoscenza dei principi coinvolti in ogni passaggio si possono ottenere risultati accurati ed attendibili. Punti fondamentali preliminari alla quantitativa: 1. analizzare il campione qualitativamente 2. preparare un elenco di composti da determinare quantitativamente (analiti) 3. selezionare un appropriato standard interno per ciascun analita 4. escogitare un'accettabile "matrice di controllo" per la calibrazione/convalida Le procedure per l'analisi quantitativa devono tener conto degli effetti di matrice, delle perdite di analita durante l'estrazione e la concentrazione, delle variazioni del

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comportamento nell'iniettore e nella colonna GC. Il caso inoltre di analisi di più componenti nella stessa matrice poi non è di facile esecuzione. La risposta del rivelatore, di solito l'area del profilo della corrente di uno ione caratteristico, è direttamente correlata alla quantità ma non è necessario e soprattutto non è opportuno calibrare questa risposta mediante standardizzazione esterna. Di conseguenza viene usato uno standard interno (SI) e viene determinato un rapporto di risposte che ovviamente è correlato alla quantità di analita. Viene eseguita la calibrazione del rapporto delle risposte analizzando soluzioni contenenti diverse quantità note di analita insieme con una quantità costante di standard interno. Da queste misure si ricava la "curva standard", un grafico dei rapporti delle risposte rispetto alla quantità o concentrazione dell'analita. Lo scopo di questo procedimento è di eliminare o rendere minimi gli errori associati alle variazioni nell'iniettore, colonna, rivelatore. Se lo standard interno viene aggiunto all'estratto appena prima della GC/MS, allora l'analisi quantitativa si riferisce soltanto all'estratto concentrato. Se lo scopo è quantificare la sostanza nella nostra matrice originale sarà necessario determinare il recupero dell'analita dalla matrice; questa operazione è tediosa, difficile e non priva di errori; è meglio evitarla quando è possibile. La soluzione più semplice al problema è di aggiungere (ed equilibrare) lo standard interno direttamente al campione (matrice) originale; purtroppo questo non è sempre possibile. Lo schema II illustra un procedimento molto tollerante rispetto a inconsistenze di recupero, perdite durante la concentrazione del campione e persino perdite dovute a rovesciamenti accidentali. Affinché il procedimento rimanga valido è necessario soltanto dimostrare che il rapporto analita/standard interno rimanga inalterato. Poche strategie di analisi quantitativa sono superiori alla GC/MS con standard interno, naturalmente la scelta dello standard interno è il fattore cruciale di questa procedura. Per poter arrivare ad un dosaggio accurato e preciso di molecole presenti in matrici complesse quali quelle biologiche come omogenati di tessuto, plasma od urine è necessario effettuare adeguati processi di purificazione del campione prima che questo possa essere iniettato nel sistema GC/MS. Una volta estratte e purificate le sostanze da analizzare, queste generalmente devono essere convertite in molecole meno polari e più volatili (e quindi più adatte all'analisi GC) tramite manipolazioni chimiche cioè reazioni di formazione di derivati (es. eteri, esteri ecc.). L'analisi quantitativa vera e propria inoltre dipende da un numero di variabili strumentali difficili da mantenere costanti anche tra misure effettuate nella stessa giornata. Quindi la strategia che viene seguita in GC/MS per superare sia il problema della resa durante la purificazione e preparazione del campione, sia le variabili strumentali è l'aggiunta al campione in esame di uno standard di riferimento (standard interno, S.I.) in quantità nota prima di tutti i passaggi preparativi.

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matricecampione

campioneestratto

rispostarapporto

analita: S.I.

concentrazione dell’analitanella matrice (campione)

estratti dicontrollo

rispostecon rapporti

calibrati

curvastandard

matrici di controllo “drogate”

standardinterno (S.I.)

HVWUD]LRQH�FRQFHQWUD]LRQH

GHULYD]LRQHDQDOLVL�*&�06

HTXLOLEULR HTXLOLEULR

6FKHPD�,,��'LDJUDPPD�GL�IOXVVR�ULDVVXQWLYR�GHO�SURFHVVR�GL�DQDOLVL�TXDQWLWDWLYD�SHU�*&�06

La scelta dello standard interno e tecnica di diluizione isotopica. Tenendo presente che lo scopo dello standard interno (SI) è di stabilire un rapporto di concentrazioni con l'analita nella matrice campione che sia accuratamente riflesso dal rapporto di risposta di ioni preselezionati misurati nel passaggio analitico della GC/MS, i seguenti fattori sono determinati per le scelte. 1. Non deve essere un componente della matrice campione 2. Deve avere proprietà fisiche e chimiche molto simili a quelle dell'analita 3. L'indice (tempo) di ritenzione gascromatografico deve essere molto simile a

quello dell'analita 4. Lo ione caratteristico dovrebbe avere un valore di m/z simile a quello dell'analita. Il primo punto si spiega da solo. Il secondo e il terzo sono di vitale importanza; l'analita e il suo standard interno dovrebbero equilibrarsi in modo eguale tra i vari siti leganti potenziali nella matrice campione. Tali siti possono includere sostanze disciolte o sospese ma anche le pareti del contenitore del campione. Se si è nel caso di una estrazione liquido - liquido, il coefficiente di ripartizione tra le fasi acquosa e organica deve essere eguale o, se si è nel caso di adsorbimento su una fase solida, le proprietà di adsorbimento e di recupero devono essere le stesse. Esistono in potenza possibilità di errori grossolani se non vengono rispettate queste condizioni. Egualmente importante, a livello critico per la GC/MS è che l'analita e lo standard interno (SI) mostrino anche comportamenti molto simili all'iniezione e nella colonna GC. I tipi di SI che soddisfano i criteri desiderati possono essere così riassunti: 1. un isomero di posizione molto simile; deve però essere separato dall'analita

sulla colonna GC dal momento che entrambi hanno lo stesso ione caratteristico. 2. un omologo o un analogo strettamente correlato; può avere indice di ritenzione

(RI) eguale o differente a quello dell'analita perché i due ioni da registrare sono di solito diversi (ma preferenzialmente non differenti di più di 20 unità di massa)

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Il primo approccio è comune ad altre tecniche analitiche quali GC, HPLC, ma in questo caso molto più selettivo in quanto l'accoppiamento GC/MS permette l'identificazione non sono sulla base del tempo di ritenzione ma anche dello specifico ione di massa m/z selezionato. Esistono documentate prove sperimentali che mostrano come grandi errori possano risultare dall'uso di uno SI non strettamente legato come struttura all'analita. Sebbene possano esistere numerose possibili scelte per uno standard interno adatto ad un particolare analita, l'unico tipo che in effetti garantisce a pieno di soddisfare tutte le condizioni richieste è l'analogo marcato con isotopi stabili. Le alterazioni nella struttura chimica e di conseguenza nel comportamento fisico e chimico causate dall'introduzione di pochi atomi di 13C o 2H isotopicamente puro in una molecola sono così sottili che soltanto la spettrometria di massa può rivelare questa differenza in modo certo ai livelli di sensibilità richiesti. Analita e standard interno si comportano in modo identico in tutti i processi necessari per purificazione e derivazione. La tecnica di aggiungere un analogo marcato per misurare quantitativamente una sostanza è nota come diluizione isotopica (GC/MS-ID). La diluizione isotopica ha il vantaggio che la calibrazione dei rapporti di risposta è semplice, diretta e mostra una linearità oltre almeno due ordini di grandezza nella concentrazione dell'analita quando le abbondanze degli ioni sono corrette per una qualsiasi sovrapposizione. Inoltre la convalida è facilmente ottenuta mediante la dimostrazione che né la matrice campione né il sistema GC esercita un effetto selettivo sul recupero dell'analita e dello standard interno. Più importante ancora, la precisione e l'accuratezza del metodo sono facilmente determinate e sono di solito eccellenti. Questi sono criteri importanti per giudicare l'accettabilità di un metodo, sulla base della stima dell'errore totale. Gli isotopi stabili che vengono generalmente utilizzati per la marcatura sono 2H, 13C, 15N e 18O, tuttavia uno dei migliori S.I. in termini di precisione, accuratezza, riproducibilità e basso costo è l'analogo tri-deuterato dell'analita, marcato in posizioni stabili. Infatti i mono deuterati non possono essere efficientemente usati a causa delle interferenze derivanti dagli isotopi naturali di 2H e 13C. Nell'impiego dei di-deuterati bisogna tener conto delle piccole interferenze dello ione m+2 dovuto all'abbondanza naturale dell' 18O. D'altra parte, gli analoghi tetra-deuterati od oltre avrebbero un tempo di ritenzione gascromatografico troppo diverso rispetto all'analita, causando una diminuizione dell'accuratezza della rivelazione dello spettrometro di massa in quanto l'analisi strumentale non avverrebbe simultaneamente sui due ioni. Nei tri-deuterati invece la differenza di tre unità di massa tra l'analita ed il suo standard interno rende minime le interferenze delle abbondanze isotopiche naturali dovute al 13C ed all' 18O e mantiene i tempi di ritenzione gascromatografici tra lo standard interno e l'analita pressoché identici. Si noti che un composto con 13C risulta marcato in modo molto stabile, ma con 2H e 18O può potenzialmente scambiare con atomi di ossigeno o con protoni della matrice. La stabilità chimica di uno standard interno così marcato deve essere controllata prima dell'uso, sia nella matrice campione che nelle soluzioni standard conservate. Un inconveniente nella scelta di composti tri-deuterati come standard interni è che spesso questi non sono disponibili in commercio ed è quindi necessario sintetizzarli nel proprio laboratorio. Per questo tipo di applicazione, la sintesi di marcati con deuterio deve soddisfare i seguenti requisiti:

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– la marcatura isotopica deve avvenire in posizione ben controllata ed in modo da assicurare la stabilità della deuterazione durante la conservazione e l'impego del composto;

– tutte le sequenze sintetiche devono garantire l'integrità della struttura, in particolare dei gruppi funzionali presenti, e non ne deve essere alterata la stereochimica;

– tutte le rese dei singoli passaggi devono essere elevate; – il precursore da cui si inizia la sequenza sintetica deve essere facilmente reperibile

in commercio. In ogni caso, sia che lo S.I. venga acquistato, sia che venga sintetizzato, è necessario determinarne la percentuale di deuterazione e la distribuzione isotopica del tri-, di-, mono- e non-deuterato. Questo tipo di analisi è importante soprattutto per determinare la percentuale di non-deuterato presente nello standard interno che va a sommarsi al composto endogeno durante l'analisi (infatti questi due composti hanno lo stesso peso molecolare). Per questo la percentuale di composto non-deuterato presente nello S.I. deve essere la più piccola possibile. Infine non si devono mai utilizzare quantità di S.I. molto più elevate rispetto alle quantità di analita da determinare perché la percentuale di non deuterato viene ad influire in maniera tanto maggiore quanto minore è la concentrazione dell'analita. Alcuni autori hanno usato quantità relativamente elevate di standard interno allo scopo di sfruttare l'effetto di trasporto (carrier) in modo da rendere minime le perdite di analita dovute ad adsorbimento su siti attivi alla superficie dei recipienti di estrazione e della colonna cromatografica. Questo effetto è significativo a concentrazioni di analita molto basse. Altri autori però contestano le affermazioni sull'utilità dell'effetto. E' incontestabile però il fatto che una delle comuni cause di scarsa sensibilità nelle analisi GC/MS è la perdita per adsorbimento dell'analita in colonna. Spesso la sensibilità aumenta dopo un numero di iniezioni di soluzione di analita. Comune pratica gascromatografica è la "mestica" (priming) delle colonne. L'effetto di tale operazione si fa sentire quando una colonna è stata prima usata per analisi di composti chimicamente differenti. Soluzione ideale sarebbe che una colonna separata venga usata per ciascuna delle analisi quantitative in corso. E' comunque consigliabile non utilizzare per dosare composti acidi una colonna precedentemente usata per composti basici. Un pericolo insito nel metodo "di mestica" è che un po' del composto adsorbito possa essere lavato via durante le successive iniezioni dando come risultato un valore erroneamente elevato per le concentrazioni. Questa potenziale sorgente di errore è facilmente appurabile analizzando un campione bianco (cioè un fluido corporeo contenente lo standard interno ma non l'analita) prima di iniziare le analisi degli incogniti. La scelta degli ioni da selezionare La scelta degli ioni può influenzare sia la sensibilità che l'accuratezza del metodo. Bisogna infatti scegliere uno ione che venga prodotto in quantità abbondante durante il processo di ionizzazione e che sia specifico del composto in esame. Generalmente si sceglie lo ione molecolare se abbastanza intenso oppure uno ione di frammentazione con la massa più alta possibile: più alta è la massa, minore è la probabilità di trovare un altro composto che produca esattamente lo stesso ione m/z. Il processo di formazione dei derivati può essere sfruttato per aumentare il peso molecolare del

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composto tramite la formazione di composti adatti (nelle acilazioni, ad esempio, si potrà utilizzare l'anidride eptafluorobutirrica, che introduce 7 atomi di fluoro invece della trifluoroacetica che ne introduce solo 3). Un'altra possibilità per aumentare la specificità dell'analisi è quella di focalizzare lo strumento contemporaneamente su due ioni della sostanza in esame e di controllare che il loro rapporto rimanga costante ed uguale a quello di uno standard iniettato puro. Nel caso in cui questo rapporto vari, si ha la certezza della presenza di un inquinante che va ad interferire con l'analisi. Estendendo il ragionamento si potrebbe pensare di aumentare ancora il numero di ioni da seguire per composto dosato. Il numero può essere valutato con un esempio pubblicato da Sphon nel 1978 riguardante il dietilstilbestrolo (DES), tramite ricerca mediante calcolatore su una base dati della consistenza di circa 30.000 spettri (MSSS). Una tale ricerca rivela che esistono 1144 composti nell'elenco che potenzialmente potrebbero dare una falsa risposta positiva per il DES se si segue soltanto lo ione molecolare 268 mediante SIM. Cinquantasette di questi composti hanno lo ione m/z 268 come picco base. Se vengono usati quindi oltre alla massa dello ione i dati di intensità relativa, 149 composti verranno trovati con un picco a m/z 268 con intensità relativa tra il 40 ed il 100% del picco più intenso. Se si comprende nella nostra rivelazione un secondo ione a massa m/z 239 con un intervallo di intensità tra il 30 ed il 100%, il numero di possibili composti scende a 5. Se esaminiamo la nostra banca di dati alla luce di 3 ioni, cioè m/z 268, 239 con gli intervalli di intensità già citati e m/z 145 con un intervallo di intensità tra il 40 e 100% si trova un solo composto il DES. Da ciò si può comprendere come sia inutile aumentare a dismisura il numero di ioni da controllare per composto, anche perché si ritornerebbe verso i valori di sensibilità tipici di uno spettro completo. Questi problemi possono venir superati lavorando in alta risoluzione, se cioè si ha la possibilità strumentale di poter distinguere tra due ioni la cui massa differisce solo sulla seconda o terza cifra decimale. D'altra parte non bisogna dimenticare che l'aumento della risoluzione strumentale porta alla diminuzione della sensibilità, e quindi se si sta lavorando con composti presenti in bassa concentrazione è necessario lavorare in condizioni strumentali che permettano di ottenere il massimo sia in termini di sensibilità che di specificità. Naturalmente uno strumento che sia in grado di registrare tutti gli ioni simultaneamente oppure di registrare in rapida sequenza ioni formati simultaneamente ed intrappolati fino alla registrazione non soffre di limitazioni di sensibilità nella registrazione dello spettro completo, il dosaggio può essere eseguito anche mediante scansioni ripetute. Di conseguenza negli strumenti a trappola ionica il guadagno di sensibilità che si ottiene con una registrazione di ioni preselezionati è soltanto doppio rispetto a quella di uno spettro completo. Processi di formazione del derivato Per una corretta analisi gascromatografica di composti polari è necessaria la loro trasformazione in composti meno polari e più volatili tramite reazioni di derivazione soprattutto se si effettuano determinazioni di sostanze presenti in tracce di matrici biologiche. Il processo di formazione del derivato deve rispondere ad alcuni requisiti quali: – la reazione deve essere quantitativa e non deve introdurre nel campione

interferenze dovute ai reagenti

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– i derivati devono essere stabili e non devono subire degradazione nel processo GC/MS.

– i derivati devono avere uno spettro di massa che fornisca una alta corrente ionica per il valore m/z registrato

– nel caso di determinazioni simultanee di più composti è necessario che la reazione avvenga in modo quantitativo su tutti.

Analisi quantitativa La determinazione quantitativa di un composto in un campione incognito viene comunemente effettuata tramite il metodo della predizione inversa utilizzando un'opportuna curva di calibrazione costruita aggiungendo quantità note e scalari del composto in esame ed una quantità di S.I. a campioni bianchi. Un'identica quantità di S.I. deve essere aggiunta ai campioni incogniti. I campioni della curva di calibrazione devono passare attraverso tutto il metodo di estrazione, purificazione e derivazione come i campioni incogniti. Dopo l'analisi viene costruita una curva di regressione (lineare o non lineare) che mette in correlazione i rapporti delle intensità ioniche del composto in esame rispetto allo S.I. con le concentrazioni degli standard di calibrazione. Utilizzando questa curva è quindi possibile risalire alla concentrazione di un campione incognito dal suo rapporto con lo S.I. Una corretta interpretazione delle curve di calibrazione è l'unico modo per ottenere dei buoni risultati, ed in particolare l'uso accurato di esse richiede l'esatta conoscenza della loro forma. Se non esistono interferenze reciproche tra l'analita e lo S.I., allora la curva di calibrazione è una linea retta passante per l'origine e si può applicare il metodo della regressione lineare. In tutti gli altri casi l'assunzione dell'esistenza di una relazione lineare introduce errori sistematici nel calcolo delle concentrazioni, con notevole diminuzione della accuratezza delle analisi. E' però quasi sempre possibile approssimare la curva di calibrazione ad una retta, passante o meno dall'origine, utilizzando un intervallo di concentrazioni sufficientemente ristretto ed una opportuna quantità di S.I. (intermedia tra il punto più basso e quello più alto della curva): in questo caso è ancora applicabile la regressione lineare. Un caso limite è quello rappresentato dal metodo detto "bracketing" che rappresenta il metodo più preciso per il calcolo di concentrazioni incognite e che è quello attualmente utilizzato dai laboratori facenti parte del National Bureau of Standards (NBS) per la certificazione di standard da utilizzare come riferimento in tutti i laboratori. Questo metodo consiste nella misura di campioni incogniti tra due standard di riferimento la cui concentrazione sia molto vicina a quella del campione incognito. Questo implica che la concentrazione di quest'ultimo sia già stata approssimativamente determinata tramite uno dei metodi meno accurati a disposizione (metodi immunoenzimatici, radioimmunometrici, ecc.). I campioni e gli standard di riferimento sono preparati in modo tale da avere rapporti con lo S.I. in un intervallo ristretto e molto vicino a 1 (si cerca ad esempio di aggiungere al campione tanto S.I. da avere un rapporto di 1 e si preparano standard di riferimento che abbiano rapporti di 0,75 e 1,25). Ogni campione incognito deve essere determinato tra i due standard di riferimento più vicini, che abbiano concentrazione appena inferiore e appena superiore a quella del campione. Il metodo del "bracketing" è estremamente preciso ed accurato, tuttavia non sempre può essere applicato nei laboratori essendo complicato, lungo e piuttosto costoso. E' stato tuttavia proprio questo metodo quello prescelto dal Community

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Bureau of Reference (BCR) nell’ambito del progetto messo a punto nel 1975 dal gruppo di Clinica Chimica della Comunità Europea per la certificazione di alcuni steroidi in plasma umano liofilizzato da poter utilizzare come standard di riferimento definitivi nel campo della Clinica Chimica. Questo si è reso necessario per unificare gli standard di riferimento da utilizzare nella Chimica Clinica in cui vengono utilizzati necessariamente metodi più "routinari" ed economici e quindi probabilmente meno accurati e precisi rispetto alla GC/MS-ID.

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LC/MS: l’abbinamento cromatografia liquida e spettrometria di massa La quantità di informazioni deducibili da una GC/MS dimostra l'utilità dell'accoppiamento in linea di un metodo di separazione, come la cromatografia, con un metodo di identificazione, come la spettrometria di massa. E' quindi naturale l'interesse alla possibilità di accoppiare la cromatografia liquida ad elevate prestazioni (HPLC) con la spettrometria di massa (MS). Lo spettrometro di massa in un sistema integrato LC/MS può servire come rivelatore universale (o almeno come rivelatore che risponde ad una estesa gamma di soluti) mancante alla HPLC e come rivelatore sensibile (in quanto il suo limite inferiore di rivelabilità è abitualmente attorno al picogrammo). Il sistema elaboratore per l'acquisizione e il trattamento dei dati non richiede particolari programmi perché tutti i metodi e gli algoritmi sviluppati ed utilizzati per la GC/MS possono essere applicati senza modifiche alla LC/MS. L'elaboratore accresce le prestazioni di questo metodo analitico nello stesso modo della GC/MS, permettendo ad esempio di registrare uno spettro completo o una corrente di uno ione scelto in precedenza, di utilizzare queste correnti per districare i segnali di picchi cromatografici mal separati, o per effettuare dosaggi quantitativi con l'aiuto di riferimenti interni. L'accoppiamento LC/MS è stato tentato già molti anni fa (Ryhage 1964 con interfaccia, Tal'Rose 1968 con accoppiamento diretto) ma soltanto dal 1973 appaiono lavori prodotti da diversi laboratori. Non esiste tuttora una vera e propria soluzione generale ai numerosi problemi di questo genere di accoppiamento mentre si hanno numerose soluzioni tecniche che possono portare a successi per limitate categorie di sostanze ma a dei fallimenti per altre. Però le sorgenti ESI e APCI (nelle loro varianti) stanno attualmente coprendo quasi tutto il mercato delle LC/MS. Le difficoltà di tutti i metodi LC/MS provengono da una parte dalle differenti proprietà fisiche di ciascuno dei sistemi solventi abitualmente usati in HPLC (acqua, solventi organici, tamponi, ...), proprietà che impediscono di considerare una differenza importante rispetto all'eluito su cui concepire un separatore selettivo; a queste proprietà si aggiungono elevati flussi che impongono interfacce con capacità di arricchimento molto superiori a quelle per GC/MS. Bisogna anche considerare che le caratteristiche dell'eluente in gascromatografia (azoto, elio, idrogeno, ...), per dimensioni molecolari, inerzia chimica, proprietà fisiche ..., sono assai diverse da quelle dell'eluito consentendone una facile separazione ed eliminazione. D'altra parte le difficoltà provengono anche dall'intenzione di applicare questo metodo LC/MS a quelle sostanze difficili, perché fragili o non volatili, che non possono essere analizzate con la GC/MS. Si potrebbe per altro osservare che, se una sostanza non determinabile per cromatografia in fase gassosa può esserlo per cromatografia in fase liquida, non è affatto corretto generalizzare che tutte le sostanze non analizzabili in GC/MS siano per forza analizzabili in LC/MS. I benefici della LC/MS possono essere così riassunti: – per il "cromatografaro": un rivelatore universale che all’occasione diviene

specifico, capace di essere qualitativo e quantitativo, e che fornisce l’identificazione dei composti;

– per lo "spettrometrista": analisi di composti non separabili mediante gascromatografia, separazione di isomeri, sistema di analisi per introduzione diretta facilmente utilizzabile in modo automatico.

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L’interfaccia Considerando un approccio tra strumenti convenzionali, questo dispositivo dovrà rispondere ai seguenti requisiti, comuni nei casi di GC e di LC tranne che nell'ultimo: 1. eliminare l'eccesso di eluenti, portando i flussi in entrata del MS ai valori

opportuni, sopportabili dai sistemi di pompaggio 2. provocare una caduta di pressione (da atmosfera a 10-4-10-5mbar) 3. essere sufficientemente inerte, per non provocare la decomposizione delle

sostanze che lo attraversano 4. avere volume morto minimo per non compromettere la risoluzione

cromatografica 5. disporre di buona resa e di elevata capacità di arricchimento per ottenere la

massima sensibilità in condizioni di vuoto soddisfacenti 6. determinare il passaggio allo stato di vapore delle soluzioni provenienti dalla LC. Le sostanze in uscita dai gascromatografici infatti si trovano già allo stato di vapore e l'interfaccia (se presente), opportunamente riscaldata, non dovrà che trasferirle in sorgente, mentre nel caso dei cromatografi liquidi dovrà provvedere anche alla loro vaporizzazione per riscaldamento. Se si considera che la LC trova applicazione nel campo delle sostanze termolabili (lavora tra 25 e 50°C), appare subito quale difficoltà esista nell'accoppiamento LC/MS; di solito si cerca di ovviare a tale contraddizzione rendendo più breve possibile la fase di riscaldamento. Una considerazione che rivela tutta la necessità di pompaggio in un sistema LC/MS scaturisce dal confronto dei volumi di vapore sviluppati da alcuni solventi usati come fase mobile in HPLC con la capacità di pompaggio di 10 ml/min delle comuni pompe a diffusione usate nello spettrometro. Da 1 a 3 ml/min di liquido corrispondono, in condizioni standard, per il n-esano 180-540 ml/min di vapore, per il metanolo 550-1650 e per l'acqua 1250-3750 ml/min. Tipi di interfacce LC/MS – introduzione liquida diretta (DLI) – trasporto meccanico ("nastro trasportatore") (MB) – formazione di aerosol (PB) – flusso continuo in bombardamento con atomi veloci (CF-FAB) - termonebulizzazione (TSP) - elettronebulizzazione (ESI) - ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) Introduzione diretta di liquidi (DLI= direct liquid introduction) Consiste nell’introdurre una minima parte (circa 1%) dell’eluito proveniente dalla colonna direttamente nello spettrometro di massa attraverso un forellino (5 µ) (Figura 42). Nel vuoto della sorg ente sia il solvente che la sostanza vaporizzano istantaneamente generando goccioline. Gran parte del solvente viene risucchiato e condensato da una criopompa (o da un sistema freddo che circonda la sorgente); poiché però i vapori del solvente sono di gran lunga più abbondanti della sostanza, questa ultima viene ionizzata con un processo di ionizzazione chimica (CI) in cui i

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vapori del solvente costituiscono il gas ionizzante. I principali vantaggi di questa interfaccia sono costituiti dalla sua semplicità costruttiva (è niente altro che un sistema di introduzione diretta) e dal fatto che si possono analizzare composti polari e termolabili senza timore di decomposizione termica e di processi di contaminazione. Gli svantaggi sono che opera soltanto in ionizzazione chimica (per altro molto dipendente dalle condizioni sperimentali, è il solvente che costituisce il reagente), che necessita di tamponi volatili (es. acetato di ammonio), che ha solo moderata sensibilità (opera su una partizione del flusso), che il forellino può ostruirsi facilmente. Inoltre questo sistema può essere utilizzato solo con strumenti quadrupolari meno sensibili ai problemi di isolamento elettrico (un sistema magnetico ha 3000V di potenziale di accelerazione in sorgente contro 10V di un quadrupolo).

InterfacciaSorgente ionica(Regione di ionizzazione chimica)

Partizione esterna(External Split)

Da HPLC

1 ml/min(al rivelatore UV)

10 l/minµ

Diaframma di acciao

Figura 42: sistema per LC/MS: introduzione diretta di liquidi

Trasporto meccanico "nastro trasportatore" (MB=moving belt) La soluzione proveniente dalla colonna HPLC viene depositata su un nastro di materiale sintetico (Kapton) che si muove in continuo trascinato da una puleggia (Figura 43). Il nastro porta la soluzione dapprima sotto un riscaldatore a raggi infrarossi che vaporizza gran parte del solvente, in seguito in una camera collegata al sistema di pompaggio in modo da permettere l'allontanamento delle ultime tracce di composti volatili. Arriva quindi in sorgente dove un rapidissimo riscaldamento vaporizza la sostanza. Quindi il nastro ritorna indietro passando attraverso una camera riscaldata per eliminare i residui. La tecnica permette di separare il soluto dalla fase mobile che viene fatta evaporare prima che il soluto raggiunga la sorgente dello spettrometro di massa. Questo tipo di interfaccia è utilizzabile sia con strumenti magnetici che con strumenti quadrupolari. Poiché la quantità di solvente che arriva in sorgente è minima possono essere ottenuti spettri con ionizzazione per interazione elettronica (EI) oppure con ionizzazione chimica (CI) usando come agente ionizzante il gas più appropriato per il

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composto in esame, senza particolari vincoli. Lo spettro non è influenzato dal solvente. La tecnica favorisce i composti semi-volatili e mostra buona sensibilità con colonne microbore. Gli svantaggi risiedono nel fatto che vengono persi i composti molto volatili, i composti sensibili al calore si decompongono, il nastro mostra effetti di memoria (picchi fantasma), non sopporta elevate quantità di acqua (flusso non superiore a 0,3 ml/min), usa tamponi volatili a meno di cercare di "raspar via" gli inorganici dal nastro. Un'altra limitazione alquanto fastidiosa è che, avendosi delle parti in movimento ed un nastro che subisce notevoli sbalzi di temperatura, si verificano di frequente inconvenienti meccanici (oltre ai problemi di contaminazione). Malgrado ciò questo sistema è stato molto usato negli anni scorsi (anche perché non erano ancora disponibili altri); oggi è in disuso.

Isolatore

Spettrometro di massa

(6)

(3)

(2)

(8)

(1)

(7)(4)

Sorgente (5)

Tenute

Nastro mobile

+

eluato da colonna HPLC

Ruote motrici

Pompa da vuoto 2° stadio

Pompa da vuoto1° stadio

Figura 43: Sistema per LC/MS a nastro trasportatore, “cinghia mobile” moving belt (MB) Accessori: (1) linea di drenaggio, in modalità di partizione per la rimozione dell’eccesso di soluzione, oppure in modalità di addizione post colonna di reagente (ad esempio matrice per FAB); (2) depositore per semplice contatto, in ceramica sinterizzata, spruzzatore a getto (gas nebulizzato), inclinato ad angoli diversi (45-90°); (3) pre riscaldatore della soluzione, ventilatore o riscaldatore ad infrarossi nelle prime versioni; non necessario per micro HPLC o FAB; (4)riscaldatore del campione; (5) riscaldatore per pulire, usato nella modalità EI e CI e non in FAB; (6) sorgente di ionizzazione (EI, CI, FAB); (7) sistema pulente del nastro (strofinio meccanico, bagno di lavaggio); (8) meccanismo di allineamento della sonda

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Formazione di aerosol (PB particle beam) Questa interfaccia prende origine dal sistema MAGIC (monodisperse aerosol generator for interfacing chromatography) (Figura 44). L’eluito dal LC entra nell’interfaccia assieme a un flusso di elio e forma così un aerosol di goccioline di solvente che si muovono verso la camera di desolvatazione. La camera è tenuta a pressione e temperatura ambiente, in essa si ha la vaporizzazione del solvente e la produzione di una miscela composta da vapori, particelle di analita e elio. Questa miscela entra in una regione a bassa pressione (ottenuta da una pompa rotativa) attraverso uno stretto ugello, durante questo processo la miscela accelera e forma un getto supersonico che contiene un raggio centrale di particelle orientato in linea retta. I vapori di solvente e l'elio sono "schiumati via" e rimossi per pompaggio da una serie di due ugelli e schiumatori, per cui entra in sorgente (soltanto) il raggio delle pesanti particelle dell'analita. Queste ultime collidono su una parete riscaldata del corpo di sorgente e sono ionizzate per impatto elettronico (EI) o per ionizzazione chimica (CI). I principi di funzionamento di questa interfaccia ricordano da vicino quelli del separatore a getto (jet) della GC/MS. I vantaggi di questa interfaccia sono: registrazione di spettri "classici" per EI, e/o spettri CI con diversi gas reagenti, facilità di operazioni, buona riproducibilità, possibilità di passare velocemente dalla LC/MS alla GC/MS. Gli svantaggi risiedono nel fatto che è richiesta una certa volatilità del campione, che alcune classi (es. zuccheri ...) non danno spettri EI adeguati, per cui è inadeguata allo studio di sostanze con pesi molecolari elevati o termolabili e poco volatili, che ha scarsa sensibilità per molecole idrosolubili e che richiede comunque tamponi volatili. L'intefaccia PB ha praticamente sostituito il nastro mobile (MB) come sistema scelto per composti con pesi molecolari medi, principalmente per i vantaggi di semplicità meccanica e robustezza; il sistema progettato originariamente per i quadrupoli è stato adattato anche a strumenti magnetici. Riceve ancora qualche attenzione per applicazioni in campo ambientale, con sostanze spesso separabili anche per GC/MS.

nebulizzatore

separatore dell’aerosolgas di dispersione(elio)

eluato da LC camera di desolvatazione

pompe da vuoto MS sorgente diionizzazione

N1 S1 N2 S2

Figura 44: sistema per LC/MS a “particle beam” PB Flusso continuo in bombardamento con atomi veloci (CF-FAB o f-FAB continuous flow fast atom bombardment) La tecnica di ionizzazione mediante bombardamento con atomi veloci (FAB) è stata adattata in modo da poter operare con una matrice fluente invece che statica rendendola così applicabile come interfaccia LC/MS, ma è principalmente una

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tecnica FAB in cui si ha all’interno della sorgente un flusso continuo di un campione in soluzione in questo modo spesso si hanno segnali migliori rispetto al FAB convenzionale. Questa tecnica viene anche chiamata FAB dinamico (dynamic FAB or dynamic LSIMS) o frit FAB. Di solito sono usati due tipi diversi di sonda: uno in cui la fase mobile viene fatta passare in una maglia fitta di acciaio o in un setto di ceramica sinterizzata posto all'estremità in sorgente e un secondo in cui il campione fluisce liberamente in quella che non è altro che una sonda normale portacampione FAB con un foro passante (Figura 45). Naturalmente il solvente deve contenere la solita matrice FAB (glicerina, tioglicerolo ...), se proviene da HPLC la matrice è spesso aggiunta dopo la colonna. La tecnica ha delle severe limitazioni sui flussi, accetta flussi 5-10 µl/min, cioè è utile per colonne capillari ma necessita di partizione per le colonne normali. Un problema poi è dato dalla soluzione che non viene vaporizzata e rimane in sorgente; le prime sonde CF-FAB avevano montato un tampone di carta assorbente (le idee artigianali hanno sempre avuto fortuna tra gli spettrometristi di massa). Gli spettri forniti sono simili a quelli di un FAB convenzionale per cui il sistema è molto adatto per composti molto polari ad alto peso molecolare ma fornisce scarsa informazione sulla frammentazione. Il CF-FAB è un veloce ed utile sistema di introduzione per campioni (puri) in soluzione perché evita la noia di inserzione e rimozione della sonda durante l'esecuzione di analisi.

isolatore termico

blocco di rameriscaldato

asta della sonda

fascio FAB

all’analizzatoredi massa

punta emisferica della sonda

lenti

L1 L2

(vespel)

capillare in silice fusaCa 3~10 l/minµ

Figura 45: Sistema per LC/MS in flusso continuo con bombardamento con atomi veloci (CF-FAB)

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Termonebulizzazione (TSP=thermospray) Rispetto alle precedenti ha avuto maggior impiego grazie alla sua praticità e versatilità.(schema generale Figura 46). Il flusso di liquido proveniente dalla colonna cromatografica (1-2 ml/min) è sottoposto ad un rapidissimo riscaldamento in un capillare in modo da formare un getto supersonico di vapore; sorprendentemente in queste condizioni la decomposizione termica praticamente non si verifica. Il capillare termina in sorgente con un orifizio di circa 0,1 mm; il getto attraversa tutta la sorgente ed entra in una linea di potente pompaggio munita di una trappola fredda che elimina l'eccesso di solvente. Durante il processo di nebulizzazione-evaporazione nel capillare riscaldato avviene un po' di ionizzazione per la presenza di elettroliti volatili nella fase mobile; soprattutto se nella fase mobile HPLC sono presenti in modo significativo ioni come l'ammonio o l'acetato (si usa un tampone a base di acetato ammonio 0,1M) allora alcune goccioline porteranno delle cariche quando lasceranno l'ugello. Nel moto il solvente evaporerà rapidamente lasciando le molecole dell'analita "nude" ed accompagnate da una carica.

Figura 46: sistema LC/MS basato su termonebulizzazione (TSP)

Come risultato insomma si avrà una molecola carica libera dalla fase mobile, ottenuta tramite un processo che avviene in modo statistico e non per applicazione di un campo elettrico esterno (Figura 47). La maggior parte della ionizzazione però avverrà mediante un classico processo di ionizzazione chimica. (NH4

+ + M → [M+H]+ + NH3). Gli ioni presenti nel getto vengono deviati dal campo elettrico presente in sorgente, entrano nel foro del cono di campionamento e passano nell'analizzatore dello spettrometro di massa (comunemente quadrupolare), il processo è incoraggiato da un elettrodo repulsore. E' chiaro che con questo sistema di ionizzazione il soluto viene sufficientemente ionizzato se abbastanza polare. La tecnica (Errore. L’origine riferimento non è stata trovata.) può essere utilizzata anche con sostanze apolari utilizzando una post-ionizzazione tramite un filamento (filament-on-TSP) che emette elettroni o tramite scarica elettrica a bagliore (glow discharge) nel vapore di solvente; in questo ultimo caso la tecnica viene detta plasmaspray (PSP). Se è presente la scarica a bagliore si assume come modello semplificato del processo di ionizzazione una fase primaria di ionizzazione elettronica delle molecole del solvente nella regione

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negativa della scarica seguita dalla ionizzazione delle molecole di analita tramite reazioni

Liquido

(Cono Campionatore)Allo spettrometro

di massa

Calore

Alla pompa

H O2

H O2

CaloreVaporizzatore

+ ++ + - -+ +-- - - .-

H O2

H O2

-H O2

S-

MH+A-

.- A-

NH4

+

+

H O2

M

NH4

++

Figura 47: termonebulizzazione: meccanismi di ionizzazione

ione/molecola in fase gassosa tra gli ioni del solvente e le molecole del campione secondo un processo simile alla ionizzazione chimica. La presenza di una post-ionizzazione può aiutare non solo aumentando la risposta rispetto ai composti non polari ma anche aggiungendo della frammentazione in più. I dati però non sono di facile interpretazione perché il processo di ionizzazione è assai complesso e non permette di prevedere in anticipo il comportamento dei vari gruppi funzionali presenti nella molecola. Punto critico della tecnica è la messa a punto di molti parametri; piccoli cambiamenti possono causare grosse perdite di sensibilità; fondamentale fattore è il controllo della temperatura del capillare di vaporizzazione per assicurare sensibilità ottimale e riproducibilità; questa temperatura deve essere regolata ad un valore tale da permettere la vaporizzazione di quasi tutto il solvente. Purtroppo la sensibilità della tecnica tende ad essere dipendente dal tipo di composto, dalla composizione del solvente ..., arrivando anche a richiedere 10µg per ottenere uno spettro invece del solito nanogrammo. I vantaggi possono essere così riassunti: va bene per composti non volatili; si usano solventi acquosi senza problemi, ma sempre con tamponi volatili; il capillare si occlude meno facilmente che nella DLI, è più largo: non ci sono parti in movimento; accetta i normali flussi HPLC (fino a 2,5 ml/min). Un vantaggio di questa tecnica TSP è la possibilità di indurre la frammentazione in ioni altrimenti stabili applicando un potenziale più elevato del normale (100-200V) all'elettrodo repulsore opposto al cono (o altro apposito elettrodo). Si pensa che la frammentazione avvenga attraverso l'accelerazione degli ioni nella regione ad alta pressione della sorgente e, tramite collisioni, al trasferimento di energia interna alle molecole di analita. La discussione sulla opportunità di questo elettrodo per frammentazione è tuttora aperta; di fatto è stata superata dalla introduzione di analizzatori con possibilità MS/MS

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Blocco riscaldante

Alla pompa rotativa(trappola criogenica)

Linea del

vapore

ConoCampionatore

Lenti

Uscitaioni

Sonda

Da LC

12

T1

T2

T4

T3

34

Figura 48: esempio di interfaccia a termonebulizzazione (TSP) con le opzioni: 1) filamento oppure 2) elettrodo per scarica a bagliore inserito in modo che si protenda all’interno della zona dello spruzzo e contemporanea presenza di 3) elettrodo accelerante e 4) elettrodo repulsore. Punti importanti per il controllo della temperatura T1: vaporizzatore, T2 punta del nebulizzatore, T3 getto, T4 blocco di sorgente Elettronebulizzazione (ES electrospray) L'interfaccia a elettronebulizzazione si basa sulla ionizzazione a elettro-nebulizzazione (ESI electrospray ionisation abbreviata anche in ESP). Essa appartiene alla famiglia delle interfacce di ionizzazione a pressione atmosferica (API Atmospheric Pressure Ionization) così dette perché la vera e propria formazione di ioni si verifica al di fuori del sistema di vuoto dello spettrometro. Il primo lavoro che descrive una LC/MS con sorgente a pressione atmosferica (API) (Horning e collaboratori, 1973) usava una sorgente di nichelio - 63 e la ionizzazione veniva ottenuta tramite gli elettroni ad elevata energia emessi dall'elemento radioattivo. Solo nel 1985 però le potenzialità di questo metodo sono state riconosciute nel campo delle "grandi molecole" (polimeri e piccole proteine). Un flusso di liquido (1-40 µl/min) entra in un ago ipodermico (0,1 mm diametro interno) che è tenuto ad elevato potenziale (valore tipico 6 kV). Il liquido è espulso dalla punta dell'ago dove la repulsione coulombiana provoca una sua dispersione come un pennacchio di goccioline cariche. Questa prima parte del processo avviene a pressione atmosferica. Il nebulizzato è diretto verso le lenti/contro elettrodo poste all’ingresso di uno analizzatore di massa, di solito quadrupolare. Tutta questa zona quindi costituisce una sorgente a pressione atmosferica (API=atmospheric pressure ionisation source). A seconda dei vari modelli di sorgente un capillare d’acciaio riscaldato (Fenn-White- house, 1985) posto prima delle lenti come “elettrodo guaina” (sheath) oppure un orifizio campionatore posto tra le lenti stesse (Bruins, 1988) agiscono da camera di desolvatazione e evitano l’entrata di vapori neutri del solvente nella zona analizzatore. In un efficace sistema brevettato anche una cortina di azoto anidro fluisce dietro ed attraverso l'orifizio campionatore di queste lenti evita l'entrata di vapori (neutri) di solvente (Figura 49). Il solvente evapora rapidamente dalle goccioline che tendono ad "esplodere" in goccioline ancora più piccole; questa diminuzione nella dimensione delle gocce

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continua fino a quando il campo elettrico alla superficie raggiunge un valore sufficiente per desorbire ioni direttamente nel gas circostante (Figura 50). Gli ioni sono tratti attraverso le lenti in direzione dei coni campionatori (ugello e schiumatore), dove si ha una sufficiente caduta di pressione che permette agli ioni liberi di entrare nell’analizzatore di massa. La eventuale barriera di azoto attua un secondo compito, quello di rompere i legami idrogeno dei gruppi ioni/solvente che creerebbero confusione nello spettro di massa.

campione insoluzione

capillare postoad elevato potenziale

contro elettrodoorifizio campionatore

cono schiumatore (skimmer)analizzatore quadrupolare

pressione atmosferica 10 - 10 mbar-4 -51 mbar

Figura 49: schema di sorgente ESI

gocciolina iniziale carica

dopo l’evaporazione del solventeaumenta il campo elettrico

rottura della gocciolina raggiuntoun certo valore (limite di Rayleigh)di campo

formazione di ioni desolvatati perulteriore rottura della gocciolinae/o evaporazione degli ioni

[M+nH]n+

Figura 50: processo in ESI. Secondo quanto illustrato da S.I. Gaskell, J. Mass Spectrom., 32 (7), 677 (1997)

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Una tecnica correlata alla ES in cui la elettronebulizzazione è aiutata pneumaticamente (ISP ion spray) (1986) può accettare flussi di liquido più elevati (fino a 200 µl/min); di fatto quasi tutte le attuali sorgenti ESI hanno il capillare in un nebulizzatore, con aggiunta di un flusso anulare di gas che assiste l’evaporazione del solvente. Quindi le sorgenti electrospray sono tutte un po’ ionspray, anche se i nomi rimangono legati a tipi commerciali di modelli. Caratteristica del fenomeno della elettronebulizzazione è la capacità di attaccare molte cariche alle grosse molecole generando una serie di ioni multicaricati; di conseguenza un polipeptide di massa molecolare 60.000 con 30-60 cariche positive attaccate, ha rapporti di massa su carica tra 1000 e 2000, ben compresi nell'intervallo misurabile da quasi tutti gli spettrometri di massa moderni. L'ESI può essere molto sensibile, può essere usata sia con ioni positivi che con ioni negativi, ed è stata applicata su molecole da meno di 500 dalton fino a oltre 100.000 dalton, può quindi essere applicata a piccole proteine. La maggior limitazione all'interfaccia ES della LC/MS è data dai bassi flussi (100µl/min) e dalla apparente variazione nell'efficienza di ionizzazione con la composizione del solvente ed il tipo di analita. Sotto molti aspetti le considerazioni sulle condizioni sperimentali per ESP sono simili a quelle per TSP perché sono simili i meccanismi di ionizzazione. ESP è usata con HPLC in fase inversa e sembra che la sensibilità sia migliore quando è presente una quantità significativa di acqua nella fase mobile. Invece di aggiungere acetato di ammonio alla fase mobile, viene usato un acido volatile per favorire la ionizzazione (acido acetico o trifluoroacetico nel caso di ioni positivi). Rispetto alla seguente tecnica APCI l'elettronebulizzazione (ESI) è in genere più applicabile ad analisi di grosse molecole (<200.000) a bassi flussi (<200 µl/min), ciò la rende importante per l'accoppiamento con l'elettroforesi capillare (CE o CZE capillary (zone) electrophoresis) (1987). La spettrometria di massa in elettronebulizzazione può essere utilizzata per la misura della massa molecolare relativa (peso molecolare medio) di grandi molecole a causa della tendenza alla formazione di ioni con (molte) più cariche. Per esempio una molecola di massa relativa M=30.000 darà uno ione con 20 cariche positive che avrà la composizione (M+20H)20+ e quindi il picco corrispondente apparirà a m/z=(M+20)/20=1501. Uno spettro tipico ESP (Figura 51) di ioni positivi della mioglobina (peso molecolare medio 16951,5) mostra un insieme di picchi corrispondenti alla molecola intatta con diverse cariche a partire da 23 con m/z 738 fino a 12 con m/z 1413. Quando la massa molecolare relativa (RMM) è incognita si può calcolare da due semplici formule (o meglio il calcolatore la deduce da semplici formule) date da

nm H

m m M = n m - H)2

1

2 12=

−−

( 2

per due picchi adiacenti di m/z m1 e m/z m2 dove m1<m2 e n2= numero delle cariche dello ione a m/z m2, H= la massa di un protone e M= la massa molecolare relativa RMM dell'incognito. Dal momento che i picchi dell'insieme sperimentale formano una serie in cui ciascun termine differisce dal vicino per una carica, risulta facile per il sistema di elaborazione dati identificare la carica associata a ciascun picco, calcolare la massa molecolare da ciascun picco usando M=n(m-H) e mediare i valori di massa molecolare. Un opportuno programma di trasformazione presenta poi i dati in uno spettro di massa ricostruito come se il campione avesse uno ione molecolare a carica

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singola. La calibrazione del sistema può essere ottenuta con soluzioni di polietilenglicole o con soluzioni di mioglobina (10-20 pmol/µl).

S#: 1 RT: 0.01 AV: 1 NL: 1.54E7T: + p Full ms

700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000m/z

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100R

elat

ive

Abu

ndan

ce

Z=

24

Z=

15

Z=

14

Z=

13

Z=

12

Z=

11

Z=

10

Z=

9

1060.5

1131.1 1211.9998.2

942.91305.0

893.31413.5848.6

808.21541.9

771.5

1696.0

616.2

1884.2707.3

1420.7 1888.91225.4 1315.8 1820.81551.7679.1 1706.1 1938.7

S#: 1 RT: 0.01 AV: 1 NL: 1.23E8T: + p Full ms

16800 16850 16900 16950 17000 17050 17100 17150

mass

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

Rel

ativ

e A

bund

ance

16951.0

16995.0

16933.017011.0

17031.017090.016784.0 17114.0 17142.016894.016802.0 16851.0

Figura 51: un tipico spettro ESI di una singola proteina, mioglobina equina, come viene registrato dallo spettrometro (a) e come risulta dalla trasformazione dei dati in un segnale risultante pari a quello ottenibile da uno ione a singola carica (b) Ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) Un ulteriore sviluppo delle tecniche LC/MS è costituito dalla ionizzazione del campione nebulizzato (da nebulizzatore pneumatico riscaldato) attraverso una scarica per effetto corona nella regione delle goccioline dello spruzzo. I campioni divengono carichi tramite ionizzazione chimica cosicché il metodo viene chiamato

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APCI (atmospheric pressure chemical ionisation). Si ottengono spettri senza frammentazione di tipo per ionizzazione chimica, da cui possono essere dedotte informazioni sul peso molecolare. La presenza di “frammenti” può derivare da una certa degradazione termica. E' un metodo di ionizzazione blando ed è particolarmente adatto all'analisi di composti non volatili di peso molecolare medio (<1500 Dalton) offre il vantaggio di essere anche compatibile con flussi LC fino a 2 ml/min (Figura 52).

Calore

150° C

Gas+

Vapore

da LC - Liquido

H O3�

H O2 H O2

H O2

H O2

H O2

M MH�

MH�

760 Torr

gas cortina

N2

N2

+600 V 0 V

Blocco riscaldante

Gas nebulizzatoreGas ausiliario(make up)

Ago dellascarica

pressione atmosferica 10 mbar-4

Figura 52: schema di interfaccia/sorgente APCI

A seconda delle preferenze nella sorgente APCI con effetto corona possono essere formati ioni reagenti sia positivi che negativi; è la polarizzazione del campo tra punta e piano (del controelettrodo) che determina la polarità degli ioni analizzati. Nell'aria ambiente una complessa sequenza di reazioni origina i protoni idrati H3O

+ [H2O]n che costituiscono gli ioni positivi reagenti. Gli elettroni originati per effetto corona danno luogo agli ioni primari (N2

+, O2+, H2O

+ e NO+) per impatto elettronico sui componenti dell'aria. (Sebbene NO non sia un componente principale dell'aria pulita, la concentrazione di questa specie viene aumentata da reazioni neutre iniziate dalla scarica). Questi ioni primari reagiscono molto rapidamente (entro 10-6 sec) formando all'equilibrio un insieme di protoni idrati. Questi ultimi dominano l'insieme di tutti gli ioni formati e reagiscono con i composti in tracce. Nel modo "ioni negativi" gli elettroni generati dalla scarica a corona sono resi rapidamente "termici" (cioè perdono il loro eccesso di energia) attraverso collisioni con le specie neutre e sono prontamente catturati da specie elettro-negative come O2 per formare O2

- e O-. Lo anione superossido (O2-), i suoi idrati (O2

-[H2O]n) e adotti (O2

-[O2]n) costituiscono i maggiori ioni negativi reagenti presenti nella sorgente APCI aperta all'aria ambiente. Le specie neutre formate nella corona (NO, NO2, O3, CO....) hanno anch'essi una certa elettronegatività e possono reagire con O2 o O- per formare una serie di ioni reagenti minori NO2

-, NO3-, O3

-, CO3-. Per semplificare le reazioni si

tende ad impedire la formazione di queste specie neutre. Gli ioni reagenti (positivi o negativi) (R) possono reagire con i componenti in tracce (T) nell'aria ambiente tramite trasferimento di carica (1,2) o trasferimento di protone (3,4).

R+ + T → T+ + R 1 R- + T → T- + R 2 RH+ + T →TH+ + R 3 R- + TH →T- + RH 4

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Le reazioni di trasferimento di un protone per dare origine a ioni positivi utilizzano protoni idrati come ioni reagenti.

H O (H O) T TH (H O) (n m 1)H O3 2 n 2 m 2+ ++ → + − + 5

Le molecole d’acqua addotte alla molecola di sostanza in tracce sono strappate via dalla cortina di gas e nella regione delle lenti prima dell’analizzatore di masse; di conseguenza soltanto specie TH+ viene rivelata anche se si formano in sorgente i suoi idrati. La reazione 5 avverrà soltanto se l'acidità in fase gassosa di H3O

+ aq è maggiore di TH+ aq. Ciò è in generale vero se la basicità in fase gassosa (affinità protonica) di T è maggiore di quella dell'acqua, il che di solito succede per la maggior parte dei composti organici contenenti ossigeno ed azoto. Nel caso di impossibilità di trasferimento di protoni è necessario lo scambio di carica. I protoni idrati hanno energie di ricombinazione più basse di gran parte delle sostanze organiche e di conseguenza non trasferiscono la carica a queste. Partendo dall'aria ambiente la specie ionica che può trasferire la carica è principalmente O2

+ (e suoi idrati), purtroppo questi reagiscono rapidamente con il vapor d'acqua per formare protoni idrati per cui si hanno sensibilità minori rispetto al trasferimento di protone. Per compensare ciò viene aggiunto un opportuno reagente di ionizzazione chimica al flusso di aria ambiente che entra in sorgente.

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L’accoppiamento elettroforesi capillare/spettrometria di massa CZE/MS Il fondamento dell'elettroforesi consiste nella differente velocità di migrazione di molecole ioniche in una soluzione di elettrolita quando queste si trovano sotto l'influsso di un campo elettrico applicato. Dal punto di vista del principio quindi non si tratta di una tecnica cromatografica, però in combinazione con la cromatografia su carta ha dato prova di grande utilità per la separazione di sostanze con cariche, a partire dai piccoli ioni per arrivare alle grandi macromolecole cariche che hanno interesse biologico e biochimico. Moltissimi di questi composti contengono gruppi acidi e basici che sono facilmente ionizzabili; l'aumentare della ionizzazione dipende dalla composizione o dal pH della matrice. La elettroforesi a zona capillare (Capillary Zone Electrophoresis CZE) è una tecnica per separare composti ionici in un tubo aperto per mezzo di applicazione di un gradiente di potenziale. I composti migrano in modo diverso attraverso il tubo a seconda della loro mobilità elettroforetica. Usando la CZE si sono raggiunte efficienze di separazione pari a 106 piatti teorici su molecole biologiche come peptidi, proteine e nucleotidi. Questo fenomeno di elettroosmosi produce flussi di liquidi inferiori a µl/min nella direzione stabilita dalla polarità del potenziale e dalla chimica di superficie del capillare di separazione. Per collegare con successo la CZE con la MS è opportuno evitare la perturbazione di questo flusso onde evitare lo scompiglio del processo di separazione. Oltre al sistema attraverso una sonda diretta, l'interfaccia CZE/MS accoppia la colonna di separazione con una sorgente ad elettronebulizzazione aiutata pneumaticamente (ion spray) attraverso un "collegamento liquido". Questo collegamento liquido aggiunge tanto flusso di gas di compensazione (make-up gas) quanto viene richiesto dalle condizioni ottimali della sorgente (da 5 a 15 µl/min). Di conseguenza la giunzione liquida evita l'applicazione del vuoto alla colonna CZE mantenendo il massimo dell'efficienza di separazione (Figura 53).

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Giunzioneliquida

Uscita alla sorgenteESI (ISP)

Fine della colonnaelettroforetica

nebulizzatore aiutato pneumaticamente

Ioni

Allo spettrometro

Cono campionatore

Gas di cortina

Elettrodo

Alimentatori

Serbatoiodel tampone

Colonnaelettroforetica

Altovoltaggio

Figura 53: schema di un accoppiamento CZE/MS con sorgente ISP (ESI) attraverso un “collegamento liquido”

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Caratteristiche delle tecniche a termonebulizzazione e elettronebulizzazione thermospray electrospray causa che produce lo spruzzo di particelle cariche

calore campo elettrico

cariche sulle goccioline di entrambe le polarità una sola polarità netta temperatura elevata ambiente decomposizione termica i composti termicamente labili

sono suscettibili di decomposizione

nessuna

pressione di solito in vuoto atmosferica meccanismo di ionizzazione ionizzazione chimica e

evaporazione ionica evaporazione ionica

numero di ioni multicarica pochi molti (se le molecole hanno diversi siti capaci di portare la carica)

frammentazione un po’ nessuna (anche se si può iniziare modificando i parametri di sorgente)

tipo di soluzioni HPLC etanoato di ammonio acquoso e simili

acqua/solvente organico polare/regolatore di pH

varianti gli elettroni emessi da un filamento o da una scarica a bagliore (=plasmaspray) per aiutare la ionizzazione

un gas di nebulizzazione caldo allo scopo di favorire l’evaporazione del solvente permette flussi di liquido più elevati (=ionspray)

la termonebulizzazione a pressione atmosferica e la termonebulizzazione elettricamente assistita aumentano la resa in multicarica

un aiuto sia pneumatico sia termico favorisce l’evaporazione ma diminuisce le cariche

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TABELLE RIASSUNTIVE LC/MS Tabella indicativa delle caratteristiche dei sistemi LC/MS attuali, il numero di stelle aumenta con le prestazioni tipo di LC/MS

limite di rivelabilità

flusso di LC

tipi di solventi

campioni semi-

volatili

campioni non volatili termolabili

intervallo di massa

DLI �� � ��� ���� �� ��

MB �� ����� ����� ����� � �(�)

TSP ��(��) ����� ���� ����� ���(�) ���(�)

PB �� ���(�) ���� ����� �(�) �(�)

CF-FAB ��(�) � ��� ���� ����� ����

ESI ����(�) � ��(�) ���� ����� �����

APCI ���� ���� �� ����� ���� ���(�)

polarità

peso

mol

ecol

are

PB DLI TSP ESI GC/MS MB f.FAB APCI