Spettroscopia di Risonanza Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)Magnetica Nucleare (NMR)

Unicam incontri

Camerino 25-26 Settembre 2003

Altisonante

Misterioso

Inquietante

Nucleare

“Tutti gli anni, verso il mese di marzo, una famiglia di zingari cenciosi piantava la tenda vicino al villaggio, e con grande frastuono di zufoli e tamburi faceva conoscere le nuove invenzioni.

Prima portarono la CALAMITA.”

Gabriel Garcia MarquezCent’anni di solitudine

Magnetica

Cronologia NMRCronologia NMR

1945 1945 Prima osservazione di un segnale NMRPrima osservazione di un segnale NMRBloch e coll. Stanford Un. (1H in H2O)Purcell e coll. Harvard Un. (1H in paraffina) (nobel 1952)

19501950 Scoperta del Chemical ShiftScoperta del Chemical Shift 1961 1961 Primo spettrometro commerciale CWPrimo spettrometro commerciale CW 1970 1970 Primo spettrometro commerciale FTPrimo spettrometro commerciale FT 19761976 Primi esperimenti 2D ( Ernst 1991 Nobel)Primi esperimenti 2D ( Ernst 1991 Nobel) 19801980 Spettrometri NMR di II generazioneSpettrometri NMR di II generazione

L’origine fisica dell’NMRL’origine fisica dell’NMR

Pauli nel 1924 introdusse l’idea dello spin nucleare

Protoni e neutroni possiedono un momento angolare di spin con relativo numero quantico di spin I=1/2

In nuclei diversi da 1H il numero quantico di spin può essere intero, semiintero o nullo; in particolare:

numero di massa dispari spin semiinteronumero di massa pari e n. atomico pari spin nullonumero di massa pari e n. atomico dispari spin intero

L’NMR dipende dall’esistenza dello spin nucleare quindi nuclei con I=0 sono magneticamente inattivi.

Spin e abbondanza nucleareSpin e abbondanza nucleare

Isotopo Spin I %1H 1/2 99.982H 1 0.01612C 0 98.8913C 1/2 1.1114N 1 99.6415N 1/2 0.3616O 0 99.7617O 5/2 0.03731P 1/2 100

Momenti magnetici nucleariMomenti magnetici nucleari

I nuclei hanno spin e sono carichi +

ogni particella carica in moto produce un campo magnetico.

ogni nucleo con un momento angolare possiede quindi un momento magnetico proporzionale.

P

<< Le cose hanno vita propria >> proclamava lo zingaro con aspro accento,

<< si tratta solo di risvegliargli l’anima.>>

2I+1 orientazioni possibili

E= h IzHo

E= h Ho

Ho

N-/N+=e-E/kT

N-

N+

E= h Ho

E=h

Ho

Diagrammadell’energia

Livelli degeneri

H0

H0

Frequenza di precessione di Larmor

Risonanza?

Irradiando il campione con delle opportune radiofrequenze e misurandone l’assorbimento potremmo ottenere lo “spettro” del composto in esame.

13C

15N

31P

1H

MHz

Chemical shiftChemical shift

Nuclei dello stesso atomo assorbono a frequenze leggermente diverse a causa del loro “intorno chimico”

Gli elettroni di un atomo inducono un piccolo campo magnetico che si oppone a quello principale

Il campo magnetico sperimentato dal nucleo è generalmente minore del campo effettivo di un fattore

H = Ho (1- ) H

Diagramma di correlazione Diagramma di correlazione 11H NMRH NMR

““Molteplicità” dei segnali NMRMolteplicità” dei segnali NMR

Ad ogni protone (carbonio, azoto …) chimicamente diverso corrisponde un segnale di diversa frequenza.

La “forma” del segnale in uno spettro NMR spesso non è un semplice picco di assorbimento ma può assumere aspetti molto diversi.

Tripletto1:2:1

Quartetto1:3:3:1

Quintetto1:4:6:4:1

Sigoletto Doppietto1:1

La molteplicità dei segnali è dovuta ai “vicini di casa”

HaHb | |

-C—C- | | a

b

Ho Ho +

Ho -

H0

Doppietto1:1

bb

HaHb | |

-C—C-Hc | |

a Ho

Ho +

Ho -

2 Ho

Tripletto1:2:1

b c

Tempi di rilassamentoTempi di rilassamento

Mxy

Tempo

Mz

Mz=M0(1-e-t/T1)

Le Risonanze MagneticheLe Risonanze Magnetiche

NMR in soluzione (ad alta risoluzione)NMR in soluzione (ad alta risoluzione) NMR allo stato solido (CP-MAS)NMR allo stato solido (CP-MAS) NMR in vivoNMR in vivo Risonanza magnetica ( imaging)Risonanza magnetica ( imaging)

NMR in soluzioneNMR in soluzione

NMR dei chimici I composti vanno sciolti in un

solvente deuterato Massima omogeneità del campo

magnetico Spettri affilati poiché il rapido moto

casuale delle molecole media a zero le interazioni dipolari anisotropiche

computer

controllielectronici

magnete a super-

conduzione

Solvente deuterato

Tubo NMR

FT

Frequenza

Tempo

spin

lock

shim

Sequenza d’impulsi

FT

1H-NMR

13C-NMR2D NMR

CH2CH3

{C8H10}

NMR allo stato solido (MAS)NMR allo stato solido (MAS)

Nei solidi i nuclei sono costretti in una determinata posizione quindi le interazioni dipolari anisotropiche (dipendenti dall’orientazione) non si annullano e gli spettri sono molto larghi.

• E.R. Andrew e I.J. Lowe dimostrarono che le interazioni dipolari anisotropiche si annullano se il campione è posto in rapida rotazione attorno ad un asse orientato a 54.74° rispetto al campo magnetico principale (Magic Angle Spinning MAS)

I campioni vengono polverizzati finemente, impaccati nel rotore e quindi messi in rotazione ad una velocità compresa tra 1 e 35 KHz

Limitata utilità nei nuclei come 1H e 19F poiché gli accoppiamenti dipolari superano i 100 KHz.

MRS in vivo e MRI (imaging)MRS in vivo e MRI (imaging)

Sono due tecniche molto conosciute per il loro utilizzo in campo biomedico ma in realtà possono essere usate in moltissimi campi scientifici.

I principi fisici fondamentali sono gli stessi dell’NMR in soluzione o MAS ma le tecniche, la strumentazione e i dati ottenuti da questi esperimenti sono molto differenti.

La prima differenza è la scomparsa del termine NUCLEARE dal nome delle tecniche.

Le differenze fondamentali derivano dalle diversità dei “campioni” da analizzare:

- omogenei nei primi due casi - assolutamente eterogenei nella MR

Gradiente

Frequenza

Ho H0

La frequenza di risonanza diventa dipendente dallo spazio.

Vista della sezione orizzontale e verticale di un tubo NMR riempito di acqua e con una barretta di plastica al centro

XY YZ

Come si ottengono queste immagini?

Immagini per retroproiezione

MR imaging

Tra le tecnologie emergenti della Medicina di laboratorio, la spettroscopia di risonanza magnetica in vivo (MRS) è particolarmente innovativa perché consente di esplorare direttamente sul paziente e in modo non invasivo la concentrazione intracellulare di alcuni intermedi metabolici e la funzionalità di diverse vie metaboliche.

MRS in vivoMRS in vivo

Invece di ottenere immagini dettagliate di tessuti con la MRS possiamo ottenere gli spettri di composti biochimici presenti all’interno di questi tessuti!

Con la spettroscopia RM del fosforo (31P-MRS):

• ATP

• fosfato inorganico (Pi)

• fosfocreatina (PCr)

• intermedi metabolici fosforilati (PME e PDE)

• concentrazione di Mg2+

• pH intracellulare

Si valuta la funzionalità di:

fosforilazione ossidativa, glicogenonolisi, glicolisi …..

Con la spettroscopia RM del protone (1H-MRS):

• n-acetilaspartato (NAA)

• colina (Cho)

• creatina + fosfocreatina (Cr)

• glutammato e glutammina (Glx)

•mio-inositolo (m-I) e acido lattico (LA)

Si valuta la funzionalità di:

sistema glutamminergico ,metabolismo energetico, la osmoregolazione del SNC …….

In vivo 31P NMR di Corynebacterium glutamicum

.. José Arcadio Buendia … pensò che era possibile servirsi di quella invenzione inutile

per sviscerare l’oro dalla terra.

Lo zingaro, che era un uomo onesto, lo prevenne: << Per quello non serve >>

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