TECNICHE ANALITICHE PRINCIPALI

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CORSO DI LAUREA FARMACIA E C.S.F.

ANALISI BIOCHIMICO – CLINICHE

A.A. 2010 – 2011 G.F. CORTELLI

cap. 1

TECNICHE ANALITICHE

PRINCIPALI

A.A 2010 – 2011 G.F. CORTELLI

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PRINCIPALI TECNICHE ANALITICHE

1. SPETTROFOTOMETRIA

a. di emissione (a fiamma)

b. assorbimento atomico

c. UV e visibile

1 a. Spettrofotometria di emissione (a fiamma)

PRINCIPIO: un corpo solido, portato all’incandescenza per

assorbimento di energia termica o elettrica, emette uno

spettro continuo a diverse lunghezze d’onda.

APPLICAZIONE: fotometri a fiamma per la determinazione

di Na, K, Li … (tale metodo, nella AUTOMAZIONE della

chimica clinica, è stato sostituito da ELETTRODI SPECI-

FICI e SELETTIVI per i singoli ioni, incorporati in Moduli

separati, ma inseriti nel sistema analitico automatizzato – MODULI ISE)

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1 a. Spettrofotometria di emissione (a fiamma)

Fotometri a fiamma per la determinazione di metalli alcalini e alcalino terrosi

1 b. Spettrofotometria ad assorbimento atomico

PRINCIPIO: un elemento in un dato stato fisico, può assor-

bire le stesse radiazioni elettromagnetiche che emette-

rebbe se, nel medesimo stato, venisse eccitato (Principio

di Kirchof). Il sistema è paragonabile alla Spettrofotome-

tria UV / Visibile, ma con elementi di determinazione e

lettura diversi.

APPLICAZIONE: impiegato per la determinazione di metalli

pesanti (Piombo, Cadmio, Zinco, Selenio …)

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1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (1)

PRINCIPIO: avvenuta la reazione specifica (enzimatica o colorimetrica) si forma una soluzione in grado di assor-bire (ad una caratteristica lunghezza d’onda) una quan-tità di luce monocromatica proporzionale alla quantità di analita presente nel prodotto di reazione. La quantità di luce assorbita sarà l’indice della concentrazione dell’analita.

Lo Spettrofotometro è composto da:

- Sorgente luminosa

- Monocromatore (filtri interferenziali o prisma)

- Cuvetta di lettura

- Fotomoltiplicatore o fotocellula


Nei moderni Analizzatori automatizzati per la grossa routine il monocromatore (filtro o prisma) è posto dopo la

cuvetta di lettura, cosicchè

- si possono leggere più lunghezze d’onda comprese tra

340 e 600 nm.

- si possono applicare sistemi di misura in bicromatismo

- si possono calcolare indici di sottrazione per sieri lipe-

mici, itterici o emolitici (modalità LIH)

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1 c. Spettrofotometria UV / Visibile


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• PIATTI REATTIVI E CUVETTE DI REAZIONE


• AU 5400, OLYMPUS

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BICROMATISMO: è una tecnica che, impiegando 2 filtri di

lettura (a due lunghezze d’onda diverse, una principale e una secondaria), può leggere simultaneamente l’assorbi-

mento del campione (prodotto di reazione) e l’assorbi-

mento di eventuali interferenze, dovute per esempio a

torbidità, o presenza di bolle nella cuvetta di reazione, o

variazioni di intensità luminosa … Avverrà allora una compensazione ed il valore della seconda lettura sarà

sottratto al valore ottenuto con il filtro principale. Teori-

camente l’assorbimento letto con il filtro secondario do-

vrebbe essere pari a zero, ma ciò non avviene, per le

molte variabili a cui è soggetta la lettura di una reazione.


/ / / lettura del bianco

reattivo + siero (noise, [C]

rumore di fondo)

- - - lettura del prodotto

di reazione

___ risultante dopo sot-

trazione del noise:

valore definitivo (vero)

T (sec) e Pt. di lettura

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VARIABILI da considerare nella valutazione di un metodo spettrofotometrico e/o di uno strumento:

- SENSIBILITA’ (dipende dal metodo)

- PRECISIONE (dipende dallo strumento)

- ACCURATEZZA (dipende dal metodo)

- LINEARITA’ (dipende dal metodo)


- 1) SENSIBILITA’ : non dipende dallo strumento ma èlegata al metodo ed alla sua capacità di dosare piccole quantità del componente studiato; NON ha un valore numerico. Con il termine di LIMITE DI RILEVABILITA’ si intende la più piccola quantità di sostanza che il metodo riesce a dosare (cioè a distinguere dal bianco, posto = allo 0 teorico). Dal punto di vista strumentale può anche venir definito come un rapporto tra il segnale analitico e il segnale di fondo (“rumore / noise”).

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1 c. Spettrofotometria UV / Visibile (6/1)

- 2) PRECISIONE : è la CONCORDANZA fra i risultati di una serie di distinte misure, ottenute con lo stesso metodo su uno stesso campione. Essa dipende dallo STRUMENTO ed in particolare da:

- SELEZIONE DELLA LUNGHEZZA D’ ONDA

- REGOLAZIONE DELLO “ZERO” DELLO STRUMENTO

- TEMPERATURA DI REAZIONE

- DISPENSAZIONE DEL CAMPIONE E DEI REATTIVI

- …


- PRECISIONE: per verificare la precisione di un metodo analitico (o di uno strumento) si procede alla lettura consecutiva di una serie di almeno 20 frazioni dello stesso campione, ripetuta in un’unica seduta analitica e, successivamente, in giornate diverse.

La distribuzione dei risultati ottenuti viene rappresentata graficamente con una CURVA A CAMPANA detta CURVA DI GAUSS (o curva degli errori).

Lo “zero” dello strumento viene verificato periodicamente mentre le altre variabili (lunghezza d’onda, temperatura di reazione, aghi di dispensazione siero / reattivi, lampada) vengono standardizzate con tarature sistematiche (con standard specifici) o con controlli periodici della temperatura, dello stato degli aghi … (MANUTENZIONE)

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- 3) ACCURATEZZA: dipende dalla specificità del metodo:

essa è il grado di concordanza tra il valore medio trovato e il valore “vero” conosciuto; anche l’accuratezza si rife-

risce di solito ad una serie di risultati ottenuti in condizio-

ni stabilite e non ad un singolo risultato.

- SPECIFICITA’: non può essere disgiunta dall’accuratez-

za: essa è la proprietà del metodo di dosare solo ed inte-ramente la sostanza studiata, senza subire interferenze

da parte di altre sostanze presenti nel composto. Se la

specificità non è soddisfacente bisogna cercare un altro

metodo (es. enzimatico anziché colorimetrico …)


SPECIFICITA’: essa, così come l’accuratezza, può quindi

essere influenzata da molte cause:

- REATTIVI

- STRUMENTI

- COMPOSIZIONE DEL CAMPIONE

- ANALITI

- MANUTENZIONE

- …

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- 4) LINEARITA’:dipende dalla metodica impiegata e non dalla strumentazione; graficamente essa viene rappresentata dalla deviazione della LEGGE DI LAMBERT-BEER per alte concentra-zioni di analita nella sostanza in esame.

La legge di L.-B. risulta valida per soluzioni o diluite, o che comunque siano dentro ad ambiti adatti di concentrazione, e qualora si usino radiazioni monocromatiche.


Tutti i parametri visti possono essere influenzati da altri fenomeni, che possono interferire sulla determinazione indipendentemente dallo strumento o dal reattivo usato.

Essi sono:

- CARRY OVER

- INTERFERENZE

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- CARRY OVER: si riferisce al dosaggio di uno stessoanalita ed è un fenomeno di TRASCINAMENTO che si può avere a causa di un ago di campionamento non ben lavato tra una “dispensazione” e l’altra e che perciò rimane “inquinato”, oppure quando la cuvette di lettura èstata precedentemente impiegata per il dosaggio di un analita a concentrazione molto alta.

SOLUZIONE DEL PROBLEMA: lavaggi prolungati degli aghi, e manutenzione puntuale dello strumento.


- INTERFERENZA: riferito al dosaggio di analiti diversi, si

verifica quando nella stessa cuvetta vengono dosati in successione, analiti i cui reattivi o le cui sostanze endo-

gene del siero stesso possono dare reazioni interferenti.

SOLUZIONE DEL PROBLEMA: lavaggi prolungati ed eventuale spostamento dei reattivi di un determinato

analita interferente in una posizione (canale) diversa.

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Curva di una reazione

enzimatica (crescente)

cinetica e misurazione

dell’intervallo fra due

punti della reazione (con

bireattivo)

PRINCIPALI TECNICHE ANALITICHE

2. TURBIDIMETRIA

3. NEFELOMETRIA

PRINCIPIO: Il fondamento delle tecniche turbidimetriche e

nefelometriche è la misura della luce assorbita o diffusa da

parte di un sistema eterogeneo quale può essere una solu-

zione colloidale o un precipitato finemente disperso.

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2.3. TURBIDIMETRIA / NEFELOMETRIA (2)

• EFFETTO TYNDALL : quando un raggio di luce attraversa un sistema contenente una fase dispersa, si può avere sia ASSORBIMENTO di una parte della luce, sia DIFFUSIONE della luce stessa (per una serie di processi di riflessione, di rifrazione e

di diffrazione).

• I due fenomeni sono in realtà sempre presenti, ma il loro contributo

risulta molto differente, a secondo delle dimensioni delle particelle

presenti in sospensione.

• Quando prevale il fenomeno di assorbimento (sospensione di

particelle grandi rispetto la � usata per la misura) conviene usare misure turbidimetriche.

- Quando invece la sospensione è molto fine, è preferibile la misura

nefelometrica.


• Entrambe le tecniche vengono attualmente usate in chimica clinica, per rilevare proteine – ANTIGENI: Ag – del siero, che hanno reagito con ANTICORPI SPECIFICI: Ab formando particelle dello stesso diametro: Ag – Ab che creano una torbidità nella soluzione finale.

• Le difficoltà da superare per la standardizzazione della turbidimetria in chimica clinica erano dovute alle diverse dimensioni delle particelle, alle diverse lunghezze d’onda (�) impiegate, ai tempi di lettura differenti.

• Con l’alta tecnologia odierna, molti problemi sono stati superati (es.con aggiunta di colloidi protettori, standardizzazione dei tempi di lettura, formazione di sospensioni stabili e riproducibili, letture a lunghezze d’onda attorno a 500 nm …) percui i metodi turbidimetrici vengono attualmente adottati anche sulla strumentazione automatizzata della grossa ruotine.

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• TURBIDIMETRIA: per la lettura in turbidimetria èsufficiente uno spettrofotometro e grazie al progresso tecnologico oggi è possibile utilizzare questa metodica anche con la strumentazione automatica per la grossa routine in chimica clinica; vengono così eseguiti i dosag-gi della maggior parte delle proteine.

• NEFELOMETRIA: tale tecnica rimane adatta per la determinazione di fasi disperse molto fini (effetto Tyndallapprezzabile) e servono strumenti dedicati; la misura della luce difratta dalle particelle si esegue ad angolo retto rispetto alla direzione della luce incidente. Oggidìsolo le proteine più “nobili” vengono eseguite con questa tecnica (immunoglobuline, aptoglobina …)

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4. SPETTROSCOPIA DI RIFLETTANZA (1)

• Si applica per la determinazione di analiti che, dopo una

reazione chimica, formano una sostanza colorata soprauna striscia reattiva (CHIMICA SECCA O DRY CHEMI-

STRY) oppure per la lettura di strisce, ove è stata fatta

una separazione di varie fasi, successivamente colorate

(ELETTROFORESI).

PRINCIPIO: si basa sulla variazione dell’intensità

luminosa della luce riflessa (ad una specifica lunghezza

d’onda) da una superficie dove è avvenuta una reazione

chimica.


ESEMPI DI APPLICAZIONE:

- Dosaggio del glucosio in pazienti diabetici

- Dosaggio semiquantitativo per esame chimico urine

- Dosaggio quantitativo di vari analiti nel sangue (Dry chemistry)

- Determinazione del profilo proteico dopo separazione

elettroforetica

- Determinazione di alcuni analiti presso Studi Medici

- Determinazione di alcuni analiti in Veterinaria

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DRY CHEMISTRY (1)

• Determinazione quantitativa di analiti in Dry Chemistry: la tecnica (sviluppata dalla Kodak) e adattata a strumen-tazione di laboratorio per grossa routine viene impiegata largamente in U.S.A. per l’esecuzione del test al letto del paziente e per il POINT OF CARE TESTINTG (P.O.C.T.)

• La tecnica si basa su LASTRE a vari strati (5)

• 1) Strato di diffusione: ha una porosità isotropica (con proprietà fisiche costanti indipendenti dalla direzione) e serve per distribuire uniformemente il campione sulla superficie della lastra trattenendo molecole, quali proteine, lipidi e pigmenti del siero.


DRY CHEMISTRY (2)

• 2) Strato di Reagenti: su di esso sono presenti i reagenti

specifici (completi o parziali) e qui avviene la reazione (finale o parziale), prima del passaggio alla successiva

membrana.

• 3) Membrana semipermeabile: essa consente il

passaggio del solo prodotto intermedio di reazione.

• 4) Strato indicatore: contiene il reattivo finale che porta al colore.

• 5) Supporto trasparente: è costituito da una pellicola

trasparente attraverso la quale viene effettuata la lettura

fotometrica (per riflessione).

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DRY CHEMISTRY (3)

• Determinazine semiquantitativa in Dry Chemistry:

• l’applicazione più diffusa è quella delle striscie reattive

per la determinazione dei caratteri chimici delle URINE.

• Procedimento: una goccia di campione (urina) reagisce su un supporto imbevuto del reattivo specifico; la

colorazione che si forma è letta per riflessione mediante

l’uso di fibre ottiche, mentre l’intensità del colore sarà

proporzionale alla concentrazione dell’analita.


DRY CHEMISTRY (4)

• Gli analiti dosati (semiquantitativamente) sono:

• pH

• Emoglobina

• Glucosio

• Acetone

• Proteine

• Pigmenti biliari

• Urobilinogeno

• Nitriti

• Peso specifico (in rifrattometria)

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DRY CHEMISTRY (5)

• Vantaggi della Chimica Secca (Dry Chemistry):

• Più agevole lo smaltimento dei rifiuti (solo solidi)

• Rapidità di esecuzione e di ottenimento del dato analitico

• Svantaggi della Chimica Secca (Dry Chemistry) per le determinazioni quantitative:

• Poche Ditte sul mercato (Kodak,Dasit), perciò: monopolio

• Rigidità delle calibrazioni, per ogni serie di lastre

• Sistema rigorosamente “chiuso”

5. TECNICHE ELETTROFORETICHE (1)

• PRINCIPIO: si sfrutta la migrazione di macromolecole,

dotate di carica elettrica, poste in un mezzo liquido, sotto l’influenza di un campo elettrico. In campo biochimico, la

principale applicazione è rappresentata dallo studio

quantitativo o semiquantitativo delle proteine seriche.

• Due sono le principali tecniche usate nei laboratori:

• - ELETTROFORESI ZONALE

• - ELETTROFORESI CAPILLARE

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• ELETTROFORESI ZONALE: I componenti sono:

• 1) SUPPORTO SOLIDO INERTE

• 2) DEPOSITORE DEL CAMPIONE

• 3) VASCHETTA DI MIGRAZIONE

• 4) VASCHETTE DI COLORAZIONE

• 5) RIFLETTOMETRO PER LA LETTURA


• SUPPORTO INERTE: deve essere permeabile alla sostanza da separare e non interferire nella reazione di separazione; può essere: carta da filtro, gel di amido, acetato di cellulosa, gel di agarosio o di poliacrilamide.

• DEPOSITORE DEL CAMPIONE: con questo dispositivo si compie l’unica operazione non automatizzata dell’intero processo; a seconda del supporto usato, la quantità di campione varia da 2 a 50 !

• VASCHETTA DI MIGRAZIONE: contiene la soluzione tampone (a pH 8.6), nella quale vengono immerse le due estremità della striscia. Viene poi applicata una differenza di potenziale con una tensione costante di 100 – 300 V, per circa 20’ (per tempi più lunghi: effetto Joule), per permettere alle proteine di migrare a velocità diversa a seconda della loro diversità di carica,verso il catodo o verso l’anodo.

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• VASCHETTE DI COLORAZIONE: i coloranti possono

essere: amido Schwatz, rosso Ponceau, blue di bromocresolo, verde di bromofenolo, sudan nero, red oil

(per lipoproteine), reattivo di Schiff (per glicoproteine) …

• RIFLETTOMETRO: prima della lettura, il supporto deve

essere diafanizzato, ponendolo su una lastrina di vetro in stufa a 40°circa per 20’; poi con il riflettometro si misura

l’assorbanza delle bande colorate tramite un fascio di

luce a lunghezza d’onda (�) adatta a seconda del

colorante usato e si ottiene un tracciato elettroforetico.


ELETTROFORESI ZONALE (classica)

elettrodi

- - - - supporto (es. acetato di cellulosa)

-.-.-.- vaschette con tampone

differenza di potenziale

supporto di acetato di cellulosa

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