Spettroscopia di assorbimento nel visibile e nell’ultravioletto...Carlo I.G. Tuberoso – Appunti...

Spettroscopia Spettroscopia di assorbimento nel di assorbimento nel

visibile e nellvisibile e nell’’ultraviolettoultravioletto

Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici uso laboratorio ver. 00

I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla

misura della radiazione elettromagnetica prodotta misura della radiazione elettromagnetica prodotta

o assorbita dagli analiti.o assorbita dagli analiti.

Si possono classificare in funzione della regione Si possono classificare in funzione della regione

dello spettro elettromagnetico (raggi X, dello spettro elettromagnetico (raggi X,

ultravioletto, visibile, infrarosso ecc.) e ultravioletto, visibile, infrarosso ecc.) e

storicamente i primi metodi spettroscopici erano storicamente i primi metodi spettroscopici erano

ristretti allristretti all ’’uso della radiazione visibile.uso della radiazione visibile.

La spettroscopia costituisce un potente La spettroscopia costituisce un potente

strumento di analisi chimica poichstrumento di analisi chimica poich éé ogni ogni

elemento chimico, ed in generale ogni sostanza, elemento chimico, ed in generale ogni sostanza,

presenta uno presenta uno spettrospettro caratteristico che fornisce caratteristico che fornisce

informazioni dettagliate e precise sulla sua informazioni dettagliate e precise sulla sua

struttura o sulla sua composizione.struttura o sulla sua composizione.

La luce viene emessa o assorbita sotto forma di La luce viene emessa o assorbita sotto forma di

quanti o fotoni. quanti o fotoni.

L'energia L'energia EE di un singolo fotone di un singolo fotone èè direttamente direttamente

proporzionale alla frequenza di radiazione proporzionale alla frequenza di radiazione νννννννν e quindi e quindi

inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda

λλλλλλλλ, secondo la formula:, secondo la formula:

E = hE = hνννννννν = = hchc //λλλλλλλλ

hh costante di costante di PlanckPlanckcc velocitvelocit àà della lucedella luce

Dott. Carlo I.G. Tuberoso – Appunti didattici Chimica Analitica ver. 00-06

Si definisce Si definisce lunghezza dlunghezza d ’’ondaonda ((λλ) la distanza minima ) la distanza minima

tra due punti in fase e viene espressa in: tra due punti in fase e viene espressa in:

ÅÅ = 10= 10--88 cm (cm ( raggiraggi X)X)

µµm = 10m = 10 --44 cm (IR)cm (IR)

nm = 10nm = 10 --77 cm (cm ( UVUV--VisibileVisibile ))

La La frequenzafrequenza rappresenta il numero di oscillazioni al rappresenta il numero di oscillazioni al

secondo, ossia secondo, ossia èè il numero di cicli che passa per un il numero di cicli che passa per un

punto nellpunto nell ’’unitunit àà di tempo e viene espressa in secdi tempo e viene espressa in sec --11..

Il colore o la lunghezza dIl colore o la lunghezza d ’’onda dei quanti di luce onda dei quanti di luce

emessi o assorbiti da un nucleo, da un atomo o da emessi o assorbiti da un nucleo, da un atomo o da

una molecola, dipende dalla loro struttura interna. una molecola, dipende dalla loro struttura interna.

In un atomo, lIn un atomo, l ’’assorbimento o lassorbimento o l ’’emissione di luce di emissione di luce di

una determinata lunghezza duna determinata lunghezza d ’’onda corrisponde alla onda corrisponde alla

transizione di un elettrone da untransizione di un elettrone da un ’’orbita ad unorbita ad un ’’altra. altra.

Lo spettro di un atomo Lo spettro di un atomo èè sempre a righe e cade sempre a righe e cade

nellnell ’’ intervallo di frequenze dallintervallo di frequenze dall ’’ infrarosso al visibile.infrarosso al visibile.


TECNICHE SPETTROSCOPICHETECNICHE SPETTROSCOPICHE


≈≈ 1010--380 nm (UV) 380 nm (UV) ≈≈ 380380--780 nm (Vis)780 nm (Vis)

≈≈ 11--1000 1000 µµµµµµµµm (IR) m (IR)

espresso anche come espresso anche come numero dnumero d ’’onda 1/onda 1/ λλλλλλλλ≈≈ 10.00010.000--10 cm10 cm


Quando una radiazione dQuando una radiazione d ’’onda compresa tra onda compresa tra

190nm e 750nm attraversa una soluzione, gli 190nm e 750nm attraversa una soluzione, gli

elettroni dei legami dei composti presenti in elettroni dei legami dei composti presenti in

soluzione passano allo stato eccitato. Meno soluzione passano allo stato eccitato. Meno

fortemente sono legati gli elettroni dei lagami fortemente sono legati gli elettroni dei lagami

entro la molecola, pientro la molecola, pi ùù elevata sarelevata sar àà la lunghezza la lunghezza

dd’’onda della radiazione assorbita e quindi pionda della radiazione assorbita e quindi pi ùù

bassa lbassa l ’’energia.energia.

SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTOSPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO


ECCITAZIONE DELLECCITAZIONE DELL’’ETILENEETILENE


PP00 = intensit= intensitàà radiazione incidenteradiazione incidenteP P == intensitintensitàà radiazione emessaradiazione emessab = b = spessore dello strato di soluzionespessore dello strato di soluzione

Quando un fascio di radiazione monocromatica Quando un fascio di radiazione monocromatica

attraversa una soluzione contenente un analita, attraversa una soluzione contenente un analita,

parte della radiazione viene assorbita:parte della radiazione viene assorbita:


TransmittanzaTransmittanza T = P / PT = P / P00

Assorbanza Assorbanza AA == log 1log 1 // TTAA == loglog PP00 // PP


A= ε ε ε ε b cA=A= ε ε ε ε ε ε ε ε b cb c

LEGGE DI LAMBERTLEGGE DI LAMBERT--BEERBEER

A = assorbanza

ε = assorbività molare (l mol-1 cm-1)

b = cammino ottico (spessore cuvetta espresso in cm)

c = concentrazione, espressa in mol l-1


Se si riporta il segnale (Se si riporta il segnale ( TT o o AA) in funzione della ) in funzione della

lunghezza del cammino ottico:lunghezza del cammino ottico:

La risposta dellLa risposta dell ’’assorbanza in funzione della assorbanza in funzione della

concentrazione concentrazione èè lineare fino ad un certo punto:lineare fino ad un certo punto:


I cromoforiI cromofori

Sono gruppi presenti in molecole organiche che Sono gruppi presenti in molecole organiche che

hanno la capacithanno la capacit àà di assorbire la radiazione di assorbire la radiazione

elettromagnetica nella regione del visibile e in elettromagnetica nella regione del visibile e in

quella dellquella dell ’’ultravioletto. I cromofori piultravioletto. I cromofori pi ùù comuni sono comuni sono

caratterizzati da gruppi insaturi in grado di caratterizzati da gruppi insaturi in grado di

delocalizzaredelocalizzare le cariche (le cariche ( etilenietileni , , acetileniacetileni , , dienidieni , ,

carbonilicarbonili , azoico, , azoico, benzenibenzeni ……). Gruppi in grado di ). Gruppi in grado di

esaltare lesaltare l ’’attivitattivit àà del cromoforo vengono denominati del cromoforo vengono denominati

auxocromiauxocromi ..


Caratteristiche di alcuni cromofori benzeniciCaratteristiche di alcuni cromofori benzenici


Le variazioni dello spettroLe variazioni dello spettro

ipocromicoipocromicoAssorbanza minoreAssorbanza minore

ipercromicoipercromicoAssorbanza maggioreAssorbanza maggiore

ipsocromicoipsocromicoLunghezze dLunghezze d ’’onda minoreonda minore

batocromicobatocromicoLunghezze dLunghezze d ’’onda maggioreonda maggiore

DENOMINAZIONEDENOMINAZIONESPOSTAMENTOSPOSTAMENTO


200200 nmnm 600600

00A

bsA

bs22 QUERCETINAQUERCETINA

Lo spettro UVLo spettro UV--VISVIS


Lo spettro UVLo spettro UV--VISVIS


Singolo raggioSingolo raggio

LO SPETTROFOTOMETROLO SPETTROFOTOMETRO

Doppio raggioDoppio raggio


La La sorgente luminosasorgente luminosa èè costituita da lampada a:costituita da lampada a:

�� deuterio per la zona delldeuterio per la zona dell ’’UVUVD2 + Ee→ D2* → D’ + D’’ + hv (U.V.)spettro della radiazione emessa: ≈ 160-375 nm

�� tungsteno (W) per la regione visibiletungsteno (W) per la regione visibiletemperatura filamento: ≈ 2870 Kspettro della radiazione emessa: ≈ 350-2500 nm

�� xenon (xenon ( XeXe) per coprire entrambe le zone) per coprire entrambe le zone


Il Il monocromatoremonocromatore scinde la luce nelle sue lunghezze scinde la luce nelle sue lunghezze

dd’’onda costituenti, ulteriormente selezionate da una onda costituenti, ulteriormente selezionate da una

fenditura successiva. I modelli pifenditura successiva. I modelli pi ùù utilizzati sono il utilizzati sono il

prisma e il reticolo di diffrazione:prisma e il reticolo di diffrazione:


Il Il rivelatorerivelatore permette di trasformare lpermette di trasformare l ’’ intensitintensit àà

luminosa in un segnale elettrico. Possono essere luminosa in un segnale elettrico. Possono essere

utilizzate fotocellule (a), utilizzate fotocellule (a), fotomoltiplicatorifotomoltiplicatori (PMT, (PMT,

photomultiplierphotomultiplier tubestubes , b) o , b) o fotodiodifotodiodi ..

b


Spettrofotometro con rivelatore a serie di diodiSpettrofotometro con rivelatore a serie di diodi


lati opachilati opachi

LE CUVETTELE CUVETTE


Lampada: singola sorgente pulsata allo XenonLampada: singola sorgente pulsata allo Xenon

Intervallo: 190Intervallo: 190 --1100nm 1100nm


La taraturaLa taratura


Differenza spettriDifferenza spettri


LL’’influenza del pHinfluenza del pH


Spettri in derivataSpettri in derivata


Rilascio di un farmaco da una formulazioneRilascio di un farmaco da una formulazione


Grazie allo sviluppo di opportuni software, gli Grazie allo sviluppo di opportuni software, gli

attuali spettrofotometri possono essere utilizzati attuali spettrofotometri possono essere utilizzati

come colorimetri, apparecchi che sono in grado come colorimetri, apparecchi che sono in grado

di misurare la radiazione luminosa e fornire un di misurare la radiazione luminosa e fornire un

dato numerico che corrisponde alla sensazione dato numerico che corrisponde alla sensazione

visiva percepita dallvisiva percepita dall’’occhio umano. occhio umano.

I COLORIMETRI (O SPETTROCOLORIMETRI)I COLORIMETRI (O SPETTROCOLORIMETRI)


Lavorando su campioni trasparenti e in soluzione Lavorando su campioni trasparenti e in soluzione èè

possibile effettuare una scansione tra 380 e possibile effettuare una scansione tra 380 e

780nm, impostare l780nm, impostare l’’osservatore standard e il tipo osservatore standard e il tipo

di sorgente (in genere 10di sorgente (in genere 10°° e D65, rispettivamente) e D65, rispettivamente)

ottenendo i valori di coordinate cromatiche nel ottenendo i valori di coordinate cromatiche nel

sistema CIE del tipo L*a*b*, L*u*v* o L*C*H*. sistema CIE del tipo L*a*b*, L*u*v* o L*C*H*.

In tale modo vengono valutati lIn tale modo vengono valutati l’’intensitintensitàà, la tinta e , la tinta e

la saturazione senza bisogno di strumenti pila saturazione senza bisogno di strumenti piùù

costosi muniti della sfera. costosi muniti della sfera.

PoichPoichéé il colore viene influenzato dalle diluizioni, il colore viene influenzato dalle diluizioni,

nel caso di campioni molto intensi nel caso di campioni molto intensi èè preferibile preferibile

ricorrere a celle dal cammino ottico inferiore ed ricorrere a celle dal cammino ottico inferiore ed

effettuare le opportune correzioni. effettuare le opportune correzioni.


•• TintaTinta ((HueHue, h) = definisce la tonalit, h) = definisce la tonalitàà del del colore (rosso, giallo, verde, azzurro)colore (rosso, giallo, verde, azzurro)

•• LuminositLuminositàà ((L*L*): indica la diversa intensit): indica la diversa intensitààdi luce, ossia di quanto la tinta di luce, ossia di quanto la tinta èè diluita diluita con il nero. Varia da zero (nero) a 100 con il nero. Varia da zero (nero) a 100 (bianco)(bianco)

•• SaturazioneSaturazione ((ChromaChroma, , C*C*): indica di ): indica di quanto la tinta pura quanto la tinta pura èè diluita con il diluita con il bianco. Varia da zero (bianco) a 100 bianco. Varia da zero (bianco) a 100 (colori spettrali puri, luci monocromatiche) (colori spettrali puri, luci monocromatiche)

I parametri di misura del coloreI parametri di misura del colore


LA RAPPRESENTAZIONE NELLO SPAZIOLA RAPPRESENTAZIONE NELLO SPAZIO

Spazio CIE L*a*b* (1976)

Spazio CIE xy (1931)


Lo spazio CIE L*a*b*Lo spazio CIE L*a*b*

luminositluminositààtinta, tonalittinta, tonalitàà saturazionesaturazione


LA FUORIMETRIALA FUORIMETRIA

Quando gli elettroni nello stato eccitato di Quando gli elettroni nello stato eccitato di singolettosingoletto tornano tornano allo stato fondamentale di allo stato fondamentale di singolettosingoletto ed emettono fotoni si ed emettono fotoni si parla di fluorescenza, processo che dura tra 10parla di fluorescenza, processo che dura tra 10--1010 s e 10s e 10--55 s ed s ed èè indipendente dalla temperatura. indipendente dalla temperatura.

Si parla di fluorescenza primaria Si parla di fluorescenza primaria quando la sostanza quando la sostanza èè fluorescente allo fluorescente allo stato naturale, mentre la fluorescenza stato naturale, mentre la fluorescenza secondaria deriva dalla reazione con secondaria deriva dalla reazione con sostanze fluorescenti (sostanze fluorescenti (derivatizzazionederivatizzazione). ). Le molecole naturalmente fluorescenti Le molecole naturalmente fluorescenti sono quelle con sistemi fortemente sono quelle con sistemi fortemente coniugati o aromatici e struttura rigida. coniugati o aromatici e struttura rigida. Il picco di emissione si trova sempre a Il picco di emissione si trova sempre a lunghezza dlunghezza d’’ onda maggiori onda maggiori (spostamento di (spostamento di StokesStokes), e pertanto, a ), e pertanto, a energia pienergia piùù bassa. bassa.


FUORIMETRIFUORIMETRI

Gli strumenti per la spettrofotometria di fluorescenza Gli strumenti per la spettrofotometria di fluorescenza molecolare (molecolare (spettrofluorimetrispettrofluorimetri ) sono simili allo ) sono simili allo spettrofotometro UVspettrofotometro UV--VIS: VIS: èè presente una sorgente luminosa presente una sorgente luminosa (allo xeno o alogena al quarzo), un reticolo monocromatore, (allo xeno o alogena al quarzo), un reticolo monocromatore, un alloggiamento per il campione, un secondo reticolo un alloggiamento per il campione, un secondo reticolo monocromatore e il rivelatore. Cambia la geometria perchmonocromatore e il rivelatore. Cambia la geometria perchééin questo caso il raggio che viene emesso in questo caso il raggio che viene emesso èè letto a 90letto a 90°° rispetto rispetto alla luce incidente. alla luce incidente.


Esistono alcune peculiaritEsistono alcune peculiaritàà che richiedono opportuni che richiedono opportuni

accorgimenti tecnici, ad es. laccorgimenti tecnici, ad es. l’’ assenza di fluorescenza provoca assenza di fluorescenza provoca

il buio totale, causando quindi problemi di azzeramento della il buio totale, causando quindi problemi di azzeramento della

linea di base. Inoltre la fluorescenza linea di base. Inoltre la fluorescenza èè molto sensibile alla molto sensibile alla

diffusione provocata dal solvente (effetto diffusione provocata dal solvente (effetto RayleighRayleigh) o da ) o da

sostanze colloidali (effetto sostanze colloidali (effetto TyndallTyndall ), alle variazioni di pH, ), alle variazioni di pH,

temperatura e viscosittemperatura e viscositàà o alla presenza di sostanze o alla presenza di sostanze

sequestranti. Le soluzioni non possono essere troppo sequestranti. Le soluzioni non possono essere troppo

concentrate in quanto una parte della luce emessa può essere concentrate in quanto una parte della luce emessa può essere

riassorbita da altre molecole non eccitate. Normalmente si riassorbita da altre molecole non eccitate. Normalmente si

eseguono diluizioni pari a 10eseguono diluizioni pari a 10--100 volte rispetto a quelle 100 volte rispetto a quelle

utilizzate in spettrofotometria UVutilizzate in spettrofotometria UV--VIS. VIS.


SPETTROSCOPIA NELLSPETTROSCOPIA NELL’’INFRAROSSOINFRAROSSO

processo che dura processo che dura tra 10tra 10--1010 s e 10s e 10--55 s s ed ed èè indipendente indipendente dalla temperatura. dalla temperatura.

ÈÈ una tecnica molto utilizzata per identificare composti una tecnica molto utilizzata per identificare composti organici ed inorganici poichorganici ed inorganici poichéé la stragrande maggioranza la stragrande maggioranza delle molecole presenta spettri di assorbimento delle molecole presenta spettri di assorbimento caratteristici. Normalmente non viene impiegata per le caratteristici. Normalmente non viene impiegata per le analisi quantitative a causa della bassa sensibilitanalisi quantitative a causa della bassa sensibilitàà e e precisione e delle frequenti deviazioni dalla legge di precisione e delle frequenti deviazioni dalla legge di BeerBeer..


Il gran numero di legami presenti nelle molecole Il gran numero di legami presenti nelle molecole poliatomichepoliatomiche comporta che i dati ottenuti dallcomporta che i dati ottenuti dall’’ analisi IR analisi IR siano molto complessi e forniscano unsiano molto complessi e forniscano un’’ improntaimpronta digitaledigitale di di identificazione caratteristica ed unica per ogni particolare identificazione caratteristica ed unica per ogni particolare molecola.molecola.


1180-1360C-Namines

1650-1750C=Ocarbonyl

2210-2260C ΞNnitriles

2850-2960C-Halkanes

3020-3080C-Halkenes

3000-3100C-Haromatic rings

3300-3500N-Hamines

3610-3640O-Hhydroxyl

ENERGIA(approx, cm -1)

LEGAMEGRUPPO


STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRSTRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRsistemi a dispersionesistemi a dispersione


GlobarLampada di NernstFilo Ni-Cr

GlobarGlobarLampada di Lampada di NernstNernstFilo Filo NiNi--CrCr

STRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRSTRUMENTI PER LA SPETTROSCOPIA IRsistemi a trasformata di sistemi a trasformata di FourierFourier


GLI SPETTRI IRGLI SPETTRI IR


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