FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI COLORIMETRICI E...

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– C

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ITIC

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I C

LIN

ICH

E

METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI

Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano sulla

interazione di radiazione elettromagnetica con la materia

Da tempo sono tra i metodi di rivelazione e quantificazione più

impiegati in Chimica Analitica Clinica

Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su interazioni con specie

molecolari che atomiche

• Assorbimento

• Emissione

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METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI

• Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano

sulla interazione di una radiazione elettromagnetica

con la materia

• Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su

interazioni con specie molecolari che atomiche

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E

MECCANISMO DELL’INTERAZIONE

• Assorbimento: la luce viene assorbita da un atomo,

ione o molecola portandoli ad un più alto stato di energia

• Emissione: rilascio di un fotone da parte di un atomo,

ione o molecola portandoli ad un più basso stato di

energia

In funzione del tipo di interazione utilizzato, possiamo

distinguere metodi di assorbimento e di emissione.

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LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE (I)

Energia del fotone = h

h = costante di Planck (6,626 x 10-34 J s) = frequenza (s-1)

All’aumentare di la frequenza e l’energia del fotone diminuiscono

= cc = velocità della luce

Unità di più comuni:

nm = 10-9 mÅ = 10-10 m

m = 10-6 m

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E

LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE (II)

Tipo Lunghezza d’onda Energia Interazione

< 0,1 nm emissione nucleare

raggi X 0,1-10 nm transizioni elettroniche (elettroni interni)

UV 10-380 nm transizioni elettroniche(elettroni di valenza)

Vis 380-800 nm transizioni elettroniche(elettroni di valenza)

IR 800 nm-100 m transizioni vibrazionali

Microonde 100 m- 1 cm transizioni rotazionali

onde radio 1 cm- metri assorbimento nucleare

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E

LO SPETTRO ELETTROMAGNETICO

= c / = c / E = hE = h

Energia

10-14 10-12 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 1 102 104 106 108 1010

1022 1019 1017 1015 1014 1010 106 103 1 10-3

Ultravioletto Visibile Infrarosso

Ra

gg

i c

os

mic

i

Ra

gg

i g

am

ma

Ra

gg

i X

Ult

rav

iole

tto

Vis

ibil

e

Infr

aro

ss

o

Mic

roo

nd

e

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da

r

Te

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NM

R

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dio

Ult

ras

uo

ni

Su

on

i(u

dib

ile

)

Infr

as

uo

ni

Frequenza [Hz]

Lunghezza d’onda [m]

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E

IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO

Una sostanza assorbe la luce solo quando l’energia della radiazione corrisponde a quella necessaria per far avvenire una transizione

Le transizioni possono essere:

• Elettroniche

• Vibrazionali

• Rotazionali

Le ultime due riguardano solo le molecole

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E

Transizioni elettroniche

Provocano modifiche nella distribuzione degli elettroni di un atomo o

di una molecola:

• Molecola (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali molecolari)

* n n*

• Atomo (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali atomici)


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ICH

E

TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO ATOMICO

S2

S1

S0

E E

S0 S2

S0 S1

S0 S2 S0 S1

I

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SPETTRO DI ASSORBIMENTO ATOMICO

Anche con atomi, che è il caso più semplice, si ha un processo di assorbimento relativamente complesso.

L’atomo di idrogeno presenta uno spettro di assorbimento “a righe” complesso dovuto a transizioni elettroniche all’interno dei sottolivelli s,p,d,f

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Transizioni vibrazionaliCausano modifiche nella lunghezza di un legame e quindi nella separazione media di due nuclei (IR)

A B A B

Transizioni rotazionaliCausano modifiche dell’energia di una molecola quando essa ruota rispetto al suo centro di gravità (microonde)

A----B A----B


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L’assorbimento della luce da parte delle molecole è un processo molto complesso

• In una molecola ogni livello di energia elettronica è suddiviso in un certo numero di sottolivelli vibrazionali

• In aggiunta ciascun sottolivello vibrazionale è ulteriormente suddiviso in sottolivelli rotazionali


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Livelli Elettronici(interazioni UV)

Sotto-livelli Vibrazionali(interazioni IR)

Sotto-livelli Rotazionali(interazioni microonde)

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• L’interazione con una molecola e l’assorbimento coinvolgono quindi non solo livelli elettronici, ma anche sotto-livelli vibrazionali e rotazionali.

• Le interazioni con altre molecole avranno anch’esse un effetto, con il risultato che lo spettro di assorbimento sarà a “bande” (ci saranno talmente tante transizioni che sarà impossibile distinguere le une dalle altre).

ASSORBIMENTO MOLECOLARE

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TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE


E

S0

S1

S2

I

Energia dei livelli elettroniciEnergia dei livelli vibrazionaliEnergia dei livelli rotazionali

Transizioni elettroniche

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TRANSIZIONI ELETTRONICHE NELLA FORMALDEIDE

Transizione

n *Transizione

n *(285 nm)

Transizione

*Transizione

*(187 nm)

H

C O

H

H

C O

H

H

C O

H

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UV/Vis, IR

• La identificazione di un composto si può effettuare sulla base del suo spettro di assorbimento, mediante confronto con lo spettro di un materiale noto o di uno standard di riferimento.

• Ciò viene fatto principalmente con la tecnica IR poiché lo spettro IR contiene più informazioni rispetto a quello UV e Vis.

ANALISI QUALITATIVA

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• L’assorbimento di radiazioni nel UV, Vis e IR copre un ampio range di lunghezze d’onda.

• Eseguendo una scansione, cioè misurando l’assorbimento alle diverse lunghezze d’onda, si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza in esame

SPETTRI UV/Vis, IR

Esempio di spettro di assorbimento molecolare:

Lunghezza d’onda

UV VisibleNear

IRIR

ANALISI QUALITATIVA

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E

UV/Vis - Transizioni elettroniche

IR - Transizioni vibrazionali (interazioni di legame)

Gli spettri UV e Vis si ottengono con lo stesso strumento

mentre quelli IR, a causa soprattutto dei differenti materiali e

sorgenti necessari, richiedono un altro tipo di

strumentazione.

Le informazioni che si ottengono sono diverse:

ANALISI QUALITATIVA

SPETTRI UV/Vis, IR

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PP

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AZ

ION

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E

L’occhio umano vede il colore complementare di quello assorbito

COLORE E TRASMISSIONE DELLA LUCE

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ASSORBIMENTO E COLORE COMPLEMENTARE

650-780

595-650

560-595

500-560

490-500

480-490

435-480

380-435

rosso

arancio

giallo-verde

verde

verde-bluastro

blu-verdastro

blu

violetto

blu-verde

blu-verdastro

porpora

rosso-porpora

rosso

arancio

giallo

giallo-verde

Lunghezza d’onda (nm) Colore assorbito Colore complementare

800

700

600

500

400

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E

La legge fondamentale su cui si basano i metodi di

assorbimento è quella di Lambert e Beer

la quantità di luce assorbita da una soluzione è

funzione della concentrazione della sostanza

assorbente e della lunghezza del cammino ottico

ANALISI QUANTITATIVA

KPdN

dP

P P - dP

dN

P = potenza della radiazione incidente

N = numero di molecole che assorbono nel cammino ottico

K = costante di proporzionalità

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E


N

0

P

P

dNKP

dP

0

KNP

Pln

0

Poiché N dipende sia dalla concentrazione c che dal

cammino ottico b si ha:

abcP

Plog

0

bc'KKN

a è comunemente definita come “assorbività” ed include anche il termine di conversione dei logaritmi da base e a base 10:

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E

KNP

Pln

0

abcP

Plog

0

abcP

Plog 0 T= P/P0

abc)Tlog( abcA

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P/P0 è anche denominata

Trasmittanza (T)

-logT = A

dove A viene definita

Assorbanza

A = bc

Il rapporto P/P0 è la misura della luce che passa attraverso la soluzione e non viene assorbita


P0

c

bP

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cbP/PlogP/PlogTlogA 00

LA LEGGE DI LAMBERT E BEER

Concentrazione

Ass

orb

anza

1.5

0.0

0.5

1.0

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EQUAZIONI FONDAMENTALI

abcP

Plog

0

abcP

Plog 0

abc)Tlog(

A)Tlog(

abcA

bcA

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N A

PP

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ION

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E

• Ogni strumento presenta caratteristiche diverse quindi è

meglio determinare l’assorbività utilizzando standard

• E’ possibile utilizzare qualsiasi unità di concentrazione:

Molarità, Normalità, ppm, ecc.

• Se la concentrazione viene espressa in Molarità ed il

cammino ottico in cm, l’assorbività viene definita come

assorbività molare () ed ha unità M-1cm-1

DETERMINAZIONE DELLA ASSORBIVITA’

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N A

PP

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ICH

E Se si ha una piccola variazione di durante le misure e non si è al

valore di max si potrebbe ottenere una notevole variazione nella

risposta

MISURA DELL’ ASSORBANZA

Piccolo errorePiccolo errore

Grande erroreGrande errore

Stessa variazione di lunghezza d’ondaStessa variazione di lunghezza d’onda

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E


La determinazione della concentrazione di una soluzione può

essere effettuata mediante due approcci di base:

1. L’assorbività della sostanza è nota o è stata già

determinata mediante standard

2. Metodo del rapporto: si basa sulla misura dell’assorbanza

di uno standard noto e del campione incognito

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1:

Una soluzione di Co(H2O)2+ presenta un’assorbanza a 530

nm in una cella di 1.00 cm. Il valore dell’assorbività molare e è 10 Ln-1cm-1.Qual è la sua concentrazione?

A = bc c = A / b

C = 0.20 / 10 x 1 = 0.020 M

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E 2:L’assorbanza di una soluzione di MnO4

- è 0.500 a 525 nm. Una

soluzione 1.0x10-4 M di MnO4- presenta un’assorbanza di 0.200

quando è stata misurata alle stesse condizioni.Determinare la concentrazione della soluzione a concentrazioni non nota. In questo esempio non si conosce la lungehzza della cella, ma

siccome è la stessa per le due misure, non è necessario conoscerla.

nota

x

nota

x

bc

bc

A

A

nota

x

nota

x

c

c

A

A

notanota

xx cA

Ac

Quindi è facile calcolare il valore della concentrazione incognita:

Cx = (0.500/0.200) 1.0x10-4 = 2.5x10-4 MQuesto metodo considera che si lavora nel range lineare.

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Sebbene nella legge di Lambert e Beer compaia l’assorbanza

della soluzione, la grandezza fisica che viene effettivamente

misurata è la trasmittanza.

L’errore nella determinazione di una concentrazione mediante una

misura spettrofotometrica (c) è quindi legato all’errore che si ha

nella misura della trasmittanza (T).

Applicando la legge sulla propagazione degli errori alla legge di

Lambert e Beer si ha:

c/c = (0.4343 / TlogT) T

ERRORE NELLA MISURA DELL’ ASSORBANZA

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E L’andamento di c/c in funzione di T è il seguente:

Errore relativo in funzione della %TE

rro r

e re

lativ

o s u

co n

c .

80% 20%

%T

ERRORE NELLA MISURA DELL’ ASSORBANZA

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Questa deviazione potrebbe essere dovuta al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità

Questa deviazione potrebbe essere dovuta al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità

Questa deviazione potrebbe essere dovuta ad un auto-assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzione

Questa deviazione potrebbe essere dovuta ad un auto-assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzione

Ambit

o lin

eare

Ambit

o lin

eare

Deviazione dalla relazione lineare

Molte sostanze danno una risposta lineare solo in un certo

intervallo di concentrazione

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Con il termine luminescenza si indicano tutti quei processi (fluorescenza, fosforescenza) che comportano l’emissione di radiazione da parte delle molecole.

La luminescenza può essere indotta da diversi processi, fra i quali l’assorbimento di radiazione. In tal caso si parla di fluorescenza e fosforescenza, che si verificano ad una energia inferiore a quella alla quale la radiazione viene assorbita, e lo spettro di emissione è approssimativamente l’immagine speculare di quello di assorbimento.

Int e

nsit à

di e

mi s

sion

e

( M-1cm

-1)

assorbimento emissione

SPETTROFLUORIMETRIA-LUMINESCENZA

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E’ possibile dimostrare che, quando l’assorbanza della soluzione è sufficientemente bassa (A 0,05) esiste una proporzionalità diretta fra l’intensità dell’emissione PF e la concentrazione:

dove P0 è la potenza della radiazione incidente e k è una costante che contiene, fra l’altro, il valore della resa quantica di emissione dell’analita

Le misure di emissione non sono misure assolute:Per effettuare misure quantitative è quindi indispensabile utilizzare una curva di calibrazione

ckPPF 0

concentrazione

PF

A 0,05

ASPETTI QUANTITATIVI

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SPETTROFLUORIMETRIA vs. SPETTROFOTOMETRIA

Spettrofotometria Spettrofluorimetria

Applicabilità Ampia Ristretta(relativamente poche sostanze

emettono)

Intervallo di linearità Ampio Ristretto

Sensibilità (oppure Media Elevatalimite di rivelazione) (è possibile utilizzare rivelatori più

sensibili o aumentare P0)

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E

BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA

• La luminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica

nell’UV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della

transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello

energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale

• La chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui

l’energia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una

reazione chimica

• La bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel

visibile che si verifica in organismi viventi

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Si parla di chemiluminescenza quando l’emissione non è indotta da assorbimento di radiazione ma da una reazione chimica. Il numero di analiti naturalmente luminescenti è relativamente ristretto.

In molti casi è però possibile rendere luminescenti analiti non emittenti mediante derivatizzazione, ovvero attraverso una reazione chimica indicatrice che comporta il legame dell’analita ad una specie luminescente.

APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA

A + B C* C + h

C

NH

NH

C

NH2 O

O

O2/OH-

NH2

COO-

COO-

+ h + N2 + H2O

- Luminol (used to detect blood)

- phenyl oxalate ester (glow sticks)

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Luciferin + O2

LuciferaseO C

O O

C R2

R1

SpontaneousCO2 + O C*

R2

R1

Light

S

N

HON

S

O

HO

Luciferin (firefly)

“Glowing” PlantsLuciferase gene cloned into plants

Bioluminescenza

APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA

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– C

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ITIC

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ICH

E

STRUMENTAZIONE PER SPETTROFOTOMETRIA

• I componenti principali della strumentazione UV/Vis e IR sono simili, indipendentemente dalla radiazione che deve essere misurata

• Ogni strumento comprenderà i seguenti componenti:

sorgente di luce cella per il campione selettore di lunghezza d’onda rivelatore

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E

STRUMENTAZIONE

Schema a blocchi di un tipico spettrofotometro UV/ Vis per assorbanza

rispostaCampioneSorgenteSelettore

di Rivelatore

Chemiluminometro

Nelle misure di luminescenza l’emissione di

radiazione da parte del campione è ottenuta o

mediante eccitazione del campione stesso con

radiazione di un’opportuna lunghezza d’onda o

per reazione chimica

risposta

Sorgente

Selettore di

RivelatoreSelettore di Campione

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E

CONTENITORI PER IL CAMPIONE (CUVETTE)

• Devono essere trasparenti a tutte le che si utilizzano • Devono essere di geometria (cammino ottico) definita

Quelle più comunemente utilizzate per analisi quantitative sono

parallelepipedi con cammino ottico di 1 cm

Intervallo di trasparenza: Silice

150-3000 nm Vetro

375-2000 nm Plastica

380-800 nm

quarzo o silice fusa

vetro o plastica

KBr, NaCl

UV Visibile IR

Cuvette standarda) volume complessivo 2-3 ml b) volume complessivo 0,2-1 ml

a b

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E

RIVELATORI

• In questi rivelatori la radiazione colpisce

un catodo iniziale, provocando

l’emissione di elettroni: effetto

fotoelettrico

• Gli elettroni prodotti vengono moltiplicati

attraverso la collisione con una serie di

catodi intermedi

• La corrente misurata è così amplificata,

rispetto a quella iniziale, di un fattore

molto elevato (106 – 107)

anodo

catodo

catodiintermedi

Fotomoltiplicatori (PM)

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SPETTROFOTOMETRO A SINGOLO RAGGIO

monocromatore

fenditura di ingresso

fenditura di uscita

cella porta campione

rivelatore

sorgente

elemento disperdente (prisma/reticolo)

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RIVELATORI

Rivelatori a stato solido: fotodiodo

• Quando si applica un opportuno potenziale ad un cristallo di Si drogato si ottengono due aree:

• In condizioni di riposo non si ha passaggio di corrente

regione p regione n

n - ricche di elettroni p - ricche di cariche positive

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RIVELATORI

Rivelatori a stato solido: fotodiodo

• Quando il fotodiodo viene esposto alla luce, la radiazione

incidente produce nuove coppie di cariche positive e negative

all’interno del materiale, permettendo il passaggio della corrente.

• L’intensità di corrente è

proporzionale alla quantità

di luce incidente.

• Un fotodiodo costa meno

di un fotomoltiplicatore.

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RIVELATORI

Array di fotodiodi

• E’ costituito da una serie di fotodiodi, ricavati ad intervalli

di spazio regolari su di un microchip. Ciascuno fotodiodo

risponde ad una data lunghezza d’onda

• Inserito in uno strumento con una ottica opportuna, questo

tipo di rivelatore permette di misurare simultaneamente

radiazioni di diverse lunghezze d’onda

reticolo

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SPETTROFOTOMETRO A SINGOLO RAGGIO A SERIE DI DIODI

reticolo

lampada adeuterio

fenditura

cella porta campione

otturatore

lampada atungsteno

rivelatore a serie di diodi

lente

lente

• Questi strumenti sono in grado di effettuare la misura in un tempo brevissimo (anche meno

di un secondo), permettendo quindi di studiare anche variazioni spettrali che

avvengono in tempi molto brevi.

• Possiedono però certe limitazioni: ad esempio, la risoluzione è limitata dal numero degli

elementi del rivelatore a serie di fotodiodi, e di solito non è minore di 0,5-1 m.

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E

SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO

• Uno spettrofotometro a doppio raggio misura

contemporaneamente l’assorbimento della

radiazione da parte del campione e del riferimento

• Il rapporto fra queste due grandezze rappresenta

l’assorbimento dovuto all’analita, ed è indipendente

da tutte le altre variabili legate alla variazione della

lunghezza d’onda

• Esistono due tipi di spettrofotometri a doppio raggio:

spettrofotometri a doppio raggio nel tempo

spettrofotometri a doppio raggio nello spazio

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SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NEL TEMPO

chopper

sorgente

monocromatore

fenditura diingresso

fendituradi uscita

campione

rivelatore

elementodisperdente

riferimento

• Uno spettrofotometro a doppio raggio nel tempo utilizza un “chopper” (di solito

uno specchio rotante) per inviare alternativamente la radiazione attraverso il

campione ed attraverso il riferimento

• La radiazione alternativamente trasmessa da campione e riferimento viene poi

misurata da un unico rivelatore

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SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NELLO SPAZIO

• Esistono limitazioni applicative per gli spettrofotometri a doppio raggio

nel tempo: ad esempio non è possibile misurare correttamente

variazioni di assorbanza che avvengono a velocità confrontabili o

maggiori di quella di rotazione del chopper. Non è quindi possibile

effettuare studi cinetici che coinvolgono reazioni veloci

• In uno strumento a doppio raggio nello spazio il fascio di radiazione

viene diviso in due parti mediante uno specchio fisso, ed i due fasci

vengono inviati rispettivamente sul campione e sul riferimento

• Non esistono parti mobili, ed è possibile studiare anche processi

molto veloci

• Sono però necessari due rivelatori distinti, che devono possedere

caratteristiche simili

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SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NELLO SPAZIO

specchio divisoredi fasciosorgente

monocromatore

fenditura diingresso

fendituradi uscita

campione

rivelatoreelementodisperdente riferimento

rivelatore

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CRITERI DI SCELTA DI UN METODO COLORIMETRICO

• Specificità della reazione• Campo di proporzionalità A/[C]• Stabilità del colore• Riproducibilità• Limpidità della soluzione• Sensibilità • Convenienza (tempo/costo)

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METODI DI DOSAGGIO DELLE PROTEINE

• Assorbimento diretto a 280 nm• Kjeldahl (idrolisi e det. dell’azoto)• Biureto (reattivo al rame)• Lowry (rame + reattivo di Folin)• Bradford (Coomassie Blu)• (Fluorescamina)

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DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONEDETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

Cromofori di una proteina:legame peptidicoTyr max a 276 nmTrp max a 280 nmPhe max a 256-260 nm (poco)

ci si riferisceall’ aminoacido libero

Metodo gravimetrico (pesata)Bisogna avere molto campione a disposizione ed allo stato puro altrimenti l’errore può essere molto elevato.Ha siti che possono reagire con altri gruppi, molecole,...

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E

Cromofori nelle proteineCromofori nelle proteine

Il legame peptidico (210

nm)

Ponte disolfuro(250 nm)

Centrato a 280 nm


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E

Metodo diretto E’ necessario avere a disposizione molta proteina (metodo assoluto).A 280 nm qual è il contributo di ciascun aa all’Assorbanza totale? Phe Tyr Trp cambia da proteina a proteinaNon c’è solo un problema di composizione ma di interazione fra anelli aromatici diversiSe ci sono più Tyr non è dato dalla somma, dipende dalla posizione che occupano sulla catena.

Metodo indiretto Ad es. Bradford sono metodi relativi Blu di Comassie legato alla proteina è blu se non è legato è marroncino. A 595 nm si misura l’Assorbanza del complesso PD e non D.


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E METODI INDIRETTIMETODI INDIRETTI

Molto spesso non è importante sapere la quantità assoluta,ma avere un metodo riproducibile che sia sensibile e che permettadi valutare la quantità in maniera relativa (avendo a disposizione uno standard).Blu di Comassie si lega alle proteine, ma a tutte in egual misura?

P + C PC

L’equilibrio deve essere tutto spostato a destraDeve essere completa, bisogna usare cioè un largo eccesso di colorante.

Riassumendo:1) la quantità che si lega deve essere la stessa per tutte le proteine;2) la reazione deve essere completa;3) il colorante libero non deve assorbire.


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EMetodo di Lowry Metodo di Lowry sensibilità: qtà inferiori a 10 g/mlQuando si mescola alla soluzione proteica il reagente di Folin (tungstato, molibdato e fosfato di sodio) ed una soluzione di solfato di rame si sviluppa un colore blu-porpora che può essereletto a 600 nm. Tris e tamponi zwitterionici (PIPES, HEPES) interferiscono. Il colore sviluppato dipende dal contenuto di tirosina e triptofano.

Reaction schematic for the Modified Lowry Protein Assay.


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E Metodi dell’acido bicinconinico (BCA).

Simile al Lowry, dipende dalla conversione di Cu++ in Cu+ in condizioni alcaline che viene poi rilevato mediante reazione con il BCA per ottenere un color porpora letto a 562 nm. E’più sensibile rispetto al Lowry (qtà inferiori a 0.5g/ml) e più tollerante per la presenza di altri composti.


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E Bradford Protein AssayBradford Protein Assay

The Bradford assay is a protein determination method that involves the binding of Coomassie Brilliant Blue G-250 dye to proteins.

The dye exists in three forms: cationic(red), neutral (green), and anionic (blue).

Under acidic conditions, the dye is predominantly in the doubly protonated redcationic form (Amax = 470 nm). However, when the dye binds to protein, it is converted to a stable unprotonated blue form (Amax = 595 nm).

It is this blue protein-dye form that is detected at 595 nm in theassay using a spectrophotometer or microplate reader.


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E

Work with synthetic polyamino acids indicates that Coomassie Brilliant Blue G-250 dye binds primarily to basic (especially arginine) and aromatic amino acid residues.

The extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is constant over a 10-fold concentration range. Thus, Beer's law may be applied for quantitation of protein.

Certain chemical-protein and chemical-dye interactions interfere with the assay. Interference from non-protein compounds is due to their ability to shift the equilibrium levels of the dye among the three colored species.


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Metodo di Bradford

Tietz

max = 595 nm

Tietz

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Selezione della proteina standard

La proteina ideale da usare come standard è la forma assolutamente pura della proteina da dosare. In assenza di tale proteina si può usare un’altra proteina come standard relativo. Il miglior standard relativo deve dare una colorazione simile a quella della proteina da saggiare. Le proteine più usate come standars sono il BSA e la gamma-globulina


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NH

NH2

N

CH3

O

OH

Creatina

NH

N

NH

CH3

O

Creatinina Picrato

NO2 NO2

NO2

O-

NO2 NO2

NO2

O-

APPLICAZIONI CLINICHE: SPETTROFOTOMETRIA DIRETTA

+ H2O

- H2O

+

La creatinina è il prodotto di eliminazione per via renale della creatina: il tasso di creatinina è quindi un indice della funzionalità renale

Possibili interferenze con composti chetonici, glucosio, proteine

Complessogiallo

=520 nm

Reazione di Jaffe

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O

NHNH

N HNH

O

O

METODI SPETTROFOTOMETRICI DIRETTI

NH C NH 2

O

NH

O

NH

Ouricasi

Determinazione dell’acido urico nel siero

3. L’allantoina non assorbe a 290 nm quindi la concentrazione dell’acido urico si ottiene per differenza

b

Ac

1. Misura di assorbanza a 290 nm: assorbono altri costituenti

2. Aggiunta di uricasi: decomposizione del solo acido urico

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SPETTROFOTOMETRIA INDIRETTA

I metodi spettrofotometrici indiretti fanno uso di reazioni enzimatiche

Questi metodi coprono dal 50% al 70% delle analisi di un laboratorio clinico

Sono molto sensibili perché sfruttano come risposta il turn-over del substrato

Sono basati su reazioni primarie e reazioni indicatrici

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E

OH

N

NOCH3

CH3 NH2

N

NOCH3

CH3 N

O

H2O2 + +HRP

Reazione indicatrice

fenolo

4-amminofenazoneReattivo di Trinder

Composto chinoiderosso-aranciomax=510 nm

SPETTROFOTOMETRIA INDIRETTA

Determinazione del Glucosio con Glucosio Ossidasi (GOD)

Reazione primaria

C6H12O6 + H2O + O2 Acido gluconico + H2O2

GOD

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TEST OTTICO DI WARBURG

N+

R

NH2

O

NR

NH2

O

..+ H+ + 2e- + H+

200 400

lunghezza d'onda (nm)

Ass

orb

anza

NAD

NADH

260 340

NAD NADH

E’ la reazione indicatricepiu’ impiegata in spettrofotometriaindiretta per applicazioni cliniche:Massimi di assorbanza separati permettono misure cinetiche

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DENATURAZIONE DEL DNA

FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI COLORIMETRICI E...

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Transcript of FACOLTA DI SCIENZE FF MM NN – CHIMICA ANALITICA CON APPLICAZIONI CLINICHE METODI COLORIMETRICI E...