tessuto epiteliale al microscopio ottico

come si ottiene, a partire da

tessuti biologici, un’immagine come questa?

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Problema 1

• la luce del microscopio può attraversare

solo materiale di spessore molto ridotto

pertanto:

La preparazione di materiale istologico

• il tessuto deve essere sezionato mediante speciali apparecchi, detti microtomi

TAGLIO AL MICROTOMO

TESSUTO

INCLUSO IN

PARAFFINA

LAMA

SEZIONI TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Problema 2

• quasi tutti i tessuti biologici sono molli e,

quindi, non si possono tagliare,

perciò

La preparazione di materiale istologico

• prima del taglio, il tessuto deve essere indurito Fissazione con aldeidi e successiva

Inclusione

Alternativa: congelamento

Problema 3

• i tessuti sono normalmente quasi incolori e privi di contrasto e non si vedrebbe nulla neanche al microscopio

La preparazione di materiale istologico

• prima dell’osservazione al microscopio, il tessuto deve essere colorato

• coloranti con affinità per componenti cellulari e tissutali diverse possono essere combinati nella stessa sezione istologica

sequenza dei passaggi in una

tipica procedura istologica

1. fissazione di un campione di tessuto

2. congelamento o inclusione del pezzo

3. taglio al microtomo

4. montaggio su vetrino

5. “bagni” in soluzioni di coloranti

6. disidratazione e coverslipping

FISSAZIONE

• SCOPO Lo scopo della fissazione è quello di preservare la struttura delle

cellule dalle alterazioni conseguenti la morte cellulare

• COME SI OTTIENE Trattamento chimico dei tessuti che porta alla precipitazione delle

proteine, tramite la formazione di legami chimici

• una rapida interruzione dei processi vitali della cellula

• inattivazione di enzimi litici

INCLUSIONE

• SCOPO

Fornire consistenza e resistenza al tessuto in modo che

possa essere tagliato in fette sottili (3-10 micron)

• COME SI OTTIENE

Si ottiene tramite l’inclusione in PARAFFINA (per MO) che si ottiene tramite la penetrazione della paraffina in

tutti gli spazi intercellulari e anche nelle cellule

INCLUSIONE

• PROCEDURA

- I frammenti sono posti in soluzioni acquose a concentrazioni di alcool crescenti, in modo da disidratare il tessuto

- passaggio in un solvente della paraffina: XILOLO o BENZOLO

- passaggio in paraffina liquida

50 %

etanolo 70 %

etanolo 95 %

etanolo

100 %

etanolo

benzene/

xilene Paraffina

fusa

Eliminare l’acqua e sostituirla con un solvente per la paraffina.

Miscibile con etanolo;

scioglie la paraffina

Tessuto

fresco

Fissazione in

formalina al 10%

label

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

INCLUSIONE IN PARAFFINA

La paraffina è liquida a 55-60° C. Solidifica a temperatura ambiente

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

TAGLIO

• Preparazione di fettine sottili di tessuto (3-10 micron)

tramite il MICROTOMO

METODI PARTICOLARI DI FISSAZIONE-TAGLIO

• Il tessuto viene congelato e tagliato con il criostato alla

temperatura desiderata

• CRIOSTATO: microtomo posto in un frigorifero

TAGLIO AL MICROTOMO

TESSUTO

INCLUSO IN

PARAFFINA

LAMA

SEZIONI

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

RECUPERO DELLE SEZIONI

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

SEZIONI NON COLORATE

VETRINO

PORTAOGGETTO

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

lo striscio

di sangue

Lo “striscio” consente lo studio microscopico

delle cellule del sangue

e non richiede il taglio

del tessuto.

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

ORIENTAMENTO DEL TAGLIO

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

RAPPRESENTAZIONE SCHEMATICA DI SEZIONI

•CORDONE SOLIDO

TUBULO

LAMINA

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

COLORAZIONE

SCOPO

- aumentare il contrasto dei diversi costituenti del tessuto per:

favorirne la osservazione

- identificare costituenti chimici specifici dei tessuti (istochimica)

COME SI OTTIENE

Dopo il taglio le sezioni sono raccolte su un vetrino portaoggetto

Estrazione della paraffina con solventi della paraffina (xilolo o benzolo)

Idratazione delle sezioni tramite passaggio in soluzioni contenenti

concentrazioni sempre più basse di alcool

( alcool acqua)

Trattamento delle sezioni con coloranti (sciolti in soluzioni acquose)

COLORANTI • i COLORANTI si comportano come molecole acide o

basiche

• una base rilascia OH-; un acido rilascia H3O

+

• i coloranti formano legami ionici con le molecole del

tessuto

• coloranti basici (+) legano molecole basofile (-)

• coloranti acidi (-) legano molecole acidofile(+)

COLORANTI

coloranti basici (+)

• includono ematossilina, blu di toluidina e blu di metilene

• colorano glicosamminoglicani (GAG), RNA, DNA (-)

coloranti acidi (-)

• includono eosina, ecc. • colorano proteine citoplasmatiche (+)

Miscele coloranti

COLORAZIONI ISTOLOGICHE

Ematossilina-eosina (H & E) è una delle colorazioni più comuni

Ematossilina è un colorante basico (+) e colora le sostanze acide (ad es. acidi nucl.)

Basofilia dei nuclei (acidi)

Eosina è un colorante acido (-) e colora le sostanze basiche (ad es.le proteine nel citoplasma

Acidofilia del citoplasma

TECNICHE IN

ISTOLOGIA TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Nucleo al MO

Nucleo al ME

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Verde di metile-pironina (verde di metile per il DNA-pironina per l’RNA)

Colorazione differenziale a pH 4,8. Al di sotto prevale la colorazione rossa dovuta

alla pironina, al di sopra prevale la colorazione verde azzurra del verde metile. I due

coloranti non sono di per sè selettivi per il DNA o RNA; di fatto la selettività è

ottenibile attraverso la definizione del pH di reazione.

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

COLORAZIONE AZAN-MALLORY

COLORAZIONE AZAN-MALLORY

Fibre collagene (blu)

Nuclei

(rosso)

Citoplasma

(rosa)

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

METACROMASIA

Un elemento istologico può assumere un colore diverso rispetto al colorante che, in genere, ha un comportamento basico (come il blu di toluidina, l’Alcian Blu, l’Azzurro A). Questi danno una colorazione blu/viola ma se si legano a polianioni (ad es. i GAG), formano polimeri che hanno un colore che vira verso il rosso (metacromasìa). Gli anioni debbono essere tuttavia posti tra loro a una distanza inferiore ad un valore minimo altrimenti la metacromasia non ha luogo (ad es. con molecole di DNA nel nucleo cellulare).

Metacromasia citoplasmatica nei Mastociti

Blu di Toluidina

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

• Alcuni coloranti legando alcuni composti chimici forniscono loro una

colorazione diversa da quella del colorante stesso.

• ES.: BLU DI TOLUIDINA colora in rosso i proteoglicani acidi della

cartilagine

Metacromasia della ECM cartilaginea

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Istologia

“funzionale” • Colture cellulari

• Coloranti vitali

• Istochimica

• Immunoistochimica

• Immunofluorescenza

L’istologia moderna non

si limita all’osservazione descrittiva degli aspetti

morfologici e strutturali

di base di cellule e

tessuti.

Esistono numerose

tecniche che consentono

di rispondere a quesiti

sulla composizione

specifica di un tessuto

correlata alle sue

funzioni

Istochimica

• L’identificazione e/o la misura quantitativa mediante reazioni di colorazione specifiche (o mediante metodi fisici) di costituenti chimici delle cellule e dei tessuti

Mentre nella biochimica tradizionale il

materiale biologico viene studiato

tipicamente “in provetta”, la citochimica e l’istochimica applicano tecniche biochimiche direttamente su

sezioni di tessuto, consentendo di

identificare i costituenti in situ.

• Colorazioni istochimiche

Le colorazioni istochimiche permettono di

evidenziare in situ determinate sostanze

chimiche contenute nei tessuti biologici.

• Si tratta quindi di eseguire vere e proprie

reazioni chimiche direttamente su cellule o

tessuti.

Con colorazioni istochimiche possiamo

evidenziare:

•LIPIDI

Sudan Nero, Sudan III (coloranti solubili nei grassi)

•CARBOIDRATI

Reazione Acido-Periodico di Schiff (PAS): colora in rosso magenta: amido, glicogeno, mucina (glicoproteina presente nel secreto mucoso del tratto respiratorio e gastro-intestinale)

GAG

Colorazione con Alcian blu

•DNA

Reazione di Feulgen che colora di rosso in modo selettivo il DNA (e non l’RNA)

ISTOCHIMICA

Cellule del tratto digerente secernenti muco (H&E; PAS-H)

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Alcian blu

E’ una reazione che mette in evidenza, qualitativamente e quantitativamente, sia le mucine acide solforate che i

glicosamminoglicani (GAG) contenenti gruppi carbossilici.

Se eseguita insieme alla reazione PAS dimostra le mucine presenti

nel preparato, sia acide (Alcian, precipitato blu intenso), sia neutre

(PAS, rosso). Se la reazione avviene in ambiente fortemente acido

(pH 1) si mettono in evidenza solo i GAG solforati, se avviene in

ambiente mediamente acido (pH 3) anche quelli carbossilici.

Evidenziazione istochimica delle mucine secrete

Colorazione Alcian blu-PAS

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Colorazione Alcian blu–PAS

In rosa le fibre

collagene e le proteine

adesive

In blu i proteoglicani

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Colorazione Alcian blu - PAS Stroma reticolare PAS positivo.

Mastociti alcianofili a causa dell’eparina

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Colorazione mediante sali di Ag

FIBRE RETICOLARI

• Costituite da collagene tipo III

• Fibre sottili (diametro 0,5-2 µm) formate da fibrille collagene di 20–40 nm.

• Non decorrono parallele ma tendono a formare una struttura a rete che sostiene le cellule circostanti.

• Il collagene III è molto ricco di catene oligosaccaridiche: perciò le f. reticolari sono colorabili con sali d’argento (fibre argirofile*) e sono PAS positive

*argirofilìa: capacità di legare ioni Ag+ ma non di ridurli (occorre un agente riducente)

Azan-Mallory

Impregnazione argentica

Dotto deferente

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Fibre reticolari in un linfonodo

negli organi linfoidi le f. reticolari sono prodotte dalle cellule reticolari

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Silver stain

tessuto nervoso:

qui i sali d’argento si legano al citoscheletro molto sviluppato

nei neuroni

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

ISTOCHIMICA: IDENTIFICAZIONE DI

ENZIMI

• Si sfrutta l’attività enzimatica di proteine dei tessuti • Si fornisce il substrato specifico per un enzima

enzima

SUBSTRATO PRODOTTO (colorato)

ESEMPIO: METODO GOMORI-TAKAMATSU per la FOSFATASI

Glicerofosfato + Ca2+ Fosfato di calcio

• Si possono evidenziare

ENZIMI IDROLITICI: fosfatasi, ATPasi, lipasi

OSSIDASI: perossidasi

DEIDROGENASI: lattico deidrogenasi

ISTOCHIMICA-IDENTIFICAZIONE DI

ENZIMI: PEROSSIDASI

neuroni TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Immunofluorescenza e

immunoistochimica

• Metodi altamente sensibili per la

localizzazione di proteine o polisaccaridi nei

tessuti

• IF: anticorpi coniugati con sostanze

fluorescenti

• IIC: anticorpi coniugati con enzima

perossidasi (rivelato poi da una reazione

istochimica)

immunocitochimica

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Microtubuli nella cellula in interfase

Immunofluorescenza con anticorpi anti-tubulina

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

immunocitochimica

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Il

micro-

scopio

ottico

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Il

micro-

scopio

ottico

MICROSCOPIO OTTICO

Il MO determina:

• un aumento del potere di risoluzione

il potere risolutivo di uno strumento

determina la distanza minima alla quale due punti vicini possono essere distinti

Per l’occhio umano R = 0,1 mm

• un ingrandimento dell’immagine

è più importante:

l’ingrandimento

o

il potere di risoluzione?

il potere risolutivo di uno strumento

(e non l’ingrandimento) determina il massimo livello di

dettaglio che si può ottenere nell’immagine

Questione di dimensioni…

0,1 nm

1 nm

10 nm

100 nm

1 µm

10 µm

100 µm

1 mm

OcchioOcchio umanoumano

MicroscopioMicroscopio otticoottico

MicroscopioMicroscopio elettronicoelettronicoa a trasmissionetrasmissione

cell. epiteliali

globuli rossi

batteri

virus

proteine

aminoacidi

atomi

MicroscopioMicroscopio elettronicoelettronicoa a scansionescansione

Vedremo che Vedremo che

ll’’osservazione di osservazione di

diversi livelli di diversi livelli di

organizzazione della organizzazione della

materia vivente materia vivente

richiede lrichiede l’’uso di uso di

diversi strumentidiversi strumenti mitocondri

Potere risolutivo 200-250 nm

il microscopio

elettronico a

trasmissione

filamento(catodo)

anodo

condensatore

preparato

obiettivo

proiettore

schermofluorescente

B

il

microscopio

elettronico a

trasmissione

filamento(catodo)

anodo

condensatore

preparato

obiettivo

proiettore

schermofluorescente

B

MICROSCOPIO ELETTRONICO • Gli elettroni sono emessi da un

filamento al tungsteno per effetto termoionico (calore) ed accelerati da un campo elettrico

• Il fascio di elettroni si propaga nel vuoto e viene focalizzato sul campione tramite una lente (bobine magnetiche)

• La traiettoria degli elettroni subisce delle modifiche quando incontra il campione

• l’immagine dipende dalle differenze nella dispersione degli elettroni nelle diverse parti del preparato

• L’immagine è raccolta su uno schermo fluorescente

• BIANCO E NERO

Microscopio ottico ed elettronico a

confronto

POTERE RISOLUTIVO

• In microscopia elettronica il potere risolutivo può essere

enormemente aumentato perché è utilizzato un raggio di elettroni al quale può essere associata una lunghezza d’onda molto piccola (λ)=0,005

• Per il microscopio elettronico λ = 0,005 nm

R = 0,002 nm (teorico)

il reale limite di risoluzione è 0,1-0,2 nm

*NA=apertura numerica ed NA=nsena, con n=indice di rifrazione del mezzo e sena il seno del semiangolo di apertura

Potere risolutivo = 0,61 λ

NA*

Risoluzione

Potere risolutivo = 0,61 l NA

Per il microscopio ottico l = 500 nm

R = 0,2 mm = 200 nm

Per il microscopio elettronico l = 0,005 nm

R = 0,002 nm (teorico)

il reale limite di risoluzione è 0,1- 0,2 nm

Luce visibile= 400-900 nm

DIFFERENZE TRA MO e TEM

MICROSCOPIO ottico MICROSCOPIO elettronico

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

L’Immagine è osservata direttamente dall’occhio

Ingrandimento fino a 1.500X

Potere risolutivo = 0,2 mm Potere risolutivo = 1 nm (0,001 mm.)

Preparazione del campione richiede Preparazione del campione richiede

se congelato solo 20 min almeno 1 giorno

DIFFERENZE TRA MO e TEM

L’immagine si forma su uno schermo fluorescente

Ingrandimento fino a 2.000.000X

Microscopia elettronica

• Preparazione del tessuto

– Fissazione in glutaraldeide

– Postfissazione in tetrossido di osmio

– Disidratazione con alcol

– Inclusione in plastiche acriliche o resine epossidiche dure (epon, araldite)

• Taglio all’ultramicrotomo

– Sezioni di 20-40 nm

• Aumento del contrasto

– Coloranti elettronici: metalli pesanti come acetato di uranile o citrato di piombo

ultramicrotomo

l’ultramicrotomo produce tipicamente sezioni di 50-70 nm

Esempio di

microscopia

elettronica a

trasmissione

linfocito

Le immagini di

microscopia elettronica

sono “in bianco e nero”. Le parti “scure” si dicono elettrondense.

L’altissimo potere

risolutivo del ME

consente di distinguere

numerose componenti

subcellulari.

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

ERITROCITI AL

MO E ME

Plasmalemma di globulo rosso

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

Microscopio elettronico

a scansione

• Risoluzione piu’ bassa rispetto alla ME a trasmissione

• Consente di valutare il rilievo degli

oggetti

• Usata per lo studio delle superfici

cellulari

Ma

cro

fag

o in m

icro

scopia

ele

ttro

nic

a a

sca

nsio

ne

TECNICHE IN

ISTOLOGIA

ca

pe

llo

alcuni esempi di

microscopia

elettronica a

scansione…

globuli

rossi

Microscopio a

scansione:

superficie dei

globuli rossi

TECNICHE IN

ISTOLOGIA