Laboratorio di Biologia Molecolare

Open Day 11 Settembre 2013 – Ente Nazionale Risi – Centro Ricerche sul Riso

Creato nel 2006 con la finalità di effettuare Selezione Assistita con i Marcatori molecolari (SAM) quale supporto ai programmi di breeding tradizionale e di

rispondere a specifiche esigenze della filiera

STRUMENTAZIONE PRESENTE NEL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE

Preparazione del campione: mulino per materiale verde e piccole

quantità di seme mulino per la macinazione dei

campioni sottoposti ad analisi OGM

Gestione e dispensazione dei campioni: sistema robotico

Rilevazione dei prodotti PCR: celle elettroforetiche sistema di acquisizione ed analisi

dell’immagine Real-Time PCR

Amplificazione PCR: Real-Time PCR PCR con gradient

Estrazione del DNA: bagnomaria bilance centrifughe camere da vuoto

Stoccaggio dei campioni e dei reagenti: frigoriferi congelatori – 20°C ultracongelatori – 80°C

Riso Origine Promotore Gene inserito Terminatore LLrice06 USA CaMV35S bar (tolleranza al glufosinato) 35S LLrice601 USA CaMV35S bar (tolleranza al glufosinato) NOS Llrice604 USA CaMV35S bar (tolleranza al glufosinato) NOS LLrice62 USA CaMV35S bar (tolleranza al glufosinato) 35S Bt63 Cina ract-1 cry1Ab-Ac (resistenza ai lepidotteri) NOS KMD1rice Cina CaMV35S cry1Ab (resistenza ai lepidotteri) NOS KeFeng6 rice Cina CaMV35S cry1Ac + Cp Ti (resistenza agli insetti) NOS Huahui-1 Cina ract-1 cry1Ab-Ac (resistenza ai lepidotteri) NOS Tarom molaii + cry1Ab Iran PEPC cry1Ab (resistenza ai lepidotteri) 35S Golden Rice 2 IRRI ? psy + crt1 (produzione di b-carotene) ? Altri… ? ?

Link utili:

http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm http://www.gmo-compass.org/eng/home/

http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/default.asp http://www.biosafetyscanner.org/

http://cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database http://www.bats.ch/gmo-watch/

ATTIVITÀ DEL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE

La biologia molecolare è un ramo della biologia che studia ed interpreta a livello molecolare i fenomeni biologici, considerando la struttura, le proprietà e le reazioni delle molecole chimiche di cui gli organismi viventi sono costituiti. Essa comprende le tecniche che consentono la rilevazione, l'analisi, la manipolazione, l'amplificazione (PCR) e la copia (clonaggio) degli acidi nucleici.

LE FASI DI UN’ANALISI MOLECOLARE

1- Estrazione del DNA 2- Amplificazione Real-Time PCR o PCR

3- Elettroforesi

4- Analisi dei risultati

ESTRAZIONE DEL DNA

Matrice: materiale verde, sementi di riso e riso (greggio, semigreggio, lavorato)

Vantaggio: possono essere utilizzate piccole quantità di materiale Le fasi dell’estrazione del DNA:

1- Lisi cellulare per liberare il DNA dai nuclei e dalle proteine istoniche ed inattivare le nucleasi cellulari (macinazione e trattamento chimico-termico)

2- Purificazione del DNA per separare il DNA dalle componenti cellulari (proteine, lipidi, polisaccaridi) e dalle sostanze interferenti

3- Precipitazione del DNA per concentrare, desalificare e recuperare il DNA in forma solida

4- Lavaggio del DNA per rimuovere i sali in eccesso

5- Sospensione del DNA nella soluzione desiderata

Provetta contenente: - il DNA da replicare, - i desossiribonucleotidi trifosfati (A, T, G, C), - gli ioni magnesio, - i primers, - la TAQ polimerasi

Appaiamento dei primers alle regioni loro complementari dei filamenti di DNA denaturati.

Un primer è un filamento di acido nucleico che serve come punto di innesco per la replicazione del DNA.

Estensione durante la quale la Taq polimerasi produce un filamento di DNA complementare al filamento di DNA bersaglio. Molte DNA-polimerasi non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento "ex novo", ma possono solo aggiungere nucleotidi ad un filamento pre-esistente.

Denaturazione per scindere la doppia elica del DNA. I due filamenti di cui essa è composta sono liberi.

PCR 35 – 45 cicli

http://users.ugent.be/~avierstr/

PRINCIPIO DELLA REAL-TIME PCR

COSTITUZIONE DI NUOVE VARIETA’

INCROCI BREEDING ASSISTITO

Osservazioni del genotipo

(uso di marcatori molecolari)

BANCA DEL GERMOPLASMA variabilità genetica

NUOVE VARIETA’

BREEDING TRADIZIONALE

Osservazioni del fenotipo

(morfo-fisiologiche e merceologiche)

Varietà con tecnologia Clearfield®

Lungo B - Lungo A - Medio - Tondo

Aromatici o tipo Basmati

Varietà convenzionali

Resistenza a patogeni fungini

Varietà per usi speciali (produzione di farine, pasta o birra; waxy)

Differenti tipologie di varietà:

APPLICAZIONI DEL BREEDING ASSISTITO CON I MARCATORI MOLECOLARI

Fingerprinting

0 0.2

Aiace

Albatros

Apollo

Arborio

Argo

Ambra

Ariete

Arpa

Artemide

Artiglio

Asso

Augusto

Baldo

Balilla

Bianca

Bravo

Brio

Cadet

Carmen

Carnaroli

Castelmochi

Centauro

CR LB1

Creso

Cripto

Delfino

Elba

Elio

Ellebi

Eolo

Ercole Eurosis

Flipper

Fragrance

Galileo

Gange Giano

Gladio

Karnak

Koral

Libero

Lido

Loto

Marte

Nembo

Padano (Bahia)

Perla

Poseidone

Rodeo

Roma

S. Andrea

Savio

Scirocco

Scudo

Selenio

SIS R215

Sprint

Tea

Tejo

Thaibonnet

Titano

Tosca Ulisse

Venere

Vialone Nano

Volano

Opale

Luxor

Carnise Carnise precoce

Arsenal

Samba

Atlante

Analisi di fingerprinting condotta su 72 varietà italiane con 24 SSR

Il fingerprinting del DNA (o impronta

genetica) è una tecnica che permette

l’identificazione individuale a

livello molecolare,

analizzando le caratteristiche uniche del DNA di un individuo,

rendendolo riconoscibile e rintracciabile

Geni di resistenza a P. grisea L’ascomicete Pyricularia grisea (Cooke) Saccardo è l’agente patogeno responsabile del brusone, la più grave patologia fungina del riso. L’identificazione di geni di resistenza in grado di contrastare il patogeno è un valido strumento da considerare nei programmi di breeding. I geni di resistenza Pi-ta, Pi-b, Pi-kh e Pi-z conferiscono completa o parziale resistenza ai ceppi di Pyricularia grisea presenti in Italia. L’inserimento, mediante incrocio, di uno o più geni Pi (gene pyramiding) consente l’ottenimento di varietà con resistenza ad ampio spettro al patogeno, evitando i trattamenti fungicidi. Specifici marcatori molecolari strettamente associati ai geni Pi permettono di distinguere i genotipi resistenti e suscettibili.

Amplificazione PCR con RM224 per il gene di resistenza Pi-kh. M: 50 bp; A, B, D: Controlli interni negativi; C: Controllo interno positivo. I campioni 5 e 6 (Libero, Arsenal) posseggono il gene Pi-kh. I campioni 1, 2, 3, 4, 7 (Albatros, Carmen, Eolo, Scirocco, Ambra) non presentano il gene.

Amplificazione PCR per il gene Pi-ta con le primer combination YL153 /YL154 (a) e YL183 /YL87 (b). M: 100 bp. Controlli 1: Tequing, 2: Nipponbare Campioni 3: Venere, 4: Artiglio, 5: Eolo

a b

a b

a

b

Aroma La 2-acetil-1-pirrolina (2AP) è una delle molecole aromatiche responsabile del aroma del riso ed è prodotta da tutti i genotipi di riso. L’enzima Betaina Aldeide Deidrogenasi (BAD2) è coinvolto nel metabolismo della 2-acetil-1-pirrolina in quanto è in grado di degradare quest’ultima. Nelle varietà aromatiche, il gene recessivo che codifica per la BAD2 presenta una delezione di 8 bp, risultando non funzionale.

Gene BAD2 funzionale

Degradazione 2AP

Riso non aromatico

Gene BAD2 non funzionale

Accumulo 2AP

Riso aromatico

Profili molecolari del gene associato al carattere aroma

Marcatori molecolari disegnati sul gene BAD2 permettono di distinguere tra genotipi aromatici, non aromatici ed eterozigoti. L’eterozigosi indica che il genotipo non è aromatico (breeding) o che si tratta di miscela di varietà aromatiche e non (prodotto alimentare).

Contenuto di amilosio L’amido di riso è composto da amilosio e amilopectina. Il contenuto di amilosio, fattore importante della qualità dell’amido, è controllato dal gene waxy che codifica per l’enzima amido sintasi legata ai granuli (GBSS). Questo gene presenta dei SNP (Polimorfismi a Singolo Nucleotide) che sono correlati con il contenuto di amilosio. In particolare gli SNP1 e SNP4 presentano dei polimorfismi, indipendenti dall’interazione genotipo-ambiente, in grado di classificare i genotipi in 4 gruppi in base al loro contenuto di amilosio.

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A + G C + G A + T C + T

> 26% 21-26%

< 5% waxy

< 21%

marcatori SNP1 + SNP4

Profili molecolari di due SNP del gene waxy che discriminano i genotipi in base al loro contenuto di amilosio.

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Come si crea un OGM?

Preparazione del costrutto di DNA 1- Scelta del gene di interesse 2- Apertura del plasmide 3 e 4- Inserimento del gene di interesse 5- Costrutto pronto Inserimento del costrutto nelle cellule vegetali Totipotenza: capacità di una singola cellula vegetale di riprodurre una pianta intera Analisi e scelta delle piante trasformate (linee transgeniche) Introgressione del transgene in linee più produttive (mediante incrocio)

Inserimento del costrutto nelle cellule vegetali

Metodo biologico (Agrobacterium

tumefaciens)

Metodo biolistico

(particle gun)

OGM (Organismo Geneticamente Modificato): Organismo il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto si verifica in natura con l’accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale. (Dir. 2001/18/CE)

RISO OGM

EVENTI OGM RISO

PCR di Screening

PCR evento-specifica

DNA pianta DNA pianta Promotore (CaMV35S)

Terminatore (NOS)

Gene di interesse inserito

COSTRUTTO OGM

Il Laboratorio di Biologia Molecolare effettua un’analisi di screening OGM «Organismi geneticamente modificati (OGM): promotore CaMV35S e Terminatore NOS. Analisi qualitativa in Real - Time PCR ». A partire da dicembre 2011, attraverso l’adozione di un Sistema Qualità conforme ai requisiti della Norma UNI CEI EN ISO/IEC 17025, la prova di screening OGM per la ricerca del promotore CaMV35S e del terminatore NOS è accreditata ACCREDIA. L’analisi di screening OGM viene eseguita su tutte le partite di seme delle varietà di cui l’ENR è costitutore prima di essere destinate alla selezione (nuclei, pre-base, base, prima riproduzione R1 e seconda riproduzione R2). Dopo la selezione, vengono eseguite le analisi di screening OGM per singolo lotto delle partite destinate ai moltiplicatori.

il DNA è un’ etichetta molecolare indelebile

che ogni campione biologico porta con sé dall’origine alla tavola

del consumatore (resta presente nel

prodotto finito)

le analisi del DNA permettono di

risalire all’origine di un prodotto agroalimentare

anche in assenza di informazioni

cartacee o di altra origine

ogni materia prima/prodotto finito è quindi classificabile in modo univoco utilizzando

le tecnologie del DNA - codice a barre del DNA

Varietà? In miscela? Resistente a malattie?

Semidwarf? (a)pigmentato? Aromatico? OGM?

Contenuto di amilosio?

I marcatori molecolari danno la risposta!

L'acido desossiribonucleico (DNA) è un acido nucleico che contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi.

La struttura della doppia elica del DNA fu scoperta nel 1953 da James Watson e Francis Crick. Hanno ottenuto il Premio Nobel nel 1962.

Il DNA è costituito da due catene dette eliche, ciascuna delle quali è costituita da delle unità base, chiamate nucleotidi, a sua volta costituiti da uno zucchero, una base azotata (adenina, guanina, citosina, timina) e un gruppo fosfato. Le due eliche sono tenute insieme attraverso dei legami tra le diverse basi azotate, in questo modo la struttura del DNA assume la forma di un lungo nastro. Il DNA è complessato in strutture chiamate cromosomi.

La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, comunemente nota con l’acronimo PCR) è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. L'amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni.

La PCR fa in una provetta ciò che ogni cellula del nostro corpo fa ogni giorno, producendo miliardi di copie esatte del nostro DNA, amplificandolo milioni di volte.

Tale metodica fu ideata nel 1983 da Kary B. Mullis il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la chimica (1993).

1 2 4 8

Molecola iniziale di DNA

Numero di molecole di DNA

I quattro primi cicli della PCR Nel sistema dell'espressione genica cellulare sono identificabili tre punti che rappresentano la direzione fondamentale del flusso di informazione genetica, partendo dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine: • L'informazione genetica è conservata nel DNA, che

può essere duplicato nella propagazione dell'informazione,

• Il DNA, per essere espresso nella cellula, viene trascritto sotto forma di RNA,

• L'RNA viene tradotto in proteine, concepite come la forma "operativa" e terminale delle informazioni contenute nel genoma.

DNA RNA PROTEINE TRASCRIZIONE TRADUZIONE

Aromatico Eterozigote Non Aromatico