TRATTAMENTO E CONSERVAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE

PER TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA

Lab. Di Biologia della RiproduzioneResp.: Angela Ferri

Laboratorio Biologia della RiproduzioneLaboratorio Biologia della Riproduzione

OSPEDALE SAN CARLOAzienda Ospedaliera Regionale-PotenzaDIP. MATERNO INFANTILEDir.: Dott. Sergio Schettini

SPERMIOGRAMMA

PatologicoNormaleRipetere

Per conferma

RipetereVariabili

Laboratorio Patologico

Variazioni Individuali Anamnesi

Esame obiettivo

Alterazione delLiquido seminale

Azoospermia Dispermia Aspermia

RipetereAlmeno 3 controlli

(Ricerca spermatozoinel sedimento)

Oligo – Asteno – Teratospermia

SpermatozoiNelle urine

si no

Eiaculazioneretrograda

Aneiaculazione

•Permette la valutazione della qualità del seme

•Esame cardine per una corretta diagnostica in

campo seminologico

•Decisivo per l’iter terapeutico della coppia infertile

TESE TESA

SPERMIOGRAMMA

Caratteri Macroscopici

Zone di Spermioagglutinazione

Cellule Germinali

Motilità

ContaNemaspermica

Morfologia

Cellule diSfaldamento

Leucociti

Volume

pH

Viscosità

Aspetto

Fluidificazione

Concentrazione/ml

4 ore

2 ore

Cocentrazione/eiaculato

Forme Normali

Forme Anomale

SPERMIOGRAMMA

VALORI DI RIFERIMENTO

WHO 2000

Leucociti 1×106/ml

pH7.5 – 8.0

Concentrazione 20×106/ml

Volume 2.0 ml

Morfologia* (WHO)

14%(Kruger)

Numero totale diSpermatozoi 20×106/ml

Motilità50%(a+b)

CONDIZIONIPATOLOGICHE

OligozoospermiaConcentrazione

<20×106/ml

AstenozoospermiaMotilità

< 50%(a+b)< 25%(progr.lin.)

TeratozoospermiaMorfologia

<30% forme norm.

SPERMIOGRAMMA

Analisi quantitative Biochimiche

Swelling test

Mar testIBT test

Studio dellaFrammentazione

Eosin test

Indagini Genetiche(Cariotipo,

Delezioni cromosoma Y)

Indagini ormonali(LH,FSH)

PREPARAZIONE DEL LIQUIDOSEMINALE

Razionale:Il liquido seminale deve essere trattato allo scopo di indurre “ in vitro” la capacitazione; solo gli spermatozoi attivati (reazione acrosomiale) saranno in grado di fecondare gli ovociti maturi.

La scelta del metodo deve basarsi sulle caratteristiche del campione:Eliminazione del plasma seminale ed incrementare le forme

dotate di migliore motilità e morfologia;Concentrazione di spermatozoi mobili;Volume;Presenza di elementi e detriti cellulari,agglutinazioni;La scelta della tecnica da utilizzare deve essere:

La meno traumatica per la cellula nemaspermica,La più idonea per il tipo di situazione seminale da affrontare,Selezionare gli spermatozoi con buona motilità aumentandone la

cinetica e conservandola nel tempo,Selezionare gli spermatozoi adatti a fecondare e con un corretto

assetto cromosomico aploide

…..e tener conto della caratteristiche del campione

METODICHE DI PREPARAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE

SWIM – UP(sfrutta la capacità degli

spermatozoi di migrare nel mezzo di coltura)

STANDARD

Da PELLET

Indicate perparametri seminali

normali

GRADIENTI DI DIVERSE DENSITA’(separazione differenziata

per centrifugazione/sedimentazione)

Indicato per alterazioni dei parametri seminaliMEDIO/SEVERE

SPERM WASHING(semplici migrazione degli spermatozooi)

Indicato per alterazioni dei parametri seminali

SEVERE

METODICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA

TECNICHETECNICHE

I° LIVELLO

II°/III° LIVELLO

IUI

GIFT

ICSI

FIVET

La conoscenza degli eventi legati alla capacitazione ed alla fecondazione

Tecniche di preparazione per la PMA

ICSI (TeSE)

E’ consigliata nei casi di:- Infertilità maschile di grado severo;- Azoospermia ostruttiva e secretiva

(spermatozoi testicolari o epididimari);

- Mancata o ridotta fertilizzazione in precedenti cicli di fertilizzazione in vitro (FIV);

- Ovociti scongelati;- Ridotto numero di ovociti;- Seme crioconservato in relazione

alla qualità seminale successiva allo scongelamento.

E’ consigliata nei casi di:- Fattore tubo-peritoneale:

patologia tubarica acquisita o congenita;

- Infertilità maschile di grado moderato;

- Endometriosi di III o IV grado;- Infertilità inspiegata se il

trattamento precedente(IUI) non ha dato risultati;

- Seme crioconservato ;- Fallimento dell’iter

terapeutico di tecniche di I livello

IN QUALI CASI VENGONO CONSIGLIATE LE VARIETECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA

FIVET ICSIVS

FIVET

La La FIVETFIVET consiste nel far consiste nel far entrare in contatto in entrare in contatto in laboratorio (in vitro) i laboratorio (in vitro) i gametigameti femminili (femminili (ovocitiovociti) e i gameti ) e i gameti maschili (maschili (spermatozoispermatozoi) ) eiaculatieiaculati

FertilizzazioneInVitroEmbryoTransfer

ICSIICSI

• Intra

• Cytoplasmatic

• Sperm

• Injection

ovocita Singolo spermatozoo

La ICSI comporta l’iniezione La ICSI comporta l’iniezione

diretta di un singolo diretta di un singolo

spermatozoo all’interno del spermatozoo all’interno del

citoplasma ovocitario.citoplasma ovocitario.

TECNICHE DI PREPARAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE DOPO Te.S.E.

Recupero del frammento testicolare;Dissezione con 2 vetrini sterili;Verifica al microscopio;Centrifugazione;Coltura degli spermatozoi in terreno

tamponato;Eventuale congelamento (non

concomitanza pick-up);

CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI

La motilità dello spermatozoo è un indicatore di vitalità Se non vi sono spermatozoi mobili: Swelling Test con utilizzo degli stessi per Icsi

Uso della Pentoxifillina:riconoscimento degli spermatozoi vitali tra quelli immobili inducendone la motilità. La qualità dello spermatozoo microiniettato è determinante nei processi di fertilizzazione e divisione embrionaria cosi come nella trasmissione di eventuali anomalie genetiche o cromosomiche. Solo gli spermatozoi che hanno completato la maturazione cellulare (citoplasmatica e nucleare) sono in grado di legarsi al terreno di coltura a base di ACIDO IALURONICO (HA). Una goccia di liquido seminale (1-2ul), concentrato secondo l’abituale protocollo di laboratorio, viene deposta in modo da toccare la goccia di HA.

PVP

Terreno tamponato per alloggiare gli ovociti

Terreno tamponato + pentoxifillina

spermatozoi migrati sul bordo della goccia

METODO CON PENTOXIFILLINA

Sperm slow

Zona d’intersezione

spermatozoi

Terreno contenenti ovociti

METODO CON ACIDO IALURONICO

L’Acido Ialuronico (HA) ricopre un ruolo fondamentale nella selezione degli spermatozoi .Gli spermatozoi maturi posseggono una glicoproteina di membrana,detta PH20, che svolge un ruolo bifunzionale: prima della reazione acrosomiale presenta attività ialuronidasica consentendo l’attraversamento delle cellule del cumulo, dopo la reazione acrosomiale interviene nel legame secondariotra lo spematozoo e la zona pellucida.

CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI

Un metodo alternativo per selezionare gli spermatozoi per la ICSI è rappresentato dalla valutazione della morfologia spermatica ad altissimo ingrandimento (IMSI). Mediante sistemi di amplificazione d’immagine digitali in combinazione con specifici obiettivi (6600x), è possibile osservare gli spermatozoi ad alto ingrandimento permettendo così di esaminare la morfologia degli organelli spermatici(acrosoma,nucleo,mitocondri, cappuccio,coda….); Motile Sperm Organellar Morphology Examination (MSOME).

CRITERI DI SELEZIONE DEGLI SPERMATOZOI

• Uno spermatozoo mancante di solo uno di questi organelli viene escluso dalla inseminazione.

• La normale morfologia dell’intera cellula spermatica è stata correlata positivamente con i tassi di fertilizzazione e di gravidanza rispetto all’ICSI tradizionale.(B.Bartow et al.2003)

• La microiniezione di spermatozoi vacuolizzati sembra ridurre il tasso di gravidanza ed è associato ad aborti precoci.

• Indicazioni all’IMSI: ripetuti fallimenti di ICSI convenzionale

LA CRIOCONSERVAZIONE DEL LIQUIDO SEMINALE

Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme:

La crioconservazione di liquido seminale rappresenta una valida tecnica alternativa di autoconservazione( previo congelamento in azoto liquido a -196 C°) le cui finalità sono rivolte a:

Prevenire la sterilità

Eseguire una Fecondazione

assistita

E’ possibile crioconservare

Liquido Seminale

Prelievo bioptici testicolari

Spermatozoi da prelievo epididimario

Programma

Gestione pazienti

Gestione interna

Pz che accedono alla Banca del Seme

Analisi da effettuare pre-criocons.

Consensi informati per la gestione del paziente e del seme crioconservato

Tempo di durata del deposito del seme

Materiali e metodi

FASE PRE-CONGELAMENTOFASE PRE-CONGELAMENTO

Esecuzione dello spermiogramma per la valutazione delle Esecuzione dello spermiogramma per la valutazione delle

caratteristiche del seme (numero, morfologia, motilità e vitalità) caratteristiche del seme (numero, morfologia, motilità e vitalità) Il paziente deve sottoporsi ad alcuni esami sierologici per evidenziare Il paziente deve sottoporsi ad alcuni esami sierologici per evidenziare

l’eventuale presenza di patologie infettive in atto (HBV, HCV, HIV, l’eventuale presenza di patologie infettive in atto (HBV, HCV, HIV,

VDRL). VDRL).

Medium di coltura Medium di coltura sperm freezing sperm freezing (glicerolo)(glicerolo)

Cryovials o vials da Cryovials o vials da 1,8 ml idonei al 1,8 ml idonei al congelamentocongelamento

Provette steriliProvette sterili Guanti criogeniciGuanti criogenici Occhiali di Occhiali di

protezioneprotezione

Cappa a flusso laminareCappa a flusso laminare CentrifugaCentrifuga Cane (stecche portafiale Cane (stecche portafiale

in alluminio)in alluminio) Tank o criobanca Tank o criobanca

(contenitore criobiologico (contenitore criobiologico in alluminio, che viene in alluminio, che viene costantemente alimentato costantemente alimentato ad Azoto Liquido)ad Azoto Liquido)

STRUMENTISTRUMENTI

Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme

Tipologia pazienti

Pz affetti da patologie che necessitano di terapie inducenti danni alla spermatogenesi (patologie neoplastiche, autoimmuni, ecc.)

Pz affetti da patologie che necessitano di interventi chirurgici all’apparato uro-genitale che possono ledere la funzione eiaculatoriaSoggetti che si sottopongono a vasectomia

Soggetti che per motivi di lavoro sono esposti a sostanze potenzialmente genotossiche.Pz con OAT che presentano transitori miglioramenti della qualità del semePz che mostrano un severo e progressivo peggioramento della qualità del seme

Pz criptozoospermici

Pz che hanno difficoltà a raccogliere il liquido seminale il giorno del prelievo ovocitario (difficoltà psicologiche o logistiche)

Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme

GESTIONE DEL

PAZIENTERequisiti

Età

Terapie

Raccolta

Astinenza

Analisi

Accertamento d’identità

Terapia antiblastica e radioterapia induttori di

danno genotossico

Crioconservazione

PrimaDopo due anni

dalla fine

Nel caso di utilizzo di farmaci che non agiscono

sul ciclo cellulare

Crioconservazione

Dopo tre mesi dalla Fine del trattamento

GESTIONE DEL

PAZIENTE

Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme

MarkersInfettivologici

Epatite B

Epatite C

Citomegalovirus

HIV

HBsAg (Antigene Australia)

HBsAb (Anticorpi anti HBs)

Anticorpi anti – HCV

HCV-RNA Qualitativo (nel caso di anticorpi

positivi)

Anticorpi anti IgG

Anticorpi anti IgM

Anticorpi anti - HIV

No crioconservazione

di liquido seminale o di tessuto testicolare in assenza di markers infettivologici

per pazienti infettivi se la banca non è attrezzata con

percorsi e contenitori dedicati ad ogni singolo virus

Linee guida per la corretta gestione della Banca del Seme

GESTIONE DEL

PAZIENTE

CONSENSI INFORMATI

E’ necessario un consenso per ogni campione seminale crioconservato

Per il rinnovo della crioconservazione

Per l’eliminazione del campione

Per il ritiroDi una o

più paillettes

Di tutto ilcampione

CONCLUSIONI

LIQUIDOSEMINALE

Diagniostica(relazionata

studio partner)Valutazione

Applicazione di Tecniche Selettive

In base alla Tecnica

IUI

ICSI

FIVET

Eventuale Crioconservazione

Gradienti

Swim - up

Lavaggio

HA

Pentoxifillina

IMSI

LA LEGGE 40/2004 DEL CODICE CIVILE ITALIANO IMPONE CHE NON PIU’ DI TRE OVOCITI POSSONO ESSERE FECONDATI AL FINE DI OTTENERE UN NUMERO MASSIMO DI TRE EMBRIONI, IN RELAZIONE A QUESTA CONDIZIONE E’ IMPORTANTISSIMA LA SELEZIONE DEGLI UNICI TRE OVOCITI E LA SELEZIONE DEI MIGLIORI SPERMATOZOI.

VALUTAZIONE CLINICA DI ALCUNE CONDIZIONI SPECIFICHE ALLA LUCE DELLA SENTENZA DELLA CORTE COSTITUZIONALE DEL I° APRILE 2009

(sent. n°151 pubblicato su GURI del 13 maggio 2009)

ORA