Specie radicaliche e stress ossidativo · • nello specifico lo ione perossinitrito può generare...

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Specie radicalichee stress ossidativo

Prof. Giorgio Sartor

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Versione 4.1 – apr 2008

gs © 2001-2008 ver 4.1 Specie radicaliche e stress ossidativo - 2 -

Radicali

• Specie chimiche con elettroni spaiati• occupano da soli un orbitale atomico o molecolare

• Molto instabili e reattivi verso le altre molecole per compensare tale squilibrio

• Autopropagazione per reazioni a catena

• Pericolosità inversamente proporzionale all’emivita

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Meccanismi di formazione di radicali

• Perdita di un elettrone:

X → X•+ + e-

• Acquisto di un elettrone:

X + e- → X•-

• Scissione omolitica di un legame covalente:

X-Y → X• + Y•

• Astrazione di un atomo di idrogeno (H•) da parte di un altra specie radicalica:

CH4 + Cl• → CH3• + HCl

Lipide-H + OH• → Lipide• + H2O

R-SH + R-O2•- → R-S•- + R-O2H


Ossigeno

• Orbitali molecolari dell’ossigeno

• Potenziali di riduzione

σσσσx

ππππy,ππππx

ππππy*,ππππx

*

σσσσx*

O2 O2.- H2O2

O21∆g

O2 O2.- H2O2 H2OOH.

e- e- + 2H+

e- + 2H+ H2Oe- + H+

-0.16v 0.94v 0.38v 2.33v

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Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)

• Specie non radicaliche– H2O2 acqua ossigenata (perossido di idrogeno)

– HOBr acido ipobromoso

– HOCl acido ipocloroso

– O3 ozono

– O21∆g ossigeno singoletto

– LOOH perossido lipidico

– ONOOH perossinitrito

• Radicali prodotti per riduzione ad un elettrone

– •O-O• + eֿ → •O-O: ֿ anione superossido

– O2•ֿ + •OH → ¹O2 + OH ֿ ossigeno singoletto

– 2O2•ֿ + 2H+ → H2O2 + ³O2 perossido

– O2•¯ + H2O → HOO• idroperossiradicale

– H2O2 + eֿ → OH ֿ + OH • radicale idrossido

– H2O2 + Fe²+ (Cu+ ) → Fe³+ (Cu++ ) + OH ֿ + OH• (R. Fenton)

– H2O2 + O2• ֿ(cat. Cu/Fe) → O2 + OH ֿ + OH• (R. Haber-Weiss)

– L + O2• ֿ→ LOO•- anione lipoperossido



• Prodotte dalla catena respiratoria

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• Prodotte dalla catena respiratoria nel complesso IV


Formazione di H2O nel complesso IV

N

N

N

N

Fe O

O

N

N

N

N

Fe OH

OH

Cu++

N

N

N

N

FeN

N

N

N

FeN

N

N

N

Fe

N

N

N

N

Fe O

O

Cu++N

N

N

N

Fe O Cu++

O+

H H

Cu+

Cu+

Cu+

2H+

e-

2H2O

e-

e-

2H+

e-

O2

+++

+++

CuB++

+++ +++ ++

+++4+

eme a

eme a eme a

eme a

eme a3

O2 + 4H+ + 4e- 2H2O

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Lipoperossidi

XY

H

HO

H

O H

C XY

XY

O

O

O2

XY

O

O H

XY

H

C XY

O O

H H

Y CH2

WCH3

O

HR

OH

+ +

Malondialdeide 4-idrossinonenale


Nature 2008 18/09

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Specie Reattive dell’Azoto (RNS)

• Prodotti prevalentemente dallo smog fotochimico

• Specie non radicaliche– HNO2 acido nitroso

– NO+ catione nitrosile

– NO- anione nitrosile

– N2O4 tetrossido di diazoto

– N2O3 triossido di diazoto

– NO2+ nitrile

– ROONO alchilperossinitrito

– NO2Cl cloruro di nitrile

• Specie radicaliche– O2 + L-arginina → NO• + L-citrullina ossido d’azoto

– O2•¯ + NO• → ONOO¯ perossinitrito

– ONOO¯ + CO2 → ONOOCO2¯ nitroperossicarbonato

– ONOOCO2¯ → NO2• + CO3

•¯ biossido d’azoto


Ossido d’azoto e NOS (EC 1.14.13.39 )

NH

NH

NH2

NH3+

O

O NH

N

NH2

NH3+

O

O

OH

NH

O

NH2

NH3+

O

O

O2

H2O

NADPHNADP+L-arginina N-ϖϖϖϖ-idrossi-L-arginina

0.5 NADPH

0.5 NADP+

Ossidazione a due elettroni

Ossidazione a tre elettroni

O2

H2O

L-citrullina

+ NO.

Nitric Oxyde Sinthase

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Ossido d’azoto e NOS (EC 1.14.13.39 )

NH

N

NH2

NH3+

O

O

H

NH

N

NH2

NH3+

O

O

OH

NH

O

NH2

NH3+

O

O

Fe3+

Fe2+

NH

N

NH2

NH3+

O

O

OH

Fe2+

OO

Fe2+

OO

NH

N

NH2

NH3+

O

O

O H

O

O

O

O

Fe3+

H2O

NADPHNADP+

L-argininaN-ϖϖϖϖ-idrossi-L-arginina

0.5 NADPH

0.5 NADP+

Ossidazione a

due elettroni

Ossidazione a tre elettroni

H2O

L-citrullina

+ NO.


NO sintasi (EC 1.14.13.39)

Dominio Ossidoreduttasico1F20

NADP+ FAD

Dominio eme1FOP EME ARG

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Specie reattive del cloro (RCS)

• Radicali– Cl•

• Non radicaliche– HOCl acido ipocloroso (ROS)

– NO2Cl cloruro di nitrile (RNS)

– Cloramine

– Cl2 cloro


Mieloperossidasi (EC 1.11.1.7)

• La mieloperossidasi(MP3+) è un enzima perossidasico presente nei granuli dei neutrofili.

• Si ritiene che produca HOCl nei fagosomi.

• Può usare anche altri ioni oltre il cloruro.

MP3+ + H2O2 Comp I

Comp II

Cl-HOCl

MP2+O2

O2.-

O2.-

RH

R.

Br-HOBr

I-HOI

SCN-HOSCN

NO2-HONO2

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Mieloperossidasi (EC 1.11.1.7)


Stabilità dei radicali

RADICALE TEMPO DI

VITA

Radicale idrossido �OH 10-9 s

Radicale alcossido �OR 10-6 s

Ossigeno

singoletto

1O2 10-5 s

Anione

perossinitrito ONOO - 0.05-1.0 s

Ossido di azoto �NO 1-10 s

Radicale perossido ROO� 7 s

Anione

superossido O2�ֿ 103-104 s

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Sorgenti di Radicali

• Endogene:

– Catena respiratoria,

– Fotosintesi,

– Sintesi di

prostaglandine,

– Metabolismo dei

nucleotidi

– Perossisomi,

– Autossidazione,

– Fagocitosi,

– Ossiemoglobina,

– Enzimi ossidativi…

• Esogene:

– Xenobiotici,

– Radiazioni

– Ionizzanti (raggi X)

– Non ionizzanti (UV)

– Calore,

– Infezione,

– Iperossia,

– Inquinamento…


Invecchiamento

Diminuzione delle difese antiossidanti

UV

Aumento dello stress ossidativo

AUMENTATA PRODUZIONE DI

ROS

Accumulazione dimutazioni del DNA

Stimolazione delle vie di trasduzione del

segnale

Modificazione di proteine

Alterazione della struttura genica

Alterazione dell’attivitàgenica

Alterazione della struttura e della

funzione delle proteine

Perdita della regolazione dell’omeostasi intracellulare ed extracellulare

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Stress ossidativo

Danni al DNA

Attivazione di Poli ADP riboso sintasi

Riduzione diNAD(H)

Diminuzione eossidazione di GSH

Inibizione dellasintesi di ATP Danni diretti

alle proteine

Aumento di Ca++

intracellulare

Danni al citoscheletro

Perossidazionelipidica

Aumento di Fe++, Cu++, eme-proteine liberi

Attivazione diNOS

Formazione di perossinitrito

Alterazione delle membrane

Perossidazionedelle membrane

Aumentato danno a DNA,

proteine e lipidi

Rilascio di ioni, eme-proteine perossidi ecc.


Danni al DNA

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Tipi di danni al DNA

• Danni naturali

• Danni fisici (radiazioni ionizzanti e UV)

• Danni chimici (ROS e inquinanti organici)


Danni Naturali

• Perdita di basi: il legame glicosidico è labile sotto condizione fisiologiche (formazione di un sito AP).

• Deamminazione: i gruppi amminici primari sono a volte instabili e possono venire convertiti in chetoni.

O P O

R

O P OH

O

NO

N

OO

NH2

P OH

O

O

OO

OH

H

NO

N

N

O

N

NH2

O

O P O

O

R

Sito AP

R

O P OH

O

NO

N

OO

O

H

O P O

R

NH3

R

O P OH

O

NO

N

OO

NH2

O P O

R

O2

Citidina Uracile

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Danni Fisici: Radiazioni Ionizzanti

• Danni diretti: Single Strand Break, Double Strand Break, mismatched bases.

• Danni indiretti: produzione di ROS.


Danni Fisici: Radiazioni UV

• Stress ossidativo: foto-carcinogenesi e foto-invecchiamento (UV-B)

• Foto-dimerizzazione: formazione di CPD e 6-4PP (UV-C).

O P O

R

O P O

R

O

O NNH

O

O

CH3

P OH

OO

O

OO

N

NO

O

CH3

O P O

R

O P O

R

O

O

P OH

OO

O

OO

N

NO

O

CH3H

N

N

O

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Danni chimici: ROS

• Causano ossidazione delle basi e amplificano deamminazioni e depurinazioni.

o Un esempio di composto ossidato è OH8dG: causa trasversioni delle basi GC → TA

RO

O

RO

N

N

N

NH

O

NH2

RO

O

RO

N

N

N

NH

O

NH2

O HROS

deossiGuanosina 8-ossi-deossiGuanosina (OH8dG)


Danni chimici: inquinanti Organici

• Genotossici: danno diretto al DNA tramite formazione di addotti (alchilanti in posizioni nucleofile).

N N

NN

NH2

R

N

NH

O

O

CH3

R

N

N

O

NH2

R

N N

NNH

O

NH2

R

Guanina

Adenina Timina

Citosina

OOH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

NN N

NN

O

H

H

DNA

(+)-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-ossidobenzo[a]pirene

(-)-trans-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diolo

(+)-anti-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diol-9,10-ossido

addotto con il DNA

monoossigenasi epossido-idrolasi

monoossigenasi

• Epigenetici: danno indiretto al DNA attraverso stress ossidativo o l’attivazione di composti pericolosi. Es. IPA.

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Antiossidanti

• Gli antiossidanti non sono, in genere, dei radicali liberi. Quindi quando un antiossidante agisce si forma un radicale derivato dall’antiossidante.

• Se un radicale libero perde o guadagna un elettrone non è più un radicale libero:

NO• → e- + NO+

NO• + e- → NO-

• La reazione tra specie radicaliche porta alla perdita netta di radicali

O2•- + NO• → ONOO-

• nello specifico lo ione perossinitrito può generare radicale idrossile.

ONOOH → OH• + NO2•


Meccanismi di riparo del danno

• Fisiopatologia ambientale…

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Referenze sul WEB

• Vie metaboliche

– KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/

• Degradazione degli xenobiotici: http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html

• Struttura delle proteine:

– Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/

– Hexpasy

• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/

• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/

• Enzyme (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/

– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/

• Enzimi:

– Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/

– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/

– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/

• Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/

• Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/

• Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html

• Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registryhttp://www.atsdr.cdc.gov

Crediti e autorizzazioni all’utilizzo

• Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:

http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/

• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:

Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor

Università di Bologna a Ravenna

Giorgio Sartor - [email protected]

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Stress ossidativo

Danni al DNA


Riduzione diNAD(H)



alle proteine

Aumento di Ca++

intracellulare




Attivazione diNOS





proteine e lipidi



Stress ossidativo

Danni al DNA


Riduzione diNAD(H)



alle proteine

Aumento di Ca++

intracellulare




Attivazione diNOS





proteine e lipidi


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Stress ossidativo

Danni al DNA


Riduzione diNAD(H)



alle proteine

Aumento di Ca++

intracellulare




Attivazione diNOS





proteine e lipidi



Stress ossidativo

Danni al DNA


Riduzione diNAD(H)



alle proteine

Aumento di Ca++

intracellulare




Attivazione diNOS





proteine e lipidi


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