STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI STUDIO dei FENOMENI APOPTOTICI negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE negli SPERMATOZOI e CORRELAZIONE con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e con i PROCESSI di CAPACITAZIONE e

FAGOCITOSIFAGOCITOSI

DottorandaDottoranda Stefania LuppiStefania Luppi

XXXIII Ciclo del Dottorato di Ricerca in Medicina materno-infantile,Pediatria dello Sviluppo e dell’Educazione, Perinatologia

29 Settembre 2008

Relazione I anno

APOPTOSI

Morte cellulare programmata Fagocitosi corpi apoptoticiSENZA infiammazione

Ruolo essenziale nel CONTROLLO NUMERO CELLULE GERMINALI Lee et al. 1997

Spermatogenesi: PERDITA di circa il 75% del pot. numero di spz maturi Dunkel et al.1997

Rottura equilibrio=

DIFETTI MATURAZIONE

FERTILITA’??

• Individuata via di segnalazione Fas in spz EIACULATI

• M con parametri liquido seminale anormale: % spz Fas+

“APOPTOSI ABORTIVA”In alcuni casi di INFERTILITA’ compromissionedi mecc. apoptotici durante spermatogenesi, percui Spz Fas+ NON vengono eliminati.

Sakkas et al., 1999, 2002

Il SISTEMA Fas/FasL

GERM CELL

SERTOLI

FasL

FasDD

Soggetti normo- e non normo-zoospermiciFas presente su membrana LEUCOCITI

Dati i risultati contrastanti presenti in letteratura è da chiarire la presenza o meno di Fas

su spz eiaculati

RIDUZIONE dell’INTEGRITA’ di MEMBRANA

Molto frequente in SOGGETTI INFERTILI Ricci et al.,2002; Glander et al.,1999

Perdita asimmetria PL di membrana Traslocazione Fosfatidil-Serina(PS)

Evento PRECOCE di apoptosi

ec

ic

FACS

+ PI

Spermatozoi:

• vitali (AV-/PI-)

• apoptotici (AV+/PI-)

• necrotici (AV+/PI+)

Legame AnnessinaV fluo (AV) - PS

Perticarari et al., 2007

lega DNA cell vive/apoptotiche penetra in cell necrotiche

FACS

Spermatozoi:• vitali (Syto-16++)• apoptotici (Syto-16+)• necrotici (Syto-16-/7-AAD+)

Syto-16 / 7-AAD (7-Amino-Actinomycin-D)

LEUCOCITI e APOPTOSI

Funzione cellulare fisiologica dei leucociti, in assenza di infez., responsabili

di RIMOZIONE SPZ APOPTOTICI migliorando la qualità del seme.

moAb anti-CD45FACS [ ] leuco:

• monociti• linfociti• PMN

Potenziale enorme di interazioni tra leucociti e sist.riproduttivo Ruolo leucociti nel liquido seminale non ancora spiegato

Correlazione LEUCOCITI

spze INDICE APOPTOTICO spz

in soggetti normo- e NONnormo-zoospermici Ricci et al., 2002

FAGOCITOSI degli SPZ APOPTOTICI

a. In mammiferi dopo INSEMINAZIONE una grande q di spz viene

rimossa attraverso FAGOCITOSI da parte delle cellule del tratto

genitale Suarez et al., 2002; Pandya e Cohen, 1985

b. FECONDAZIONE avviene SOLO in seguito a CAPACITAZIONE degli spz nel tratto genitale

In app genitale dopo richiamo LEUCOCITI per chemotassi,

inducono APOPTOSI spz post-capacitati che NON hanno fertilizzato

l’ovocita, a cui segue la FAGOCITOSI senza reaz infiammatoria.

OBIETTIVI della RICERCA:

1. Studio dell’APOPTOSI degli spz, in condiz. fisiologiche e dopo capacitazione in vitro:

- diversi marker dell’apoptosi- in pz normo- e NONnormo-zoospermici

Metodiche: AV/PI; Syto-16/7-AAD in FACS

2. Analisi del SISTEMA Fas/FasL negli spz, in condiz. basali e dopo capacitazione in vitro e nei leucociti

Metodiche: moAb fluoresceinati anti-Fas in combinazione con il FACSmoAb fluoresceinti anti-CD45

3. Definire il ruolo dei LEUCOCITI in rapporto all’apoptosi e alla rimozione degli spermatozoi

Metodica: moAb fluoresceinati anti-CD45 in FACS

5. Analisi del processo di FAGOCITOSI degli spz in condizioni basali e dopo capacitazione in vitro in pz normo- e NONnormo-zoospermici:

- anomalie nella fagocitosi in casi di INFERTILITA’ di COPPIA- > suscettibilità di spz di maschi infertili ad essere fagocitati

Tali informazioni fornirebbero una possibilità in più per la diagnostica delle infertilità e una possibile chiave di intervento per il loro trattamento.

4. Confermare il risultato di altri studi in cui si è dimostrato che, se

indice apoptotico spz è > 40%, si riscontra < prob di gravidanza e > prob di aborti spontanei in seguito a tecniche di PMA (IUI, FIVET)

…..

RISULTATI PRELIMINARI

1) Allestito test citometrico per verificare CAPACITA’ di FAGOCITOSI degli spz da parte di MACROFAGI (FACS)

Risultati confermati con MICROSCOPIA OTTICA A FLUORESCENZA

Phrodo succinimydil ester

2) Suscettibilità spz ad essere fagocitati PRIMA e DOPO CAPACITAZIONE in vitro

Fagocitosi può favorire RIMOZIONEspz meno efficienti

Spz non coloratiSpz non cap pHrodoSpz cap pHrodo

3) Differenza dovuta a ≠ espressione di molecole di spf come C1q (macrofagi) e C1qR (spz)

AMPLIARE CASISTICA per verificare se questa differenza è correlataa ≠ fagocitosi da parte dei macrofagi e comprendere se e come

le 2 tecniche di capacitazione in vitro (MP e SU) possano influire su tale meccanismo.

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

FL1-H: C1qr FITC

0

20

40

60

80

100

% o

f M

ax

68.2

Spermi non cap solo second.004 61.2

Spermi non cap 60.006 59

Spermi non cap 74.005 68

Spermi MP NC.007 84.7

Spermi MP solo second.008 90.7

Spermi MP 60.010 91.7Spermi MP 74.009 91.5

10 0 10 1 10 2 10 3 10 4

FL1-H: C1qr FITC

0

20

40

60

80

100

% o

f M

ax

52

NON CAP CAP (mp)

NON CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60

CAP: moAb anti-C1qR clone 74, clone 60