PROPOSTA E VALIDAZIONE DI UN METODO IN SPETTROMETRIA ICP-MS PER LA DETERMINAZIONE DI Pt IN ULTRATRACCE

IN CAMPIONI DI PLASMA E FRAZIONE ULTRAFILTRATA M.C. Bruzzoniti1, P. Larger2, A. Mangia3, M. Maffini3, C. Mucchino3, C. Sarzanini1 1 Dipartimento di Chimica Analitica, Università di Torino, via P. Giuria 5, 10125 Torino 2 Pharmacokinetic, Dynamics & Metabolism, Nerviano Medical Science, Viale Pasteur 10,

20014 Nerviano (MI) 3 Dipartimento di Chimica Generale ed Inorganica, Chimica Analitica, Chimica Fisica,

Università di Parma, Parco Area delle Scienze 17/A, 43100 Parma

La moderna terapia farmacologica antitumorale prevede la somministrazione di quantità di farmaco strettamente necessarie all’ottenimento degli effetti desiderati, a causa della tossicità dei principi attivi utilizzati. In quest’ambito, gli studi di farmacocinetica e la determinazione, quindi, del principio attivo nei vari fluidi biologici sono di estrema attualità e necessitano di metodi analitici sempre più accurati e sensibili [1,2]. Poiché infatti i livelli di platino nella porzione ultrafiltrata del plasma possono essere a livello di nmolL-1, sono richiesti metodi analitici estremamente sensibili, quali quelli basati sull’impiego della tecnica ICP-MS. L’ampio intervallo di concentrazione atteso rende inoltre questa tecnica particolarmente indicata. I moderni strumenti ICP-MS dispongono della cosiddetta modalità “hot plasma” che presenta vantaggi, come l’aumentata sensibilità ai rapporti massa/carica elevati senza che il rumore di fondo aumenti apprezzabilmente.

Scopo di questo lavoro è stato lo sviluppo e la validazione di un metodo ICP-MS in modalità “hot plasma” per la determinazione del Pt totale in plasma di topo e nella frazione ultrafiltrata di animali trattati con farmaci a base di Pt.

Lo strumento utilizzato è un ICP-MS X-7 (ThermoElemental, Winsford, UK) con nebulizzatore Meinardt e camera impact bead raffreddata con un peltier a 3°C. I parametri strumentali per la modalità “hot plasma” sono stati ottimizzati per ottenere almeno 2x106 cps per 238U e 1.5x106 per 115In, con una soluzione di tune a 5 µg/l. La stabilità dello strumento è stata verificata mediante una acquisizione di 10 ripetizioni di una opportuna soluzione di tune equispaziata nell’intervallo di masse (short term stability): in tutti i casi il valore RSD è risultato inferiore allo 0.7%.

Il plasma e la frazione ultrafiltrata sono stati trattati con acqua regia mediante mineralizzatore a microonde utilizzando bombe in PFA con inserto interno di quarzo. Le metodologie di trattamento del campione reperite in letteratura per questa tipologia di matrice [3] e a questi livelli di concentrazione (nmolL-1) hanno evidenziato una scarsa ripetibilità. Il ciclo di mineralizzazione è stato pertanto ottimizzato ottenendo come risultato finale CV% < 5% ottenuti dall’esecuzione di 6 replicati di mineralizzazione, utilizzando una soluzione standard alla concentrazione di 5 ngL-1 in Pt.

La validazione è stata condotta in accordo con le linee guida FDA Bioanalytical Validation [4]; inoltre, alcuni parametri sono stati definiti anche sulla base delle raccomandazioni EURACHEM/CITAC [5].

Al fine di evidenziare contaminazioni accidentali è stata adottata una opportuna strategia di mineralizzazione che ha previsto il trattamento sia del bianco di mineralizzazione che delle soluzione standard in triplicato. La retta di calibrazione è stata ottenuta utilizzando soluzioni standard mineralizzate: in ciascuna corsa l’Ir e l’Au sono stati aggiunti come standard interni alla concentrazione finale di 100 ngL-1. Sono state confrontate inoltre le pendenze delle rette risultanti

da soluzioni standard ottenute da oxaliplatin e da soluzioni standard di acido esacloro platinico, per evidenziare possibili effetti dovuti alle diverse forme dell’analita: la differenza tra le due pendenze non è risultata statisticamente significativa al livello di confidenza del 95%.

La validazione secondo il protocollo FDA è stata eseguita separatamente per le due tipologie di matrici, in considerazione degli ampi intervalli di concentrazione attese. La linearità è stata pertanto verificata nell’intervallo 5-2500 nmolL-1 per quanto riguarda la validazione sulla matrice della frazione ultrafiltrata, mentre sul plasma è stata verificata nell’intervallo 50-25000 nmolL-1.

Particolare attenzione è stata rivolta alla valutazione dell’effetto memoria mediante il confronto dell’analisi dello stesso bianco prima e dopo l’acquisizione sia di standard che di campioni di controllo (QC) di plasma e di ultrafiltrato. Effetti memoria sono stati rivelati solo relativamente all’analisi di campioni di plasma contenenti Pt ad elevata concentrazione, richiedendo pertanto l’introduzione di un’ulteriore fase di lavaggio con una miscela di HNO3 (2%), HCl (6%) e Triton X-100 (0.05%) dopo tali campioni.

Il limite di rivelabilità, la linearità, la ripetibilità intra-day e la precisione between-day sono stati valutati statisticamente considerando i risultati ottenuti nell’arco di tre giorni, utilizzando tre lotti indipendenti di standard e campioni di controllo.

La linearità è stata valutata anche applicando alla calibrazione ottenuta i test del lack-of-fit e di Mandel. La significatività dell’intercetta con α=5% è stata verificata eseguendo un t-test. E’ stato ottenuto un valore di limite di rivelabilità inferiore a 2.5 nmolL-1 (corrispondenti a circa 1 ngL-1), così come un’elevata precisione applicando la correzione per lo standard interno.

I campioni di controllo prodotti da un laboratorio esterno per entrambe le matrici biologiche (plasma e ultrafiltrato) a tre livelli di concentrazione (basso, intermedio e alto), sono stati analizzati in un blind test; l’accordo fra i risultati ottenuti e quelli dichiarati sono risultati accettabili per il protocollo bioanalitico seguito (15%).

E’ stata anche valutata la robustezza della procedura analitica rispetto al trattamento e alla conservazione del campione, confrontando i risultati ottenuti dall’analisi dei campioni di controllo conservati in un caso per 4 ore a temperatura ambiente prima dell’analisi e nell’altro scongelati e ricongelati per tre volte prima dell’analisi. In nessun caso è stata evidenziata alcuna differenza significativa.

Il metodo è stato quindi applicato all’analisi di due lotti di plasma e corrispondente frazione ultrafiltrata provenienti da topi trattati con farmaco a base di platino. Riferimenti [1] J.G. Morrison, P. White, S. McDougall, J.W. Firth, S.G. Woolfrey, M.A. Graham, D.

Greenslade, J. Pharm. Biomed. Anal., 24, (2000) 1-10. [2] M. Verschraagen, K. Van der Born, T.H.U. Zwiers, W.J.F. Van der Vijgh, J. Chromatogr. B,

772, (2002) 273-281. [3] ML-1200 Application Notes, Milestone FKV, Sorisole (BG), Italy, 1999. [4] Giudance for Industry, Bioanalytical Method Validation, Internet version, Maggio 2001

http://www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.htm [5] The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory Guide to Method Validation and

Related Topics, EURACHEM Guide, (1998) LGC, Teddington, GB; http://www.eurachem.ul.pt/