SOFTWARE PER LO SVILUPPO DI MAPPE FISICHE Simone Scalabrin DiMI Studente di dottorato in Informatica...

SOFTWARE PER LO SVILUPPO SOFTWARE PER LO SVILUPPO DI MAPPE FISICHEDI MAPPE FISICHE

Simone ScalabrinSimone Scalabrin

DiMI

Studente di dottorato in Informaticawww.dimi.uniud.it/scalabri

Università degli Studi di UdineIstituto agrario San Michele all’Adige

MAPPA FISICAMAPPA FISICA

• Insieme di contigInsieme di contig

• Ogni contig è un insieme ordinato di frammenti di DNA Ogni contig è un insieme ordinato di frammenti di DNA parzialmente sovrappostiparzialmente sovrapposti

•Minimal tiling pathMinimal tiling path

Librerie di cloni BAC, copertura del genoma pari a 7-30x, inserti sono prodotti con diversi insiemi di enzimi di restrizioneA

Clone BAC

Digestione

Separazione Rilevamento Dimensionam

20,000 bp

10,000 bp

4,000 bp

2,000 bp

1,200 bp800 bp

B

Comparazione a coppie Assemblaggio a

stringenza alta

C

Riassemblaggio manualecon stringenza bassa

DVerifica & AllineamentoE

Meyers, Scalabrin, Morgante 2004 Nature Reviews Genetics

COME SI COSTRUISCE UNA COME SI COSTRUISCE UNA MAPPA FISICAMAPPA FISICA

• Serie di cloni genomici parzialmente Serie di cloni genomici parzialmente sovrappostisovrapposti

• Identificazione delle sovrapposizioniIdentificazione delle sovrapposizioni

1043_A23

1096_G08

Digestione

Separazione Rilevamento Dimensionamento

20,000 bp

10,000 bp

4,000 bp

2,000 bp

1,200 bp

800 bp

B Clone BAC

IDENTIFICAZIONEIDENTIFICAZIONEDIDI

SOVRAPPOSIZIONISOVRAPPOSIZIONI

Fingerprinting

EcoRI

Fingerprinting

IDENTIFICAZIONEIDENTIFICAZIONEDIDI

SOVRAPPOSIZIONISOVRAPPOSIZIONI

Scelta degli enzimi

• Numero di frammenti prodotti

• Distribuzione delle bande prodotte

• Composizione del genoma

• Costo degli enzimi

ENZIMI A BLUNT ENDENZIMI A BLUNT END

5’AATGCATAGTACACATGTACTACAGATACGTACACAT 3’

3’TTACGTATCATGTGTACATGATGTCTATGCATGTGTA 5’

Estremità Estremità piattepiatte

TAGLIO BLUNT ENDTAGLIO BLUNT END

5’AATGCATAGT 3’ 5’ACACAT 3’

3’TTACGTATCA 5’ 3’TGTGTA 5’

5’ACACATGTACTACAGATACGT 3’

3’TGTGTACATGATGTCTATGCA 5’

ENZIMI A STICKY ENDENZIMI A STICKY END

5’ACTGAATGCATACTTAAGACATAGAGT 3’

3’TGACTTACGTATGAATTCTGTATCTCA 5’

Estremità Estremità

appiccicoseappiccicose

TAGLIO STICKY ENDTAGLIO STICKY END

5’ACTGAATGCATACT 3’ 5’TAAGACATAGAGT 3’

3’TGACTTACGTATGAAT 5’ 3’TCTGTATCTCA 5’

IL IL FINGERPRINTINGFINGERPRINTING FLUORESCENTEFLUORESCENTE

5’ACTGAATGCATACTTT 3’

3’TGACTTACGTATGAAT 5’

Marcatura fluorescenteMarcatura fluorescente

Colori differenti

Comparazione a coppie

Assemblaggio astringenza alta

C

LA LOGICA DEL LA LOGICA DEL FINGERPRINTINGFINGERPRINTING

Frammenti di uguale dimensione nelFrammenti di uguale dimensione nel pattern pattern di digestionedi digestione

PossibilePossibile sovrapposizione sovrapposizione

BBAA

PROBLEMI NEL CONFRONTO PROBLEMI NEL CONFRONTO TRA TRA FINGERPRINTFINGERPRINT

• DimensionamentoDimensionamento dei frammentidei frammenti• Falsi positivi (caso, bande doppie)Falsi positivi (caso, bande doppie)• Falsi negativi (eterozigosi, bande Falsi negativi (eterozigosi, bande

mancanti)mancanti)

TECNICHE DI TECNICHE DI FINGERPRINTINGFINGERPRINTING

1. 1. Digestione sempliceDigestione semplice

2. 2. Digestione e marca- Digestione e marcatura radioattivatura radioattiva

Gel d’agarosioGel d’agarosio

Dimensionamento poco precisoDimensionamento poco preciso

Gel di poliacrilammideGel di poliacrilammide

Dimensionamento più precisoDimensionamento più preciso

3. 3. Digestione e marca- Digestione e marcatura fluorescentetura fluorescente

Gel di poliacrilammideGel di poliacrilammide

Dimensionamento più precisoDimensionamento più preciso

Meno falsi positivi grazie ai coloriMeno falsi positivi grazie ai colori

AA BB

TECNICHE DI TECNICHE DI FINGERPRINTINGFINGERPRINTING

AA BB

Digestione semplice Digestione e marcatura fluorescente

FALSO POSITIVOFALSO POSITIVO

IL IL FINGERPRINTINGFINGERPRINTING FLUORESCENTEFLUORESCENTE

• Un enzima Un enzima frequent cutterfrequent cutter che produce che produce estremità piatteestremità piatte

• 4 enzimi che producono estremità 4 enzimi che producono estremità appiccicoseappiccicose

• Reazioni di estensione della singola Reazioni di estensione della singola basebase con ddNTP fluoresceinaticon ddNTP fluoresceinati

• Elettroforesi su poliacrilammideElettroforesi su poliacrilammide

L’ANALISI DEI DATIL’ANALISI DEI DATI

Individuazione dei picchiIndividuazione dei picchi

Rimozione background Rimozione background e bande vettoree bande vettore

ElettrocromatogrammiElettrocromatogrammi ABI Prism 3730ABI Prism 3730

GeneMapperGeneMapper

GenoprofilerGenoprofiler

Script in PERLScript in PERL

Costruzione contigCostruzione contig FPCFPC

ATTIVITA’ATTIVITA’ SOFTWARESOFTWARE

ELETTROCROMATOGRAMMI (fsa)ELETTROCROMATOGRAMMI (fsa)

Picco elettroforeticoPicco elettroforetico

ELETTROCROMATOGRAMMIELETTROCROMATOGRAMMI

INDIVIDUAZIONE DEI PICCHIINDIVIDUAZIONE DEI PICCHI

Tabella in formato testo (GeneMapper)Tabella in formato testo (GeneMapper)

ELETTROCROMATOGRAMMIELETTROCROMATOGRAMMI

Composizione per colore:• Almeno 200 picchi• 30 – 50 bande vere• Altezza minima (livello minimo di

background)

Eletrocromatogrammi → testo

• Dividere in colori• Massima sensibilità (FPC tratta 0-60000)• 4 colori → 4 zone

50 500 50 500 50 500 50 500

0 6000015000 30000 45000

Eletrocromatogrammi → testo

1028_B10 141526,71739,15867,46664,57170,67319,116500,018532,820370,920919,621139,522703,724783,350414,1

BLU

VERDE

ROSSO

LA RIMOZIONE DEL LA RIMOZIONE DEL BACKGROUNDBACKGROUND

Bande vere

Background

Rimozione del rumore

LA RIMOZIONE DEL LA RIMOZIONE DEL BACKGROUND 1BACKGROUND 1

f(avg)

Genoprofiler 1.10http://wheat.pw.usda.gov/PhysicalMapping/tools/genoprofiler/genoprofiler.html


f(ratio)

Scalabrin e Morgante


ULUA

LLLA

UL

UA

LLLA

fine

IG = UA1 – LA1IG = UA1 – LA1

UL = UA – 0,3 * IGUL = UA – 0,3 * IG

LL = LA + 0,15 * IGLL = LA + 0,15 * IGScalabrin e Morgante Script in Perl

LA COSTRUZIONE DEI LA COSTRUZIONE DEI CONTIGCONTIG

Due parametri chiave

Tolerance = scarto accettato

Cutoff: probabilità che il match tra due cloni sia dovuto puramente al

caso (e non sia una vera sovrapposizione)

Cutoff più basso → maggior stringenza

FPC 8.1

- FingerPrinted Contigs

- 2 passi per assemblare i cloni in contigs:

1) Clustering: basato sul numero delle bande condivise2) Ordinamento: trova la soluzione migliore che massimizzi le sovrapposizioni

http://www.agcol.arizona.edu/software/fpc/

Confronto tra due cloni

• Sulston cutoff score

mnL ((1 p)m pnL m )

mM

nL

where p = (1 – b)nH, b = 2t/gellen, t is the tolerance, gellen is the number of possible values for bands, nL and nH are the minimum and maximum number of bands for the two clones (nL<nH), and M is the number of shared bands.

Dove nL e nH sono il numero minimo e massimo di bande per i due cloni ed M è il numero minimo di bande condivise, p=(1-b)nH, b=2t/gellen, t è la tolleranza, gellen è la lunghezza del gel.

b rappresenta la probabilità che una banda di un clone faccia il match con una banda dell’altro clone.

t t0 gellen

p rappresenta la probabilità che nessuna delle nH bande del clone “più grande” facciano il match con una data banda del clone “più piccolo”.

Mapping BACs within contigs

CB MapsFPC prova a ordinare cloni basandosi su Consensus Bands

Extra bands

Clone name

Bands

+ = shared bando = missing bandx = 2 tolerance bin

Clone order

Cloni Q

• numero sufficiente di bande per entrare in un contig• molte bande extra• non bene nella mappa

4 Tipi di Qs

2) Clone in posizione errata - sequenza ripetuta

1) Fingerprint di scarsa qualità

3) Soluzione non ottimale

4) Diversità allelica

Riassemblaggio semi-manualea stringenza bassa

D

Verifica e allineamentoE

Collegamento fra mappa fisica e genetica, considerazioni

• Quanti contig ci aspettiamo di ottenere nella mappa fisica iniziale?– 1 per cromosoma!!!

– Dipende dal genoma in questione

• Ogni contig deve essere collegato alla mappa genetica– 1 marker per contig fornisce la posizione

– 2 marker per contig forniscono anche l’orientamento

RINGRAZIAMENTIRINGRAZIAMENTI• Prof. Michele MorganteProf. Michele Morgante• Dott. Riccardo VelascoDott. Riccardo Velasco• Dott. Marco MoroldoDott. Marco Moroldo• Prof. Alberto PolicritiProf. Alberto Policriti• Dott. Giacomo PreteDott. Giacomo Prete• Dott.sa Raffaella MarconiDott.sa Raffaella Marconi• P.Ch. Nicoletta FeliceP.Ch. Nicoletta Felice• Dott. Massimo PindoDott. Massimo Pindo• Dott.sa Michela TroggioDott.sa Michela Troggio• Dott.sa Cinzia SegalaDott.sa Cinzia Segala• Dott. Paolo FontanaDott. Paolo Fontana

APPENDICE

LETTERATURALETTERATURA• Mapping and sequencing complex genomes: Mapping and sequencing complex genomes:

Let’s get physical!, Let’s get physical!, Meyers, Scalabrin, Meyers, Scalabrin, MorganteMorgante, Nature Reviews Genetics, 2004, Nature Reviews Genetics, 2004

• FPC: a system for building contigs from FPC: a system for building contigs from restriction fingerprinted clones, restriction fingerprinted clones, Soderlund, Soderlund, Longden, MottLongden, Mott, , 19971997

• DNA markers in plant improvement: an DNA markers in plant improvement: an overview, overview, KumarKumar, , 19991999

• Nucleotide and aplotype diversity in wine Nucleotide and aplotype diversity in wine cultivars of Grape, cultivars of Grape, Prete, Cattonaro, Prete, Cattonaro, MorganteMorgante, , 20032003

L’IMPATTO DELL’ETEROZIGOSIL’IMPATTO DELL’ETEROZIGOSI

50% frammenti condivisi50% frammenti condivisi 50% frammenti condivisi e 4 50% frammenti condivisi e 4 cloni di tipo B mancanticloni di tipo B mancanti

1200 CBu1200 CBu 2200 CBu2200 CBu

Descrizione del processo

• Giorno 1: precoltura cellulare

• Giorno 2: coltura cellulare

• Giorno 3: isolamento DNA

• Giorno 4: frammentazione DNA

• Giorno 5: marcatura DNA e separazione su sequenziatore

N. campioni

1600

1600

1600

1600

1600

Tutte 5 fasi avvengono simultaneamente8000 campioni DNA diversi processati settimanalmente

3 persone

A

B

B

A

C

Informatica

Robotica

Ancora robotica

Automazione

48 campioni DNA ogni 35 minuti, 2000 al giornosenza intervento operatore

IDENTIFICARE LE IDENTIFICARE LE SOVRAPPOSIZIONISOVRAPPOSIZIONI

Marcatori

VV132

VV132


Marcatori

VV132


Marcatori

VV132

Fingerprinting

EcoRI


Marcatori

VV132

Fingerprinting

Codice rimozione Codice rimozione background(3)background(3)

upper_avgupper_avg = = avg of peaks 3-7avg of peaks 3-7

lower_avglower_avg = = avg of 60th peak onavg of 60th peak on

ratioratio = = upper_avg / lower_avgupper_avg / lower_avg

IFIF ( (ratio < 4,5ratio < 4,5) {) {throw awaythrow away}}

IFIF ( (#peaks < 60#peaks < 60) {) {thresholdthreshold = = 500500}}

ELSEELSE { {thresholdthreshold = = iteration()iteration()}}

CodiceCodice

ITERATION()ITERATION()initialGapinitialGap == upper_avg – lower_avgupper_avg – lower_avg

upper_limitupper_limit = = heigth[7]heigth[7]

lower_limitlower_limit = = heigth[60]heigth[60]

WHILEWHILE ((avg is changing AND ratio > 4,5avg is changing AND ratio > 4,5) {) {

upper_limitupper_limit = = upper_avg – (0,2 * initialGap + upper_avg – (0,2 * initialGap + (upper_avg - lower_avg) * (0,1 + ratio / 100))(upper_avg - lower_avg) * (0,1 + ratio / 100))

lower_limitlower_limit = = lower_avg + 0,1 * initialGap + lower_avg + 0,1 * initialGap + (upper_avg - lower_avg)*(ratio/100)(upper_avg - lower_avg)*(ratio/100)

COMPUTECOMPUTE upper_avg, lower_avg and ratioupper_avg, lower_avg and ratio

}}

INTEGRAZIONE TRA MAPPA INTEGRAZIONE TRA MAPPA FISICA E GENETICAFISICA E GENETICA

GR05680,0

GR01767,2

BA002517,6BA000321,1F20236b21,8IN012623,4GR040924,4GR028025,5F2068126,1E39/M49-11426,7E32/M62-28230,5F20236a33,7

Chr 10

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