Unità 3 La tecnologia del DNA ricombinante e la genomica · Integrazione del frammento di DNA del...
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Unità 3 La tecnologia del DNA ricombinante e la genomica
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Unità 3La tecnologia del DNA ricombinante e la genomica
Unità 3
Obiettivi
Conoscere le principali tecniche utilizzate per produrre cloni di geni specifici
Sapere come vengono ottenuti gli organismi geneticamente modificati, per quali scopi sono utilizzati e quali rischi comportano
Conoscere i principali metodi di analisi del DNA
Capire l’importanza dei risultati della genomica e, in particolare, del Progetto Genoma Umano
La tecnologia del DNA ricombinante e la genomica
Qual è la vera portata dei recenti successi della ricerca in ambito genetico e dove ci può portare il progresso nelle tecniche di analisi e studio del nostro genoma?
3
Prova di competenza – Conoscere i propri geni
Lezione 1
LA CLONAZIONE GENICA
4
Le biotecnologie permettono di manipolare gli organismi o i loro costituenti molecolari per ottenere prodotti utili
– In particolare, la tecnologia del DNA ricombinante permette di manipolare il DNA
– I plasmidi sono molecole di DNA circolare che si riproducono autonomamente nei batteri
– Sono strumenti fondamentali per l’ingegneria genetica e la clonazione genica in particolare
5
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
Come si clona un gene
1. Si isola un DNA plasmidico, che farà da vettore
2. Si isola il DNA donatore da cui si vuole estrarre il gene
3. Si taglia il DNA plasmidico con un enzima di restrizione
4. Si taglia il DNA donatore con lo stesso enzima, ottenendo molti frammenti
5. Si mescolano DNA plasmidico e DNA donatore
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
6
6. Si aggiunge DNA ligasi, che catalizza la formazione di legami covalenti tra il DNA plasmidico e i frammenti di DNA donatore. Si ottengono così plasmidi ricombinanti che contengono frammenti del DNA donatore
7. Si inserisce il DNA plasmidico in una colonia di batteri, ottenendo batteri ricombinanti
8. Riproducendosi le cellule batteriche daranno origine a cloni di cellule identiche, ognuno contenente un frammento del DNA donatore
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
7
Esempi
di uso dei geni
Plasmide
con DNA
ricombinante
Batterio E. coliPlasmide
Cromosoma
batterico
Gene che si vuole clonare
DNA
Gene
che si vuole clonare
Cellula contenente
Il gene che si vuole clonare
Batterio
ricombinante
Cloni
di cellule
I geni possono essere
inseriti in altri organismi
Isolamento dei geni
o delle proteine dal batterio clonato
Le proteine
ricavate possono
essere usate
direttamente
Esempi di uso
delle proteine
Gene
che si vuole clonare
Isolamento
del plasmide
1
Isolamento
del DNA
2
Taglio del plasmide
con l’enzima
3
Taglio del DNA cellulare
con lo stesso enzima
4
Integrazione del frammento
di DNA del donatore nel plasmide
5
Aggiunta della DNA ligasi,
che chiude l’anello
formando
legami covalenti
6
Inserzione del
plasmide nel batterio
(trasformazione)
7
Duplicazione
del batterio
in coltura
8
9
8
Batterio E. coliPlasmide
Cromosoma
batterico
Geneche si vuole clonare
DNA
Cellula contenente
il gene che si vuole clonareIsolamento
del plasmideIsolamento
del DNA
1
2
9
Batterio E. coliPlasmide
Cromosoma
batterico
Geneche si vuole clonare
DNA
Cellula contenente
il gene che si vuole clonare
Gene
che si vuole clonare
Isolamento
del plasmideIsolamento
del DNA
Taglio del plasmide
con l’enzima
Taglio del DNA cellulare
con lo stesso enzima
1
2
3
4
10
Batterio E. coliPlasmide
Cromosoma
batterico
Geneche si vuole clonare
DNA
Cellula contenente
il gene che si vuole clonare
Gene
che si vuole clonare
Isolamento
del plasmideIsolamento
del DNA
Taglio del plasmide
con l’enzima
Taglio del DNA cellulare
con lo stesso enzima
1
2
3
4
Integrazione del frammento
di DNA del donatore nel plasmide
5
11
Batterio E. coliPlasmide
Cromosoma
batterico
Geneche si vuole clonare
DNA
Cellula contenente
il gene che si vuole clonare
Gene
che si vuole clonare
Isolamento
del plasmideIsolamento
del DNA
Taglio del plasmide
con l’enzima
Taglio del DNA cellulare
con lo stesso enzima
1
2
3
4
Plasmide
con DNA
ricombinanteGene
che si vuole clonare
Integrazione del frammento
di DNA del donatore nel plasmide
Aggiunta della DNA ligasi,
che chiude l’anello
formando
legami covalenti
5
6
12
Plasmide
con DNA
ricombinanteGene
che si vuole clonare
Batterio
ricombinante
Inserzione del
plasmide nel batterio
(trasformazione)
7
13
Plasmide
con DNA
ricombinanteGene
che si vuole clonare
Batterio
ricombinante
Cloni
di cellule
Inserzione del
plasmide nel batterio
(trasformazione)
Duplicazione
del batterio
in coltura
8
7
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Plasmide
con DNA
ricombinante
Gene
che si vuole clonare
Batterio
ricombinante
Cloni
di cellule
Isolamento dei geni
o delle proteine dal batterio clonato
Le proteine
ricavate possono
essere usate
direttamente
Esempi di uso
delle proteine
Inserzione del
plasmide nel batterio
(trasformazione)
Duplicazione
del batterio
in coltura
8
7
I geni possono essere
inseriti in altri organismi
Esempi
di uso dei geni
9
15
STEP BY STEP
Perché la velocità con cui i batteri si duplicano è utile quando si vuole clonare un gene?
16
3.1 È possibile ottenere molte copie di un gene
inserendolo all’interno di un batterio
Gli enzimi di restrizione tagliano il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche
– Ognuno di questi enzimi lega il DNA in corrispondenza di una specifica sequenza, il sito di restrizione
– Molti enzimi di restrizione producono frammenti di restrizione dotati di estremità coesive, cioè a filamento singolo
– Frammenti dotati di estremità coesive complementari possono legarsi tra loro
– La DNA ligasi permette di formare legami permanenti tra i frammenti formando una molecola di DNA ricombinante
17
3.2 Il DNA viene “tagliato e incollato” utilizzando
enzimi specifici
Sequenza di riconoscimento
dell’enzima di restrizione
1
2
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
Estremità coesiva
18
Sequenza di riconoscimento
dell’enzima di restrizione
1
2
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
Estremità coesiva
3
Aggiunta di un
frammento di DNA
proveniente da
un’altra fonte
19
Sequenza di riconoscimento
dell’enzima di restrizione
1
2
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
Estremità coesiva
3
Aggiunta di un
frammento di DNA
proveniente da
un’altra fonte
4
Due (o più) frammenti
si legano mediante
appaiamento delle basi
complementari
20
Sequenza di riconoscimento
dell’enzima di restrizione
1
2
DNA
L’enzima di restrizione
taglia il DNA in frammenti
Estremità coesiva
3
Aggiunta di un
frammento di DNA
proveniente da
un’altra fonte
4
Due (o più) frammenti
si legano mediante
appaiamento delle basi
complementari
La DNA ligasi
incolla i filamenti
Molecola
di DNA ricombinante5
21
STEP BY STEP
Che cosa sono le estremità coesive?
22
3.2 Il DNA viene “tagliato e incollato” utilizzando
enzimi specifici
Una libreria genomica raccoglie tutti i frammenti di DNA clonati provenienti da un genoma
I frammenti sono inseriti in vettori necessari alla loro conservazione e duplicazione
– Plasmidi batterici
– DNA fagico
– BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
23
3.3 I geni clonati possono essere archiviati in
“librerie” genomiche
Plasmide
ricombinante
Clone
del fagoClone
batterico
Libreria fagicaLibreria plasmidica
oppure
DNA ricombinante
del fago
Genoma tagliato
con l’enzima
di restrizione
24
STEP BY STEP
Si può dire che una libreria genomica contiene numerose copie di ciascun “libro”
Che cosa si intende con questa affermazione?
25
3.3 I geni clonati possono essere archiviati in
“librerie” genomiche
È possibile creare una libreria che contiene tutti i geni espressi da un organismo partendo dal suo mRNA
– Una volta isolato l’mRNA si utilizza l’enzima trascrittasi inversa per sintetizzare i filamenti di DNA complementari a quelli di mRNA
– Si elimina l’RNA con un enzima che lo degrada
– Si sintetizzano filamenti di DNA complementari a quelli già ottenuti
– Il risultato sono dei frammenti di DNA a doppio filamento detti cDNA (DNA complementare)
26
3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata
per produrre geni da clonare
Una libreria di cDNA è utile per studiare i geni responsabili delle funzioni specializzate di un particolare tipo di cellule
Essendo prive di introni, le molecole di cDNA sono più corte e “maneggevoli” rispetto alle versioni complete dei geni
27
3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata
per produrre geni da clonare
Nucleo della cellula
Isolamento dell’mRNA dalla
cellula e aggiunta di trascrittasi
inversa; sintesi del filamento
di DNA complementare
Splicing dell’RNA2
Trascrizione1
3
Demolizione dell’RNA4
Sintesi del secondo
filamento di DNA5
mRNA
DNA
di un gene
eucariote
IntroneEsone
Trascritto
di RNA
Esone Introne Esone
Trascrittasi inversa
Provetta
Sintesi del
filamento di cDNA
cDNA del gene
(senza introni)
28
STEP BY STEP
Perché un gene di cDNA ottenuto utilizzando la trascrittasi inversa è spesso più corto di un gene naturale?
29
3.4 La trascrittasi inversa può essere utilizzata
per produrre geni da clonare
Per individuare un determinato gene all’interno di una libreria genetica possiamo usare una sonda nucleotidica
– Costituita da DNA o RNA fluorescente o marcato radioattivamente
– Contiene una breve sequenza nucleotidica complementare a una porzione del gene di interesse
30
3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni
contenenti geni specifici
31
3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni
contenenti geni specifici
Come si può usare una sonda nucleotidica
– Si trasferiscono alcune cellule dalle colonie di batteri di una libreria genica su un disco di carta da filtro
– Si tratta il disco in modo da lisare le cellule e separarei filamenti di DNA
– Si aggiunge una soluzione contenente la sonda
– La colonia contenente il gene di interesse risulterà marcata
– Si prelevano cellule della colonia di partenza e si coltivano in modo da ottenere grandi quantità del gene di interesse
Sonda
radioattiva
DNA
a singolo filamento
L’appaiamento
complementare
marca il gene
desiderato
Aggiunta di DNA
a singolo filamento
proveniente da una
libreria genomica
32
STEP BY STEP
In che modo una sonda costituita da DNA o RNA radioattivo permette di individuare i cloni batterici contenenti un particolare gene?
33
3.5 Le sonde nucleotidiche riconoscono cloni
contenenti geni specifici
Lezione 2
GLI ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI
34
- Le cellule e gli organismi ricombinanti ottenuti con la tecnologia del DNA sono usati per sintetizzare proteine e altre molecole utili
- È possibile utilizzare diversi tipi di organismi ricombinanti a seconda delle caratteristichedella molecola che si desidera produrre
– Procarioti: per esempio Escherichia coli
– Facilmente manipolabili geneticamente ed economici
– Possono secernere le sostanze prodotte nel terreno di coltura
35
3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati per
produrre grandi quantità di prodotti genici
specifici
– Eucarioti
– Saccharomyces cerevisiae
– Può produrre e secernere complesse proteine eucariotiche
– Colture di cellule di mammiferi
– Sono indispensabili per produrre glicoproteine
– Mammiferi ricombinanti
– Possono produrre molecole utili e secernerle nel propprio latte
36
3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati
per produrre grandi quantità di prodotti
genici specifici
37
38
STEP BY STEP
Perché le glicoproteine non possono essere prodotte su vasta scala utilizzando batteri o cellule di lievito geneticamente modificate?
39
3.6 Cellule e organismi ricombinanti sono usati
per produrre grandi quantità di prodotti
genici specifici
La tecnologia del DNA ricombinante è molto utilizzata per la produzione di medicinali e la diagnosi di malattie
- Terapie ormonali
– Ormoni identici a quelli umani sicuri, puri ed economici
– Per esempio: insulina, HGH, TPA
- Diagnosi
– Diagnosi precoce di malattie ereditarie
– Diagnosi di infezioni da virus difficilmente identificabili (HIV)
40
COLLEGAMENTO salute
La tecnologia del DNA ha trasformato l’industria
farmaceutica e la ricerca biomedica
- Vaccini
– La tecnologia del DNA ricombinante è utile sia per ottenere i vaccini che per produrli su larga scala
41
COLLEGAMENTO salute
La tecnologia del DNA ha trasformato l’industria
farmaceutica e la ricerca biomedica
42
OGM (Organismi Geneticamente Modificati) hanno un patrimonio genetico modificato
Organismi transgenici contengono materiale genetico derivante da altre specie
43
3.7 Gli organismi geneticamente modificati
stanno trasformando l’agricoltura e
l’allevamento
Piante GM modificate per
– Resistere a erbicidi, parassiti
– Maggiore produttività
– Migliori valori nutritivi
Animali GM
– Attualmente sono utilizzati solo nella ricerca biologica o per produrre molecole utili in campo farmaceutico
44
3.7 Gli organismi geneticamente modificati
stanno trasformando l’agricoltura e
l’allevamento
Agrobacterium tumefaciens
DNA contenente
il gene utile
Plasmide
Ti Inserimento del
gene nel plasmide
mediante l’enzima
di restrizione
e la DNA ligasi
Plasmide
Ti
ricombinante
1
Sitodi restrizione
45
Agrobacterium tumefaciens
DNA containinggene for desired trait
Plasmide
Ti Inserimento del
gene nel plasmide
mediante l’enzima
di restrizione
e la DNA ligasi
Plasmide
Ti
ricombinante
1
Sitodi restrizione
Cellula vegetale modificata
Introduzione
del plasmide
in cellule
Vegetali
Coltivate
in vitro
2
DNA contenente il nuovogene in un cromosoma della pianta
46
Agrobacterium tumefaciens
DNA containinggene for desired trait
Plasmide
Ti Inserimento del
gene nel plasmide
mediante l’enzima
di restrizione
e la DNA ligasi
Plasmide
Ti
ricombinante
1
Sitodi restrizione
Cellula vegetale modificata
Introduzione
del plasmide
in cellule
Vegetali
Coltivate
in vitro
2
DNA contenente il nuovogene in un cromosoma della pianta
Sviluppo
della pianta
3
Pianta con il nuovo carattere
47
STEP BY STEP
Qual è la funzione del plasmide Ti nella produzione di piante transgeniche?
48
3.7 Gli organismi geneticamente modificati
stanno trasformando l’agricoltura e
l’allevamento
- Esistono diverse norme e procedure indispensabili per limitare i pericoli legati all’utilizzo di OGM
- Timori comuni
– Piante GM possono introdurre allergeni negli alimenti
– Le proteine transgeniche possono essere testate
– Prodotti contenenti OGM devono indicarne la presenza in etichetta
- Rischi per le specie naturali
– Trasmissione dei geni modificati a specie selvatiche
– Riduzione della biodiversità
49
COLLEGAMENTO ambiente
Chi ha paura degli OGM
50
Terapia genica: curare malattie genetiche modificando i geni degli individui malati
Una possibile procedura
– Si clona il gene normale e si inserisce in un vettore retrovirale
– Si prelevano cellule del paziente interessate dalla malattia e si infettano con il vettore
– Il retrovirus inserisce nel genoma delle cellule il proprio DNA insieme al gene clonato
– Le cellule vengono reinserite nel paziente
51
COLLEGAMENTO salute
Geni di ricambio
Sperimentazione clinica
– Nel 2000 è stata avviata una sperimentazione clinica di terapia genica su 10 bambini malati di SCID
– 9 hanno avuto miglioramenti significativi, 3 si sono ammalati di leucemia (1 è morto), in 2 casi si è visto che il sito di integrazione del gene era la causa della leucemia
Problemi tecnici e dubbi etici
– Come integrare i meccanismi di controllo genico
– Come evitare il rischio di danneggiare altre funzioni
– Eugenetica e altri dubbi etici
52
COLLEGAMENTO salute
Geni di ricambio
Inserimento del gene normale
in un retrovirus vettore
1
Acido nucleico virale
Retrovirus
Una cellula del midollo osseo
viene infettata con il virus
2
Il DNA virale si integra
nel cromosoma della cellula
3
Iniezione
delle cellule nel paziente
4
Cellula di midollo osseo del paziente
Midollo
osseo
Gene clonato
(allele normale)
53
54
Lezione 3
I METODI DI ANALISI DEL DNA
55
Il DNA profiling è una procedura che prevede l’analisi di frammenti di DNA per stabilire se essi derivino da un particolare individuo
– Vengono confrontati marcatori genetici che variano da persona a persona
– I marcatori contenuti nei campioni biologici vengono amplificati
– L’amplificazione permette di avere a disposizione quantità sufficienti per il confronto
56
3.8 Ogni individuo è caratterizzato
da un diverso profilo del DNA
Scena del delitto
Isolamentodel DNA
1Sospettato 1 Sospettato 2
Amplificazione
del DNA
di marcatori
selezionati
2
Confronto
dei DNA
amplificati
3
57
3.8 Ogni individuo è caratterizzato
da un diverso profilo del DNA
STEP BY STEP
Perché il profilo genetico viene ottenuto confrontando specifici marcatori genetici e non interi genomi?
58
La PCR permette di amplificare specifiche sequenze di DNA
Si basa sull’utilizzo di una coppia di primer– Brevi sequenze nucleotidiche complementari alle due
estremità della sequenza da amplificare
– Funzionano da punto di partenza per la sintesi delle nuove molecole di DNA
Fasi della PCR– Il campione viene riscaldato per aprire le doppie eliche
– Il campione viene raffreddato facendo appaiare i primer con le sequenze bersaglio
– Una DNA polimerasi sintetizza nuovi filamenti di DNA allungando i primer
59
3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa la
reazione a catena della polimerasi (PCR)
- Applicazioni della PCR
– Amplificare DNA preistorico
– Indagini scientifiche sulla scena di crimini
– Diagnosi prenatale di malattie genetiche
– Diagnosi di infezioni di virus difficilmente identificabili
60
3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa la
reazione a catena della polimerasi (PCR)
Ciclo 1
produce 2 molecole
21 3
DNA estratto
dal genoma
Ciclo 3
produce 8 molecole
Ciclo 2
produce 4 molecole
3 5 3 5 3 5
Sequenza
bersaglio
Con il calore
si separano
i filamenti
di DNA
Nella miscela
raffreddata i primer
formano legami
idrogeno con le
estremità delle
sequenze bersaglio
35
3 5
35
35 35
Primer Nuovo DNA
5
La DNA
polimerasi
aggiunge
nucleotidi
all’estremità 3
di ogni primer
5
61
Ciclo 1
produce 2 molecole
DNA estratto
dal genoma
3 5 3 5 3 5
Sequenza
bersaglio
Con il calore
si separano
i filamenti
di DNA
Nella miscela
raffreddata i primer
formano legami
idrogeno con le
estremità delle
sequenze bersaglio
35
3 5
35
35 35
Primer Nuovo DNA
5
La DNA
polimerasi
aggiunge
nucleotidi
all’estremità 3
di ogni primer
21
5
3
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Ciclo 3
produce 8 molecole
Ciclo 2
produce 4 molecole
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STEP BY STEP
Perché la PCR è adatta all’analisi di DNA molto antichi?
64
3.9 Per amplificare le sequenze di DNA si usa
la reazione a catena della polimerasi (PCR)
L’elettroforesi su gel del DNA
– Campioni di DNA vengono posti a un capo di una lastra di gel
– Un elettrodo negativo e posto dal lato del DNA, uno positivo dall’altro
– Le molecole di DNA migrano verso il polo positivo
– Più sono grandi più si muovono lentamente nel gel
– Quando la corrente viene staccata, sul gel si osserva una serie di bande ognuna corrispondente a frammenti di DNA della stessa lunghezza
65
3.10 L’elettroforesi su gel separa le molecole di
DNA in base alle loro dimensioni
Miscela di frammenti
di DNA di diverse dimensioni
Elettroforesi completata
Molecole
più lunghe
(più lente)
Gel
Generatore
elettrico
Molecole
più corte
(più veloci)
66
STEP BY STEP
Perché durante l’elettroforesi le molecole di DNA migrano verso il polo positivo?
Perché le grandi molecole si spostano più lentamente di quelle piccole?
67
3.10 L’elettroforesi su gel separa le molecole di
DNA in base alle loro dimensioni
- DNA ripetitivo: sequenze nucleotidiche presenti nel genoma in moltissime copie
– Le STR sono brevi sequenze ripetute molte volte di seguito presenti nel genoma umano
- Analisi delle STR
– Il numero di ripetizioni delle STR in un particolere sito del genoma varia da persona a persona
– Per ottenere il profilo genico di una persona, si analizzano 13 siti specifici
68
3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere
i profili genetici
- Analisi delle STR
– Il numero di ripetizioni delle STR in un particolare sito del genoma varia da persona a persona
– Per ottenere il profilo genico di una persona, si analizzano 13 siti specifici
– Attraverso appositi primer si amplificano le sequenze di DNA contenute in questi siti con una PCR
– I prodotti della PCR vengono sottoposti a elettroforesi
– La lunghezza dei frammenti ottenuti permette di determinare il numero di STR presenti in ogni sito e confrontarli nei diversi campioni
69
3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere
i profili genetici
Sito di STR 1
DNA prelevato sulla scena del delitto
Sito di STR 2
DNA dell’individuosospettato
Il numero di STR
corrisponde Il numero di STR
non corrisponde
70
DNA
prelevato sulla scena
del delitto
DNA
dell’individuo
sospetto
71
STEP BY STEP
Che cosa sono le STR?
72
3.11 Il DNA ripetitivo è utile per ottenere
i profili genetici
Alcune applicazioni del profilo genetico
– Indagini di polizia
– Determinare la paternità o i legami parentali
– Identificazione di resti umani
– Identificazione di specie animali e vegetali
Attendibilità del test del DNA
– Salvo errori procedurali, la probabilità che due individui a caso abbiano lo stesso profilo genetico è di 1 su 10 miliardi
73
COLLEGAMENTO società
La parola ai geni
74
75
SNP: sono variazioni presenti nel genoma umano che interessano singole coppie di basi
RFLP: sono particolari SNP presenti su siti di restrizione che alterano la lunghezza dei frammenti di DNA ottenibili con il taglio da parte dell’enzima di restrizione
– L’analisi dei RFLP viene effettuata separando mediante elettroforesi su gel i frammenti di restrizione ottenuti dai campioni che si vogliono confrontare
76
3.12 Per individuare le differenze nelle sequenze di
DNA si possono usare i RFLP
Aggiunta
degli enzimi
di restrizione
Campione 1 Campione 2
Taglio
w
z
x
yy
TaglioTaglio
w
z
x
yy
Frammenti
più lunghi
Frammenti
più corti
77
STEP BY STEP
Come viene effettuata l’analisi dei RFLP?
78
3.12 Per individuare le differenze nelle sequenze di
DNA si possono usare i RFLP
- Il sequenziamento con il metodo di Sanger si basa sulla possibilità di interrompere la duplicazione di un filamento di DNA e individuare l’ultimo nucleotide inserito
79
3.13 Tramite il metodo Sanger è possibile
determinare la sequenza di un frammento di
DNA
1. il frammento di DNA di cui si desidera determinare
la sequenza viene separato nei due filamenti che lo
compongono aumentando la temperatura e viene
poi mescolato in una provetta ai reagenti necessari
per la sintesi del DNA
80
2. la sintesi dei nuovi filamenti di DNA inizia
all’estremità 3� del filamento stampo e procede
finché non viene casualmente incorporato un
didesossiribonucleotide, che ne blocca
l’allungamento; alla fine si otterrà una miscela di
frammenti di varie lunghezze che terminano con un
nucleotide marcato
81
3. i frammenti vengono separati per
mezzo di un’elettroforesi, che avviene
all’interno di un capillare pieno di gel
in questo modo i filamenti migrano lungo il capillare verso il
polo negativo disponendosi secondo la loro lunghezza e
un lettore fluorescente può identificare al loro passaggio il
tipo di nucleotide che corrisponde all’ultima posizione di
ciascun frammento
82
4. i dati possono essere letti sotto forma di
uno spettrogramma che indica la sequenza
complementare al filamento stampo
83
STEP BY STEP
Qual è la funzione dei didesossiribonucleotidi fluorescenti nel sequenziamento tramite il metodo Sanger?
84
3.13 Tramite il metodo Sanger è possibile
determinare la sequenza di un frammento di
DNA
Lezione 4
LA GENOMICA
85
Un genoma è l’intero corredo di geni di un organismo
– I primi studi genomica si sono focalizzati su organismi semplici come i procarioti
– Gli studi recenti hanno permesso il sequenziamento del genoma di molti eucarioti, compreso quello umano
La comparazione di genomi di diversi organismi
– Permette di individuare le relazioni evolutive
– Aiuta a individuare le funzioni dei geni
86
3.14 La genomica è lo studio scientifico di interi
genomi
87
STEP BY STEP
Perché è utile sequenziare genomi non umani?
88
3.14 La genomica è lo studio scientifico di interi
genomi
Una volta sequenziato il genoma di un organismo
– Si individuano gli Open Reading Frames
– In caso di geni codificanti si può dedurra le sequenza amminoacidica
– Si identificano le sequenze regolatrici
Queste informazioni possono essere analizzate con due approcci
– Funzionale: approfondendo il ruolo di ciascun gene
– Comparativo: confrontando i genomi di diversi organismi
89
3.15 Si possono ottenere molte informazioni
diverse dallo studio dei genomi
90
- Oltre al genoma di un organismo è possibile studiare
– Il suo trascrittoma: l’insieme di molecole di RNA effettivamente trascritte
– Il suo proteoma: l’insieme di tutte le proteine espresse
- L’analisi di informazioni così ricche e complesse è resa possibile dagli strumenti forniti dalla bioinformatica
91
3.15 Si possono ottenere molte informazioni
diverse dallo studio dei genomi
STEP BY STEP
Perché la bioinformatica è uno strumento fondamentale nello studio del proteoma?
92
3.15 Si possono ottenere molte informazioni
diverse dallo studio dei genomi
- Il Progetto Genoma Umano è un progetto pubblico di ricerca che ha lo scopo di determinare l’intera sequenza nucleotidica del genoma umano
– Il DNA è stato prelevato da 5 donatori statisticamente rilevanti
– Lo scopo era quello di identificare la sequenza e la posizione di ogni gene presente nel nostro genoma
– Nel 2000 ha raggiunto il suo scopo
93
Cacciatori di geniCOLLEGAMENTO società
- Celera Genomics è una società privata che ha lavorato allo stesso scopo, in parallelo con un sistema diverso
– Con questo metodo ha sostenuto costi più di 10 volte inferiori rispetto al Progetto Genoma Umano
– Pur iniziando in un secondo momento è arrivata ad ottenere il sequenziamento completo in contemporanea
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Cacciatori di geniCOLLEGAMENTO società
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- Risultati e applicazioni
– Gli esseri umani hanno circa 2100 geni che rappresentano solo l’1,5 % del DNA
– Il resto è composto da introni, sequenze regolatrici, e in gran parte da sequenze ripetute ed elementi trasponibili
– La mappatura del genoma umano ha permesso di individuare centinaia di geni associati a malattie
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Cacciatori di geniCOLLEGAMENTO società
DNA ripetitivo
comprendente
elementi
trasponibili
e sequenze
affini (44%)
DNA
ripetitivo
privo di
elementi
trasponibili
(15%)
DNA
non codificante
(15%)
Introni
e sequenze
regolatrici (24%)
Esoni (regioni dei geni codificanti per
una proteina o trascritte in rRNA o tRNA)
(1,5%)
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Il Progetto Genoma Umano ha applicato una procedura in tre stadi
– Mappa genetica a bassa risoluzione creata analizzando 5000 RFLP
– Mappa fisica indicante il numero di basi compreso tra un marcatore e l’altro
– Sequenziamento dell’insieme di frammenti di DNA precedentemente mappati
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3.16 Il metodo di sequenziamento shotgun
applicato a interi genomi può fornire
rapidamente una grande quantità di dati
Frammentazione mediante
enzima di restrizione
Cromosoma
Frammenti di DNA
Sequenziamento
dei frammenti
Allineamento
dei frammenti
Riassemblaggio della
sequenza completa
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STEP BY STEP
Qual è il vantaggio principale del metodo shotgun?
100
3.16 Il metodo di sequenziamento shotgun
applicato a interi genomi può fornire
rapidamente una grande quantità di dati
- Il confronto tra genomi di specie affini permette di fare luce su eventi evolutivi recenti
- Confronti tra specie più lontane permettono di indagare la storia evolutiva più remota
alla luce dell’evoluzione
101
3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza
evolutiva tra esseri umani e scimpanzé
- Confronto tra genoma umano e di scimpanzé
– Differenza dell’1,2% per sostituzioni di singole basi
– Differenza del 2,7% per inserzioni o delezioni di porzioni più estese
– Una importante differenza riguarda il gene FOXP2
– Sembra abbia subito un veloce cambiamento nella specie umana
– Mutazioni associate a problemi nel linguaggio
– Le differenze individuate potrebbero essere importanti per spiegare l’evoluzione del linguaggio esclusiva della nostra specie
alla luce dell’evoluzione
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3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza
evolutiva tra esseri umani e scimpanzé
STEP BY STEP
In che modo il confronto delle sequenze nucleotidiche di un gene in specie diverse può fornirci informazioni sulla loro relazione evolutiva?
alla luce dell’evoluzione
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3.17 I genomi contengono indizi sulla divergenza
evolutiva tra esseri umani e scimpanzé
