Tesi morena coricciati

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PAVIA

Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “L. Spallanzani”

Laurea Magistrale in Biologia Sperimentale e Applicata

Dipartimento di Scienze del Farmaco

DETERMINAZIONE DEL PROFILO METABOLICO DI

VINI BARBERA IN PUREZZA DELL’OLTREPÒ

PAVESE

Relatore:

Dott.ssa Maria Daglia

Correlatori:

Prof.ssa Ornella Pastoris

Dott.ssa Alessandra Leoni

Tesi Sperimentale di

Morena Coricciati

Anno Accademico 2013/2014

2

Ai miei genitori e i miei nonni.

3

INDICE

PARTE COMPILATIVA

1 VITI E IDENTITA’ 5

1.1 I VITIGNI 5

1.2 IL TERRITORIO 6

1.3 BARBERA STORIA E TRADIZIONE 8

1.3.1 AMPELOGRAFIA E FENOLOGIA 11

2 POTENZIALE NUTRACEUTICO DEL VINO 12

2.1 I POLIFENOLI 13

2.2 FLAVONOIDI ( C6–C3–C6 ) 14

2.3 ANTOCIANINE 15

2.4 FLAVANOLI 16

2.5 FLAVONOLI 17

2.6 I NON FLAVONODI 18

2.7 ACIDI FENOLICI 19

2.8 GLI ACIDI IDROSSICINNAMICI (HCA) 19

2.9 GLI STILBENI 20

PARTE SPERIMENTALE

3 INTRODUZIONE 22

4 CLONI 24

5 MATERIALI E METODI 28

6 RISULTATI E DISCUSSIONE 29

DATI ANALITICI

7 CONCLUSIONI 51

8 BIBLIOGRAFIA 58

9 ALLEGATO 62

4

Parte Compilativa

5

1 VITI E IDENTITA’

Nella concezione attuale del vino i vitigni autoctoni o tradizionali rappresentano un

patrimonio culturale locale che si presenta originale e unico. L’interesse per i vitigni

autoctoni, (ovvero tutti tranne quelli provenienti da altre nazioni o ottenuti per incrocio), è

aumentato, e si pone pertanto il problema di saper utilizzare un patrimonio biologico

complesso. Il Ministero delle Politiche Agricole, Alimentari e Forestali ha istituito, per la vite,

dei registri che elencano le varietà di vite coltivate in alcuni importanti Paesi viticoli

mediterranei, come Italia, Francia, Grecia e Spagna. Secondo questi dati, aggiornati al 2000-

2002, i vitigni da vino ufficialmente registrati nel nostro Paese, sono circa il doppio di quelli

catalogati in Francia e in Grecia e quasi il triplo di quelli riportati per la Spagna. L’Italia, tra i

numerosi altri Paesi viticoli europei, è forse il più ricco di “ampelo-diversità”. Infatti sono

stati censiti circa 2000 vitigni, alcuni dei quali sono rari e in via di abbandono e sono stati

recuperati negli ultimi 15 anni nella sola Italia Nord-Occidentale1. Le ragioni sono molteplici,

ma tra le principali va ricordata la frammentazione dell’Italia che è un territorio

orograficamente complesso, formato da ambienti spesso molto diversi, la frammentazione

socio-economica e politica italiana, ma soprattutto la posizione geografica della penisola che,

protesa al centro del Mediterraneo, è sicuramente servita da ponte, da zona di passaggio tra

Nord e Sud, tra Est ed Ovest, per le diverse specie mediterranee e per le loro varietà, portate

dai numerosi popoli che hanno occupato o percorso il nostro Paese.

1.1 I VITIGNI

L’uva è prodotta da piante appartenenti al genere Vitis. Sistematicamente la famiglia delle

Vitacee appartiene al regno delle Plantae, Philum Magnoliophita, Classe Magnoliopsida,

Ordine Rhamnales. Il genere Vitis viene suddiviso in due sottogeneri principali dal punto di

vista tassonomico, entrambi diploidi, Muscadinia ed Euvitis: al primo appartengono le viti

con corredo cromosomico 2n = 40 mentre al secondo quelle con 2n = 38, che vengono

suddivise in base alla loro origine di coltivazione. Mentre il sottogenere Euvitis è stato trovato

nei depositi del Terziario sia in Asia sia nel Nord America, il sottogenere Muscandinia emerge

soltanto tra i materiali fossili del Nord America, il che suggerisce che questa divisione si sia

verificata prima del Quaternario cioè circa due milioni di anni fa. Sembra che la famiglia delle

Vitacee sia comparsa sulla terra circa 140 milioni di anni fa, ma in seguito alle glaciazioni

molte specie di viti si estinsero. La Vitis vinifera si salvò nell’area pontica tra il Caucaso, il

Mar Caspio e il Mar Nero, oggi è coltivata in tutto il mondo. A sua volta essa si distingue in 2

sottospecie una coltivata chiamata Vitis sativa e una selvatica chiamata Vitis sylvestris2. Il

genoma di Vitis vinifera presenta 38 cromosomi a corredo diploide (2n=38) per un totale di

6

487 Mb equivalenti a circa 30.000 geni3. I fattori genetici propri di un vitigno sono tra gli

aspetti che incidono più fortemente sulla composizione delle uve. Lo studio del DNA

attraverso marcatori come i microsatelliti o SSP (Simple Sequence Repeats) permette di

individuare il profilo genetico per ogni varietà. Questo ha permesso di tracciare geneticamente

i vitigni e identificarli, in modo da evitare eventuali truffe nel mercato del vino.

1.2 IL TERRITORIO

L’Oltrepò pavese, è una delle principali aree vitate italiane e rappresenta circa il 3% della

superficie nazionale e 75% della produzione di vino.

La viticoltura in quest’area rappresenta il fulcro della produttività agricola del territorio e

traina da decenni l’economia dell’area. Il territorio della provincia di Pavia è formato da tre

aree geografiche: il Pavese, la Lomellina e l’Oltrepò4. Quest’ultima si estende su una

superficie di 1099 Km2

confina a est con l’Emilia Romagna (provincia di Piacenza), a ovest

con il Piemonte (provincia di Alessandria) e a sud con la Liguria. La provincia di Pavia è

attraversata da est a ovest dal fiume Po; l’ Oltrepò Pavese è la regione delineata dal fiume a

nord, che si spinge fino all’Appennino Ligure. Questo territorio, a pochi chilometri dal Po

presenta una fascia collinare che ben si presta, come clima ed esposizione alla coltivazione

della vite. (Figura1).

Figura 1 -Cartina della Lomellina, del Pavese e dell’Oltrepò Pavese.

Qui infatti la coltivazione della vite risale almeno all’epoca etrusca e può essere seguita, nella

sua evoluzione dall’antichità al medioevo e lungo tutta l’età moderna.

Negli ultimi secoli l’attività vitivinicola ha acquisito una presenza tale da caratterizzare in

modo specifico la zona.

Nella relazione dell’Inchiesta Agraria, altrimenti nota come inchiesta Jacini, avviata con legge

7

del 15 marzo 1877, l’Oltrepò pavese è già riconosciuto per la sua attività vitivinicola, estesa

su circa 15000 ettari, con una produzione di 570.000 quintali di uva.

La descrizione contenuta nel rapporto per l’Inchiesta Agraria, tuttavia, si colloca in un

contesto temporale molto particolare perché caratterizzato da una crisi, originata da fattori di

natura ambientale ed economica, che raggiungerà il suo culmine all’inizio del Novecento. Un

primo momento di difficoltà venne registrato dopo la metà del XIX secolo con la diffusione

dell’oidio e della peronospora che colpirono a più riprese le viti dell’area fino verso la fine del

secolo. Alla fine degli anni Novanta, apparve nell’area la fillossera, e in pochi anni distrusse

la produzione viticola dell’Oltrepò. Se infatti nel 1900 la produzione di vino della zona era

pari a 600.000 ettolitri, frutto di una coltivazione estesa su circa 20.000 ettari di terreno, solo

cinque anni dopo, a parità di superficie, la produzione si era ridotta di oltre il 30%, mettendo

in crisi l’intero settore. La fillossera non fu l’unica responsabile della crisi di inizio

Novecento. La produzione di vino dell’Oltrepò era messa in difficoltà anche dalle

trasformazioni economiche e sociali italiane che esponevano la regione a una concorrenza più

ampia. Nei primi decenni del Novecento il prezzo dell’uva subì un calo molto significativo

nell’area che raggiunse il culmine nel biennio 1907-08. Il nuovo contesto economico

richiedeva una differente organizzazione produttiva che permettesse di tutelare i piccoli

produttori della zona. Fu in questo contesto che nacquero le Cantine sociali, forme societarie

che rappresentano ancora oggi, un elemento fondamentale per lo sviluppo della viticoltura in

Oltrepò ed esprimono l’interazione tra elementi di natura economica, sociale e culturale.

Il successo della viticoltura nell’Oltrepò Pavese nel corso del Novecento dipese anche

all’equilibrio che la società locale aveva saputo costruire tra il consolidamento di una rete di

piccoli produttori fortemente radicati nel territorio e il processo di progressiva

specializzazione volto a impostare un approccio industriale alla viticoltura avviato già prima

del primo conflitto mondale. Effetti principali di questo fenomeno furono la riduzione del

numero dei vitigni a favore di poche qualità che garantivano una produzione maggiore o più

continua. È in questa fase che inizia il calo di alcune varietà tipiche della zona a favore dei

quattro vitigni che ancora oggi coprono la quasi totalità della produzione della zona: Croatina,

Barbera, Pinot, e Riesling.

La produzione di Barbera venne incrementata in conseguenza alla resistenza all’oidio e alla

abbondante resa e semplicità di vinificazione6. Oggi il Barbera è predominante nell’Oltrepò

centro-occidentale (2839 ettari).

Con l’istituzione della Denominazione di Origine Controllata D.O.C. (Dpr, 12/07/1963, n.

930, pubblicato in G.U. n. 188, 15/07/1963) il territorio pose le basi per adeguarsi ai tempi e

nel 1970 nacque ufficialmente la D.O.C. Oltrepò Pavese, con il 98.72% di coltura

8

specializzata in collina5. Nel 1961 nacque il “Consorzio di Tutela dei vini tipici e pregiati

dell’Oltrepò Pavese” che identificò la zona collinare come l’unica adatta a dare uve di pregio

ai fini della vinificazione.

Nel DPR 8/8/2007, art.3, vengono fissati i criteri relativi alla configurazione del vigneto, e di

conseguenza le condizioni accettabili nel caso di produzioni di vino monovitigno, considerato

in purezza, anche per la concessione della DOC, quando la superficie vitata è rappresentata da

un solo vitigno per almeno 85 % della sua area.

1.3 BARBERA STORIA E TRADIZIONE

Barbera è il nome di un vitigno piemontese diffuso per la maggior parte nella zona tra Asti e

Casale Monferrato, ma anche largamente coltivato in molte zone lombarde con eguale

successo (Figura2).

Figura 2-Distribuzione nazionale del Barbera.

Il Barbera è identificato da Giuseppe Aldo di Ricaldone, studioso di antichi documenti del

Monferrato, con un certo vitigno denominato “Berbexinis”, citato in un atto del 1249, nel

quale viene narrato che la Chiesa di Sant’Evasio di Casale affittò un terreno a tale Guglielmo

Crova con l’obbligo di impiantarvi “bonis vitibus berbexinis”. Secondo altri studiosi, il nome

Barbera deriva dalla trasformazione del lombardo “albéra” e del latino “albuelis” con

accostamento al nome di luogo Barberi, frazione di Villafranca Sabauda in provincia di

Torino. Il Barbera vanta citazioni sul territorio dell’ Oltrepò sin dai primi del 1800 e oggi è

uno dei vitigni più coltivati. La Denominazione di Origine Controllata risale al 19707. Il

Barbera appare nel 1798, alla stesura della prima ampelografia dei vitigni coltivati sul

9

territorio piemontese compiuta dal conte Nuvolone, sotto il nome di “Vitis vinifera

Montisferratensis”.

Tale denominazione si doveva al nome storico della regione collinosa, Monferrato, ancora

oggi centro principale di coltivazione del vitigno Barbera. Probabilmente la varietà di uva

Barbera è nata da uno spontaneo incrocio di semi di vitigni più antichi. E’ certo però, che le

origini del vitigno Barbera sono antichissime, anche se i documenti che ne danno

testimonianza risalgono solamente a qualche secolo fa. Infatti, la prima traccia ufficiale del

Barbera si trova in un documento del XVIII secolo conservato nel municipio di Nizza

Monferrato. Il primo merito al Barbera è raccontato da Paolo Diacono secondo il quale nella

battaglia di Refrancore del 663, le schiere dei Longobardi di Grimaldo batterono i Franchi

dopo averli ubriacati con vino delle cantine vicine. Si racconta infatti che per l’occasione i

Longobardi riempirono di questo vino numerosissime anfore che disseminarono

appositamente per i campi. Queste servirono da richiamo per i Franchi i quali le svuotarono

avidamente. Oggi il vino Barbera rappresenta circa il 50% dell’intera produzione viticola del

Piemonte. Si può affermare, infatti, che il Barbera è il vino del Piemonte per antonomasia al

punto tale da immedesimarsi con l’immagine vinicola della Regione.

Il vitigno è meno antico di altri coltivati da sempre in Piemonte (Moscato, Grignolino,

Nebbiolo), ma la sua espansione è stata costante nei secoli. Le ragioni storiche della scelta di

questa coltivazione da parte dei viticoltori sono dovute al fatto che si tratta di un vitigno

"rustico" con notevole capacità vegetativa, che offre elevata produzione di grappoli ed è meno

soggetto di altri alle mutevoli condizioni climatiche della zona e agli attacchi dei parassiti e

delle muffe cui è soggetta la pianta. Le prime notizie certe di uve "barbera" risalgono attorno

al 1700, in documenti che riguardano la sua coltivazione nella zona di Montegrosso d'Asti,

anche se è probabile che la varietà esistesse già da molto tempo ma non fosse conosciuta con

questo nome. Il successo di questo vitigno fu immediato, si propagò rapidamente in quasi

tutto il Piemonte aiutato dal disastro provocato dalla fillossera, che costrinse i viticoltori a

reimpiantare completamente i vitigni distrutti, innestandoli "viti americane" più resistenti e

abbandonando molte varietà più delicate, alcune ormai completamente scomparse, altre

sopravvissute in pochissimi filari e poi "riscoperte" in epoca recente: i casi più noti sono

quelli dell'Arneis e del Favorita. Sebbene nell'ultimo trentennio molte zone tradizionali della

Barbera, come il nord astigiano e il casalese, abbiano perso notevoli superfici vitate, causa

l'industrializzazione e l'abbandono delle campagne, nel solo Monferrato il vitigno Barbera è

coltivato su quasi 15mila ettari di terreno collinare. Estensioni meno elevate ma significative

si trovano anche nell'albese, nei Colli Tortonesi e nell'Oltrepò Pavese, mentre in altre parti del

Piemonte la presenza è più marginale8. Nel 1997 sono stati rilevati dall'Albo vigneti D.O.C.

10

2.407 ettari di Barbera nell'Oltrepò Pavese, che rappresentano il 25,7% della produzione

totale di vini D.O.C di quest'area (Tabella1).

1. Alba 2. Albugnano

3. Barbera d'Alba 4. Barbera del Monferrato

5. Bonarda dell'Oltrepo' Pavese 6. Botticino

7. Buttafuoco dell'Oltrepo' Pavese o Buttafuoco 8. Canavese

9. Casteggio 10. Castel san Lorenzo

11. Cellatica 12. Colli Bolognesi

13. Colli d'Imola 14. Colli di Parma

15. Colli Piacentini 16. Colli Romagna Centrale

17. Colli Tortonesi 18. Collina Torinese

19. Colline Novaresi 20. Colline Saluzzesi

21. Gabiano 22. Garda

23. Gutturnio 24. Langhe

25. Monferrato 26. Oltrepo' Pavese

27. Piemonte 28. Pinerolese

29. Riviera del Garda Bresciano o Garda Bresciano 30. Rosso di Cerignola

31. Rubino di Cantavenna 32. San Colombano al Lambro o san

Colombano

33. Sangue di Giuda dell'Oltrepo' Pavese o Sangue

di Giuda 34. Sannio

35. Valsusa

Tabella 1-Elenco dei nomi commerciali dei vini Barbera D.O.C.

Secondo i dati ISTAT la vendemmia 2013 in Lombardia è stata molto abbondante come nel

resto d’Italia ma la proporzione con il passato non è così eclatante: rispetto all’anno

precedente ISTAT registra un incremento produttivo del 6% contro il +18% del dato

nazionale. Il raggiungimento della qualità si sta perseguendo ultimamente attraverso

l’intensificazione dell’uso delle IGT, mentre la proporzione tra vini bianchi e rossi sembra

essersi stabilizzata vicino alla parità (Figura3).

Figura 3-Dati produzione vino ISTAT.

11

La produzione in Lombardia è cresciuta del 6.5% nel 2013 a 1.3 milioni di ettolitri, il dato

simile alla media 2008-2012, questa regione ha rappresentato nel 2013 circa il 3% della

produzione nazionale di vino.

Dal punto di vista qualitativo, ulteriori progressi sono stati messi a segno. Soltanto il 14% dei

vini lombardi manca di denominazione DOC o IGT. Il vino “non più comune” si è riversato

nelle IGT e non nelle DOC: la produzione di vini IGT cresce del 15% a 403mila ettolitri, il

livello più elevato mai raggiunto in Lombardia e rappresenta oggi il 31% della produzione

totale il 35% sopra la media storica. La produzione di vini DOC è invece cresciuta del +6%.

Per quanto riguarda le superfici vitate, queste sono cresciute del 3% a 21452 ettari nel 2013.

Concentrate a Pavia, Brescia e Bergamo i dati in crescita, perdono ettari Sondrio, Bergamo e

Cremona.

1.3.1 AMPELOGRAFIA E FENOLOGIA

Il vitigno Barbera appartiene alla Vitis Vinifera L.. Il germoglio dell’uva Barbera è ad apice

espanso, verde chiaro quasi biancastro, parzialmente carminato, aracnoideo sugli orli, con

foglioline apicali spiegate, poco tomentose sulla pagina superiore, con peli striscianti molto

fitti su quella inferiore (Figura4). La foglia adulta è media, pentagonale, quinquelobata, con

seno peziolare a lira, per lo più chiuso, a volte con bordi sovrapposti. La pagina superiore è

glabra, quella inferiore invece tomentosa (Figura5). Il grappolo è medio, spesso piramidale,

più raramente cilindrico, compatto (Figura6).

Figura 6-Grappolo di Barbera.

Figura 4-Foglia di Barbera

Figura 5-Apice di Barbera

12

L’acino è medio, ellissoidale, con buccia pruinosa, sottile, di colore blu intenso. La polpa

succosa, dolce e acidula. La fioritura avviene normalmente nella prima decade di giugno,

l’invaiatura avviene per lo più verso la metà di agosto. La vendemmia della Barbera si svolge

ai primi di ottobre. Questo vitigno è sensibile a gelate, brinate e anche a malattie

crittogramiche come l’oidio e agli attacchi di botrite. La Barbera è un vitigno di buona vigoria

che richiede terreni collinari argillosi calcarei. La produzione è costante e relativamente

abbondante9.

2 POTENZIALE NUTRACEUTICO DEL VINO

I composti ad attività nutraceutica sono sostanze alimentari che hanno caratteristiche

benefiche e protettive nei confronti della salute sia fisica, sia psicologica dell'individuo. Il

vino, in particolare quello rosso, è uno degli alimenti più ricchi di nutraceutici grazie alla

presenza di differenti polifenoli.

Ai polifenoli sono attribuite diverse proprietà benefiche, tra le quali:

azione antiossidante: essi proteggono le cellule dai danni causati dai radicali liberi, che si

sviluppano con il normale metabolismo cellulare e a causa di eventi come radiazioni, fumo,

agenti inquinanti, raggi UV, stress emotivo e fisico, additivi chimici attacchi virali e

batterici ecc.

azione anticancerogenica: in quanto hanno un impatto sullo step di iniziazione dello sviluppo

del cancro, proteggendo le cellule contro l'attacco diretto da carcinogeni o alterando il loro

meccanismo di attivazione. Tale attività è stata dimostrata con sperimentazioni in vitro e i dati

ottenuti da studi in vivo su animali da esperimento o sull’uomo sono ancora contraddittori.

Influenza sui fattori di rischio delle malattie cardiovascolari: quali aumento delle HDL (capaci

di rimuovere il colesterolo in eccesso dai tessuti periferici), e diminuzione del fibrinogeno

plasmatico e dell’aggregazione piastrinica.

azione antinfiammatoria: effetto inibitorio sulla cascata dell' acido arachidonico.

azione antibatterica e antivirale.

I flavonoidi esercitano attività antimicrobiche, antiallergiche, antiaggregante,

antinfiammatoria, antitumorale e antiossidante. Appartengono a questa classe di composti le

antocianine, che oltre ad avere un’azione antiossidante, antinfiammatoria agiscono contro i

processi neurodegenerativi, i flavan-3-oli e i flavonoli, importanti nei processi di

pigmentazione dell’uva.

Tra i non flavonoidi troviamo invece: gli acidi fenolici che danno una maggior stabilità al

13

vino; gli acidi idrossicinnamici con azione anti-mutagena e anticancerogena e gli stilbeni. Di

quest’ultimo gruppo fa parte il resveratrolo, fitoalessina prodotta dalla pianta in risposta agli

stress biotici e abiotici.

Questo composto possiede attività antiossidanti, antinfiammatorie, antiaggreganti, tutti

risultanti in effetti cardioprotettivi e stimolanti la produzione di NO endoteliale. Inoltre svolge

un ruolo protettivo contro malattie neurodegenerative quali il morbo di Alzheimer e il morbo

di Parkison.

2.1 I POLIFENOLI

I polifenoli sono una grande famiglia di metaboliti secondari prodotti dalle piante presenti

negli alimenti e bevande che giocano un ruolo importante sia nella fisiologia dei vegetali

(pigmentazione, crescita, riproduzione, protezione dai parasiti…) sia sulla salute umana. Ai

polifenoli sono attribuite proprietà antiossidanti, battericide e protettive nei riguardi delle

malattie cardiovascolari. I polifenoli presentano un anello benzenico sostituito da uno o più

gruppi idrossilici (-OH) (Figura7).

Figura 7-Struttura generica dei flavonoidi.

In base alla struttura chimica i polifenoli sono classificati in due gruppi: flavonoidi e non

flavonoidi. L’uva contiene composti non flavonoidi soprattutto nella polpa dell’acino, mentre

i flavonoidi sono contenuti nella buccia e nei semi. I flavonoidi presentano una struttura

comune data da uno scheletro chimico, detto scheletro di difenilpirano, costituito da due anelli

di benzene (anello A e B) uniti da un anello piranosico chiuso (anello C) (Figura8).

Figura 8-Scheletro di difenilpirano

14

Essi possono trovarsi in forma libera o possono legarsi ad altri flavonoidi, zuccheri o non

flavonoidi10

. Attualmente sono stati individuati 400 flavonoidi in frutta, verdura e bevande di

origine vegetale come tè, cacao e vino, e la lista è in costante crescita. Questi composti

possono essere a loro volta suddivisi, in base allo stato di ossidazione dell'anello piranosico

centrale in sei sottoclassi: Flavonoli, Flavoni, Flavanoni, Antociani, Flavanoli e Isoflavoni. La

classe dei non flavonoidi comprende gli acidi fenolici, derivati dell'acido benzoico (Figura9),

come l’acido gallico e l’acido protocatechico, e derivati dell’ acido cinnamico (Figura10),

che consistono principalmente di acido cumarico, caffeico e ferulico; seguiti dagli stilbeni, tra

i quali il più rappresentativo è il resveratrolo, che esiste nelle forme isomeriche cis e trans.

Figura 9-Acido benzoico Figura 10-Acido cinnamico

I polifenoli sono presenti nei tessuti vegetali principalmente come glicosidi, associati a vari

acidi organici o polimerizzati a formare complessi ad alto peso molecolare, come i tannini11,12

.

Nel corso degli ultimi 20 anni, tali composti sono stati oggetto di studio per il loro potenziale

coinvolgimento nella prevenzione di malattie croniche, quali malattie cardiovascolari, cancro,

osteoporosi, diabete mellito, e malattie neurodegenerative. La loro azione protettiva è stata

attribuita inizialmente alle loro proprietà antiossidanti, alla capacità di inibire o ridurre

differenti enzimi, come la telomerasi13

e ciclossigenasi14,15

o lipossigenasi16,17

e di recente,

all'interazione con le vie di trasduzione del segnale18,19

. Inoltre, è stata ampiamente studiata

l'attività antimicrobica di polifenoli contro una vasta gamma di microrganismi presenti negli

alimenti di origine vegetale e nelle piante medicinali. Tra i polifenoli, i flavan-3-oli, i

flavonoli e i tannini hanno ricevuto più attenzione per la spiccata attività antimicrobica

rispetto ad altri polifenoli.

2.2 FLAVONOIDI ( C6–C3–C6 )

I flavonoidi possiedono uno scheletro generale C6-C3-C6, in cui le due unità C6 (anello A e

anello B), di natura fenolica, sono legate da una catena di 3 atomi di carbonio (o anello C)

(Figura11).

15

Figura 11-Formula di struttura di un flavonoide

I flavanoli o flavan-3-oli sono comunemente chiamate catechine e costituiscono il gruppo di

flavonoidi più abbondanti nel mondo vegetale.

I flavonoidi assorbono fortemente le radiazioni UV e il loro accumulo nelle pagine delle

foglie è in relazione con il ruolo protettivo dal danno che queste radiazioni causano al DNA

delle cellule. Nell'uomo invece esercitano attività antimicrobiche, antiallergiche,

antiaggregante, antinfiammatorio, antitumorale e antiossidante.

2.3 ANTOCIANINE

Le antocianidine sono pigmenti idrosolubili responsabili della colorazione rossa, blu e viola

nella maggior parte di fiori, frutta, ortaggi e alcune varietà di cereali come il riso nero. Nelle

piante esistono principalmente nella forma glicosidata di antocianine e il 90% è rappresentato

da: delfinidina, pelargonidina e cianidina20

. Le antocianine sono costituite da due anelli

benzenici uniti mediante un anello eterociclico e presentano a seconda dell’antociano,

sostituenti -OH ai vertici degli anelli benzenici o dell’anello eterociclico. Sono note più di 500

antocianine che differiscono per l’idrosilazione, la metilazione dell’anello B o dalla

glicosilazione con differenti zuccheri21,22

(Figura12). Il colore degli antociani è pH-

dipendene, rosso in acido e blu in ambiente basico ma può dipendere anche dal grado di

idrossilazione metilazione e glicossilazione.

Figura 12–Struttura delle principali antocianine

16

Questi polifenoli giocano un ruolo importante nell’impollinazione e nella protezione dalle

radiazioni UV. Nell’uomo svolgono un’azione antiossidante, antinfiammatoria e inibiscono

alcune cellule tumorali. Riguardo al loro potenziale effetto positivo contro i processi

neurodegenerativi, diversi studi suggeriscono che tali composti riescono ad attraversare la

barriera emato-encefalica e a localizzarsi in aree deputate all’apprendimento e alla memoria,

migliorando le funzioni cognitive23

.

2.4 FLAVANOLI

I flavan-3-oli sono la più grande sottoclasse di flavonoidi costituiti da monomeri, oligomeri e

polimeri (Figura13). Si trovano nella parte solida dell’uva (buccia, semi e steli) in forma

monomerica o polimerica. Le unità fondamentali di tali composti sono quattro monomeri:

catechina, epicatechina, gallocatechina ed epigallocatechina24

. Catechina ed epicatechina

possono formare polimeri, che sono spesso indicati come proantocianidine.

Figura 13 - Struttura chimica dei flavan 3-oli.

I monomeri più comuni sono: (+)-catechina e (-)- epicatechina, mentre (-)- catechina e (+)-

epicatechina sono meno diffusi (Figura14).

Figura 14-(+)-Catechina e (-)- Epicatechina.

La presenza di quattro isomeri è dovuta ai due centri chirali in C2 e C3. A differenza degli

antociani, le catechine non sono legate a molecole glucidiche e non hanno gruppi metossili

17

come sostituenti, si distinguono dalle antocianine per il grado di ossidazione dell’anello B. Le

catechine possono combinarsi con molecole di acido gallico in posizione 3, dando origine ai

catechin-gallati.

2.5 FLAVONOLI

I flavonoli sono pigmenti di colore giallo che sono presenti in tutte le uve bianche e nere, in

piccole concentrazioni (Figura15).

Figura 15-Struttura generale dei flavonoli

18

In base ai sostituenti dell’anello laterale si differenziano in quercetina, miricetina e

kampferolo (Figura 16).

Figura 16-Formula di struttura di quercitina, mirecitina e kampferolo.

I flavonoli svolgono ruoli importanti non solo nel colore e nella qualità del vino ma anche per

i benefici sulla salute. La loro funzione è quella di rendere più stabile il colore attraverso la

co-pigmentazione25

con gli antociani. Anche la formazione di un legame con uno zucchero

sembra incrementare la stabilità del pigmento, pur non avendo un effetto diretto sulla

colorazione.

2.6 I NON FLAVONOIDI

Molti composti non flavonoidi presenti nell’uva e nel vino sono acidi fenolici. Questi sono

costituiti da un anello benzoico sostituito da uno o più gruppi fenolici e metossilici (R1, R2 o

R3) e da un gruppo carbossilico legato direttamente (benzoici) o tramite una catena di atomi

di carbonio (cinnamici) all’anello. Si suddividono in due famiglie: i derivati dell’acido

benzoico o acidi idrossibenzoici (C6-C1), i derivati dell’acido cinnamico o idrossicinnamici

(C6-C3), più altri derivati fenolici come gli stilbeni (C6-C2-C6).

19

2.7 ACIDI FENOLICI

Gli acidi fenolici sono noti anche come idrossibenzoati, il derivato principale è l’acido

gallico che, insieme all’acido ellagico, costituisce il monomero base per la formazione dei

tannini idrolizzabili (Figura17).

Figura 17-Acido gallico

E’ presente nelle foglie e nelle bucce di molti frutti tra cui l’uva. L'acido gallico sembra avere

attività antiossidanti, antitumorali e attività antiangiogenica in vitro.

Nelle varietà di uve rosse, la concentrazione degli acidi fenolici è superiore sia nella polpa sia

nel mosto, dove gli acidi benzoici e cinnammici sono i predominanti, rispetto alle uve

bianche26

. I tannini si distinguono in idrolizzabili o gallici, di cui fanno parte gallotannini ed

ellagitannini, e in tannini condensati o catechici. I tannini tendono a polimerizzare

determinando maggiore intensità colorante mediante co-pigmentazione, maggior stabilità del

vino, maggiore morbidezza e volume in bocca e maggiori aromi di fruttato27

.

2.8 GLI ACIDI IDROSSICINNAMICI (HCA)

Gli acidi idrossicinnamici possiedono uno scheleto C6-C3 e appartengono al gruppo dei

fenilpropanoidi. I derivati più comuni sono: l’acido p-cumarico, acido caffeico e ferulico,

componenti presenti in frutta e verdura (Figura18). Questi derivati sono generalmente molto

più abbondanti nelle forme trans rispetto alle forme cis in quanto più stabili28

. Gli acidi

idrossicinnamici sono coinvolti nelle reazioni di imbrunimento del mosto causate da

ossidazione enzimatica in quanto i substrati ideali delle polifenolossidasi (PPO)29

. Questi

composti importanti per i loro effetti sulla digeribilità dei cibi e per la loro attività

antimicrobica, e la loro azione anti-mutagena e anticancerogena30

.

20

Figura 18-Struttura degli acidi p- coumarico, caffeico, ferulico e cinnamico.

2.9 GLI STILBENI

Questi composti hanno una grande importanza dovuta all’influenza positiva sulla salute.

Possiedono due anelli benzenici separati da un etano, agiscono da regolatori della crescita e

fitoalessine, composti prodotti da piante in risposta agli attacchi fungini, agenti patogeni

batterici e virali. Uno dei derivati di maggior importanza per gli effetti sulla salute è il

resveratrolo; esiste nelle forme cis e trans, e l’isomerizzazione da trans a cis è favorita

dall’esposizione alle radiazioni ultraviolette31

(Figura19). Il resveratrolo e gli altri stilbeni

sono prodotti in diverse parti della vite, ma la massima concentrazione è nella buccia, degli

acini e nelle foglie32,33

. L’interesse per il resveratrolo, è aumentato da quando fu indicato

come la possibile spiegazione del “Paradosso francese”, che è l’apparente efficacia del

moderato consumo di vino rosso di ridurre il rischio di malattie cardiovascolari34

. Il trans-

resveratrolo possiede proprietà antiossidanti tali da poter prevenire l’insorgenza di malattie

cardiovascolari, come l’arteriosclerosi, modulando il metabolismo dei lipidi, inibendo

l’ossidazione delle LDL e l’aggregazione delle placche arteriosclerotiche35,36

.

Figura 19-Formula di cis-resveratolo e trans-resveratrolo

21

Parte Sperimentale

22

3 INTRODUZIONE

La tipologia di vite “Barbera N.” è stata ammessa al Registro Nazionale delle varietà della

vite il 25/05/1970 con pubblicazione sulla Gazzetta Ufficiale G.U. 149 del 17/06/1970. Il

vino che viene prodotto con questa tipologia di uva, il Barbera, è descritto da disciplinari di

produzione che possono variare a seconda della zona di produzione e che, per quanto attiene

l’Oltrepò Pavese, sono stati pubblicati con Decreto 3 agosto 2010 concernente la modifica

del disciplinare di produzione della Denominazione di Origine Controllata dei vini "Oltrepò

Pavese" Data di pubblicazione: 29/02/2012.

Il Barbera, può essere composto da uve:

barbera: dall’85% al 100%

altri vitigni di uve nere raccomandate o autorizzate: 0% - 15%.

Il prodotto commerciale è in genere ottenuto da una miscela delle varietà di uva ammesse dal

disciplinare e pertanto parte delle caratteristiche dell’uva barbera vengono attenuate dalla

presenza delle altre varietà ammesse. È pratica comune infatti predisporre già vigneti destinati

alla produzione di vino DOC impiantando, accanto a piante di Barbera anche piante delle altre

varietà che andranno, una volte entrate in produzione, a costituire il vino.

Inoltre osservando le caratteristiche chimico-fisiche ed organolettiche riportate dal

Disciplinare di produzione, si osserva che per l’uva barbera è ammessa la vinificazione in

molte tipologie di vino (Tabella2):

Tabella 2-Caratteristiche chimico-fisiche ed organolettiche.

e che i vini prodotti possono essere :

fermi, mossi o frizzanti con la sovrappressione che può arrivare fino a 2.5 atm per un

VINO %

BARBERA

%

CROATINA

UVA RARA,UGHETTA E

PINOT NERO

% ALTRE

UVE

rosato

frizzante 25 - 65 25 - 65 fino a max. 45 fino a max. 15

barbera 85 fino a max. 15

barbera

frizzante 85

fino a max. 15

barbera riserva 85 fino a max. 15

buttafuoco minimo 65 fino a max. 35 (comprendendo

anche croatina)

sangue di

giuda 25 - 65 25 - 65 fino a max. 45

bonarda 85 - 100 fino a max. 15 (comprendendo

anche barbera)

23

vino frizzante,

secchi o amabili con un tenore zuccherino che varia tra 0.1 g/l di glucosio/fruttosio di

un Barbera o di un Buttafuoco e gli oltre 100 g/l di glucosio/fruttosio che

caratterizzano il Sangue di giuda

con titolo alcolometrico volumico variabile, a seconda della tipologia del prodotto, da

5,5° % v/v come è ammesso per il sangue di giuda a 14° % v/v facilmente riscontrabili

in vini Riserva della tipologia Barbera o Buttafuoco.

Le innumerevoli sfaccettature che questo vino può assumere nella sua produzione destinata

alla grande distribuzione e la significativa produzione, ne hanno fatto un prodotto di massa,

talvolta di basso valore commerciale e purtroppo spesso privo di una sua connotazione

caratteristica, nonostante il suo indubbio valore organolettico.

Il Barbera dell’Oltrepò Pavese e tutti gli altri vini DOC che con le uve Barbera sono prodotti,

sono descritti come vini tipici dell’Oltrapò Pavese, ma trovano forte competizione in vini

simili e con composizioni analoghe vengono prodotti anche nelle aree limitrofe, anche se con

nomi differenti.

L’insieme di tutti questi fattori ha contribuito negli anni a rendere questo vino, con destino

comune a tanti altri in Italia, quanto mai debole e soggetto a subire le influenze della

concorrenza e della contraffazione, fatto questo che ha determinato il progressivo

livellamento dei prezzi al consumo, anche se i costi di produzione nel contempo sono in

continuo aumento per un insieme di fattori.

Da alcuni anni, il Dipartimento di Scienze del Farmaco collabora con Riccagioia SCpA, in un

progetto di ricerca che ha la finalità di mettere a punto un protocollo di analisi specialistiche

tali da costruire una carta di identità dei principali vini dell’Oltrepò Pavese, per

individuarne le principali caratteristiche chimico-fisiche,

analizzare le loro caratteristiche organolettiche, per descriverle anche dal punto di

vista analitico,

evidenziare le loro potenzialità sia dal punto di vista organolettico sia dal punto di

vista salutistico

e infine tutelare il prodotto difendendolo da eventuali contraffazioni, se non addirittura

da frodi.

Il Barbera è stato infatti studiato come vino di confronto al Bonarda, tipico dell’Oltrepò

Pavese e altrettanto diffuso sul territorio.

Nella fase attuale della ricerca sono stati considerati dei campioni di Barbera prodotti nelle

cantine sperimentali di Riccagioia per poter evidenziare caratteristiche analitiche relative alla

sola uva Barbera, dal momento che per il prodotto commerciale non è facile escludere la

24

presenza di uve barbera nell’uvaggio finale.

In questa tesi sono stati quindi considerati due campioni, ricavati da cloni di barbera

appartenenti alle collezioni di Riccagioia, vinificati in piccole o medie quantità (sotto i 5hl),

sicuramente in purezza per analizzare anche dal punto di vista organolettico, le caratteristiche

del vino.

I vini Barbera considerati nella tesi rispondono completamente ai parametri indicati dal

disciplinare di produzione e quindi l’attenzione è stata focalizzata, in questa ricerca, sul

riconoscimento e sul dosaggio di polifenoli, antociani e altri prodotti correlati.

4 CLONI

La selezione clonale sta assumendo sempre maggiore importanza grazie alle innovazioni della

botanica e delle ricerche a livello biologico e molecolare. I ricercatori cercano di produrre

delle variazioni varietali delle uve già conosciute in modo da sopperire alle problematiche

create dalle condizioni ambientali avverse e dalle malattie, come esplosione della filossera

alla metà dell'ottocento. Nella seconda metà del Novecento, con le nuove tecnologia, sono

stati prodotti numerosi cloni di viti per renderle resistenti a particolari malattie e condizioni.

Naturalmente tutto questo deve avvenire sotto un attento controllo e una ricerca rigorosa

disciplinata per legge ed eseguita nella pratica da centri di ricerca autorizzati e dipendenti dal

Ministero dell'Agricoltura, per l'Italia il centro di riferimento è il CNR. La normativa che

regola la selezione clonale a livello europeo e implementa la legge nazionale del 8 febbraio

2005, è la 68/193/CEE, specifica per la vite. Un clone è una discendenza vegetativa derivata

da una pianta di vite capostipite scelta per la sua identità varietale, i suoi caratteri fenotipici

(morfologici, agronomici, produttivi ed enologici) ed il suo stato sanitario nei confronti delle

malattie virali. Tutte le piante di una discendenza clonale sono identiche fra di loro e con la

pianta originaria. Con il clone è possibile riprodurre in serie le migliori viti, senza quindi farle

impollinare e modificare spontaneamente in modo da perdere determinate caratteristiche.

Chiaramente con l'impollinazione le caratteristiche potrebbero anche migliorare e comunque

la pianta seguirebbe la sua evoluzione naturale, quindi la clonazione non deve essere usata

come sostituto permanente.

Compito della clonazione è combattere soprattutto le virosi, ovvero quelle malattie virali che

potrebbero compromettere la salvaguardia della specie o anche di una singola varietà: piante

sane sono riprodotte per clonazione per evitare il propagarsi di un virus. I diversi cloni

possono essere anche incrociati fra loro in modo da riuscire ad ottenere varietà con

caratteristiche peculiari. Attualmente le piante clonate servono più che altro nella

comparazione di laboratorio e nella conservazione della specie.

25

Nel caso specifico di Riccagioia, cloni di incroci particolari vengono utilizzati per ottenere

piante con caratteristiche particolari, esaltando parametri commercialmente interessanti quali

sapore o profumo delle bacche, resistenza alle malattie o capacità produttiva.

Negli ultimi anni è stata creata una nuova metodologia per la selezione clonale approvata dal

Comitato Nazionale per l’Esame delle Varietà di Vite il 3 marzo 2000, adottata dal Ministero

delle Politiche Agricole e Forestali con D.M. 06.02.2001che prevede:

a) individuazione e scelta delle piante madri dei presunti cloni sulla base delle caratteristiche

che interessano il selezionatore;

b) esecuzione, sulle piante scelte, dei test virologici;

c) costituzione di almeno un vigneto di moltiplicazione, con un minimo di 20 ceppi per ogni

biotipo, su un portinnesto, e con il requisito che il campo di impianto debba essere costituito

preferibilmente nella zona di individuazione o di diffusione del vitigno in selezione o

comunque vocata e che il terreno sia esente da nematodi vettori.

d) rilievi ed analisi sulle discendenze clonali per almeno 3 annate al fine di verificare la

persistenza, dopo la propagazione propagazione, del/i carattere/i per il/i quale/i si è effettuata

la selezione.

Per i vitigni ad uva da vino, al fine di verificare le potenzialità enologiche del presunto clone,

dovranno essere effettuate curve di maturazione degli zuccheri, degli acidi fissi, dell’acidità

titolabile, del pH; microvinificazione con analisi chimiche e sensoriali dei vini. Per i vitigni a

buccia colorata sono inoltre obbligatorie le seguenti analisi chimiche delle uve:

- profilo degli antociani della buccia (se il clone è dotato di polpa colorata, è necessario

determinare anche il profilo degli antociani di questa parte dell’acino);

- profilo degli acidi idrossicinnamici legati all’acido tartarico della buccia e della polpa;

- profilo dei flavonoli della buccia;

- indici di antociani totali a maturazione. Nella presentazione dei cloni per l’omologazione

devono essere indicate le caratteristiche in base alle quali è stata fatta la selezione. In questo

modo si potrebbe arricchire in tempi ragionevoli il patrimonio in cloni del nostro Paese,

incrementando anche la variabilità di biotipi necessaria per il mantenimento e miglioramento

della qualità dei vini.

Ottenuta l’omologazione (l'atto che riconosce la validità del clone a fini vivaistici) e

l’iscrizione del clone selezionato nel Registro Nazionale, il costitutore fornisce i ‘materiali

iniziali’ ad un Nucleo di premoltiplicazione che li pone nei propri vigneti di piante madri per

la produzione del materiale ‘di base’. Questa fase, detta ‘premoltiplicazione’, è finalizzata a

fornire il materiale di moltiplicazione del clone ai vivaisti che con esso a loro volta

costituiranno i propri vigneti di piante madri. I vivaisti propagheranno gemme e/o talee

26

prelevate annualmente da questi vigneti producendo il materiale ‘certificato’ che viene

commercializzato con etichetta azzurra ai viticoltori per l’impianto dei vigneti.

I campioni di vino utilizzati nel presente elaborato di tesi derivano appunto da due esempi di

piante varietali che stanno seguendo questo percorso ed in particolare:

il campione Barbera Fiori è stato prodotto in un vigneto monovarietale, di barbera in

purezza derivante da presunti cloni, e quindi in attesa di ottenere l’eventuale

omologazione ministeriale;

il Barbera 039 è stato ottenuto da cloni di barbera di recente omologazione (2013), di

proprietà dell’Università di Milano e coltivati presso i vigneti sperimentali di

Riccagioia.

Nella tabella successiva sono riportati i 33 cloni di Barbera autorizzati dal Ministero per le

Politiche agricole, alimentari e forestali: il clone 039 analizzato nella presente tesi è stato

omologato con il nome I –UNIMI Barbera 3 in data 27/09/2013 e pubblicato in G.U. 241 del

14/10/2013 (Tabella3).

27

Codice Clone Data emanazione Gazzetta Ufficiale Data

1 I - RAUSCEDO 4 24/12/1969 D.P.R. 1164/69 in G.U. 48 24/02/1970

2 I - FEDIT 3 C.S.G. 24/12/1969 D.P.R. 1164/69 in G.U. 48 24/02/1970

4 I - MI-B-12 29/04/1976 G.U. 153 11/06/1976

5 I - MI-B-34 29/04/1976 G.U. 153 11/06/1976

7 I - PC-Ba-9 20/06/1979 G.U. 218 09/08/1979

8 I - PC-Ba-26 20/06/1979 G.U. 218 09/08/1979

9 I - AT 84 01/10/1980 G.U. 300 31/10/1980

10 I - CVT AL 115 19/01/1990 G.U. 199 27/08/1990

11 I - CVT AT 171 19/01/1990 G.U. 199 27/08/1990

12 I - CVT AT 424 19/01/1990 G.U. 199 27/08/1990

13 I - BA-AL-128 22/12/1988 G.U. 199 27/08/1990

14 I - BA-AL-132 22/12/1988 G.U. 199 27/08/1990

15 I - 17-BA 31/08/1990 G.U. 242 15/10/1991

16 I - CVT 83 06/11/2001 G.U. 297 22/12/2001

17 I - VCR 19 09/01/2007 G.U. 38 15/02/2007

18 I - VCR 101 09/01/2007 G.U. 38 15/02/2007

19 I - VCR 433 09/01/2007 G.U. 38 15/02/2007

20 I - VCR 207 12/01/2009 G.U. 93 22/04/2009

21 I - VCR 223 12/01/2009 G.U. 93 22/04/2009

22 I - CVT OB66 12/01/2009 G.U. 93 22/04/2009

23 I - CVT GJ1 12/01/2009 G.U. 93 22/04/2009

24 I - CVT GJ 105 22/04/2011 G. U. 170 23/07/2011

25 I - CVT MCC 3 22/04/2011 G. U. 170 23/07/2011

26 I - Ampelos DGV 13 10/07/2013 G. U. 186 09/08/2013

27 I - VITIS 9 27/09/2013 G. U. 241 14/10/2013

28 I - UNIMI Barbera 3 27/09/2013 G. U. 241 14/10/2013

29 I - UNIMI Barbera 5 27/09/2013 G. U. 241 14/10/2013

30 I - CVT GJ 102 15/05/2014 G.U.127 04/06/2014

31 I - CVT GJ 106 15/05/2014 G.U. 127 04/06/2014

32 I - Ampelos 16 15/05/2014 G.U. 127 04/06/2014

33 I - Ampelos 19 15/05/2014 G.U. 127 04/06/2014 Tabella 3-Elenco dei cloni di Barbera autorizzati dal MIPAAF.

http://catalogoviti.politicheagricole.it/varieta/019/cloni/019-001.pdf#zoom=100


















28

5 MATERIALI E METODI

Reattivi:

Metanolo Sigma Aldrich (HPLC grade)

Acido formico 1M Sigma Aldrich

Acetonitrile Sigma Aldrich (LC grade)

Acqua Millipore grade

Descrizione e preparazione del campione:

In questo studio sono stati analizzati 2 campioni di vino Barbera: 039 e Fiori. Ciascun

campione è stato filtrato con filtri Millex-HV in PVDF con porosità di 0,45 e 0,22 μm e

successivamente sottoposto ad analisi UHPLC-PDA-hESI-MSn.

Analisi UHPLC-PDA-hESI-MSn :

L’analisi dei campioni di vino è stata condotta utilizzando un sistema Jasco X-LC

(Jasco,Easton,MD,USA) dotato di una pompa quaternaria, un detector UHPLC-PDA e uno

spettrometro di massa a trappola lineare LTQ-XL (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)

attraverso una sorgente h-ESI . La separazione è stata effettuata utilizzando una colonna

Purospher® RP-18 (5 μm) LiChroCART® 250-4 (250 mm x 4 mm i.d., 5 μm) (Merck) con la

corrispondente precolonna (Merck). La fase mobile è rappresentata da acqua acidificata con

acido formico allo 0,1 % (eluente A) e acetonitrile (eluente B), il flusso è stato impostato a 1

mL/min e il volume d’iniezione a 5 μL. Il gradiente di eluizione è mostrato nella (Tabella4):

Tempo

(min)

Acqua acida

(H3O+)

Acetonitrile

(CH3CN)

5 98 2

40 60 40

45 0 100

47 0 100

52 98 2

57 98 2

Tabella 4-Gradiente di eluizione del metodo analitico.

29

La temperatura del sistema è stata mantenuta a 24 °C. I cromatogrammi sono stati registrati a

λ 280 nm (oltre che a 220, 254, 366, 520 nm); gli spettri sono stati registrati nel range 200-

650 nm per tutti i picchi. La trappola ionica ha operato nelle condizioni di data dependent, full

scan (80-1500 m/z), zoom scan e in modalità MSn. Per ottenere gli ioni frammento è stata

applicata un’energia di collisione del 35%; il voltaggio è stato tenuto a 3 kV per la

ionizzazione negativa e 5 kV per quella positiva, la temperatura del capillare era 275 °C, il

flusso di gas nella guaina era di 20 unità arbitrarie e l’ Auxiliary/sweep gas flow rate era di 17

unità arbitrarie.

6 RISULTATI E DISCUSSIONE

La ricerca svolta presso il laboratorio di Chimica degli Alimenti e Nutraceutica del

Dipartimento di Scienze del Farmaco dell’Università degli Studi di Pavia è stata finalizzata a

determinare il profilo metabolico di due campioni di vino Barbera: Barbera Fiori e 039,

utilizzando il metodo: UHPLC-PDA-hESI-MSn. Dal confronto dei cromatogrammi ottenuti,

tenendo conto del tempo di ritenzione e spettro MS e MS2, è stato possibile identificare 23

composti di natura polifenolica, alcuni presenti nei due campioni di vino analizzati, altri

presenti solo in uno. Più in particolare:

nel campione di vino Barbera Fiori sono state identificate 35 sostanze di cui 3 acidi

organici, 9 acidi idrossicinnamici, 14 flavonoidi, di cui 8 antociani, e 1 amminoacido.

nel campione di vino Barbera 039 sono state identificate 24 sostanze di cui 2 acidi

organici, 6 acidi idrossicinnamici, 9 flavonoidi, di cui 6 antociani e 1 aminoacido.

Nella seguente tabella sono riportati i numeri relativi ai composti presenti nei diversi cloni di

Barbera (Tabella5):

CLONE Acidi organici Acidi

idrossicinnamici Flavonoidi Antociani Amminoacidi

Barbera Fiori 3 9 14 8 1

Barbera 039 2 6 9 6 1

Tabella 5-Numeri composti presenti nei diversi cloni.

Dalla seguente tabella si può osservare che i flavonoidi sono la famiglia di composti

numericamente più abbondante, seguiti dagli antociani, mentre acidi organici e acidi

idrossicinnamici sono presenti con pochi composti così come gli amminoacidi.

30

Dati analitici

31

A seguito sono riportati i cromatogrammi e le tabelle relative ai tempi di ritenzione, ai valori

m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi

organici presenti nel campione di vino Barbera Fiori.

BARBERA FIORI

Figura 20 -Cromatogramma total ion current, del campione di vino Barbera Fiori.

ACIDI ORGANICI

Tempo di ritenzione

(min)

m/z [ M+H]-

MS² m/z Struttura proposta

3.12

191

173(100),111

Acido citrico

7.78

169

125(100)

Acido gallico

11.67

153

109(100)

Acido protocatechico

Tabella 6-Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa

agli acidi organici presenti nel campione di vino Barbera Fiori.

32

Figura 21-Spettro MS e spettro MS2 del composto acido citrico con tempo di ritenzione 3.12 min.

Figura22-Spettro MS e spettro MS2del composto acido gallico con tempo di ritenzione 7.78 min.

Figura23 -Spettro MS e spettro MS2del composto acido protocatechico con tempo di ritenzione 11.67 min.

33

ACIDI IDROSSICINNAMICI

Tempo di ritenzione

(min)

m/z [ M+H]-


2.09

195

159(100),129(70),

177(20)

Acido diidroferulico

13.46

311

179(65),149(100)

Acido cis/trans caftarico

16.27

295

163(10),149(2)

Acido cis-trans cutarico

17.38

325

193(100),265,235

Acido trans-feruriltartarico

17.51

179

135(100)

Acido caffeico

21.19

165

147(100),119(2)

Acido diidrossicumarico

21.76

163

119(100)

Acido trans-p-cumarico

36.51

329

229(100),211,311

171,293

Estere esoso dell'acido

vanillico

45.88

194

179(100),194,163

Acido ferulico

Tabella 7-Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa gli

acidi idrossicinnamici presenti nel campione di vino Barbera Fiori.

34

Figura 24-Spettro MS e spettro MS2 del composto acido diidroferulico con tempo di ritenzione 2.09 min.

Figura25-Spettro MS e spettro MS2 del composto acido cis/trans caftarico con tempo di ritenzione 13.46 min.

Figura26-Spettro MS e spettro MS2 del composto acido cis/trans cutarico con tempo di ritenzione 16.27 min.

35

Figura 27-Spettro MS e spettro MS2 del composto acido trans-ferultartarico con tempo di ritenzione 17.38 min.

Figura 28-Spettro MS e spettro MS2del composto acido caffeico con tempo di ritenzione 17.51 min.

Figura 29-Spettro MS e spettro MS2 del composto acido diidrossicumarico con tempo di ritenzione 21.19 min.

36

Figura 30-Spettro MS e spettro MS2 del composto acido trams-p-cumarico con tempo di ritenzione 21.79 min.

Figura 31-Spettro MS e spettro MS2 del composto estere esoso dell'acido vanillico con tempo di ritenzione 36.51 min.

Figura 32-Spettro MS e spettro MS2del composto acido ferulico con tempo di ritenzione 45.88 min.

37

FLAVONOIDI

Tempo di ritenzione

(min)

m/z [ M+H]-


10.18

593

425(100),407,289,

467

(epi) gallocatechina (epi)

catechina

11.17

305

261(40),221(80),

179(100),165(30),

125(20)

Epi gallocatechina

13.78

577

425(100),289(20)

Procianidina B2

13.80

577

425(100),407,451,2

89

Procianidina B3

15.63

289

245(100),205(35),

179(10)

Catechina

15.71

865

577(100),289

Procianidina trimero

20.48

479

317(100)

Miricetina 3-O-galattoside

20.64

493

317(100)

Miricetina 3-O-glucuronide

20.84

197

169(100),125(5)

Etilgallato

23.08

477

301(100)

Quercetina 3-O-glucuronide

23.65

449

303(100),285(60)

Astilbina

24.85

507

345(100),344(100)

Siringetina-3-glucoside

25.83

389

227(100)

Resveratrolo trans-glucoside

36.21

227

185

Resveratrolo

Tabella8-Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa ai

flavonoidi presenti nel campione di vino Barbera Fiori.

38

Figura 33-Spettro MS e spettro MS2 del composto (epi) gallocatechina (epi) catechina con tempo di ritenzione 10.18 min.

Figura 34-Spettro MS e spettro MS2 del composto epigallocatechina con tempo di ritenzione 11.17 min.

Figura 35-Spettro MS e spettro MS2 del composto procianidina B2 con tempo di ritenzione 13.78 min.

39

Figura 36-Spettro MS e spettro MS2 del composto procanidina B3 con tempo di ritenzione 13.80 min.

Figura 37-Spettro MS e spettro MS2 del composto catechina con tempo di ritenzione 15.63 min.

Figura 38-Spettro MS e spettro MS2 del composto procianidina trimero con tempo di ritenzione 15.71 min.

40

Figura 39- Spettro MS e spettro MS2 del composto miricetina 3-o--galattoside con tempo di ritenzione 20.48 min.

Figura 40-Spettro MS e spettro MS2 del composto miricetina 3-o--glucuronide con tempo di ritenzione 20.64 min.

Figura 41-Spettro MS e spettro MS2 del composto etilgallato con tempo di ritenzione 22.84 min.

41

Figura 42-Spettro MS e spettro MS2del composto quercetina 3-o-glucuronide con tempo di ritenzione 23.08 min.

Figura 43-Spettro MS e spettro MS2 del composto astilbina con tempo di ritenzione 23.65 min.

Figura 44-Spettro MS e spettro MS2 del composto siringetina-3-glucoside con tempo di ritenzione 24.85 min.

42

Figura 45-Spettro MS e spettro MS2 del composto resveratrolo trans-glucoside con tempo di ritenzione 25.83 min.

Figura 46-Spettro MS e spettro MS2 del composto resveratrolo con tempo di ritenzione 36.21 min.

43

ANTOCIANI

Tempo di ritenzione

(min)

m/z [ M+H]- MS² m/z Struttura proposta

18.48

517a

355

Piranomalvidina 3

glucoside

19.02

559

353(100),515(98)

Vitisina di tipo B di

Malvidina3-acetil

glucoside

19.03

561a

399(100)

Carbossipirano Malvidina-

3-glucoside

20.14

809a

357(100),519,647

Malvidina 3-cumaroil

glucoside metilmetionina

catechina

20.44

479

317(100)

Petudina 3-O-glucoside

22.73

493

331(100)

Malvidina 3-glucoside

23.63

449

303(100),285(60)

Cianidina-3-O glucoside

41.96

331

313(100)

Malvidina


agli antociani presenti nel campione di vino Barbera Fiori.

a: I composti sono stati rivelati in positivo.

44

Figura 47-Spettro MS e spettro MS2 del composto piranomalvidina 3-glucoside con tempo di ritenzione 18.48 min.

Figura 48-Spettro MS e spettro MS2 del composto vitisina di tipo B di malvidina 3-acetil glucoside con tempo di ritenzione

19.02. min.

Figura 49-Spettro MS e spettro MS2 del composto carbossipirano malvidina-3-glucoside con tempo di ritenzione19.03

min.

45

Figura 50-Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina 3-cumaroil glucoside metilmetionina con tempo di ritenzione

20.14 min.

Figura 51-Spettro MS e spettro MS2 del composto petudina 3-o-glucoside con tempo di ritenzione 20.44 min.

Figura 52-Spettro MS e spettro MS2del composto malvidina 3-glucoside con tempo di ritenzione 22.73 min.

46

Figura 53-Spettro MS e spettro MS2 del composto cianidina 3-o-glucoside con tempo di ritenzione 23.63 min.

Figura 54-Spettro MS e spettro MS2 del composto malvidina con tempo di ritenzione 41.96 min.

AMMINOACIDI

Tempo di ritenzione

(min)


45.86

194

179(100),194(25),164

β-Alanina


agli amminoacidi presenti nel campione di vino Barbera Fiori.

47

Figura 55-Spettro MS e spettro MS2 del composto β-Alanina con tempo di ritenzione 45.86 min.

BARBERA 039

A seguito sono riportati i cromatogrammi e le tabelle relative ai tempi di ritenzione, ai valori

m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa agli acidi

organici presenti nel campione di vino Barbera 039

Figura 56- Cromatogramma total ion current, del campione di vino Barbera 039.

48

ACIDI ORGANICI

Tempo di ritenzione

(min)


3.13

191

173(100),111

Acido citrico

7.82

169

125(100)

Acido gallico

Tabella 11- Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa

agli acidi organici presenti nel campione di vino Barbera 039.


Tempo di

ritenzione (min)

m/z [ M+H]- MS² m/z Strutture proposte

2.12

195

159(100),128(70),

176(20)

Acido diidroferulico

17.74

179

135(100)

Acido caffeico

21.41

165

147(100)

Acido diidrossicumarico

21.92

163

119 (100)

Acido trans-p-cumarico

36.67

329

229(100),

311,211,171,293

Estere esoso dell’acido

vanillico

45.95

194

179(100),

194(40),163(25)

Acido ferulico


agli acidi idrossicinnamici presenti nel campione di vino Barbera 039.

49

FLAVONOIDI

Tempo di

ritenzione (min)


10.38

593

425(100)

(epi)gallocatechina

(epi)catechina

14.03

577

425(100),289

Procianidina dimero

15.97

865

289,287,299

Procianidina trimero

18.11

289

245(100),205,

179

Epicatechina

18.11

289

245(100),

205(40)

Catechina

21.06

197

167(100),125(5)

Etilgallato

23.26

477

301(100)

Quercetina 3-O-

glucuronide

24.87

507

345

Siringetina 3- glucoside

37.93

303

285(100)

Diidroquercetina

Tabella 13-Tempo di ritenzione, valori m/z dello ione parent e degli ioni frammento e struttura chimica proposta relativa ai

flavonoidi presenti nel campione di vino Barbera 039.

50

ANTOCIANI

Tempo di

ritenzione (min)


20.72

809

357(100)

Malvidina-3-glucoside-

metilmetin catechina

20.74

809

357(100),647,

519

Malvidina-3-o-glucoside 8

etil(epi)catechina

22.26

625

579(100)

Malvidina-3-glucoside-4-

vinilcatecolo

37.84

303

286(100),187(0)

Delfinidina

41.08

331

313(100)

Malvidina

67.66

465

183(100),447,

401,337

Diidroquercetina derivati


agli antociani presenti nel campione di vino Barbera 039.

AMMINOACIDI

Tempo di

ritenzione (min)


45.95

194

179(100),194,164

β-Alanina


agli amminoacidi presenti nel campione di vino Barbera 039.

51

7 CONCLUSIONI

La ricerca condotta sui campioni di vino Barbera Fiori e Barbera 039, ha permesso di ottenere

per ciascuno di essi una parziale caratterizzazione chimica da cui emerge la presenza di

almeno 44 prodotti appartenenti ai seguenti gruppi :

acidi organici

acidi idrossicinnamici

flavonoidi, e tra questi gli antociani .

Nei due vini analizzati, è stata identificata anche la β-alanina, che si presume sia proveniente

dai lieviti utilizzati durante la fermentazione. A seguito sono rappresentati in tabella i vari

composti chimici identificati per ciascuno dei due vini analizzati.

ACIDI ORGANICI

L’acido gallico e acido citrico sono presenti in entrambi i vini; il Barbera Fiori presenta inoltre

l’acido protocatechico.

ACIDI ORGANICI

COMPOSTO BARBERA FIORI BARBERA 039

Acido citrico √ √

Acido gallico √ √

Acido protocatechico √

Tabella 16-Acidi organici presenti nei vari campioni di vino.

52


Il Barbera Fiori presenta il maggior numero di composti appartenenti alla famiglia degli acidi

idrossicinnamici, l’acido cis/trans caftarico, l’acido cis/trans cutarico e l’acido trans-

feruriltartarico mancano nel Barbera 039.



Acido cis/trans caftarico √

Acido cis/trans cutarico √

Acido trans-feruriltartarico √

Acido caffeico √ √

Acido diidrossicumarico √ √

Acido trans-p-cumarico √ √

Estere esoso dell'acido

vanillico

√ √

Acido ferulico √ √

Acido diidroferulico √ √

Tabella 17-Acidi idrossicinnamici presenti nei vari campioni di vino.

53

FLAVONOIDI

Si nota una maggiore abbondanza numerica di flavonoidi nel Barbera Fiori in cui sono

presenti tutti i composti in elenco con eccezione di procianidina dimero, procianidina trimero,

epicatechina e diidroquercetina che invece compaiono solo nel campione di Barbera 039. Si

può notare che il resveratrolo manca completamente nel Barbera 039.

FLAVONOIDI


(epi) gallocatechina (epi)

catechina

√ √

Epi gallocatechina √

Procianidina B2 √

Procianidina B3 √

Catechina √ √

Procianidina trimero √

Miricetina 3-O-galattoside √

Miricetina 3-O-glucuronide √

Etilgallato √ √

Quercetina 3-O-glucuronide √ √

Astilbina √

Siringetina-3-glucoside √ √

Resveratrolo trans-glucoside √

Resveratrolo √

Procianidina dimero √

Procianidina trimero √

Epicatechina √

Diidroquercetina √

Tabella 18-Flavonoidi presenti nei vari campioni di vino.

54

ANTOCIANI

Il quantitativo di antociani nei due campioni e numericamente simile. I composti identificati

nei due vini sono complessivamente differenti, con la sola eccezione della Malvidina che

compare in entrambi i campioni.

ANTOCIANI


Piranomalvidina 3-glucoside √

Vitisina di tipo B di

Malvidina3-acetil glucoside

√

Carbossipirano Malvidina-3-

glucoside

√

Malvidina 3-cumaroil

glucoside metilmetionina

catechina

√

Petudina 3-O-glucoside √

Malvidina 3-glucoside √

Cianidina-3-O glucoside √

Malvidina √ √

Malvidina-3-glucoside-

metilmetin catechina

√

Malvidina-3-O-glucoside 8

etil(epi)catechina

√

Malvidina-3-glucoside-4-

vinilcatecolo

√

Delfinidina √

Diidroquercetina derivati √

Tabella 19-Antociani presenti nei vari campioni di vino.

55

AMMINOACIDI

Entrambi i campioni presentano la β-Alanina che si presume derivi dal ciclo metabolico dei

lieviti residui dalla fermentazione.

AMMINOACIDI


β-Alanina √ √

Tabella 20-Amminoacidi presenti nei vari campioni di vino.

Dall’analisi dei dati ottenuti appare chiaro che il Barbera Fiori presenta una quantità

numericamente molto superiore di composti chimici tra quelli identificati mediante UHPLC-

PDA-hESI-MSn.

Nella tabella successiva e nel grafico derivante è rappresentata la differenza evidenziata nei

due vini rispetto al numero e alla tipologia dei composti chimici che è stato possibile

identificare strumentalmente :

FAMIGLIE DI COMPOSTI BARBERA FIORI BARBERA 039

ACIDI ORGANICI 3 2

ACIDI IDROSSICINNAMICI 9 6

FLAVONOIDI 14 9

ANTOCIANI 8 6

Tabella 21-Numero di composti chimici identificati nei vini campione, rappresentato per famiglie di composti.

56

Grafico 1-Numero di composti chimici identificati nei vini campione, rappresentato per famiglie di composti

Per quanto riguarda le varie classi di composti identificati analiticamente, si nota che il

Barbera Fiori risulta più ricco del Barbera 039 per quanto riguarda ciascuna famiglia di

composti identificati ed in particolare:

20 composti risultano presenti solo nel Barbera Fiori,

9 composti risultano presenti solo nel Barbera 039

15 composti, comprendendo anche la β–alanina, risultano comuni a entrambi i vini.

FAMIGLIE DI PRODOTTI

COMPOSTI PRESENTI SOLO NEL:

PRODOTTI COMUNI

BARBERA FIORI BARBERA 039

ACIDI ORGANICI 1 0 2

ACIDI IDROSSICINNAMICI 3 0 6

FLAVONOIDI 9 4 5

ANTOCIANI 7 5 1

Β - ALANINA 0 0 1

Tabella 22-Distribuzione dei composti organici identificati nei due vini barbera analizzati.

57

Grafico 2-Distribuzione dei composti organici identificati nei due vini barbera analizzati.

Ulteriori indagini verranno svolte per correlare la composizione chimica in polifenoli alle

proprietà sensoriali determinate sia mediante analisi sensoriale tradizionale condotto con

panel di degustatori addestrato, sia mediante tecniche analitiche avanzate quali naso e lingua

elettronica.

58

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9 ALLEGATO

Tesi morena coricciati

Data & Analytics

Transcript of Tesi morena coricciati