UN MARCATORE BIOLOGICO PER LA DIAGNOSI DI ABUSO ALCOLICO: CDT

Valeria Crespi, Ursula AndreottaLaboratorio di Tossicologia UO Medicina del Lavoro e PreventivaAO Ospedale di Circolo e Fondazione Macchi Varese

ALCOLISMO

PROBLEMA RILEVANTE IN AMBITO LAVORATIVO CON RIPERCUSSIONI DI TIPO ECONOMICO

PER GLI ELEVATI COSTI SOCIALI:RIDOTTA PRODUTTIVITA’ASSENTEISMOAUMENTO INFORTUNI

PER LA SALUTE

PER LA SICUREZZA DEI LAVORATORI E DEI LORO COMPAGNI DI LAVORO

RUOLO DEL LABORATORIOD’ ANALISI NELL’ABUSO CRONICO

IMPEGNO CRESCENTE NEL TEMPO PER CERCARE DI METTERE A DISPOSIZIONE DEL CLINICO BIO-MARCATORI IN GRADO DI RISOLVERE:

PROBLEMI SIA DIAGNOSTICI CHE PRONOSTICI

INDIVIDUARE I FORTI BEVITORI

MONITORARE I PAZIENTI IN REMISSIONE

IDENTIFICARE LE EPATOPATIE DI ORIGINE ALCOLICA DALLE ALTRE

MARCATORE DIAGNOSTICO IDEALEDI ABUSO ALCOLICO

ESSERE IL PRODOTTO BIOCHIMICO CORRELATO IN MODO SPECIFICO CON LA PRESENZA O CON IL METABOLISMO DELL’ALCOL;

ESSERE DIPENDENTE DAL CONSUMO DI ALCOL;

ESSERE ABBASTANZA SENSIBILE DA PERMETTERE UNA VALUTAZIONE DEI LIVELLI DI CONSUMO ALCOLICO MINIMI CHE SI ASSOCIANO A DANNI FISICI E PSICHICI;

ESSERE CARATTERIZZATO DA UNA CINETICA DI ELIMINAZIONE NOTA, CIOE’ AVERE UN TEMPO DI DIMEZZAMENTO (t 1/2) RELATIVAMENTE BREVE IN MODO DA POTER MONITORARE L’ASTINENZA.

CDT(CARBOYDRATE DEFICIENT TRANSFERRIN) o

TRANSFERRINA DESIALATA

L’INDICATORE BIOLOGICO CDT o TRANSFERRINA DESIALATA SODDISFA I CRITERI RICHIESTI E RAPPRESENTA UNO DEI RELATIVAMENTE RECENTI MARCATORI DI ABUSO ALCOLICO I CUI LIVELLI SIERICI AUMENTANO IN CASO DI CONSUMO ELEVATO DI ALCOL

UN CONSUMO REGOLARE DI 50-80 g DI ALCOL AL GIORNO, CORRISPONDENTE AD UNA BOTTIGLIA DI VINO DA 750 mL di 11°-13°, SPESSO SI TRADUCE IN UN ELEVATO VALORE DI CDT( SENSIBILITA’ > 80% Helander, Department of Clinical Neuroscience,Karolinska Institude,Sweden)

DOPO ASTINENZA, IL TEMPO DI DIMEZZAMENTO (t 1/2) DELLA CDT NEL SIERO E’ DI 10 - 15 GIORNI, CON UNA NORMALIZZAZIONE DOPO 2 – 4 SETTIMANE

ABUSO ALCOLICO

BEVANDE VOLUME g Alcol/gg per 2 settimane che

alterano la CDT

VINO 11° - 13° 0.75 L 60 - 80g

BIRRA 5° 1.5 L 60 - 80g

SUPER ALCOLICI~ 40°

0.20 L 60 - 80g

Grammi di alcol = ( ml di bevanda alcolica x grado x 0.80 )/100

TRANSFERRINA

L’ABUSO ALCOLICO INTERFERISCE NELLA GLICOSILAZIONE DELLA TRANSFERRINA

GLICOPROTEINA DEPUTATA AL TRASPORTO DEL FERRO

COMPOSTA DA UNA CATENA POLIPEPTIDICA DI 679aa

DUE DOMINI CON OGNUNO UN SITO SPECIFICO DI LEGAME PER UNO IONE Fe+++

DUE CATENE COMPLESSE DI N-GLICANI, ACUI IN PARTE E’ DOVUTA LA MICROETEROGENEITA’ DELLA MOLECOLA, CHE TERMINANO NORMALMENTE CON RESIDUI DI ACIDO SIALICO

TRANSFERRINA

Glicoproteina con PM = 79,5 kD

ACIDO SIALICO da 0 a 8 residui

Fe 3+ Fe 3+ COOH

Due catene di glicani bi-,tri- o tetra-ramificateDue siti di legame

per gli ioni Fe3+

Catena polipeptidica di 679 residui amminoacidici divisa in due domini :- N-terminale di 336 aa- C-terminale di 343 aa

H2N

TRANSFERRINA ISOFORMEIN ACCORDO CON IL LIVELLO DI RAMIFICAZIONE, LE DUE CATENE DI N-GLICANI MOSTRANO STRUTTURE BI-TRI- E TETRA RAMIFICATE E OGNI RAMIFICAZIONE TERMINA CON UN RESIDUO DI ACIDO SIALICO.

GASIALO-Tf < 1% MONOSIALO-Tf < 1% DISIALO-Tf < 2%

TRISIALO-Tf 4.5 – 9% TETRASIALO-Tf 70 – 80% PENTASIALO-Tf 12 - 18%

ESASIALO-Tf ~ 2% EPTASIALO-Tf < 2% OTTASIALO-Tf < 1%

CAUSE dell’ AUMENTO DELLA CDT

L’ABUSO CRONICO DI ALCOL PORTA AD UN’ALTERAZIONE NELLA BIOSINTESI DELLA TRANSFERRINA CON RIDUZIONE DELLA GLICOSILAZIONE

Il PROBABILE MECCANISMO E’ L’INIBIZIONE DELLE GLICOTRANSFERASI EPATICHE DA PARTE DELL’ACETALDEIDE PRODOTTA DAL CATABOLISMO DELL’ETANOLO

AUMENTO, ETANOLO DIPENDENTE, DELLE SIALIDASI EPATICHE

INTERFERENZA SUL TRASPORTO DELLE PROTEINE A LIVELLO DELL’APPARATO DEL GOLGI

QUESTE ALTERAZIONI PORTANO AD UN AUMENTO SIGNIFICATIVO DELLE ISOFORME CON BASSE RAMIFICAZIONI COME ASIALO, MONOSIALO E DISIALO TRANSFERRINA

CDT

LA CDT CORRISPONDE ALLE ISOFORME DELLA TRANSFERRINA ASIALO, MONOSIALO E DISIALO.LA MOLECOLA TARGET PER LA STANDARDIZZAZIONE DELLA

CDT E’ LA DISIALO TRANSFERRINA, PRINCIPALE ISOFORMA (WG-CDT,Ingelheim,2006)

RISPETTO AI MARCATORI TRADIZIONALI DI ABUSO CRONICO DI ALCOL (GGT, MCV, ALT e AST), LA CDT HA UNA SPECIFICITA’ MAGGIORE INTORNO AL 95%

LA CDT SI PRESENTA COME UN MARCATORE INDIPENDENTE, A MEDIO TERMINE, NON SOGGETTO A VARIAZIONI CAUSATE DA ALTRE ALTERAZIONI DOVUTE A FARMACI, DIABETE ,OBESITA’, EPATOPATIE E DISORDINI EMATOLOGICI.

AFFIANCATA AI MARCATORI TRADIZIONALI, AIUTA IL CLINICO A DIFFERENZIARE TRA DISORDINI EPATICI DOVUTI AD ASSUNZIONE DI ALCOL O NO

SENSIBILITA’ E SPECIFICITA’ BIOMARCATORI DI ABUSO ALCOLICO

CRONICO

TEST SENSIBILITA’ SPECIFICITA’ EMIVITA

GGT 34 – 85% 20 – 85% 3 – 4 settimane

MCV 40 – 90% 60 - 90 3 mesi

AST ALT

15 – 69%26 – 58%

BassaBassa

2 – 3 settimane

CDT >80% 90 – 97% 2 settimane

ALTRE ISOFORME DELLA TRANSFERRINA e SINDROMI CDG

ESISTONO ALTRE ISOFORME DELLA TRANSFERRINA, OLTRE A QUELLE CITATE:ISOFORME RELATIVE AI LEGAMI CON LO IONE Fe+++

ISOFORME RELATIVE ALLA SOSTITUZIONE DI aa NELLA CATENA POLIPEPTIDICA, LE COSI’ DETTE VARIANTI GENETICHE . NE SONO STATE CARATTERIZZATE CIRCA 40, MA SOLO 3-4 HANNO UNA PREVALENZA NELLA POPOLAZIONE DI CIRCA L’1%

I DISTURBI CONGENITI DELLA GLICOLSILAZIONE, CDG ( CONGENITAL DISORDERS OF GLYCOSILATION ), DOVE, LA MANCATA SINTESI O UN DIFETTO DI SINTESI DI PARTE DELLE CATENE DI CARBOIDRATI, PORTA AD UN AUMENTO DELLE ISOFORME CARENTI IN CARBOIDRATI

APPLICAZIONI DOSAGGIO CDT

SCOPI CLINICIIDENTIFICAZIONE DI POTENZIALI INDIVIDUI A RISCHIO DI ABUSO ALCOLICO;

MONITORAGGIO DI PAZIENTI IN TERAPIA DI RIABILITAZIONE DA TALE ABUSO( SIA PER CONTROLLARE L’ASTINENZA CHE PER INDIVIDUARE LE RICADUTE);

DIFFERENZIAZIONE DI MALATTIA EPATICA DOVUTA AD ASSUNZIONE O NON DI ALCOL;

INDIVIDUAZIONE PAZIENTI AD AUMENTATO RISCHIO DI COMPLICAZIONI POST-OPERATORIE O POST-TRAUMATICHE;

INDENTIFICAZIONE DELLE SINDROMI CDG

APPLICAZIONI DOSAGGIO CDT

SCOPI MEDICO-LEGALI

VALUTAZIONE DELL’IDONEITA’ AL RINNOVO DELLA PATENTE DI GUIDA IN SEGUITO A SOSPENSIONE PER VIOLAZIONE DELL’ART. 186 DEL CODICE DELLA STRADA, IN ASSOCIAZIONE AD ALTRI MARKERS DI ABUSO (GGT, MCV, ALT e AST, BILIRUBINA)VALUTAZIONE IDONEITA’ PER IL RILASCIO DI ALTRI PERMESSI AD ES. PORTO D’ARMI

METODI DI LABORATORIO PER CDT

IMMUNOLOGICI ( DI RCENTE INTRODUZIONE UN TEST BASATO SU REAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO)CE ( CAPILLARY ELECTROPHORESIS)HPLC ( HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

I TEST IMMUNOLOGICI IN GENERE SI BASANO SULLA INIZIALE SEPARAZIONE ATTRAVERSO MICROCOLONNE A SCAMBIO ANIONICO SULLA BASE DEL PI DELLE DIVERSE FRAZIONI E SULLA DETERMINAZIONE IMMUNOCHIMICA DELLE ISOFORME ELUITE.DUE PROBLEMATICHE:

- CHE LA FRAZIONE CDT RACCOLTA CONTENGA ISOFORME NON CDT(TRISIALO E TETRASIALO)

- NON DISTINGUE L’EVENTUALE PRESENZA DELLE VARIANTI GENETICHE CHE POSSONO DARE RISULTATI FALSI POSITIVI NEL CASO DELLA VARIANTE GENETICA DI TIPO D, O FALSI NEGATIVI NELCASO DELLA VARIANTE GENETICA DI TIPO B

METODI DI LABORATORIO PER CDT

LA TECNICA IN ELETTROFORESI CAPILLARE (CE), PERMETTE LA SEPARAZIONE DELLE VARIE ISOFORME DISTINGUENDO SIA I PICCHI RELATIVI AD OGNI ISOFORMA SIA LE VARIANTI GENETICHE. CON QUESTA TECNICA , POTREBBERO VERIFICARSI DELLE INTERFERENZE, ALLA LUNGHEZZA D’ONDA DI LETTURA DI 200 nm, DA PARTE DI ALTRE BIOMOLECOLE CON PI SIMILE ( WG-CDT, Ingelheim, 2006)

LA TECNICA IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA RISOLUZIONE (HPLC) E’ CONSIDERATA IL METODO DI RIFERIMENTO PERCHE’ PERMETTE LA RIPRODUCIBILE SEPARAZIONE E IDENTIFICAZIONE DELLE DIFFERENTI ISOFORME , NONCHE’ DELLE VARIANTI GENETICHE E DELLE ISOFORME ATIPICHE, CAUSA DI NON CORRETTA DETERMINAZIONE DELLA CDT CON METODI IMMUNOCHIMICI.INOLTRE LA MISURAZIONE A 460 nm RENDE IL METODO SENSIBILE E SPECIFICO CON BASSO RISCHIO DI INTERFERENZE( WG-CDT, Ingelheim, 2006)

HPLC-METODO RECIPE

PER LA VALENZA MEDICO-LEGALE DELLE RICHIESTE DEL NOSTRO LABORATORIO, E IN BASE ALLE INDICAZIONI DELLE SOCIETA’ SCIENTIFICHE, LA SCELTA OPERATA E’ STATA QUELLA DELLA TECNICA CROMATOGRAFICA IN HPLC

IL METODO PREVEDE:- SATURAZIONE FERRICA DEL CAMPIONE- INCUBAZIONE PER 30’- CENTRIFUGAZIONE- SURNATANTE INIETTATO NEL CROMATOGRAFO (400uL)- ELUIZIONE A GRADIENTE TERNARIO- COLONNA A SCAMBIO ANIONICO- RIVELAZIONE UV-vis A 460 nm

RISULTATO ESPRESSO COME % CDT RISPETTO ALLA TRANSFERRINA TOTALE

% CDT HPLCCAMPIONE NEGATIVO

1.5% 4.7% 83% 10.8%

% CDT – HPLCCAMPIONE PATOLOGICO con asialo Tf

0.7% 7.5% 4.9% 75.7% 11.2%

% CDT – HPLC VARIANTE GENETICA di tipo D

% CDT- HPLC SINDROME CDG

CASISTICA

VIENE PRESENTATA LA DISTRIBUZIONE DI UNA CASISTICA DI UN CENTINAIO DI PAZIENTI ANALIZZATI DAL NOSTRO LABORATORIO, CON METODO RECIPE IN HPLC. SI TRATTA DI PAZIENTIINVIATI PER LA QUASI TOTALITA’ DALLA COMMISSIONE MEDICA LOCALE PATENTI di GUIDA DI VARESE.

I VALORI DECISIONALI, SONO STATI CALCOLATI ANALIZZANDO 20 CAMPIONI DI NON BEVITORI.IL VALORE DI CUT-OFF RICAVATO È RISULTATO ESSERE DEL 2% .

I CONTROLLI UTILIZZATI, CONFORMI AI DETTAMI DEL WG PER LA STANDARDIZZAZIONE DELLA CDT HANNO DIMOSTRATO DI AVERE UN CV% INTER ASSAY IN LINEA CON LE INDICAZIONI DELLE SOCIETA’ SCIENTIFICHE

CONTROLLO BASSO

Media 1.63%Ds 0.16CV% 9.67%

CONTROLLO ALTO

Media 3.54%Ds 0.22CV% 6.3%

DISTRIBUZIONE DEI VALORI DI CDT DI 110 PAZIENTIN°

PAZI

ENTI

Cut off 2%

0,7-0.8 09 -1.0 1.1 -1.2 1.3 -1.4 1.5-1.6 1.7-1.9 2-2.2 2.4-2.5 2.7-3.4

Media = 1.2Mediana = 1.1 Ds = 0.5Positivi = 8.2%

CDT%