Tecniche analitiche per Tecniche analitiche per l'autenticazione e la l'autenticazione e la

tracciabilità degli tracciabilità degli alimentialimenti

Analiti utili per tracciabilità e Analiti utili per tracciabilità e autenticazioneautenticazione

elementi e isotopielementi e isotopi: si tratta di parametri spesso legati al : si tratta di parametri spesso legati al terreno, in particolare per quanto riguarda gli elementi in terreno, in particolare per quanto riguarda gli elementi in tracce, e quindi idonei per la tracciabilità; sono utili anche tracce, e quindi idonei per la tracciabilità; sono utili anche per l'autenticazioneper l'autenticazione

composticomposti: una vastissima gamma di composti può essere : una vastissima gamma di composti può essere sfruttata analiticamente per classificare e quindi sfruttata analiticamente per classificare e quindi autenticare gli alimenti; più difficile è impiegarli per la autenticare gli alimenti; più difficile è impiegarli per la tracciabilitàtracciabilità

parametri spettraliparametri spettrali: è possibile impiegare alcuni parametri : è possibile impiegare alcuni parametri spettrali, es. assorbanze a determinate spettrali, es. assorbanze a determinate , come variabili , come variabili per ottenere classificazioni di gruppi di alimenti; anche in per ottenere classificazioni di gruppi di alimenti; anche in questo caso i parametri sono più idonei all'autenticazione questo caso i parametri sono più idonei all'autenticazione che alla tracciabilitàche alla tracciabilità

Molti parametri chimico-fisici sono utilizzabili allo scopo di Molti parametri chimico-fisici sono utilizzabili allo scopo di autenticareautenticare o o tracciaretracciare un prodotto alimentare. Essi sono di un prodotto alimentare. Essi sono di tre tipi:tre tipi:

Stable Isotope Analysis (SIA)Stable Isotope Analysis (SIA): probabilmente la tecnica più efficiente, : probabilmente la tecnica più efficiente, sfrutta la spettrometria di massa o la tecnica NMR per evidenziare le sfrutta la spettrometria di massa o la tecnica NMR per evidenziare le distribuzioni isotopiche caratteristiche di materiali aventi origine diversadistribuzioni isotopiche caratteristiche di materiali aventi origine diversa

Tecniche di analisi elementare (GF-AAS, ICP-AES, ICP-MS)Tecniche di analisi elementare (GF-AAS, ICP-AES, ICP-MS): si tratta di : si tratta di tecniche in grado di determinare quasi tutti gli elementi del sistema tecniche in grado di determinare quasi tutti gli elementi del sistema periodico a concentrazioni estremamente basse. Particolarmente periodico a concentrazioni estremamente basse. Particolarmente promettente per la tracciabilità sembra essere la determinazione delle promettente per la tracciabilità sembra essere la determinazione delle terre rare o lantanidi (REE)terre rare o lantanidi (REE)

Tecniche cromatograficheTecniche cromatografiche: un insieme di tecniche di separazione, alcune : un insieme di tecniche di separazione, alcune delle quali sono impiegate per la determinazione di classi di composti che delle quali sono impiegate per la determinazione di classi di composti che possono essere utilizzati nella differenziazione di prodotti alimentaripossono essere utilizzati nella differenziazione di prodotti alimentari

Tecniche elettroforeticheTecniche elettroforetiche: altro insieme di tecniche di separazione, di : altro insieme di tecniche di separazione, di grande potenzialità nel campo agroalimentaregrande potenzialità nel campo agroalimentare

Tecniche di analisi molecolareTecniche di analisi molecolare: molto diffuse in campo analitico, : molto diffuse in campo analitico, promettente la versione NIR (Near Infrared)promettente la versione NIR (Near Infrared)

Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)Risonanza Magnetica Nucleare (NMR): si tratta di una tecnica potentissima : si tratta di una tecnica potentissima per la differenziazione di prodotti alimentari di origine diversa o ottenute per la differenziazione di prodotti alimentari di origine diversa o ottenute con procedimenti diversicon procedimenti diversi vedi lezioni Prof. Botta vedi lezioni Prof. Botta

Le tecniche potenzialmente più utili nel campo dell'autenticazione e della Le tecniche potenzialmente più utili nel campo dell'autenticazione e della tracciabilità degli alimenti sono le seguenti:tracciabilità degli alimenti sono le seguenti:

Tecniche di analisi Tecniche di analisi elementareelementare

Le tecniche di analisi elementare, e in particolare quelle di Le tecniche di analisi elementare, e in particolare quelle di spettroscopia atomica, sono in grado di determinare spettroscopia atomica, sono in grado di determinare elementi a livello di tracce e ultratracce. Spesso questi elementi a livello di tracce e ultratracce. Spesso questi elementi fungono da elementi fungono da marcatorimarcatori, fornendo informazioni , fornendo informazioni sull'origine delle materie prime con cui è confezionato un sull'origine delle materie prime con cui è confezionato un prodotto alimentare. Le tecniche di maggior utilità per prodotto alimentare. Le tecniche di maggior utilità per l'autenticazione in campo agroalimentare sono le seguenti:l'autenticazione in campo agroalimentare sono le seguenti:

• spettroscopia di assorbimento atomico con fornetto di spettroscopia di assorbimento atomico con fornetto di grafite (GF-AAS)grafite (GF-AAS)

• spettroscopia di assorbimento atomico con fiamma (FAAS)spettroscopia di assorbimento atomico con fiamma (FAAS)

• tecniche al plasmatecniche al plasma• spettroscopia di emissione atomica con plasma (ICP-spettroscopia di emissione atomica con plasma (ICP-

AES)AES)• spettrometria di massa con plasma (ICP-MS)spettrometria di massa con plasma (ICP-MS)

Spettroscopia di assorbimento Spettroscopia di assorbimento atomicoatomico

Metodo di Metodo di atomizzazionatomizzazion

ee

Temperatura di Temperatura di atomizzazione atomizzazione (°C)(°C)

TecnicaTecnica

FiammaFiamma 1700-32001700-3200 FAASFAAS

ElettrotermicoElettrotermico 1200-30001200-3000 GF-AAS, ET-AASGF-AAS, ET-AAS

Tecniche al plasmaTecniche al plasma

Plasma Monocromatore Detector

Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry (ICP-AES)

Plasma Analizzatore a quadrupolo Detector

Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry (ICP-MS)

Schema della Schema della strumentazionestrumentazione

• Sistema di introduzione Sistema di introduzione del campionedel campione

• Torcia ICP e riserva di gasTorcia ICP e riserva di gas

• Generatore di Generatore di radiofrequenzeradiofrequenze

• Spettrometro (ottico o Spettrometro (ottico o massa)massa)

• Rivelatori e sistema Rivelatori e sistema elettronico associatoelettronico associato

• Sistema di controllo e Sistema di controllo e acquisizione dati via PCacquisizione dati via PC

Un tipico spettrometro al plasma è composto dalle seguenti parti:Un tipico spettrometro al plasma è composto dalle seguenti parti:

Principio dell’emissione Principio dell’emissione atomicaatomica

CI

hE

Esempio di strumento ICP-Esempio di strumento ICP-AESAES

Pompa Pompa peristalticaperistaltica

NebulizzatoreNebulizzatoreCamera di Camera di

nebulizzazionenebulizzazione

Smaltimento Smaltimento fumifumiSistema Sistema

otticoottico

2 canali:2 canali:1 per il 1 per il

campionecampione1 per lo scarico1 per lo scarico

al PCal PCTorcia di Torcia di quarzo in quarzo in posizione posizione assialeassiale

Principio della separazione di Principio della separazione di ioniioni

Sorgente ionica (plasma)Sorgente ionica (plasma)

MagneteMagnete

m/z 56 (Fem/z 56 (Fe++))

m/z 63 (Cum/z 63 (Cu++))

m/z 64 (Znm/z 64 (Zn++))

Lo strumentoLo strumento

Pompa Pompa peristalticaperistaltica

NebulizzatoreNebulizzatoreCamera di Camera di

nebulizzazionenebulizzazione

Smaltimento Smaltimento fumifumi

Spettrometro Spettrometro di massadi massa al PCal PCTorcia di Torcia di

quarzoquarzoInterfacciaInterfaccia

Spettro di massa con ICPSpettro di massa con ICP

Ad ogni picco nell’intervallo 2-240 u.m.a. (unità di massa atomica) Ad ogni picco nell’intervallo 2-240 u.m.a. (unità di massa atomica) corrisponde uno ione monoelementare a massa/carica ben definita, oppure corrisponde uno ione monoelementare a massa/carica ben definita, oppure ioni poliatomici che costituiscono interferenze positiveioni poliatomici che costituiscono interferenze positive

Limiti di rivelabilitàLimiti di rivelabilità

I limiti di I limiti di rivelabilità più rivelabilità più bassi si ottengono bassi si ottengono con la tecnica ICP-con la tecnica ICP-MSMS

Tecniche cromatograficheTecniche cromatografiche

Tra le tecniche più idonee all’analisi di campioni Tra le tecniche più idonee all’analisi di campioni agroalimentari vi sono le cosiddette agroalimentari vi sono le cosiddette tecniche tecniche cromatografichecromatografiche, utilizzate per separare e identificare , utilizzate per separare e identificare singolarmente i componenti di una miscelasingolarmente i componenti di una miscela

Il termine deriva dal Il termine deriva dal greco ed è legato al suo greco ed è legato al suo inventore, un botanico inventore, un botanico russo di nome Tzwett russo di nome Tzwett (nato ad Asti), che (nato ad Asti), che all’inizio del XX secolo all’inizio del XX secolo intendeva separare le intendeva separare le sostanze coloranti della sostanze coloranti della clorofillaclorofilla

La prima separazioneLa prima separazione

Tswett intendeva separare i pigmenti Tswett intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; riempì una presenti nella clorofilla; riempì una colonna di vetro con carbonato di colonna di vetro con carbonato di calcio, vi depositò in testa un estratto calcio, vi depositò in testa un estratto di foglie verdi ed eluì con solfuro di di foglie verdi ed eluì con solfuro di carbonio: i vari pigmenti si carbonio: i vari pigmenti si separarono in bande coloratesepararono in bande colorate

Tswett chiamò questa procedura Tswett chiamò questa procedura cromatografiacromatografia dal greco dal greco scrittura del scrittura del colorecolore o, visto il significato del suo o, visto il significato del suo cognome in russo, cognome in russo, scrittura di Tswettscrittura di Tswett

Queste tecniche sono molto varie, ma si basano tutte su un Queste tecniche sono molto varie, ma si basano tutte su un principio comune: esse sfruttano la differenza di interazione dei principio comune: esse sfruttano la differenza di interazione dei componenti di una miscela nei confronti di un supporto statico, la componenti di una miscela nei confronti di un supporto statico, la fase fissafase fissa o o stazionariastazionaria, e di un supporto dinamico, la , e di un supporto dinamico, la fase mobilefase mobile o o eluenteeluente, che fluisce attraverso la fase fissa trascinando le sostanze , che fluisce attraverso la fase fissa trascinando le sostanze componenti la miscela. Durante l’attraversamento, detto processo componenti la miscela. Durante l’attraversamento, detto processo di eluizione, i componenti subiscono un rallentamento più o meno di eluizione, i componenti subiscono un rallentamento più o meno marcato a seconda della loro affinità per la fase fissa ed escono da marcato a seconda della loro affinità per la fase fissa ed escono da essa a tempi diversi, in modo da poter essere identificati uno per essa a tempi diversi, in modo da poter essere identificati uno per uno. Le sostanze che compongono la miscela vengono identificate uno. Le sostanze che compongono la miscela vengono identificate mediante un rivelatore posto all’uscita dalla fase fissa che registra mediante un rivelatore posto all’uscita dalla fase fissa che registra le modifiche di alcune proprietà chimico-fisiche. Il responso che si le modifiche di alcune proprietà chimico-fisiche. Il responso che si ottiene si chiama ottiene si chiama cromatogrammacromatogramma

Principi della cromatografiaPrincipi della cromatografia

Tipi di cromatografiaTipi di cromatografia

I due gruppi principali di tecniche cromatografiche I due gruppi principali di tecniche cromatografiche sono:sono: la la cromatografia liquidacromatografia liquida, nella quale la fase , nella quale la fase

mobile è liquida e la fase fissa è solida o liquida mobile è liquida e la fase fissa è solida o liquida

la la gascromatografiagascromatografia, nella quale la fase mobile è , nella quale la fase mobile è gassosa e la fase fissa è solida o liquidagassosa e la fase fissa è solida o liquida

Nella cromatografia liquida (LC) la fase fissa è Nella cromatografia liquida (LC) la fase fissa è una colonna o un supporto planare contenente il una colonna o un supporto planare contenente il materiale attivo, la fase mobile è un liquido; materiale attivo, la fase mobile è un liquido; essa è utilizzata per la separazione di sostanze essa è utilizzata per la separazione di sostanze poco volatili come idrocarburi ad alto peso poco volatili come idrocarburi ad alto peso molecolare, molecole biologiche (proteine, molecolare, molecole biologiche (proteine, grassi), sostanze ioniche o ionizzabili (anioni, grassi), sostanze ioniche o ionizzabili (anioni, amine, zuccheri)amine, zuccheri)

Cromatografia liquidaCromatografia liquida

Particolarmente usate Particolarmente usate sono la cromatografia sono la cromatografia ad alta pressione o ad alta pressione o HPLC per la HPLC per la separazione di separazione di sostanze neutre e la sostanze neutre e la cromatografia ionica cromatografia ionica (IC) per la separazione (IC) per la separazione di sostanze ionichedi sostanze ioniche

Esempio di Esempio di cromatogrammacromatogramma

Un esempio di analisi HPLC si ha nella figura sottostante, Un esempio di analisi HPLC si ha nella figura sottostante, nella quale è mostrata la separazione e identificazione di nella quale è mostrata la separazione e identificazione di antocianine in un campione di vino Cabernet Sauvignonantocianine in un campione di vino Cabernet Sauvignon

Recentemente, uno sviluppo importante della tecnica HPLC è stato Recentemente, uno sviluppo importante della tecnica HPLC è stato l’interfacciamento alla spettrometria di massa per ottenere strumenti LC-MS, l’interfacciamento alla spettrometria di massa per ottenere strumenti LC-MS, in modo da poter avere in ogni istante lo spettro di massa delle sostanze in modo da poter avere in ogni istante lo spettro di massa delle sostanze separateseparate

Tecnica LC-MSTecnica LC-MS

La tecnica LC-MS La tecnica LC-MS consente di avere consente di avere informazioni informazioni strutturali sulle strutturali sulle molecole separate e molecole separate e quindi permette di quindi permette di riconoscere in riconoscere in maniera più semplice maniera più semplice i vari composti. Quasi i vari composti. Quasi sempre gli alimenti, sempre gli alimenti, in quanto campioni di in quanto campioni di natura organica, sono natura organica, sono miscele complesse miscele complesse contenenti numerose contenenti numerose sostanze diversesostanze diverse

Un esempio di analisi HPLC-MS si ha nella figura sottostante, Un esempio di analisi HPLC-MS si ha nella figura sottostante, nella quale è mostrata la separazione di antocianine nel vino nella quale è mostrata la separazione di antocianine nel vino (sx alto) e gli spettri di massa relativi ad alcuni picchi(sx alto) e gli spettri di massa relativi ad alcuni picchi

Nella gascromatografia (GC) la fase fissa è una colonna contenente il materiale Nella gascromatografia (GC) la fase fissa è una colonna contenente il materiale attivo e la fase mobile è un gas; essa è utilizzata per la separazione di sostanze attivo e la fase mobile è un gas; essa è utilizzata per la separazione di sostanze volatili o volatilizzabili come idrocarburi a basso peso molecolare, aromi, acidi volatili o volatilizzabili come idrocarburi a basso peso molecolare, aromi, acidi organici. Tra le varie versioni, particolarmente utilizzata in campo agroalimentare organici. Tra le varie versioni, particolarmente utilizzata in campo agroalimentare è la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) che è la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) che consente di avere informazioni strutturali sulle sostanze separateconsente di avere informazioni strutturali sulle sostanze separate

GascromatografiaGascromatografia

Esempio di Esempio di gascromatografogascromatografo

Forno per la colonna

Iniettore

Impostazione dei

parametri strumentali

Interfaccia cromatografo – spettrometro di

massa

Spettrometro di massa

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

2500e3

5000e3

7500e3

10.0e6

12.5e6

15.0e6

al PC

Esempio di cromatogramma Esempio di cromatogramma GC-MSGC-MS

0 25 50 75 100 125 1500e3

500e3

1000e3

1500e3

2000e3

2500e3

3000e3

3500e3

4000e3120

91

65

51

77 105144136

0 25 50 75 100 125 150 1750e3

250e3

500e3

750e3

1000e3

1250e3

1500e3

1750e3

2000e3

2250e3

2500e3 150

135

77

107

51

63 89

117 166 175

cromatogrammacromatogramma

tempo di ritenzionetempo di ritenzione

spettrispettri di di

massamassa

m/zm/z

I database di cui I database di cui dispongono i moderni dispongono i moderni strumenti GC-MS strumenti GC-MS contengono gli spettri contengono gli spettri di massa di circa di massa di circa 400.000 composti, tra 400.000 composti, tra cui quasi tutti quelli di cui quasi tutti quelli di interesse in chimica interesse in chimica degli alimenti. Per degli alimenti. Per confronto, è sempre confronto, è sempre possibile riconoscere i possibile riconoscere i composti separaticomposti separati

m/zm/z

Un esempio di analisi GC-MS si ha nella figura Un esempio di analisi GC-MS si ha nella figura sottostante, nella quale è mostrata la separazione sottostante, nella quale è mostrata la separazione e identificazione di composti volatili in un vino e identificazione di composti volatili in un vino Nebbiolo mediante SPMENebbiolo mediante SPME

Tecniche elettroforeticheTecniche elettroforeticheLe tecniche elettroforetiche sono spesso associate alle tecniche Le tecniche elettroforetiche sono spesso associate alle tecniche cromatografiche, in quanto permettono la separazione di miscele di cromatografiche, in quanto permettono la separazione di miscele di ioni che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse ioni che migrano sotto l’effetto di un campo elettrico con diverse velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi velocità di migrazione. In realtà non si tratta di metodi cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione cromatografici veri e propri, in quanto non avviene la ripartizione degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria. Per questo sono degli analiti tra fase mobile e fase stazionaria. Per questo sono chiamate anche chiamate anche tecniche ancillaritecniche ancillari rispetto alle cromatografiche. La rispetto alle cromatografiche. La strumentazione richiesta è comunque affine e quindi sono valide strumentazione richiesta è comunque affine e quindi sono valide molte delle nozioni acquisite in campo cromatografico. La molte delle nozioni acquisite in campo cromatografico. La rivelazione delle sostanze avviene per via fotometrica, con detector rivelazione delle sostanze avviene per via fotometrica, con detector elettrochimico o mediante interfacciamento con uno spettrometro elettrochimico o mediante interfacciamento con uno spettrometro di massadi massa

Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate in campo Si tratta di un gruppo di tecniche molto utilizzate in campo biologico, biochimico e molecolare per la separazione di proteine, biologico, biochimico e molecolare per la separazione di proteine, polinucleotidi e altri biopolimeri, e in generale di ioni e anfoliti polinucleotidi e altri biopolimeri, e in generale di ioni e anfoliti (sostanze che si comportano come acidi o basi a seconda del pH, (sostanze che si comportano come acidi o basi a seconda del pH, es. aminoacidi e peptidi)es. aminoacidi e peptidi)

Applicazioni della CEApplicazioni della CEDal momento che la stragrande maggioranza delle molecole Dal momento che la stragrande maggioranza delle molecole di interesse biologico, e quindi agroalimentare, è carica, la di interesse biologico, e quindi agroalimentare, è carica, la CE ha applicazioni importanti nell’analisi di aminoacidi, CE ha applicazioni importanti nell’analisi di aminoacidi, peptidi, proteine, acidi nucleici a altri biopolimeri, con tempi peptidi, proteine, acidi nucleici a altri biopolimeri, con tempi di analisi minori rispetto a tecniche cromatografiche di analisi minori rispetto a tecniche cromatografiche equivalenti (es. SEC). In particolare, per l’analisi di proteine e equivalenti (es. SEC). In particolare, per l’analisi di proteine e peptidi è possibile separare analiti che differiscono per un peptidi è possibile separare analiti che differiscono per un solo aminoacidosolo aminoacido

Nella figura è Nella figura è mostrata mostrata l’analisi di una l’analisi di una miscela di miscela di sostanze varie sostanze varie impiegate impiegate come additivi come additivi negli alimentinegli alimenti

Tecniche spettroscopicheTecniche spettroscopiche

I metodi di riconoscimento delle adulterazioni e gli studi di I metodi di riconoscimento delle adulterazioni e gli studi di classificazione descritti sinora sono basati sulla determinazione classificazione descritti sinora sono basati sulla determinazione quali- e quantitativa di analiti, siano essi elementi, composti o quali- e quantitativa di analiti, siano essi elementi, composti o isotopiisotopi

Un approccio differente consiste nella determinazione di parametri Un approccio differente consiste nella determinazione di parametri spettroscopici quali l’assorbanza o la riflessione dei campioni a spettroscopici quali l’assorbanza o la riflessione dei campioni a determinate lunghezze d’onda, fenomeni che sono causati dalla determinate lunghezze d’onda, fenomeni che sono causati dalla presenza nel campione di molecole che sono in grado di assorbire o presenza nel campione di molecole che sono in grado di assorbire o di riflettere la luce. Questi fenomeni possono essere utilizzati come di riflettere la luce. Questi fenomeni possono essere utilizzati come variabili, senza riferimento specifico alle molecole che li causano, a variabili, senza riferimento specifico alle molecole che li causano, a scopo di classificazionescopo di classificazione

La determinazione quali- e quantitativa di questi parametri si La determinazione quali- e quantitativa di questi parametri si effettua con tecniche spettroscopiche di analisi molecolare, che si effettua con tecniche spettroscopiche di analisi molecolare, che si differenziano per l’intervallo spettrale utilizzato: sono attualmente differenziano per l’intervallo spettrale utilizzato: sono attualmente impiegate l’UV-visibile e l’Infrarossoimpiegate l’UV-visibile e l’Infrarosso

Spettroscopie molecolariSpettroscopie molecolari

• Il campione è irraggiato con luce avente Il campione è irraggiato con luce avente nell’UV, nel nell’UV, nel visibile o nell’infrarossovisibile o nell’infrarosso

• Le molecole che compongono il campione assorbono Le molecole che compongono il campione assorbono l’energia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far l’energia irradiata se essa è in quantità sufficiente per far vibrarevibrare i loro gruppi funzionali (IR) oppure per promuovere i loro gruppi funzionali (IR) oppure per promuovere transizioni elettroniche (UV- visibile)transizioni elettroniche (UV- visibile)

• La risposta del campione viene registrata sotto forma di La risposta del campione viene registrata sotto forma di spettrospettro e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla e, in base ai segnali raccolti, è possibile risalire alla composizione del campione in termini di molecole, oppure composizione del campione in termini di molecole, oppure è possibile sfruttare gli assorbimenti alle singole è possibile sfruttare gli assorbimenti alle singole a scopo a scopo di classificazionedi classificazione

Le tecniche di analisi molecolare sono utilizzate per Le tecniche di analisi molecolare sono utilizzate per determinare composti. Esse sono basate genericamente sui determinare composti. Esse sono basate genericamente sui seguenti passaggi:seguenti passaggi:

Spettroscopia InfrarossaSpettroscopia Infrarossa

Questa tecnica si basa sull’interazione tra la materia e le Questa tecnica si basa sull’interazione tra la materia e le radiazioni infrarosse, cioè radiazioni ad energia inferiore a radiazioni infrarosse, cioè radiazioni ad energia inferiore a quella della radiazione visibilequella della radiazione visibile (al di sopra di 800 nm) (al di sopra di 800 nm)

L'intervallo spettrale utilizzato L'intervallo spettrale utilizzato comprende radiazioni la cui energia comprende radiazioni la cui energia è sufficiente per far vibrare in è sufficiente per far vibrare in maniera specifica i maniera specifica i gruppi funzionaligruppi funzionali delle molecole, cioè delle molecole, cioè pezzipezzi di di molecole aventi caratteristiche molecole aventi caratteristiche particolari tali da impartire ai particolari tali da impartire ai composti che li contengono proprietà composti che li contengono proprietà chimico-fisiche rilevanti; attraverso chimico-fisiche rilevanti; attraverso l’assorbimento di radiazione IR è l’assorbimento di radiazione IR è possibile l’identificazione dei gruppi possibile l’identificazione dei gruppi funzionalifunzionali

H

C

H

OHH

alcol metilico

H

H

C

H

C OH

H

H

alcol etilico

Modalità di misura IRModalità di misura IRL’interazione tra la radiazione IR e il campione può essere in assorbimento, L’interazione tra la radiazione IR e il campione può essere in assorbimento, in trasmissione oppure in riflettanzain trasmissione oppure in riflettanza

Campo spettrale utilizzato:Campo spettrale utilizzato:

0.7 - 500 0.7 - 500 m (14000 - 20 cmm (14000 - 20 cm-1-1))• 0.7 - 2.5 0.7 - 2.5 m (14000 - 4000 cmm (14000 - 4000 cm-1-1): vicino IR (NIR)): vicino IR (NIR)• 2.5 - 20 2.5 - 20 m (4000 - 500 cmm (4000 - 500 cm-1-1): medio IR (MIR)): medio IR (MIR)• 20 - 500 20 - 500 m (500 - 20 cmm (500 - 20 cm-1-1): lontano IR (FIR)): lontano IR (FIR)

Lo spettro IR di un campione si ottiene irraggiando il campione Lo spettro IR di un campione si ottiene irraggiando il campione stesso con un intervallo più o meno ampio di stesso con un intervallo più o meno ampio di nella regione nella regione dell’infrarosso; le dell’infrarosso; le assorbite corrispondono ai gruppi funzionali assorbite corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole presenti nel campione. La risposta può essere delle molecole presenti nel campione. La risposta può essere visibile sotto forma di visibile sotto forma di spettro di assorbimento. spettro di assorbimento. Nella figura è Nella figura è mostrato lo spettro IR di una sostanza pura (vanillina), irraggiata mostrato lo spettro IR di una sostanza pura (vanillina), irraggiata con un intervallo di con un intervallo di tra 2.5 e 20 µm (o tra 2.5 e 20 µm (o compresa tra 4000 e 500 compresa tra 4000 e 500 cmcm-1-1))

Esempio di spettro IREsempio di spettro IR

Il 100% della Il 100% della scala di scala di trasmittanza trasmittanza (%T) corrisponde (%T) corrisponde ad assorbimento ad assorbimento nullo; al nullo; al contrario, lo 0% contrario, lo 0% indica che la indica che la sostanza assorbe sostanza assorbe totalmente la totalmente la

Spettro IR del vinoSpettro IR del vino

composti presenti composti presenti nel campione: i nel campione: i picchi a 1450 e picchi a 1450 e 1950 nm sono 1950 nm sono assegnabili assegnabili entrambi al gruppo -entrambi al gruppo -OH dell’acqua e OH dell’acqua e degli alcoli; la spalla degli alcoli; la spalla a 1690 nm è dovuta a 1690 nm è dovuta ai gruppi -CHai gruppi -CH33 (presenti in (presenti in numerosi composti numerosi composti nel vino) e ai gruppi nel vino) e ai gruppi –CH di composti –CH di composti aromatici (anche aromatici (anche essi in grande essi in grande quantità nel vino)quantità nel vino)

Spettro di assorbimento IR di un campione di vino bianco, registrato Spettro di assorbimento IR di un campione di vino bianco, registrato tra 450 e 2500 nm, quindi nella regione del cosiddetto NIR (Near tra 450 e 2500 nm, quindi nella regione del cosiddetto NIR (Near Infrared o vicino infrarosso). I picchi evidenziati sono dovuti Infrared o vicino infrarosso). I picchi evidenziati sono dovuti all’assorbimento diall’assorbimento di

Spettroscopia UV-visibileSpettroscopia UV-visibileNella spettrofotometria UV-visibile il campione è irraggiato con un Nella spettrofotometria UV-visibile il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di intervallo più o meno ampio di nella regione ultravioletto-visibile, nella regione ultravioletto-visibile, cioè tra 150 e 800 nm; le cioè tra 150 e 800 nm; le assorbite, aventi energia sufficiente a assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni elettroniche, corrispondono a gruppi promuovere transizioni elettroniche, corrispondono a gruppi funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimentospettro di assorbimento

Spettro di assorbimento UV-visibile di Spettro di assorbimento UV-visibile di una sostanza pura (aldeide p-una sostanza pura (aldeide p-dimetilamino cinnamica), irraggiata con dimetilamino cinnamica), irraggiata con un intervallo di un intervallo di tra 200 e 600 nm. tra 200 e 600 nm. Valori alti di assorbanza corrispondono Valori alti di assorbanza corrispondono ad assorbimenti di luce elevati. La ad assorbimenti di luce elevati. La banda a 395 nm rende conto del fatto banda a 395 nm rende conto del fatto che il composto è colorato in arancio, che il composto è colorato in arancio, colore complementare rispetto al colore complementare rispetto al violetto che corrisponde alla regione violetto che corrisponde alla regione spettrale interessata (spettrale interessata (~ 400 nm~ 400 nm))

Le bande di assorbimento UV sono in Le bande di assorbimento UV sono in numero minore rispetto all’IR, tuttavia numero minore rispetto all’IR, tuttavia è possibile utilizzarle per effettuareè possibile utilizzarle per effettuaredede

Esempio di spettro UV-Esempio di spettro UV-visibilevisibile

Lo spettro UV-visibile di un campione si ottiene irraggiandolo con un Lo spettro UV-visibile di un campione si ottiene irraggiandolo con un intervallo più o meno ampio di intervallo più o meno ampio di nella regione tra 150 e 800 nm; le nella regione tra 150 e 800 nm; le assorbite corrispondono a gruppi funzionali delle molecole assorbite corrispondono a gruppi funzionali delle molecole presenti nel campionepresenti nel campione

determinazioni quantitative secondo la legge di Lambert-Beer A = determinazioni quantitative secondo la legge di Lambert-Beer A = bCbC

Spettro UV-visibile del vinoSpettro UV-visibile del vinoSpettro di assorbimento UV-visibile (linea più sottile) di un estratto Spettro di assorbimento UV-visibile (linea più sottile) di un estratto da vino rosso contenente i composti fenolici; è mostrato anche il da vino rosso contenente i composti fenolici; è mostrato anche il grafico della derivata prima dello spettro (linea più spessa), utile ad grafico della derivata prima dello spettro (linea più spessa), utile ad evidenziare i massimi di assorbimentoevidenziare i massimi di assorbimento

Si osservano due bande Si osservano due bande principali a 538 e 280 nm: la principali a 538 e 280 nm: la prima (non a caso il vino ha prima (non a caso il vino ha colore rosso, complementare colore rosso, complementare del verde che si trova in del verde che si trova in quella zona) è dovuta agli quella zona) è dovuta agli assorbimenti delle principali assorbimenti delle principali antocianine del vino, antocianine del vino, delfinidina, malvidina e delfinidina, malvidina e petunidina, la seconda è petunidina, la seconda è dovuta a flavonoidi, alle dovuta a flavonoidi, alle procianidine e agli stessi procianidine e agli stessi antociani. Le spalle a 520 e antociani. Le spalle a 520 e 310 nm sono attribuibili alla 310 nm sono attribuibili alla cianidina, un’antocianina di cianidina, un’antocianina di solito minoritariasolito minoritaria

Analisi UV-visibile e IR del Analisi UV-visibile e IR del vinovino

Le tecniche spettroscopiche di assorbimento UV-visibile e IR, Le tecniche spettroscopiche di assorbimento UV-visibile e IR, combinate con l’analisi multivariata dei dati, possono essere combinate con l’analisi multivariata dei dati, possono essere impiegate nella classificazione dei vini. Gli spettri di impiegate nella classificazione dei vini. Gli spettri di assorbimento danno indicazioni sui composti presenti nel assorbimento danno indicazioni sui composti presenti nel campione, ma in questo caso le variabili non sono i campione, ma in questo caso le variabili non sono i composti, bensì gli assorbimenti dei campioni alle varie composti, bensì gli assorbimenti dei campioni alle varie utilizzate. Se lo spettro di assorbimento è registrato tra, utilizzate. Se lo spettro di assorbimento è registrato tra, poniamo, 200 e 800 nm, si seleziona un certo numero di poniamo, 200 e 800 nm, si seleziona un certo numero di con un passo di 1 nm, alle quali misurare l’assorbanza; in con un passo di 1 nm, alle quali misurare l’assorbanza; in questo esempio si avrebbe un dataset composto da circa questo esempio si avrebbe un dataset composto da circa 600 variabili. Il numero effettivo di intervalli di 600 variabili. Il numero effettivo di intervalli di può variare può variare a seconda della necessità di valutare spettri più o meno a seconda della necessità di valutare spettri più o meno definitidefiniti

Il vantaggio di poter applicare un simile metodo consiste nel Il vantaggio di poter applicare un simile metodo consiste nel fatto che registrare uno spettro UV o IR è generalmente più fatto che registrare uno spettro UV o IR è generalmente più semplice e rapido che effettuare una separazione semplice e rapido che effettuare una separazione cromatografica o una determinazione elementarecromatografica o una determinazione elementare