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Specie radicalichee stress ossidativo
Prof. Giorgio Sartor
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Versione 4.1 – apr 2008
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Radicali
• Specie chimiche con elettroni spaiati• occupano da soli un orbitale atomico o molecolare
• Molto instabili e reattivi verso le altre molecole per compensare tale squilibrio
• Autopropagazione per reazioni a catena
• Pericolosità inversamente proporzionale all’emivita
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Meccanismi di formazione di radicali
• Perdita di un elettrone:
X → X•+ + e-
• Acquisto di un elettrone:
X + e- → X•-
• Scissione omolitica di un legame covalente:
X-Y → X• + Y•
• Astrazione di un atomo di idrogeno (H•) da parte di un altra specie radicalica:
CH4 + Cl• → CH3• + HCl
Lipide-H + OH• → Lipide• + H2O
R-SH + R-O2•- → R-S•- + R-O2H
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Ossigeno
• Orbitali molecolari dell’ossigeno
• Potenziali di riduzione
σσσσx
ππππy,ππππx
ππππy*,ππππx
*
σσσσx*
O2 O2.- H2O2
O21∆g
O2 O2.- H2O2 H2OOH.
e- e- + 2H+
e- + 2H+ H2Oe- + H+
-0.16v 0.94v 0.38v 2.33v
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Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
• Specie non radicaliche– H2O2 acqua ossigenata (perossido di idrogeno)
– HOBr acido ipobromoso
– HOCl acido ipocloroso
– O3 ozono
– O21∆g ossigeno singoletto
– LOOH perossido lipidico
– ONOOH perossinitrito
• Radicali prodotti per riduzione ad un elettrone
– •O-O• + eֿ → •O-O: ֿ anione superossido
– O2•ֿ + •OH → ¹O2 + OH ֿ ossigeno singoletto
– 2O2•ֿ + 2H+ → H2O2 + ³O2 perossido
– O2•¯ + H2O → HOO• idroperossiradicale
– H2O2 + eֿ → OH ֿ + OH • radicale idrossido
– H2O2 + Fe²+ (Cu+ ) → Fe³+ (Cu++ ) + OH ֿ + OH• (R. Fenton)
– H2O2 + O2• ֿ(cat. Cu/Fe) → O2 + OH ֿ + OH• (R. Haber-Weiss)
– L + O2• ֿ→ LOO•- anione lipoperossido
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Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
• Prodotte dalla catena respiratoria
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Specie Reattive dell’Ossigeno (ROS)
• Prodotte dalla catena respiratoria nel complesso IV
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Formazione di H2O nel complesso IV
N
N
N
N
Fe O
O
N
N
N
N
Fe OH
OH
Cu++
N
N
N
N
FeN
N
N
N
FeN
N
N
N
Fe
N
N
N
N
Fe O
O
Cu++N
N
N
N
Fe O Cu++
O+
H H
Cu+
Cu+
Cu+
2H+
e-
2H2O
e-
e-
2H+
e-
O2
+++
+++
CuB++
+++ +++ ++
+++4+
eme a
eme a eme a
eme a
eme a3
O2 + 4H+ + 4e- 2H2O
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Lipoperossidi
XY
H
HO
H
O H
C XY
XY
O
O
O2
XY
O
O H
XY
H
C XY
O O
H H
Y CH2
WCH3
O
HR
OH
+ +
Malondialdeide 4-idrossinonenale
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Nature 2008 18/09
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Specie Reattive dell’Azoto (RNS)
• Prodotti prevalentemente dallo smog fotochimico
• Specie non radicaliche– HNO2 acido nitroso
– NO+ catione nitrosile
– NO- anione nitrosile
– N2O4 tetrossido di diazoto
– N2O3 triossido di diazoto
– NO2+ nitrile
– ROONO alchilperossinitrito
– NO2Cl cloruro di nitrile
• Specie radicaliche– O2 + L-arginina → NO• + L-citrullina ossido d’azoto
– O2•¯ + NO• → ONOO¯ perossinitrito
– ONOO¯ + CO2 → ONOOCO2¯ nitroperossicarbonato
– ONOOCO2¯ → NO2• + CO3
•¯ biossido d’azoto
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Ossido d’azoto e NOS (EC 1.14.13.39 )
NH
NH
NH2
NH3+
O
O NH
N
NH2
NH3+
O
O
OH
NH
O
NH2
NH3+
O
O
O2
H2O
NADPHNADP+L-arginina N-ϖϖϖϖ-idrossi-L-arginina
0.5 NADPH
0.5 NADP+
Ossidazione a due elettroni
Ossidazione a tre elettroni
O2
H2O
L-citrullina
+ NO.
Nitric Oxyde Sinthase
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Ossido d’azoto e NOS (EC 1.14.13.39 )
NH
N
NH2
NH3+
O
O
H
NH
N
NH2
NH3+
O
O
OH
NH
O
NH2
NH3+
O
O
Fe3+
Fe2+
NH
N
NH2
NH3+
O
O
OH
Fe2+
OO
Fe2+
OO
NH
N
NH2
NH3+
O
O
O H
O
O
O
O
Fe3+
H2O
NADPHNADP+
L-argininaN-ϖϖϖϖ-idrossi-L-arginina
0.5 NADPH
0.5 NADP+
Ossidazione a
due elettroni
Ossidazione a tre elettroni
H2O
L-citrullina
+ NO.
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NO sintasi (EC 1.14.13.39)
Dominio Ossidoreduttasico1F20
NADP+ FAD
Dominio eme1FOP EME ARG
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Specie reattive del cloro (RCS)
• Radicali– Cl•
• Non radicaliche– HOCl acido ipocloroso (ROS)
– NO2Cl cloruro di nitrile (RNS)
– Cloramine
– Cl2 cloro
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Mieloperossidasi (EC 1.11.1.7)
• La mieloperossidasi(MP3+) è un enzima perossidasico presente nei granuli dei neutrofili.
• Si ritiene che produca HOCl nei fagosomi.
• Può usare anche altri ioni oltre il cloruro.
MP3+ + H2O2 Comp I
Comp II
Cl-HOCl
MP2+O2
O2.-
O2.-
RH
R.
Br-HOBr
I-HOI
SCN-HOSCN
NO2-HONO2
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Mieloperossidasi (EC 1.11.1.7)
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Stabilità dei radicali
RADICALE TEMPO DI
VITA
Radicale idrossido �OH 10-9 s
Radicale alcossido �OR 10-6 s
Ossigeno
singoletto
1O2 10-5 s
Anione
perossinitrito ONOO - 0.05-1.0 s
Ossido di azoto �NO 1-10 s
Radicale perossido ROO� 7 s
Anione
superossido O2�ֿ 103-104 s
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Sorgenti di Radicali
• Endogene:
– Catena respiratoria,
– Fotosintesi,
– Sintesi di
prostaglandine,
– Metabolismo dei
nucleotidi
– Perossisomi,
– Autossidazione,
– Fagocitosi,
– Ossiemoglobina,
– Enzimi ossidativi…
• Esogene:
– Xenobiotici,
– Radiazioni
– Ionizzanti (raggi X)
– Non ionizzanti (UV)
– Calore,
– Infezione,
– Iperossia,
– Inquinamento…
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Invecchiamento
Diminuzione delle difese antiossidanti
UV
Aumento dello stress ossidativo
AUMENTATA PRODUZIONE DI
ROS
Accumulazione dimutazioni del DNA
Stimolazione delle vie di trasduzione del
segnale
Modificazione di proteine
Alterazione della struttura genica
Alterazione dell’attivitàgenica
Alterazione della struttura e della
funzione delle proteine
Perdita della regolazione dell’omeostasi intracellulare ed extracellulare
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Stress ossidativo
Danni al DNA
Attivazione di Poli ADP riboso sintasi
Riduzione diNAD(H)
Diminuzione eossidazione di GSH
Inibizione dellasintesi di ATP Danni diretti
alle proteine
Aumento di Ca++
intracellulare
Danni al citoscheletro
Perossidazionelipidica
Aumento di Fe++, Cu++, eme-proteine liberi
Attivazione diNOS
Formazione di perossinitrito
Alterazione delle membrane
Perossidazionedelle membrane
Aumentato danno a DNA,
proteine e lipidi
Rilascio di ioni, eme-proteine perossidi ecc.
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Danni al DNA
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Tipi di danni al DNA
• Danni naturali
• Danni fisici (radiazioni ionizzanti e UV)
• Danni chimici (ROS e inquinanti organici)
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Danni Naturali
• Perdita di basi: il legame glicosidico è labile sotto condizione fisiologiche (formazione di un sito AP).
• Deamminazione: i gruppi amminici primari sono a volte instabili e possono venire convertiti in chetoni.
O P O
R
O P OH
O
NO
N
OO
NH2
P OH
O
O
OO
OH
H
NO
N
N
O
N
NH2
O
O P O
O
R
Sito AP
R
O P OH
O
NO
N
OO
O
H
O P O
R
NH3
R
O P OH
O
NO
N
OO
NH2
O P O
R
O2
Citidina Uracile
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Danni Fisici: Radiazioni Ionizzanti
• Danni diretti: Single Strand Break, Double Strand Break, mismatched bases.
• Danni indiretti: produzione di ROS.
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Danni Fisici: Radiazioni UV
• Stress ossidativo: foto-carcinogenesi e foto-invecchiamento (UV-B)
• Foto-dimerizzazione: formazione di CPD e 6-4PP (UV-C).
O P O
R
O P O
R
O
O NNH
O
O
CH3
P OH
OO
O
OO
N
NO
O
CH3
O P O
R
O P O
R
O
O
P OH
OO
O
OO
N
NO
O
CH3H
N
N
O
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Danni chimici: ROS
• Causano ossidazione delle basi e amplificano deamminazioni e depurinazioni.
o Un esempio di composto ossidato è OH8dG: causa trasversioni delle basi GC → TA
RO
O
RO
N
N
N
NH
O
NH2
RO
O
RO
N
N
N
NH
O
NH2
O HROS
deossiGuanosina 8-ossi-deossiGuanosina (OH8dG)
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Danni chimici: inquinanti Organici
• Genotossici: danno diretto al DNA tramite formazione di addotti (alchilanti in posizioni nucleofile).
N N
NN
NH2
R
N
NH
O
O
CH3
R
N
N
O
NH2
R
N N
NNH
O
NH2
R
Guanina
Adenina Timina
Citosina
OOH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
NN N
NN
O
H
H
DNA
(+)-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-ossidobenzo[a]pirene
(-)-trans-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diolo
(+)-anti-7,8-diidro-benzo[a]pirene-7,8-diol-9,10-ossido
addotto con il DNA
monoossigenasi epossido-idrolasi
monoossigenasi
• Epigenetici: danno indiretto al DNA attraverso stress ossidativo o l’attivazione di composti pericolosi. Es. IPA.
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Antiossidanti
• Gli antiossidanti non sono, in genere, dei radicali liberi. Quindi quando un antiossidante agisce si forma un radicale derivato dall’antiossidante.
• Se un radicale libero perde o guadagna un elettrone non è più un radicale libero:
NO• → e- + NO+
NO• + e- → NO-
• La reazione tra specie radicaliche porta alla perdita netta di radicali
O2•- + NO• → ONOO-
• nello specifico lo ione perossinitrito può generare radicale idrossile.
ONOOH → OH• + NO2•
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Meccanismi di riparo del danno
• Fisiopatologia ambientale…
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Referenze sul WEB
• Vie metaboliche
– KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/
• Degradazione degli xenobiotici: http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html
• Struttura delle proteine:
– Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/
– Hexpasy
• Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/
• Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/
• Enzyme (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
– Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/
• Enzimi:
– Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/
– Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/
– Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/
• Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/
• Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/
• Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html
• Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registryhttp://www.atsdr.cdc.gov
Crediti e autorizzazioni all’utilizzo
• Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da:
http://www.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/
• Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l’autore usando questa frase:
Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor
Università di Bologna a Ravenna
Giorgio Sartor - [email protected]
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Stress ossidativo
Danni al DNA
Attivazione di Poli ADP riboso sintasi
Riduzione diNAD(H)
Diminuzione eossidazione di GSH
Inibizione dellasintesi di ATP Danni diretti
alle proteine
Aumento di Ca++
intracellulare
Danni al citoscheletro
Perossidazionelipidica
Aumento di Fe++, Cu++, eme-proteine liberi
Attivazione diNOS
Formazione di perossinitrito
Alterazione delle membrane
Perossidazionedelle membrane
Aumentato danno a DNA,
proteine e lipidi
Rilascio di ioni, eme-proteine perossidi ecc.
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Stress ossidativo
Danni al DNA
Attivazione di Poli ADP riboso sintasi
Riduzione diNAD(H)
Diminuzione eossidazione di GSH
Inibizione dellasintesi di ATP Danni diretti
alle proteine
Aumento di Ca++
intracellulare
Danni al citoscheletro
Perossidazionelipidica
Aumento di Fe++, Cu++, eme-proteine liberi
Attivazione diNOS
Formazione di perossinitrito
Alterazione delle membrane
Perossidazionedelle membrane
Aumentato danno a DNA,
proteine e lipidi
Rilascio di ioni, eme-proteine perossidi ecc.
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Stress ossidativo
Danni al DNA
Attivazione di Poli ADP riboso sintasi
Riduzione diNAD(H)
Diminuzione eossidazione di GSH
Inibizione dellasintesi di ATP Danni diretti
alle proteine
Aumento di Ca++
intracellulare
Danni al citoscheletro
Perossidazionelipidica
Aumento di Fe++, Cu++, eme-proteine liberi
Attivazione diNOS
Formazione di perossinitrito
Alterazione delle membrane
Perossidazionedelle membrane
Aumentato danno a DNA,
proteine e lipidi
Rilascio di ioni, eme-proteine perossidi ecc.
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Stress ossidativo
Danni al DNA
Attivazione di Poli ADP riboso sintasi
Riduzione diNAD(H)
Diminuzione eossidazione di GSH
Inibizione dellasintesi di ATP Danni diretti
alle proteine
Aumento di Ca++
intracellulare
Danni al citoscheletro
Perossidazionelipidica
Aumento di Fe++, Cu++, eme-proteine liberi
Attivazione diNOS
Formazione di perossinitrito
Alterazione delle membrane
Perossidazionedelle membrane
Aumentato danno a DNA,
proteine e lipidi
Rilascio di ioni, eme-proteine perossidi ecc.
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