Società Italiana di FotoBiologia

Sezione Nazionale della International Union for Photobiology

Congresso Annuale 2008

Firenze, Chiostro del Maglio Centro Militare di Medicina Legale. Via Venezia, 5

29 - 31 Maggio 2008

Società Italiana di Fotobiologia

ATTI DEL CONGRESSO NAZIONALE

DELLA SOCIETA’ ITALIANA DI FOTOBIOLOGIA

Firenze, 29-31 Maggio 2008

COMITATO SCIENTIFICO

Gianfranco Canti, Milano Sergio Caffieri, Padova Pier Giacomo Calzavara-Pinton, Brescia Giovanni Checcucci, Pisa Franco Fusi, Firenze Francesco Ghetti, Pisa Giulio Jori, Padova Giuseppe Palumbo, Napoli Massimo Trotta, Bari

COMITATO ORGANIZZATORE

Gianfranco Canti, Milano Francesca Cialdai, Firenze Antonio Conti, Firenze Franco Fusi, Firenze Francesco Ghetti , Pisa Monica Monici, Firenze Giovanni Romano, Firenze

SUPPORTO TECNICO Pasquale Imperiale, Firenze

Il Convegno Nazionale della Società Italiana di Fotobiologia -

2008 - ha luogo con il sostegno ed il patrocinio da parte di:

Provincia di Firenze

Società Italiana di FotoBiologia Sezione Nazionale della International Union for Photobiology

Congresso Annuale 2008 Firenze, Chiostro del Maglio Centro Militare di Medicina Legale. Via Venezia, 5

29-31 Maggio 2008

Programma

Giovedì 29 Maggio

14.30

15.00 Registrazione e accoglienza

Apertura del Congresso (Saluti delle Autorità)

15.15 - 16.00

Plenary Lecture

Chairperson: Gianfranco Canti (Milano)

Riccardo Pratesi (Firenze)

Luci e colori in foto-bio-medicina

16.00 – 18.30

Comunicazioni Orali (10’+5’di discussione)

Chairperson: Paola Taroni (Milano)

DIFFUSION&PERTURBATION: PACCHETTO SOFTWARE PER LO STUDIO DELLA MIGRAZIONE FOTONICA NEL TESSUTO BIOLOGICO F. Martelli, S. Del Bianco, A. Ismaelli, G. Zaccanti IMAGING IN AUTOFLUORESCENZA NELLA MALATTIA DI STARGARDT Bini A., Sodi A., Forconi S, Passerini I, Torricelli F, Menchini U IN VIVO CORRELATION MICROSCOPY METHODS. G. Chirico CARATTERIZZAZIONE DI ILLUMINATORE A LED PER LA FOTOTERAPIA DELLA MALATTIA DI C. NAJJAR C. Bonvicini, V. Venturi, G. Romano, M. Monici, F. Cialdai, A. Conti, F. Fusi SPETTROSCOPIA DI AUTOFLUORESCENZA DI TESSUTO EPATICO IN CONDIZIONI NUTRIZIONALI ALTERATE U. De Simone, A.C. Croce, A. Ferrigno, M. Vairetti, I. Freitas, E. Boncompagni, G. Bottiroli TECNICHE DI SPETTROSCOPIA LASER PER RIVELAZIONE DI BIOMARKERS E DIAGNOSI TUMORALE G. Giubileo, A. Puiu, F. Dell’Unto CYTOCHROME C OXIDASE: A POSSIBILE PHOTOACCEPTOR FOR THE LIGHT-INDUCED RESPIRATORY RATE INCREASE IN LIVING CELLS A. Remedi, G. Cercignani,G. Colombetti, R. Del Carratore, S. Lucia TIME-RESOLVED FLUORESCENCE IN BIOLOGY R. Mercatelli, M. Vassalli PHOTOTOXICITY OF STATINS A. Salvador, P. Grobelny, G. Viola, D. Vedaldi, F. Dall’Acqua

Venerdì 30 Maggio

9.00 - 9.10 Conferimento del Premio di Laurea “Thameur Ben Amor”

9.10 - 9.40 Comunicazione orale del vincitore del Premio “Thameur Ben Amor”

9.40 - 10.30

Plenary Lecture

Chairperson: Francesco Lenci (Pisa)

Kristian Berg (Oslo)

Photochemical internalization (PCI). A novel technology for light-directed

drug delivery

10.30 - 10.50 Coffee break

10.50 – 12.30

Comunicazioni Orali (10’+5’di discussione)

Chairperson: Rinaldo Cubeddu (Milano)

PDT TREATMENT OF EXPERIMENTAL ORAL CANDIDIASIS IN MICE C. Alongi, I. Naldi, L. Fantetti, G. Roncucci PHOTODYNAMIC ACTIVITY OF A NEW ZN(II) PHTHALOCYANINE DERIVATIVE: IN VIVO TREATMENT OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA C. Alongi, T. Scommegna, L. Fantetti, G. Roncucci UTILIZZO DI NANOPARTICELLE NELLA TERAPIA FOTODINAMICA IN VIVO M. Camerin , M. Moreno , M. Magaraggia, D. Russell, G. Jori IN VIVO ABSORPTION SPECTRA OF THE TWO STABLE STATES OF THE EUGLENA PHOTORECEPTOR PHOTOCYCLE L. Barsanti, P. Coltelli, V. Evangelista, V. Passarelli, N. Vesentini, A.M. Frassanito, P. Gualtieri CHARACTERIZATION OF THE CRISTALLINE STRUCTURE OF THE EUGLENA PHOTORECEPTOR L. Barsanti, P. Coltelli, V. Evangelista, V. Passarelli, N. Vesentini, A.M. Frassanito, P. Gualtieri UVB PHOTOLYSIS OF 5-FLUOROURACIL IN SOLUTION AND IN DRUG FORMULATIONS G. Miolo, C. Marzano, S. Caffieri

12.30 - 13.30 Pausa pranzo

13.30 - 14.30 Sessione Poster

IMPIEGO TERAPEUTICO DI LUCE POLARIZZATA INCOERENTE NELLA RADIODERMITE Faraone V., Ruello E., Scarmato A., Denaro L., Sansotta C., Testagrossa B., Ruggeri P., Vermiglio G. PHOTODYNAMIC EFFECTS OF NOVEL MESO DI- AND TETRA-ARYL PORPHYRIN DERIVATIVES IN HUMAN ADENOCARCINOMA CELLS. M. B. Gariboldi, R. Ravizza, R. Molteni, S. Meschini, E. Caruso, S. Banfi, E. Monti. IL TRATTAMENTO CON LASER Nd:YAG PULSATO INDUCE LA PRODUZIONE DI MOLECOLE DELLA MATRICE EXTRACELLULARE IN CELLULE DEI TESSUTI CONNETTIVI. POTENZIALITÀ APPLICATIVE NELLA RIPARAZIONE DEI TESSUTI. F. Cialdai, V. Basile, G. Romano, F. Fusi, A. Conti, M. Monici. MAL-PDT NEL TRATTAMENTO DI CARCINOMI SQUAMOCELLULARI IN SITU, MICROINVASIVI E INVASIVI. C. Zane, M. Venturini, R. Sala, R. Capezzera, M. T. Rossi, G. Parrinello, C. Specchia, P. Calzavara-Pinton. TRATTAMENTO CON MAL-PDT DELLA CUTE FOTODANNEGGIATA DI VISO E CUOIO CAPELLUTO. C. Zane, R. Capezzera, M. T. Rossi, P. Calzavara-Pinton POSSIBLE APPLICATION OF ANTIBACTERIAL PHOTODINAMIC CHEMOTHERAPY (PACT) V. Orlandi, E. Caruso, S. Banfi, P. Barbieri

14.30 – 15.10

Plenary Lecture

Chairperson: Giorgia Miolo (Padova)

Stefania Motta (Milano)

ALA-PDT e prospettive in dermatologia: dai tumori all'estetica

15.10 - 16.25

Comunicazioni Orali (10’+5’di discussione)

Chairperson: Giulio Jori (Padova)

PHOTODYNAMIC THERAPY: NEWS Rossi R., Zanieri F., Lotti T. FOTORINGIOVANIMENTO ABLATIVO E NON ABLATIVO: DALLA LUCE PULSATA AL LASER P. Campolmi, P. Bonan, G. Cannarozzo, T. Lotti

VALUTAZIONE DERMOSCOPICA DI NEVI MELANOCITICI ACQUISITI IN PAZIENTI ESPOSTI A DOSI SUBERITEMIGENE DI UVB A BANDA STRETTA O UVA1 A. M. Manganoni, G. Tucci, M. Venturini, C. Farisoglio, M. T. Rossi, P. G. Calzavara-Pinton.

TRATTAMENTO MEDIANTE FOTOTERAPIA CON LUCE ROSSA DELL’ACNE VOLGARE DI GRADO MODERATO. C. Zane, R. Capezzera, A. Pedretti, E. Facchinetti, M.T. Rossi, P.G. Calzavara-Pinton

RUOLO DEI SISTEMI LASER NEL TRATTAMENTO DELLE LESIONI CUTANEE CRONICHE C. Mirabella, D. Fortuna

16.25 - 16.40 Coffee break

16.40 - 18.00

Comunicazioni Orali (10’+5’di discussione)

Chairperson: Giuseppe Palumbo (Napoli)

PROPRIETA’ FOTO- E RADIO-SENSIBILIZZANTI DI DERIVATI TETRAPIRROLICI BORONATI NELLA TERAPIA DEL MELANOMA PIGMENTATO Friso E., Vicente Graça H., Soncin M., Fabris C., Moro D., Colautti P., Rosi G., Jori G. GOLD NANORODS AS NEW CHROMOPHORES IN THE LASER WELDING OF CONNECTIVE TISSUES: CHALLENGES, RESULTS AND PERSPECTIVES F. Ratto, P. Matteini, F. Rossi, R. Pini, N. Tiwari, S.K. Kulkarni, L. Menabuoni INVESTIGATION ON FIBROUS COLLAGEN MODIFICATIONS DURING CORNEAL LASER WELDING BY MEANS OF POLARIZING, FLUORESCENCE, ELECTRON AND MULTIPHOTON MICROSCOPIES P. Matteini, F. Rossi, F. Ratto, G. Agati, R. Pini, R. Cicchi, F.S. Pavone ATTIVITA’ FOTOCITOPROTETTIVA DI ISOTIOCIANATI A. Tarozzi, F. Morroni, A. Marchesi, C. Angeloni, A. Merlicco, S. Hrelia, G. Cantelli Forti, Patrizia Hrelia

18.00 Assemblea dei Soci

20.00 Cena sociale

Sabato 31 Maggio

9.00 - 9.40

Plenary Lecture

Chairperson: Massimo Trotta (Bari)

Carlo Musio (Napoli)

Seeing without looking: models and mechanisms of non-visual photoreception

9.40 – 10.45

Comunicazioni Orali (10’+5’di discussione)

Chairperson: Franco Fusi (Firenze)

HE-NE LASER IRRADIATION OF OCIMUM BASILICUM L. SEEDS RESULTS IN INCREASE OF BOTH THE RATE OF SEED GERMINATION AND PLANT GROWTH AND IN A RISE OF THE TOTAL CONTENT OF TERPENES Pinelli P., Paventi G., Pizzuto R., Maiuro L., Rapparini F., Alvino A., Ognissanti M., Marcellino G., Passarella S. STUDIO CINETICO DELLE PROPRIETA’ DEL SITO DI LEGAME QB DEL CENTRO DI REAZIONE FOTOSINTETICO DI RHODOBACTER SPHAEROIDES F. Milano, F. Ciriaco, A. Agostiano, F. Mavelli, M. Trotta PHOTOPHYSICAL PROPERTIES OF QUINONES AND THEIR INTERACTION WITH THE PHOTOSYNTHETIC REACTION CENTRE A. Barbafina, F. Elisei, L. Latterini, F. Milano, M. Trotta, A. Agostiano

10.45 - 11.00 Coffee break

11.00 – 12.30

Comunicazioni Orali (10’+5’di discussione)

Chairperson: Franco Fusi (Firenze)

DELAYED LUMINESCENCE E PERFORMANCE GERMINATIVA DI SINGOLI SEMI E. Costanzo, M. Gulino, L. Lanzanò, F. Musumeci, A. Scordino, L. Sui, S. Tudisco IDENTIFICAZIONE DELLE REGIONI DI REGOLAZIONE DEI GENI DELLA FAMIGLIA MULTIGENICA LHCB1 IN SPINACIO MEDIANTE GENOME WALKING. C. Leoni, R. Galleran, L.R. Ceci SCATTERING DI LUCE LASER E MICROSCOPIA A FORZA ATOMICA SU FRAMMENTI DI BETACONNETTINA DEL MUSCOLO CARDIACO UMANO S. Marchetti, F. Sbrana, R. Raccis, L. Lanzi, C. M. C. Gambi, M. Vassalli, B. Tiribilli, A. Pacini, A. Toscano

12.30 Chiusura dei lavori

GIOVEDI’ 29 MAGGIO

Luci e colori in foto-bio-medicina

Riccardo Pratesi, Dip. Fisica, Università di Firenze

Innumerevoli sono gli effetti della radiazione ottica sulla biomateria e molte terapie se ne

avvantaggiano, seguendo i progressi della scienza fotobiomedica e della fototecnologia. Il fascino

che fin dall’antichità ha attribuito poteri benefici alla luce solare perdura tutt’oggi, inducendo usi

impropri e/o dannosi della radiazione ottica, sui quali la comunità scientifica è chiamata a vigilare.

La relazione riassumerà brevemente lo stato dell’arte sul progresso delle sorgenti ottiche e sugli

avanzamenti delle applicazioni terapeutiche.

DIFFUSION&PERTURBATION: PACCHETTO SOFTWARE PER LO STUDIO DELLA MIGRAZIONE FOTONICA NEL TESSUTO BIOLOGICO

Fabrizio Martelli1, Samuele Del Bianco2, Andrea Ismaelli1 and Giovanni Zaccanti1

1 Dipartimento di Fisica dell’Università degli Studi di Firenze, Via G. Sansone 1, 50019 Sesto

Fiorentino, Firenze, Italy 2 CNR-Istituto di Fisica Applicata “Nello Carrara”, Via Madonna del Piano 10, 50019 Sesto

Fiorentino, Firenze, Italy. Diffusion&Perturbation è un software dedicato al calcolo e alla visualizzazione delle soluzioni

dell’equazione della diffusione e della sua teoria perturbativa per mezzi diffusivi omogenei. Questo

paccheto software ha una semplice interfaccia con l’utente sviluppata nell’ambiente

LabWindows/CVI. L’obiettivo di questo software è di fornire un supporto allo studio della

migrazione fotonica attraverso il tessuto biologico. Esso è stato concepito sia per gli specialisti che

per i non specialisti di migrazione fotonica. Il tipo di informazione ricostruita attraverso questo

software copre tutte le grandezze fisiche utilizzate in questo tipo di studi come la irradianza (o

fluence rate) nel mezzo omogeneo, la riflettanza e la trasmittanza diffusa. I campi di applicazione

vanno dalla spettroscopia dei tessuti, all’imaging ottico, alla terapia fotodinamica.

IMAGING IN AUTOFLUORESCENZA NELLA MALATTIA DI STARGARDT

A. Bini, A. Sodi, S. Forconi, I. Passerini°, F.Torricelli°, U.Menchini

Clinica Oculistica , Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi, Firenze °SOD Diagnostica Genetica, Azienda Ospedaliero Universitaria Careggi, Firenze

La malattia di Stargardt ( STGD) è la più comune maculopatia eredofamiliare ; essa è caratterizzata

da un esordio nell’età giovanile adulto con un progressivo aggravamento visivo.

La STGD è in genere trasmessa con modalità autosomica recessiva associata a mutazioni del gene

ABCA4 che codifica per una proteina di trasporto del ciclo visivo.

A causa del deficit funzionale di tale proteina si verifica a livello dell’epitelio pigmentato retinico

(EPR) un accumulo intracellulare del metabolica tossico A-2E, principale componente delle

lipofuscine.

Poiché le lipofuscine sono in rapporto all’autofluorescenza dell’EPR nel presente lavoro abbiamo

valutato l’aspetto in autofluorescenza del fondo oculare di 20 pazienti affetti da STGD.

Le alterazioni riscontrate sono state correlate con le mutazioni riscontrate in questi pazienti a carico

del gene ABCA4.

Nella casistica studiata sono stati identificati alcuni principali patterns di alterazioni

autofluorescenti a livello del polo posteriore ; i patterns suggestivi per una maggiore

disorganizzazione strutturale dell ‘EPR sono risultati correlati a mutazioni presumibilmente

responsabili di una più grave alterazione funzionale della proteina codificata da ABCA4.

IN VIVO CORRELATION MICROSCOPY METHODS.

Giuseppe Chirico

Dipartimento di Fisica, Università di Milano Bicocca, Piazza della scienza 3, 20126, Milano (I).

Two main issues in modern applications of optical microscopy are related to the possibility to

provide information of biological cells and tissue in-vivo and to the attainment of higher resolution.

In order to reach these goals, brighter and more versatile probes are being continuously developed

together with new optical and image analysis methods. We report here on the use of nanoparticles

for developing new probes for fluorescence applications in bio-medical sciences and on image

analysis techniques, that provide information on the kinetics of the interactions of these

nanoparticles with cells. Two systems will be discussed as examples: gold nanoparticles coupled to

fluorophores and fluorescent proteins, leading to a fluorescence brightness enhancement, and

polymeric nanoparticles that interact and internalize in cells.

CARATTERIZZAZIONE DI ILLUMINATORE A LED PER LA FOTOTERAPIA

DELLA SINDROME DI CRIGLER-NAJJAR

Bonvicini C. , Venturi V.1, Romano G.2, Monici M.3, Cialdai F.2, Conti A.2 and Fusi F.2

1CIAMI ONLUS,

2Dip. Fisiopatologia Clinica, sez. Fisica Medica, Università di Firenze 3ASAcampus, ASA Research Division, Dip. di Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze.

La Sindrome di Crigler-Najjar è una rara malattia ereditaria, a trasmissione autosomica recessiva,

dovuta al deficit di un enzima del fegato (B-UGT). Esso permette la coniugazione della bilirubina

(neurotossica) con l’acido glicuronico, consentendo l’eliminazione della stessa attraverso la bile.

Precedentemente all’introduzione della fototerapia, l’iperbilirubinemia poteva causare gravi quadri

neurologici e ritardo mentale.

I pazienti con sindrome di Crigler-Najjar devono sottoporsi a fototerapia giornaliera (di solito la

notte) esponendo la superficie corporea a luce blu di fluenza circa 3-4 mW/cm2 per 8 ore. Set-up

fototerapici a lampade fluorescenti sono assolutamente non-portatili per non dire intrasportabili,

restringendo fortemente la libertà individuale con l’impossibilità di pernottamenti fuori casa.

Attualmente le lampade fluorescenti sono le sorgenti più usate perchè uniscono alta efficienza (~

20%) con bassa emissione di radiazione infrarossa e basso costo. Hanno però bassa brillanza ovvero

la superficie radiante è elevata rendendo le lampade di grosso ingombro.

Se questo inconveniente è di non grande importanza per la routine in neonatologia, diventa

insormontabile per l’adulto.

Per ovviare a questa situazione è stato progettato un prototipo di illuminatore a LED di alta potenza.

Le sorgenti a semiconduttore stanno infatti raggiungendo un grado di efficienza ed affidabilità tali

da poter essere già da oggi impiegate con successo nella fototerapia dell’iperbilirubinemia. Tale

illuminatore i vantaggi di un minor costo, maneggevolezza e un illuminazione piu’ uniforme

rispetto a precedenti modelli. La lunghezza d’onda di picco di emissione è di 455nm,

corrispondente al valore che studi clinici hanno dimostrato essere la più efficace per la terapia della

sindrome di Crigler-Najjar.

Il set-up è stato poi validato su un paziente consenziente.

SPETTROSCOPIA DI AUTOFLUORESCENZA DI TESSUTO EPATICO

IN CONDIZIONI NUTRIZIONALI ALTERATE

U. De Simone1, Anna Cleta Croce1, Andrea Ferrigno, Mariapia Vairetti3, Isabel Freitas1,2, Eleonora Boncompagni2, Giovanni Bottiroli1

1 IGM / CNR - Sezione di Istochimica e Citometria, e 2Dipartimento di Biologia Animale; 3 Dipartimento di Medicina&Terapia, Università degli studi di Pavia, Pavia.

Il contributo dei fluorofori endogeni all’emissione dell’autofluorescenza del fegato è strettamente dipendente dalla sua attività metabolica. Risultati preliminari ottenuti sul fegato umano in presenza di accumulo di lipidi mostrarono alterazioni dei parametri di autofluorescenza (ampiezza del segnale, forma spettrale, cinetica di photobleaching) rispetto al tessuto epatico in condizioni normali. Scopo di questo lavoro è verificare il ruolo dei diversi fluorofori endogeni presenti nel tessuto epatico, con particolare riferimento alla vitamina A e ai lipidi. A tal fine è stato utilizzato un modello animale che in letteratura è riportato garantire condizioni standardizzate: il fegato di ratti in condizione di alterazione nutrizionale, digiuno, che induce un temporaneo accumulo sia di lipidi che di retinoidi nel tessuto epatico. Sezioni criostatiche di campioni di tessuto epatico (conservati a – 80 °C) di ratti Wistar, nutriti normalmente o a digiuno (24 h), sono state sottoposte in parallelo a: 1) analisi istochimica (reazione del cloruro d’oro per la marcatura della vitamina A, “Nile Red”, fluorocromo specifico per i lipidi); 2) analisi di autofluorescenza per eccitazione a 366 nm (imaging per la localizzazione dei segnali con elevata fotolabilità, microspettrofluorimetria). I dati istochimici e l’analisi di immagine di autofluorescenza hanno confermato l’incremento della concentrazione di vitamina A e di lipidi e la loro colocalizzazione nel parenchima epatico di ratto a digiuno. L’analisi di fitting spettrale e la cinetica di fotodecomposizione per irraggiamento continuo hanno indicato la vitamina A come il fluoroforo endogeno maggiormente responsabile delle differenze fotofisiche tra i ratti a digiuno e i ratti controllo. Queste risultati suggeriscono quindi la vitamina A come potenziale “marker” per valutazioni in vivo, in tempo reale dell’accumulo di lipidi in condizioni di alterazioni fisiologiche, o patologiche.

TECNICHE DI SPETTROSCOPIA LASER PER RIVELAZIONE DI BIOMARKERS E DIAGNOSI TUMORALE

G. Giubileo1, A. Puiu2, F. Dell’Unto3

1ENEA, 2Università degli Studi di Roma Tor Vergata, 3Università degli Studi di Roma Sapienza

La presente comunicazione riporta risultati ottenuti dal Laboratorio di Spettroscopia Molecolare

dell’ENEA di Frascati, nell’ambito della diagnostica biomedica non invasiva. Gli apparati realizzati

ed utilizzati negli esperimenti sono basati sulle due tecniche seguenti.

1. Spettroscopia IR ad alta risoluzione in fase gassosa per la determinazione di composti organici

volatili in traccia (fino a concentrazioni inferiori al ppbv). Applicazione principale è l’analisi

dell’espirato per la rivelazione di markers molecolari che siano segno di patologie in atto, o monitor

per lo studio di percorsi biochimici organici. La tecnica consente inoltre il monitoraggio (sempre

attraverso l’espirato) di sonde molecolari marcate con isotopo non radioattivo. Vengono illustrati i

risultati ottenuti nel corso della rivelazione di markers dello stress ossidativo nei sistemi biologici

analizzati: pazienti oncologici, subacquei in immersione prolungata, arance infettate da patogeno.

2. Spettroscopia della fluorescenza indotta per studiare composizione e struttura di tessuti biologici

specifici. Lo scopo è mettere in luce e quantificare differenze qualitative, utili per distinguere il

tessuto tumorale dal tessuto sano ai fini di una diagnostica precoce non invasiva. I dati riportati

provengono dall’analisi di reperti istologici di tiroide, nei quali abbiamo riscontrato la presenza di

due bande di fluorescenza significative.

CYTOCHROME C OXIDASE: A POSSIBILE PHOTOACCEPTOR FOR THE LIGHT-INDUCED RESPIRATORY

RATE INCREASE IN LIVING CELLS

A. Remedi1, G. Cercignani2, G. Colombetti1

, R. Del Carratore3, S. Lucia1

1 Istituto di BioFisica, CNR – Pisa 2 Dipartimento di Biologia – Università di Pisa Istituto di Fisiologia Clinica, CNR – Pisa For a long time some researchers have been investigated the effects of visible-to-near-infrared (Vis-

NIR) radiation on several kind of eukaryotic cells, reporting a light-induced increase of cell

proliferation parameters; they suggests that these effects are mediated by the mitochondrial enzyme

cytochrome c oxidase, CcOX [1; 2]. In the latest years, the use of therapeutic light radiation (Low

Laser Therapy, LLT) in different pathologies renewed the interest about the above cited light-

induced effects [3; 4; 5].

We studied the effects of light during irradiation in order to assess the involvement of CcOX as a

primary photoacceptor and to understand the underlying action mechanism of the light effect. To

this purpose, we measured, through a Clark electrode under conditions of steady-state reduction of

cytochrome c, the CcOX-O2 consumption rate during Vis-NIR irradiation on cultured cells. In our

experimental conditions, when Visible light is switched on, we measure a sudden increase in O2

consumption rate on cultured mammalian cells, on Tetrahymena thermophila cells and on

aerobically-grown Saccharomyces cerevisiae cells. Visible light doesn’t induce any relevant effect

on semi-anaerobically-grown yeast cells, in which CcOX activity is reduced. Also the irradiation of

CcOX12-deleted yeast cells doesn’t have any effect, whereas wild-type cells of the same strain

show a photoresponse. These results seem to confirm that CcOX is the primary photoacceptor.

Along these lines, the analysis of the dose-response curves obtained on T. thermophila shows an

higher effectiveness of blue component (420±30 nm), consistent with the absorption spectrum of

mixed-valence CcOX. Differently from reported results, in our conditions, NIR light has no effect

on the same metabolic parameter. Preliminary results on the T. thermophila respiratory rate show

that the effect of light irradiation depends on the cellular culture phase and this effect is stronger in

early stationary phase. Therefore, on the basis of our results, CcOX is the most probable

photoacceptor involved in this phenomena.

[1] Karu, T.I. (1999). J Photochem Photobiol B:Biol 49:1-17. [2] Karu, T.I., L.V. Pyatibrat, and G.S. Kalendo (2004). Photochem Photobiol Sci, 3:211–216. Seme, M.T., P. Summerfelt, J. Neitz, J.T. Eells, and M.M. Henry (2001). Invest. Ophthalm. Vis. Sci., 42:834–841. [3]Whelan, H.T., E. Buchmann, A. Dhokalia, M. P. Kane, N.T. Whelan, M.T.T. Wong-Riley, [4]J.T. Eells, L.J. Gould, R. Hammamieh, R. Das, M.M. Henry, and M. Jett (2003). J Clin Laser Med & Surgery, 21:67-74. [5]Wong-Riley, M.T.T., H.L. Liang, J.T. Eells, B. Chance, M.M. Henry, E. Buchmann, M. Kane, and H.T. Whelan (2005). J. Biol. Chem., 280:4761–4767.

TIME-RESOLVED FLUORESCENCE IN BIOLOGY

Raffaella Mercatelli, Massimo Vassalli

Centro Studi Dinamiche Complesse (CSDC), Università di Firenze

In fluorescence microscopy, the fluorescence emission can be characterised not only by intensity

and position, but also by lifetime. Fluorescence lifetime imaging (FLIM) is a functional imaging

methodology that can provide information, not only concerning the localisation of specific

fluorophores, but also about the local fluorophore environment (reporting, for example, on the local

pH, refractive index, ion or oxygen concentration without the need for ratiometric measurements).

It may be implemented in scanning confocal or multi-photon microscopes, or in wide-field

microscopes and endoscopes.

FLIM is based on time-resolved image acquisition method. The time-resolved information is

obtained, in the time domain, by exciting the sample with a short optical pulse and observing the

decay of the fluorescence intensity with time-correlated single photon counting (TCSPC).

Fluorescence lifetime imaging can report on photophysical events that are difficult or impossible to

observe by fluorescence intensity imaging.

FLIM has been used to image interactions between proteins such as receptor oligomerisation and to

reveal protein phosphorylation by detecting fluorescence resonance energy transfer (FRET).

When applied to tissue autofluorescence, it reveals intrinsic excellent contrast between different

types and states of tissue.

PHOTOTOXICITY OF STATINS

Alessia Salvador1, Pawel Grobelny2, Giampietro Viola1, Daniela Vedaldi1, Francesco Dall’Acqua1

1Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università degli Studi di Padova via Marzolo 5, 35131; 2Department of Inorganic & Analytical Chemistry, Faculty of Pharmacy Grunwaldzka 6, 60-780

Poznan, Poland.

Statins [3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors] are first-line agents for the

treatment of hypercholesterolemia and are used by millions of persons to avoid cardiovascular

diseases. Despite of their widely administration, the phototoxicity of this class of drugs has not been

studied in detail yet even if few cases of possible clinical phototoxic reactions have been already

reported in literature. We decided to evaluate the photostability and the phototoxic activity of two

synthetic statins through a series of in vitro tests with the aim of identifying their mechanism of

action.

N

OH OH

COOH

F

COOH

OH OH

N

F

Fluvastatin Pitavastatin

We studied the photochemical and photobiological properties of fluvastatin and of pitavastatin, an

highly effective statin already available for use in Japan.

The photolysis of the drugs in aqueous solution was assessed and the formation of some

photoproducts was demonstrated after UV-A radiation. Then, the separation and the

characterization of photoproducts were developed by HPLC, mass spectroscopy and NMR. The

cytotoxicity and the photocytotoxicity of two photoproducts were tested in vitro in human

immortalized keratinocytes in comparison with those of the drugs. Finally, flow cytofluorimetric

experiments were performed with the purpose of clarifying the mechanism of cellular death and the

organelles implicated in this event.

VENERDÌ 30 MAGGIO

Photochemical internalization: A technology for site-specific drug delivery

Kristian Berg1, Pål Kristian Selbo1, AnetteWeyergang1, Ole-Jacob Norum1,2,Anette Bonsted1,Qian Peng3 and Anders Høgset4

Department of Radiation Biology1, Surgical Oncology1,2 and Pathology3, Norwegian Radium Hospital, Oslo, Norway. 4PCI Biotech, Oslo, Norway

The utilisation of macromolecules in therapy of cancer and other diseases is becoming

increasingly relevant. Recent advances in molecular biology and biotechnology have made it

possible to improve targeting and design of cytotoxic agents, DNA complexes and other

macromolecules for clinical applications. To achieve the expected biological effect of these

macromolecules in many cases internalisation to the cell cytosol is crucial. At an intracellular level,

the most fundamental obstruction for cytosolic release of the therapeutic molecule is the membrane-

barrier of the endocytic vesicles.

Photochemical internalisation (PCI) is a novel technology for release of endocytosed

macromolecules into the cytosol. The technology is based on the use of photosensitizers located in

endocytic vesicles that upon activation by light induces a release of macromolecules from their

compartmentalization in endocytic vesicles. PCI has been shown to enhance the biological activity

of a large variety of macromolecules and other molecules that do not readily penetrate the plasma

membrane, including type I ribosome-inactivating proteins (RIPs), gene-encoding plasmids,

adenovirus, oligonucleotides and the chemotherapeuticum bleomycin. PCI has also been shown to

enhance the treatment effect of targeted therapeutic macromolecules.

The results show that PCI can induce efficient light-directed delivery of macromolecules into

the cytosol, indicating that PCI may have a variety of useful applications for site-specific drug

delivery, e.g. in gene therapy, vaccination and cancer treatment. Recent advances in understanding

the mechanisms of action as well as the development of PCI towards clinical utilization will be

presented.

PDT TREATMENT OF EXPERIMENTAL ORAL CANDIDIASIS IN MICE

C. Alongi, I. Naldi, L. Fantetti and G. Roncucci

Molteni Therapeutics, Via Fiorentina 1, 53100, Siena, Italy i.naldi@moltenitherapeutics.it Photodynamic therapy (PDT) is a bimodal therapeutic strategy, in which the combination of a drug

(photosensitizer) with light gives a cytotoxic effect, that can be applied in several medical fields,

spanning from tumoral or psoriatic pathologies, to microbial infections1. Over the past years,

several photosensitizing dyes have been proposed as PDT agents and among these phthalocyanines

seem to represent one of the most promising classes, especially for antimicrobial application. Zn(II)

phthalocyanine derivatives synthesized2 in our laboratories have demonstrated broad spectrum and

very high activities, no selection of resistance and possibilities to inactivate multi drug resistant

microorganisms as bacteria and fungi.

In vitro PDT protocols have been successfully transferred to the treatment of in vivo animal model

infections. Here we report the assessment of RLP068 efficacy topically applied to treat a murine

oral infection3, caused by a Candida albicans clinical isolate.

The ability of light-activated RLP068 to reduce the rate of progression of oral candidiasis indicates

this Zn(II) phtalocyanine derivative as a promising candidate for a valid alternative treatment of

common fungal oral infections.

References: 1. M.R. Hamblin et al, Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease?, Photochem. Photobiol. Sci., 2004, 3: 436-

450.

2. G. Roncucci et al, EP 0906758 A1 (1999).

3. N. Takakura et al, A novel murine model of oral candidiasis with local symptons characteristic of oral trush, Microbiol. Immunol., 2003,

47 (5): 321-326.

PHOTODYNAMIC ACTIVITY OF A NEW ZN(II) PHTHALOCYANINE DERIVATIVE: IN VIVO TREATMENT OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA

C. Alongi, T. Scommegna, L. Fantetti and G. Roncucci

Molteni Therapeutics, Via Fiorentina 1, 53100, Siena, Italy t.scommegna@moltenitherapeutics.it The growing resistance of pathogenic microorganisms against antimicrobial agents has generated a

research for alternative treatments for localized infections1. Photodynamic therapy (PDT), currently

applied as treatment for cancer and for certain benign conditions2, is a promising candidate.

Moreover superficial wound infections are potentially suitable for treatment by PDT because of the

ready accessibility of these wounds for both topical delivery of the photosensitizer and light1.

In this study we report the activity of compound RLP068, a new photodynamic agent synthesized in

our laboratories3 tested on a Pseudomonas aeruginosa infection animal model4 in comparison to

classic antibiotic therapy.

The higher ability of light-activated RLP068 to reduce the rate of progression of the infection and

the mortality of infected animals further confirms this treatment as an alternative to conventional

antibiotic therapy for localized lesions.

References

1. Saskia A.G. et al, Photodynamic therapy for Staphylococcus aureus infected burn wounds in mice, Photochem. Photobiol. Sci., 2005,

Vol.4, 503-509.

2. Oleinick N.L. et al The role of apoptosis in response to photodynamic therapy: what, where, why, and how, Photochem. Photobiol. Sci.,

2002, Vol.1, 1-21.

3. Roncucci G. et al., EP 0906758 A1 (1999).

4. Stevens E.J. et al., A quantitative model of invasive Pseudomonas infection in burn injury, Journal of Burn Care & Rehabilitation, 1994,

Vol.15 N.3, 232-235.

UTILIZZO DI NANOPARTICELLE NELLA TERAPIA FOTODINAMICA IN VIVO

Camerin M. 1, Moreno M.2, Magaraggia M.1, Russell D.2, Jori G.1

1 Dipartimento di Biologia, Università di Padova, Padova, Italy ; 2 School of Chemical Sciences and Pharmacy, University of East Anglia, Norwich, UK Lo sviluppo delle nanotecnologie ha seguito un andamento esponenziale nell’ultimo decennio con

applicazioni in campo industriale, alimentare e anche biomedico. Infatti le nanoparticelle sono

correntemente usate come biosensori ambientali, in attività di imaging e in numerose applicazioni

terapeutiche. Nella terapia fotodinamica, date le loro dimensioni, le nanoparticelle possono essere

usate come efficienti veicolanti di fotosensibilizzatori .

Per il nostro studio in vivo noi abbiamo utilizzato nanoparticelle d’oro coniugate con una

ftalocianina ( C11Pc) legata alla superficie tramite ponti tiolici che formano legami covalenti. Le

nanoparticelle hanno un diametro di 2-4 nm. In studi preliminari si è dimostrato che tali

nanoparticelle coniugate producono un incremento del 50 % della resa quantica dell’ossigeno di

singoletto rispetto alla ftalocianina libera. Sulla base di questi risultati si è proceduto ad effettuare

studi in vivo utilizzando come modelli animali topi C57BL/6 in cui erano state trapiantate, tramite

inoculazione sottocutanea, cellule di melanoma amelanotico.

Si sono effettuati studi di farmacocinetica, a vari tempi, analizzando in parallelo la ftalocianina

libera e quella coniugata; a parità di dose inoculata ( 1.5 µM/kg di peso corporeo) le nanoparticelle

determinano un accumulo maggiore dell’agente fototerapeutico nei tessuti con una maggiore

selettività per il tessuto tumorale rispetto alla cute circostante. I topi sono stati irradiati a due tempi

post iniezione ( 3 e 24 h) con luce rossa ( 600-700 nm, 175 mW/cm2, 15 min). La risposta tumorale

più accentuata in termini di ritardo nella crescita neoplastica è stata osservata per i topi irradiati a 3

h dopo la somministrazione. Studi successivi di microscopia elettronica evidenziano,dopo

irradiamento, un danno maggiore e diversificato indotto nel tessuto tumorale dalla ftalocianina

coniugata con nanoparticelle.

IN VIVO ABSORPTION SPECTRA OF THE TWO STABLE STATES OF THE EUGLENA PHOTORECEPTOR

PHOTOCYCLE

Laura Barsanti1, Primo Coltelli2, Valtere Evangelista1, Vincenzo Passarelli1, Nicoletta Vesentini3, Anna Maria Frassanito, and Paolo Gualtieri1 1Istituto di Biofisica, 2ISTI, 3IFC, Area della Ricerca CNR, Via Moruzzi 1, 56124 Pisa, Italy

Euglena gracilis, a fresh-water flagellated unicellular alga, possesses a simple but sophisticated

light detecting system, consisting of an eyespot formed by carotenoids globules and a

photoreceptor. In general, as the cell rotates while swimming, the eyespot comes between the light

source and the photoreceptor, thus modulating the light that reaches it, and regulating the steering of

the locomotory flagellum.

All light-sensory proteins are known to attain the final-signal transducing states through multiple

meta-stable and stable intermediate states. The chromophores themselves undergo conformational

changes in multiple intermediate states and promote structural changes in entire proteins. This

change in conformation subsequently leads to formation of a signalling state of sufficient stability to

communicate the process of photon absorption to a downstream signal transduction partner. These

intermediate states seem to be essential for efficient light-signal conversion.

In order to provide important and discriminating information on the series of structural changes that

Euglena photoreceptive protein(s) undergoes inside the photoreceptor in response to light, we

measured the absorption spectra of the two stable states A and B of photoreceptor photocycle in

vivo. Data were collected by two different devices, i.e. a microspectrophotometer and a digital

microscope. Both techniques achieved super imposable spectra, with a major peak in the stable state

A at 498 nm, and a major peak in the stable state B at 462 nm, with a blue shift of 36 nm.

Our results show that the photocycle and the absorption spectra of the photoreceptor have no

similarities with the spectroscopic features of blue-light receptor flavoproteins, while possess strong

spectroscopic similarities with a rhodopsin-like proteins. Moreover, the analysis of the absorption

spectra of the two stable states of the photoreceptor and the absorption spectrum of the eyespot

suggests an intriguing hypothesis for the orientation of microalgae toward light.

CHARACTERIZATION OF THE CRISTALLINE STRUCTURE OF THE EUGLENA PHOTORECEPTOR

Laura Barsanti1, Primo Coltelli2, Valtere Evangelista1, Vincenzo Passarelli1, Nicoletta Vesentini3,

Anna Maria Frassanito1 and Paolo Gualtieri1

1Istituto di Biofisica, 2ISTI, 3IFC, Area della Ricerca CNR, Via Moruzzi 1, 56124 Pisa, Italy Membrane proteins (MPs) play an essential role in determining the interactions of biological

systems with their surroundings. As gatekeepers of cellular boundaries, they are involved with

matter, energy, and information transport to maintain life activities, and also with drug delivery to

cure diseases. However, little is known about how to harness their unique biological functions in

practical devices.

Stacked membrane structures mediated by MPs are abundant in biological systems. For example,

the grana structure of thylakoid membranes in plant chloroplasts enables efficient light harvesting

and development of a proton gradient for ATP production; myelin is used in higher-vertebrate

nervous systems to pack nerve fibers (axons) where mutations in the extracellular domains of the

integral MPs are the causes of many peripheral-nerve diseases.

Here we present the isolation and the characterization of the unique structure of the Euglena gracilis

photoreceptor. The structure of this photoreceptor can be defined as a natural super lattice made up

of closely stacked protein-membrane lamellae separated by an aqueous phase. Each lamella is an

ordered condensed phase complex of light-sensory proteins. In the photoreceptor we can count

about 50 lamellae. The 2D crystal possesses an hexagonal protein packing, observed by means of

Fourier Transform. This structure closely resemble the 3D crystal obtained by a rapid cooperative

assembly process directed by universal electrostatic interactions that organizes proteorhodopsin

spontaneously into ordered condensed phases. The best resolution obtainable is 85 Ǻ; this

resolution does not allow distinguishing between 3-fold or 6-fold symmetry.

The importance of these structure is that it should be possible to use this kind of protein in

substitution of bR for biomimetic ATP production, optical data storage, artificial retinas, and

photovoltaic devices.

UVB PHOTOLYSIS OF 5-FLUOROURACIL IN SOLUTION

AND IN DRUG FORMULATIONS

Giorgia Miolo, Cristina Marzano, Sergio Caffieri Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova The chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU) is a pyrimidine analogue used as an

antineoplastic drug both systemically and topically for a variety of cancerous and precancerous

diseases. 5-FU undergoes photodegradation under UVB light, as shown both in aqueous and

methanol diluted solution and in a topical drug formulation. As monitored by HPLC,

photodegradation in solution is concentration dependent. Indeed, the concentrated solution (10-1 M)

for systemic administration shows negligible loss of the active principle under UVB light. On the

contrary, the cream, in spite of the presence of excipients which are able to shield the incident

radiation, shows low photostability under UVB exposure.

By irradiation in water, 5-FU yields two photoproducts which have been characterized as two

isomers coming from the addition of a water molecule to the double bond of the drug. Analogous

addition occurred when 5-FU was irradiated in the presence of methanol or cysteine, suggesting

nucleophiles as possible targets explaining the skin phototoxicity of 5-FU.

This kind of photoaddition could involve proteins and therefore generate antigens which might be

responsible for allergic/photoallergic contact dermatitis, a common side effect induced by this drug.

Moreover, photolysis of 5-FU induced loss of antiproliferative activity of the drug in HCT-15 and

HeLa cells.

Therefore, patients under 5-FU treatment should avoid sun or artificial lamps exposure and greater

attention should be taken when 5-FU is administered for topical use in skin and eye diseases since

light exposure is higher in these parts of the body. The risk is both the loss of therapeutic activity

and induction of photoallergy.

SESSIONE POSTER

IMPIEGO TERAPEUTICO DI LUCE POLARIZZATA INCOERENTE NELLA

RADIODERMITE

Faraone V., Ruello E., Scarmato A., Denaro L., Sansotta C., Testagrossa B., Ruggeri P., Vermiglio G. Dipartimento di Protezionistica Ambientale, Sanitaria, Sociale ed Industriale Facoltà di Medicina e Chirurgia - Università degli Studi di Messina La fototerapia nasce dall’osservazione sperimentale di miglioramenti generalizzati e apprezzabili

su diverse patologie indotte a seguito di esposizione a radiazione ottica, in particolare nel visibile e

nell'infrarosso. In tempi relativamente recenti l'applicazione di luce incoerente policromatica

polarizzata (PILER, Polarized Policromatic Incoherent Light Low Energy Radiation)(400-

200nm)oltre a presentare un' elevata efficacia biologica si è dimostrata di facile utilizzo, senza

rischi per il paziente e di basso costo.

Anche se interessanti impieghi della fototerapia PILER sono stati sperimentati in ortopedia, nella

medicina dello sport e in ambito psicoterapeutico, il campo di principale applicazione rimane la

dermatologia ed, in particolare, nel trattamento di alcune patologie cutanee e delle ulcere.In questo

lavoro vengono presentati i risultati preliminari del trattamento della radiodermite localizzata alla

mano sinistra di un paziente con pregressa attività di medico ortopedico. Tale radiodermite, quando

di tipo cronico evolutivo, si dimostra refrattaria alla guarigione completa, nonostante i possibili

trattamenti chirurgici e farmacologici. La mano del paziente viene irradiata con una sorgente di

luce policromatica incoerente polarizzata (400-2000nm) (Bioptron), con densità di potenza di 40

mw/cm2.

Tale tipo di trattamento deve protrarsi almeno un anno per osservare apprezzabili miglioramenti

della cute delle dita con scomparsa delle ulcere, caduta quasi completa delle escare, ristrutturazione

cutanea e miglioramento funzionale. Si deve, però, sottolineare la necessità che il trattamento con la

PILER sia mantenuto con costanza nel tempo per evitare una ricomparsa delle alterazioni cutanee.

In considerazione dei promettenti risultati ottenuti in tempi relativamente brevi rispetto alla

difficoltà di guarigione insita nel tipo stesso di patologia, della semplicità del trattamento privo di

qualunque effetto collaterale che lo rende gradito al paziente, del fatto non trascurabile che

l'irraggiamento possa essere effettuato anche a domicilio o ambulatorialmente, riteniamo che la

PILER possa proporsi come soluzione valida per il trattamento delle patologie cutanee in soggetti

che svolgona attività interventistica con impiego di sorgenti di radiazioni ionizzanti.

PHOTODYNAMIC EFFECTS OF NOVEL MESO DI- AND TETRA-ARYL PORPHYRIN

DERIVATIVES IN HUMAN ADENOCARCINOMA CELLS.

M.B. Gariboldi, R. Ravizza, R. Molteni, S. Meschini*, E. Caruso, S. Banfi, and E. Monti.

DBSF – Section of Pharmacology, University of Insubria, -Busto Arsizio (VA); * Dept. of Technologies and Health, Istituto Superiore di Sanità - Rome, Italy

Photodynamic therapy (PDT) of cancer is based on tumor-specific accumulation of a

photosensitizer, followed by irradiation with light of appropriate wavelength, which induces cell

death. Photosensitizers (PSs) used in the clinic are effective in the treatment of lung, esophageal,

cervical, bladder and gastric cancers, but present with a number of limitations. Therefore, synthesis

and characterization of novel PSs with increased photon absorption at longer wavelengths,

improved tissue retention, rapid clearance from surrounding normal tissues, high quantum yield of

reactive oxygen species, and minimal toxicity in the dark represent areas of active research. In this

study we evaluated the phototoxic activity of a number of meso di- and tetra-aryl substituted

porphyrin derivatives, synthesized in our laboratory, to identify new synthetic compounds suitable

for PDT. Their effects were assessed in the human colon carcinoma cell line HCT116 and the

results compared with those obtained with tetra-(m-hydroxyphenyl)-chlorine (m-THCP, marketed as

Foscan), approved for clinical use.

Cytotoxicity studies, performed by the MTT assay following 24h exposure to the compounds, 2h

irradiation and 24h in drug-free medium, showed that some of the 5,15-diaryl compounds are more

effective than both 5,10,15,20-tetraarylporphyrins and m-THCP We also investigate some

mechanistic aspects of the photodynamic action of the most active compounds in the series,

including intracellular accumulation, subcellular localization, induction of apoptosis, and generation

of reactive oxygen species (ROS) and NO•. The results of cytotoxicity studies confirm that the

novel PSs are more effective, at least in vitro, than m-THCP); all the compounds tested exhibit

similar singlet oxygen quantum yields and are devoid of intrinsic cytotoxicity in the absence of light

irradiation. Differential intracellular accumulation can partly explain the observed differences in

phototoxicity. Flow cytometric studies indicate that apoptosis occurs in varying degrees following

photodynamic treatment with the tested compounds. Significant increases in ROS and NO•

generation were also observed; however, the contribution of this latter effect to the overall

phototoxicity is unclear. Taken together, our observations suggest that the diaryl derivatives

included in the present study could represent promising leads for the development of novel

photosensitizing agents.

IL TRATTAMENTO CON LASER Nd:YAG PULSATO INDUCE LA PRODUZIONE DI

MOLECOLE DELLA MATRICE EXTRACELLULARE IN CELLULE DEI TESSUTI

CONNETTIVI. POTENZIALITÀ APPLICATIVE NELLA RIPARAZIONE DEI TESSUTI.

F. Cialdai1, V. Basile1, G. Romano1, F. Fusi1, A. Conti1, M. Monici2

1Dipartimento di Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze, V.le Pieraccini 6, 50139 Firenze.

2ASAcampus, ASA Research Division, Dipartimento di Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze, V.le Pieraccini 6, 50139 Firenze.

Numerosi studi hanno dimostrato che lo stress meccanico è un fattore chiave nell’omeostasi tissutale. Al contrario, le condizioni di assenza di stimoli meccanici inducono un danno morfologico e funzionale. A causa delle proprie funzioni fisiologiche, i tessuti connettivo, osseo, cartilagineo e muscolare interagiscono in modo dinamico con stimoli di tipo meccanico e gravitazionale, modificando le proprie caratteristiche attraverso continue variazioni della composizione. E’noto, infatti, che lo stress meccanico incrementa la produzione di componenti della matrice extracellulare (MEC), anche se sono ancora sconosciuti i meccanismi di meccanotrasduzione e le condizioni di carico ottimali per migliorare l’omeostasi tissutale. Considerando l’importanza dell’attivazione cellulare e della produzione di MEC nella rigerazione tissutale, un adeguato utilizzo della stimolazione meccanica potrebbe rappresentare un valido strumento nella riparazione dei tessuti e nel “tissue engineering”. Al fine di aumentare le nostre conoscenze sulla meccano-biologia e sviluppare efficaci applicazioni cliniche è importante esplorare nuove modalità di erogazione degli stimoli meccanici. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare la possibilità di utilizzare il laser Nd:YAG pulsato, che grazie all’elevata potenza di picco produce effetto fotomeccanico, per indurre la produzione di molecole della MEC da parte di cellule del tessuto connettivo. Come modello sperimentale sono stati utilizzati fibroblasti fetali e condrociti umani derivanti da cartilagine iliaca di donatore adulto. Il monostrato cellulare è stato esposto per 73s a trattamento con laser Nd:YAG pulsato (ASA srl) con lunghezza d’onda di 1064nm, durata dell’impulso di 200 µs, frequenza 10Hz ed energia pari a 458.65 mJ/cm2. Il trattamento è stato ripetuto per 3 giorni consecutivi. Successivamente, tramite microscopia di autofluorescenza ed immunofluorescenza, sono state studiate la morfologia cellulare, la produzione di molecole della MEC (collagene, fibronectina, mucopolissaridi), l’adesione cellulare ed il metabolismo energetico. I risultati dimostrano che lo stress fotomeccanico induce un rimodellamento del citoscheletro, una ridistribuzione delle integrine di membrana ed un incremento nella produzione di molecole della MEC. Questi risultati potrebbero essere importanti nello sviluppo di protocolli clinici per il trattamento di patologie dei tessuti connettivi con laser Nd:YAG pulsato. Anche se sono necessari ulteriori studi, le nostre osservazioni suggeriscono che questa nuova modalità di applicazione dello stimolo meccanico potrebbe avere importanti ricadute nella rigenerazione, riparazione ed ingegneria tissutale. Inoltre, le informazioni ottenute da questo studio contribuiscono a comprendere i meccanismi molecolari e cellulari alla base dell’effetto terapeutico osservato nelle applicazioni cliniche del laser Nd:YAG pulsato (Hilterapia) per il trattamento di malattie del sistema muscolo-scheletrico e articolare.

MAL-PDT NEL TRATTAMENTO DI CARCINOMI SQUAMOCELLULARI IN SITU,

MICROINVASIVI E INVASIVI.

Cristina Zane1, Marina Venturini1, Raffaella Sala1, Rossana Capezzera1, MariaTeresa Rossi1,

Giovanni Parrinello2, Claudia Specchia2, Piergiacomo Calzavara-Pinton1.

1Clinica Dermatologica, Università degli Studi di Brescia. 2 Dipartimento di Biotecnologie,Università degli Studi di Brescia

Background: La terapia fotodinamica(PDT) con metil-aminolevulinato (MAL) è un’opzione

terapeutica non-invasiva approvata per il trattamento delle cheratosi attiniche e della malattia di

Bowen, entrambi precursori del carcinoma squamocellulare.

Obiettivo: Valutare l’efficacia, le caratteristiche prognostiche, la tollerabilità e l’esito estetico di

MAL-PDT nel trattamento del carcinoma squamocellulare.

Metodi: Sono stati trattati 55 pazienti per un totale di 112 lesioni (carcinomi squamocellulari,

malattia di Bowen), diagnosticati mediante biopsia cutanea. Una crema contenente MAL (160 mg g-

1) è stata applicata per 3 ore prima di irradiare la zona con una lampada a diodi (spettro d’emissione

con picco a 635±18 nm; fluenza = 37 J cm-2). Il trattamento è stato ripetuto dopo 7 giorni. Sono stati

valutati i tassi di risposta completa dopo 3 mesi dall’ultimo trattamento, i tassi di recidiva dopo 24

mesi e l’esito estetico.

Risultati: I tassi di risposta completa sono stati del 73.2% a 3 mesi e del 53.6% a 24 mesi.

L’atipia cellulare, la variante clinica e la profondità della lesione sono risultati essere importanti

predittori della risposta a 3 mesi all’analisi univariata dei dati (p<0.001). L’atipia cellulare è

risultato essere l’unico fattore predittivo indipendente statisticamente significativo della risposta al

trattamento a 3 mesi.

Conclusioni: La MAL-PDT potrebbe rappresentare un’efficace e ben tollerata opzione terapeutica

per il trattamento dei carcinomi squamocellulari in situ ( malattia di Bowen) e microinvasivi ben

differenziati (scores di Broders I e II). Al contrario, il suo utilizzo dovrebbe essere evitato nel caso

di carcinomi squamocellulari superficiali microinvasivi ma scarsamente differenziati e per i

carcinomi squamocellulari invasivi o nodulari.

TRATTAMENTO CON MAL-PDT DELLA CUTE FOTODANNEGGIATA DI VISO E

CUOIO CAPELLUTO.

Cristina Zane, Rossana Capezzera, MariaTeresa Rossi, Piergiacomo Calzavara-Pinton.

Clinica Dermatologica, Università degli Studi di Brescia.

L’efficacia e la tollerabilità della terapia fotodinamica con acido aminolevulinico (ALA) per il

trattamento della cute fotodanneggiata, ovvero la cosiddetta “photorejuvenation”, sono state

riportate in alcuni recenti studi. I risultati di tali studi sono però difficilmente comparabili in quanto

sono basati solo su una valutazione clinica ed i protocolli di trattamento (es. concentrazione e

formulazione della crema, tempo di applicazione, spettro e dose della luce in grado di attivare la

crema, numero e frequenza dei trattamenti) variano notevolmente nelle diverse casistiche.

Nel presente studio, 20 pazienti con cute fotodanneggiata e cheratosi attiniche del viso e cuoio

capelluto sono stati sottoposti a due trattamenti mensili utilizzando una crema contenente 160 mg/gr

di metilaminolevulinato (MAL, Metvix®, Galderma, F), secondo il protocollo standard approvato

per il trattamento delle cheratosi attiniche.

MAL è stato applicato in medicazione occlusiva per tre ore ed in seguito rimosso prima

dell’esposizione a 37 J/cm2 di una luce rossa emessa da una lampada a LED (Aklilite® CL 128,

Photocure, N).

Il miglioramento di diversi parametri clinici è stato valutato secondo una scala clinica e la

valutazione della cute foto danneggiata è stata eseguita mediante ecografia cutanea ad alta

risoluzione (20 MHz B-Mode) prima e dopo il trattamento.

I trattamenti sono stati ben tollerati, con la comparsa solamente di dolore e sensazione di bruciore

transitori e di entità lieve. Dopo il trattamento, la cute si presentava diffusamente eritemato-

edematosa, con accentuazione di tali segni e formazione di croste nelle aree dove erano anche

presenti cheratosi attiniche. Questi fenomeni si sono risolti spontaneamente entro cinque giorni

senza formazione di cicatrici nè alterazioni pigmentarie.

MAL-PDT potrebbe dunque rappresentare un nuovo, efficace, ben tollerato e non invasivo

trattamento della cute foto danneggiata.

POSSIBLE APPLICATION OF ANTIBACTERIAL PHOTODINAMIC

CHEMOTHERAPY (PACT)

Orlandi Viviana, Caruso Enrico, Banfi Stefano and Barbieri Paola. Department of Biological and Structural Science, University of Insubria, Varese (Italy) Bacteria can grow either as planktonic cells or as sessile cells which form functional and organized

communities (biofilms). In biofilms, microorganisms, enveloped in the exopolisaccaridic matrix

are more tolerant to antibacterial agents than their planktonic counterpart, a feature that contributes

to their persistence in the colonized environment, i.e. chronic infections.

Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) is a recently developed therapeutic option

that uses photosensitive molecules and visible light to induce lethal oxidative damages on

microbes and can be used to eradicate biofilms. In a previous work, we tested a panel of new

synthetic tetraaryl-porphyrins as photosensitizers (PSs) in in vitro experiments against planktonic

cultures of several bacteria. After exposure to micromolar concentrations of PS and irradiation

with visible light, a 5 to 7 log units reduction of viable cells, with respect to the untreated control,

was observed depending on the bacterial species and the structure of the PS.

Here we report preliminary results on possible application of PACT to biofilm removal and waste

water disinfection. Some PSs were found active against biofilms of different microorganisms,

causing a depletion of viable cells up to 7 log units. However, some PSs displayed a certain degree

of toxicity even in the dark, contrarily to what observed with planktonic cultures. PACT seems to

be a very promising technique also in environmental applications, such as waste water disinfection.

Indeed, a sunlight activated PS causes a high lethality rate in faecal microorganisms, both in lab

cultures and in actual waste water samples.

LA TERAPIA FOTODINAMICA CON ACIDO δδδδ-AMINOLEVULINICO E PROSPETTIVE

IN DERMATOLOGIA: DAI TUMORI ALL'ESTETICA

Stefania Motta1, Marcello Monti1

1Università degli Studi di Milano e Istituto Clinico Humanitas, Milano

Il Carcinoma Basocellulare o Epitelioma Basocellulare (BCC), detto anche semplicemente

Basalioma, è il tumore più frequente per l’uomo. Si stima che in Italia vi siano 150.000 nuovi casi

ogni anno (in USA 1.000.000). Come per la maggioranza dei tumori anche per il BCC la diagnosi

precoce ed il trattamento precoce è la miglior arma a disposizione della medicina. La causa

d’insorgenza del BCC nel 90% dei casi è l’eccessiva esposizione al sole o alle lampade a Raggi

Ultravioletti (RUV). Infatti, in questi casi il BCC compare sulle zone di cute maggiormente esposte

alla luce, come volto, capillizio per i calvi, orecchie, spalle, dorso. Nel restante 10% le cause sono

da ricercare nella condizione genetica ( forma familiare), o nell’uso di trattamenti con farmaci

come: immunosoppressori ( trapianti d’organo), il cortisone ( malattie infiammatorie croniche o

autoimmuni), chemioterapici ( neoplasie ). Anche i trattamenti con raggi X ( radioterapia,

cobaltoterapia) inducono il BCC.

Per cute fotodanneggiata si intende un’insieme di cambiamenti in negativo che si manifestano

quando la cute viene esposta a lungo al sole o alle lampade UV. Si tratta di una forma del tutto

particolare d’invecchiamento e non è in relazione all’età del soggetto.

Il Fotoinvecchiamento appare in forme differenti, ma i due criteri principali sono la lassità della

pelle e la comparsa di rughe o di linee. I raggi UV degradano rapidamente le fibre elastiche e di

collageno del derma che non hanno più possibilità di ricostruirsi.

L’impiego dell’ALA-PDT nel trattamento dei BCC ha dimostrato percentuali di guarigione

sovrapponibili a quelle ottenibili con la chirurgia tradizionale e superiore a quanto ottenibile con i

metodi distruttivi (LASER, Crioterapia, RadioFrequenza ecc). Inoltre il trattamento ALA-PDT non

dà esiti cicatriziali nè danneggia il tessuto circostante la lesione, mentre dà possibilità di trattare

lesioni estese, più lesioni contemporaneamente o non idonee alla rimozione chirurgica e permette

l’applicazione su individui ritenuti non idonei alla chirurgia.

Per questi motivi ALA-PDT è considerato trattamento di prima scelta del BCC.

L’impiego di ALA-PDT nel trattamento della cute fodanneggiata permette l’eliminazione di un

numero elevato di cellule potenzialmente evolventi verso il tumore e sensibilizza il paziente alla

corretta esposizione ai raggi solari scongiurando la degenerazione tumorale cutanea.

Dal punto di vista dermatologico il pregio più importante del trattamento anti Fotoinvecchiamento

con Terapia Fotodinamica sta nel fatto che apportando un indubbio beneficio estetico si esegue

contemporaneamente una decisa prevenzione dei Tumori Fotoindotti.

PHOTODYNAMIC THERAPY: NEWS

Rossi R., Zanieri F., Lotti T.

Dermatology and Physiotherapy Unit, Department of Dermatological Sciences. University of

Florence School of Medicine, Florence, Italy

Reports about the applications of topical Photodynamic Therapy (PDT) with Metylaminolevulinate

(MAL) or aminolevulinic acid (ALA) in dermatology cover common skin cancer types and also

certain benign skin disorders. PDT with local application of a standardized preparation containing

MAL, the only photosensitizers approved in European Union at a concentration of 20% in a O/W

emulsion followed by red light exposure, has been shown to be efficacious in the treatment of

actinic keratosis, superficial and nodular basal cell carcinoma and more recently has been registered

for the treatment of Bowen’s disease. Open studies have provided promising results in oncologic

dermatology for the treatment of cutaneous lymphoma, actinic cheilitis and squamous cell

carcinoma but the use of MAL-PDT in these indications must follow all the rules and

authorizations specified by the local Ethical Committees.Topical photosensitizer (MAL and ALA)

have been used also for the treatment of inflammatory skin disorders such as psoriasis or acne

vulgaris, for HPV viral disease, for granulomatous skin disorders (localized scleroderma and

necrobiosis lipoidica) and more recently for photorejuvenation. These conditions are under clinical

investigation with different and contradictory results but with excellent future perspectives.

However studies with longer follow-up are required to arrive at conclusive remarks about the

usefulness of PDT. Our presentation reviews the recently published data on clinical MAL-ALA

based off-label PDT.

FOTORINGIOVANIMENTO ABLATIVO E NON ABLATIVO: DALLA LUCE PULSATA

AL LASER

P.Campolmi1, P.Bonan, G. Cannarozzo, T.Lotti2

1AOUC, Firenze; 2Department of Dermatological Sciences. University of Florence School of

Medicine, Florence, Italy

È sempre in aumento la domanda per problematiche di natura estetica rivolta soprattutto alla

soluzione di un problema fisiologico quale il cosiddetto “invecchiamento cutaneo” sia inteso come

chromoaging che come photoaging. Questo processo è legato a un meccanismo complesso che

coinvolge i danni diretti verso il DNA, la generazione dei reactive oxygen species e dei radicali

liberi che provocano flogosi, necrosi ed apoptosi.

Lo sviluppo innovativo che ha permesso di dotare il laser CO di sistemi scanner che consentono una

irradiazione”quasi contemporanea” di più impulsi senza sovrapposizione rappresenta il “gold

standard” del cosiddetto ringiovanimento ablativo. Nell'ultimo decennio anche i laser cosiddetti non

ablativi consentono di ottenere un ringiovanimento attraverso un danno termico controllato con

innalzamento delle temperature del collagene e conseguente accorciamento, frammentazione e

denaturazione delle fibre e produzione di neocollagene.

Tutto questo senza creare danni superficiali ma ottenendo però buoni risultati estetici e con un

decorso postoperatorio a basso rischio di effetti collaterali. Queste nuove metodiche producono

un'insieme di microtraumi termici a colonna risparmiando le zone perilesionali e ciò si traduce in

scarso dolore, rapida guarigione e buoni risultati estetici. Questi sistemi frazionali possono essere

divisi in due gruppi principali: i non ablativi e i minimamente ablativi.

Recentemente sono stati introdotti sistemi non coerenti di luce pulsata ad alta intensità che

emettono in un ampio spettro con lunghezza d'onda comprese tra 500 e 1200 nm.

La possibilità di poter sfruttare varie fluenze, varie durate dell'impulso, impulsi singoli, doppi o

tripli e varie pause tra un impulso e l'altro permette una grande variabilità sulla scelta dei parametri

e quindi una grande adattabilità epurativa per i differenti fototipi e indicazioni.

VALUTAZIONE DERMOSCOPICA DI NEVI MELANOCITICI ACQUISITI IN PAZIENTI

ESPOSTI A DOSI SUBERITEMIGENE DI UVB A BANDA STRETTA O UVA1

Ausilia Maria Manganoni, Giovanna Tucci, Marina Venturini, Camillo Farisoglio, MariaTeresa

Rossi Pier Giacomo Calzavara-Pinton.

Clinica Dermatologica, Università degli Studi di Brescia.

Background: È noto che le radiazioni solari sono in grado di modificare le dimensioni e il pattern

dermoscopico dei nevi melanocitici acquisiti.

Obiettivo: Valutare se ripetute esposizioni a dosi equivalenti suberitemigene di UVA o UVB

possono indurre modificazioni delle caratteristiche dermoscopiche dei nevi melanocitici acquisiti.

Metodi: Venti volontari hanno ricevuto dosi equivalenti suberitemigene di UVB a banda stretta

(narrow-band UVB, NB-UVB) o di UVA1. In ciascun volontario sono stati selezionati 3 nevi

melanocitici acquisiti del tronco. Durante le esposizioni, un nevo è stato coperto con un cerotto

opaco, su un altro nevo è stata applicata una crema solare con filtri anti UVA e UVB e un altro nevo

è stato lasciato scoperto.

Risultati: I nevi esposti a NB-UVB o a UVA1 hanno mostrato modificazioni statisticamente

significative nelle loro caratteristiche dermoscopiche: aumento dimensionale, aumento del reticolo

pigmentario, diffuso incremento della pigmentazione, formazione focale di strie radiali, aumento

del numero e delle dimensioni di punti e globuli marroni.

Conclusioni: I nevi melanocitici acquisiti hanno mostrato modificazioni simili nelle dimensioni e

nel pattern dermoscopico a seguito dell’esposizione a dosi suberitemigene di NB-UVB o UVA1.

TRATTAMENTO MEDIANTE FOTOTERAPIA CON LUCE ROSSA DELL’ACNE

VOLGARE DI GRADO MODERATO.

Zane C, Capezzera R, Pedretti A, Facchinetti E, Rossi MT, Calzavara-Pinton PG.

Clinica Dermatologica, Università degli Studi di Brescia.

Durante gli ultimi 20 anni sono stati sperimentati numerosi trattamenti topici, sistemici e fisici per

la cura dell’acne volgare.

Recentemente sono stati sperimentati mediante trials aperti e non controllati gli effetti di diversi

protocolli terapeutici con luce visibile (blu e rossa). I meccanismi d’azione sono sconosciuti anche

se il più importante sembra essere il danno fotodinamico esercitato dalle radiazioni sul P.Acnes.

In questo studio sono stati trattati 27 pazienti, 24 femmine e 3 maschi, che presentavano al viso

acne volgare di tipo comedonico, papuloso e pustoloso. Il viso di questi pazienti è stato esposto a

luce rossa due volte alla settimana per 4 settimane a un dosaggio di 20 J/cm2.

Tutti i pazienti hanno ben tollerato la terapia mostrando un miglioramento clinico alla fine del

trattamento, con persistenza dei risultati positivi anche dopo 3 mesi dalla fine del trattamento.

Questi risultati mostrano che la fototerapia con luce rossa può essere una valida opzione terapeutica

per il trattamento dell’acne moderata in pazienti che non rispondono alle terapie convenzionali.

RUOLO DEI SISTEMI LASER NEL TRATTAMENTO

DELLE LESIONI CUTANEE CRONICHE

C. Mirabella1, D. Fortuna2

1AOUC, Firenze; 2El.En. S.p.A. L’utilizzo dei laser in chirurgia e nel trattamento delle lesioni cutanee croniche è relativamente recente ma le indicazioni per il suo impiego sono oggetto di continue ricerche. Nel laser CO2 luce è generata da un gas ad anidride carbonica ed è caratterizzata da un elevato coefficiente di assorbimento dell’acqua. Pertanto la radiazione si concentra nel contenuto acquoso cellulare ed ha una minima capacità di penetrazione tessutale, poche decine di micron. Questa caratteristica lo rende estremamente preciso e controllabile ed è per questo che è divenuto il più diffuso sistema laser per la chirurgia dei tessuti molli1, 3. Gli effetti biologici del laser, taglio, vaporizzazione, coagulazione e biostimolazione, possono essere facilmente ottenuti anche con lo stesso sistema semplicemente variandone l’intensità di potenza (W/cm2). Questo laser può, infatti, essere utilizzato per incidere, vaporizzare, coagulare e si ipotizzata abbia anche un effetto di biostimolazione2,3. La chirurgia laser è in generale una chirurgia mininvasiva che viene impiegata anche nel debridment delle ulcere cutanee croniche in associazione ai fattori di crescita piastrinici4. La precisione e la selettività sono date sia dal diametro dello spot, fino a 150 µm, che dalla lunghezza d’onda che garantisce una penetrazione tessutale micrometrica. La possibilità di operare a distanza e non a contatto (con opportune lenti focali si può lavorare fino a 40 cm di distanza dal campo), offre il vantaggio di ridurre considerevolmente le volumetrie operatorie e permette di operare attraverso piccole brecce operatorie. Nel centro dello spot si raggiungono temperature comprese tra 150 e 1800 °C, questo garantisce un’ asepsi assoluta. L’effetto fotocoagulativo sull’area residua periferica garantisce linfostasi ed emostasi, per vasi con diametro minore di 500 µm. Questo garantisce un campo operatorio asciutto, pulito e sterile. L’emostasi e la linfostatsi nel postoperatorio riducono la prevalenza di raccolte ed edemi, utile anche a limitare la riduzione del pH tessutale responsabile della stimolazione delle terminazioni nervose periferiche. L’effetto fotochimico nell’area residua stimola proliferazione cellulare cosicché, invece che di cicatrizzazione, nel caso di taglio laser si può parlare di una restitutio ad integrum della parte lesa. Altra sorgente utilizzata nel trattamento delle ulcere cutanee è il Nd:YAG, nello specifico quello impiegato è un laser di alta intensità pulsato che esalta la rapidità della risposta analgesica, anche su patologie dislocate nei piani profondi. Le caratteristiche principali di interesse nel nostro settore sono l’elevata potenza di emissione e la cessione controllata dell'energia rispettando il tempo di rilassamento termico. Trovando indicazione nel trattamento antinfiammatorio in generale, nel trattamento non farmacologico del dolore e nella biostimolazione.

1. Wang X et al., Photomed Laser Surg. 2005 Feb;23(1):20-6. 2. Manolis EN et al, Wound Repair Regen. 2007 Mar-Apr;15(2):252-7. 3. Bergh A. et al, Acta vet. Sacnd. 2006, 47,33-42 4. Il gel piastrinico, Laser CO2 e approccio multidisciplinare alle “chronic wound”. Atti XXXVII Convegno

Nazionale di Studi di Medicina Trasfusionale. Paestum 4-7.10.2006.

PROPRIETA’ FOTO- E RADIO-SENSIBILIZZANTI DI DERIVATI TETRAPIRROLICI

BORONATI NELLA TERAPIA DEL MELANOMA PIGMENTATO

Friso E.1, Vicente Graça H.4, Soncin Marina1, Fabris Clara1, Moro Davide2, Colautti Paolo2, Rosi

Giancarlo3 e Jori Giulio1. 1Dipartimento di Biologia dell’Università di Padova, 2Dipartimento di Fisica dell’Università di Padova, 3Enea Fis-ion, Cr Casaccia, Roma, 4Department of Chemistry, Louisiana State University, Baton Rouge, LA, USA La terapia fotodinamica ( PDT ) e la terapia per cattura di neutroni da parte del boro ( BNCT ) sono

due modalità terapeutiche attualmente studiate ed utilizzate per il trattamento dei tumori. In

entrambi i casi si utilizza una molecola normalmente non tossica, in grado di indurre morte cellulare

esclusivamente nel tessuto in cui viene accumulata, in seguito ad interazione con una opportuna

radiazione come neutroni termici o lunghezze d’onda nel visibile. Attualmente stiamo studiando

una clorina boronata TPCF la quale può funzionare sia da foto- che da radio-sensibilizzante ed è

costituita da un anello tetrapirrolico al quale sono stati legati 16 atomi di F e 4 gruppi carboranici

contenenti ciascuno 9 atomi di boro per un totale di 36 atomi per molecola. Per gli studi preliminari

è stata determinata la stabilità del suo macrociclo e la resa quantica di ossigeno di singoletto in

seguito ad irradiamento con luce rossa. Dallo studio sulla fotoossidazione del 9, 10-dimetil-

antracene è risultata una Φ∆ piuttosto bassa, ma gli esperimenti di fotosensibilizzazione cellulare

indicano una completa mortalità cellulare già dopo 5 min di irradiamento con luce rossa successivi

ad un’incubazione di 24 h con TPCF 20 µM, condizione in cui si ottiene il massimo accumulo (4.2

nmoli/mg di proteine) di clorina nelle cellule. Osservazioni al microscopio a fluorescenza hanno

evidenziato che TPCF si accumula a livello della membrana esterna e quindi il successivo

irraggiamento provoca la completa distruzione della membrana plasmatica delle cellule

determinando un meccanismo di morte di tipo necrotico confermato sia dal saggio della caspasi-3

sia da osservazioni al microscopio a fluorescenza con la sonda cromatinica Hoechst 33342. Per gli

studi in vivo sono stati utilizzati topi C57BL/6 portatori del melanoma melanotico impiantato

sottocute. Gli esperimenti di farmacocinetica eseguiti in funzione del tempo hanno evidenziato che

l’accumulo della clorina nel tumore a 3 h è di circa 5 nmoli per g di tessuto il doppio rispetto alla

cute peritumorale e dieci volte rispetto alla cute distale. Con questi presupposti verranno svolti degli

esperimenti di PDT e di BNCT.

GOLD NANORODS AS NEW CHROMOPHORES IN THE LASER WELDING OF CONNECTIVE TISSUES:

CHALLENGES, RESULTS AND PERSPECTIVES

F. Ratto1, P. Matteini1, F. Rossi1, R. Pini1, N. Tiwari2, S.K. Kulkarni2, L. Menabuoni3 1 Istituto di Fisica Applicata, CNR, Sesto Fiorentino (Italy), 2 Department of Physics, University of Pune, Pune (India), 3 Unità Operativa Oculistica Azienda USL 4 Prato (Italy) The laser welding of connective tissues is a powerful alternative to conventional approaches based on suturing and stitching of accidental and surgical wounds.1 Advantages include a more immediate sealing and minor use of foreign material, which translate into lesser inflammatory response and scarring. The laser welding technique is optimized by coupling of near infrared (NIR) radiation, which is poorly absorbed by endogenous tissues, with corresponding NIR exogenous chromophores, applied topically at the wound site.2 Standard NIR chromophores are organic molecules of less-than-ideal efficiency and stability in a biological environment, which narrows the range of application of this technology. In this context the introduction of new concepts of NIR chromophores is an intriguing opportunity. Recently we have exploited the exceptional properties of gold nanorods (GNRs) to assist the NIR laser welding of connective tissues.3 GNRs exhibit localized plasmon resonances whose spectrum can be steered and tuned in the NIR range with their size and shape, and so behave as functional NIR chromophores. They feature good stability and chemical flexibility, similar to the immunogold.4 Colloidal GNRs were grown from gold nanoseeds in the presence of ammonium surfactants to induce the shape anisotropy.5 We have chosen lens capsules excised from porcine eyes as our model connective tissues, and simulated hetero-transplants. The interface between patches of capsules were stained with GNRs and then irradiated by a 810 nm diode laser. Reproducible spot-wise welds were realized by laser pulses of 40 ms and 80 – 110 J cm-2, through

conspicuous reorganization of the collagen filaments, up to a distance of 60 µm from the stained interface. At present the pathway towards the clinical exploitation of our results is hampered mainly by concerns on the biocompatibility of the GNRs, which are coated with cytotoxic surfactants. Immediate developments of our work will include the replacement of these molecules with more inert and sustainable layers, such as polyethylene glycol and silica.

1 R. Pini, F. Rossi, P. Matteini, F. Ratto, Laser tissue welding in minimally invasive surgery and microsurgery, in Biophotonics (Eds.: L. Pavesi, P.M. Fauchet), Springer Verlag Series in Medical Physics, 2008, pp. 269–296. 2 F. Rossi, R. Pini, L. Menabuoni, R. Mencucci, U. Menchini, S. Ambrosini, G. Vannelli, J. Biomed. Opt. 2005, 10, 024004. 3 F. Ratto, P. Matteini, F. Rossi, R. Pini, N. Tiwari, S.K. Kulkarni, L. Menabuoni, Proc. SPIE Vol. 6844 2008. 4 W. Faulk W, G. Taylor, Immunochemistry 1971, 8, 1081–1083. 5 N. Tiwari, S. Kalele, S.K. Kulkarni, Plasmonics 2007, 2, 231–236.

INVESTIGATION ON FIBROUS COLLAGEN MODIFICATIONS DURING CORNEAL LASER WELDING

BY MEANS OF POLARIZING, FLUORESCENCE, ELECTRON AND MULTIPHOTON MICROSCOPIES P. Matteini1, F. Rossi1, F. Ratto1, G. Agati1, R. Pini1, R. Cicchi2, F.S. Pavone2 1Istituto di Fisica Applicata “Nello Carrara”, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Firenze, Italy 2LENS and Department of Physics, University of Florence, Firenze, Italy

Laser welding of corneal tissue is a technique used to provide immediate closure of corneal

wounds. The procedure lies in the staining of the cut with a saturated solution of Indocyanine Green

followed by continuous wave irradiation with an 810 nm diode laser at low power densities (12-16

W/cm2) which induces a local heating in the range 55-65 °C1. In this study we present a multimodal

microscopy approach aimed at evaluating the structural modifications induced in the stromal

collagen of porcine eyes during the laser welding of corneal wounds. Cornea samples obtained from

twenty freshly-enucleated eyes were cut with a pre-calibrated knife and subjected to the laser

welding procedure. Polarized light microscopy (PLM) as well as single-photon fluorescence

microscopy (FM) were performed on optical microscopes operating in transmission and epi

geometry respectively. Second Harmonic Generation (SHG) microscopy was performed on a

inverted laser scanning microscope equipped with a mode-locked femtosecond Ti:Sapphire laser

emitting at 880 nm and operating in forward and backward directions.

After diode laser irradiation the stromal lamellar arrangement was lost and a densely packing of

collagen bundles increasingly disordered appeared at the weld site. The persistence of collagen

birefringence and SHG signal as well as the fully preserved ultrastructural properties of collagen

fibrils at this site pointed out the avoidance of collagen triple helix denaturation. Lack of severe heat

injury as charring or tissue coagulation, which may jeopardize the correct healing of the wound,

evidenced the minimally invasiveness of the laser system employed for corneal closure. Moreover

FM provided a detailed description of the phase-transitions occurring in stromal matrix by growing

temperature. Thermal plot evidenced two main transition points beneath operative temperature of

laser welding intervention which are not associated with fibrous collagen. These results suggested

occurrence of some structural modification to other extracellular components as proteoglycans or

collagen VI responsible for stabilizing and maintaining the orderly arrangement of fibrils within the

corneal stroma. 1P. Matteini, F. Rossi, L. Menabuoni, R. Pini, “Microscopic characterization of collagen modifications induced by low-temperature diode-laser

welding of corneal tissue,” Lasers Surg. Med. 39, 597-604 (2007)

ATTIVITA’ FOTOCITOPROTETTIVA DI ISOTIOCIANATI

Andrea Tarozzi1, Fabiana Morroni1, Alessandra Marchesi1, Cristina Angeloni2, Adriana Merlicco1, Silvana Hrelia2, Giorgio Cantelli Forti1, Patrizia Hrelia1

1Dipartimento di Farmacologia, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna

2Dipartimento di Biochimica “G. Moruzzi”, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna La prevenzione del danno ossidativo cutaneo indotto dalle radiazioni UVA rappresenta un

importante metodo di intervento per attenuare o prevenire gli stati patologici cutanei conseguenti al

danno indotto da radicali liberi. Attualmente c'è un interesse crescente verso gli isotiocianati (ITC),

e in particolare il sulforafane (SUL), molecole con proprietà "antiossidante indiretta" che derivano

dall'idrolisi dei glucosinolati presenti nei vegetali della famiglia delle Cruciferae e del genere

Brassica, come i broccoli, cavolfiori, cavoli e cavoletti di Bruxelles. Le proprietà antiossidanti del

SUL e degli ITC in generale sono da imputare essenzialmente all’induzione di proteine e di enzimi

che esercitano la loro azione protettiva nei confronti del danno ossidativo cellulare. La ricerca si è

posta l’obiettivo di valutare l’attività fotocitoprotettiva del SUL nei confronti di un danno cellulare

indotto da una esposizione acuta di radiazioni UVA. La sperimentazione è stata condotta mediante

un approccio integrato di test in vitro che utilizza una linea cellulare di cheratinociti umani

(HaCaT), rappresentativa dell’epidermide, e permette la valutazione di meccanismi cellulari che

sottendono il danno ossidativo indotto da UVA come la formazione di radicali liberi, la perdita di

capacità di formare unità di colonie (CFU) di cheratinociti e la frammentazione del DNA. Il

pretrattamento di 24 ore delle cellule HaCaT con SUL (2,5-10 µM) ha dimostrato la capacità di

contrastare sia la diminuita formazione di CFU sia la frammentazione del DNA indotta da 40

J/cm2di UVA. In parallelo, i risultati di attività antiossidante hanno mostrato come i cheratinociti

trattati con lo stesso intervallo di concentrazioni di SUL presentavano un aumento della capacità di

neutralizzare i radicali liberi a livello del citoplasma. A conferma di questa attività "antiossidante

indiretta", i cheratinociti trattati con SUL mostravano un incremento dei livelli di glutatione e

dell'attività degli enzimi glutatione-S-transferasi e glutatione-reduttase. Questi risultati mostrano

come il SUL eserciti una azione fotocitoprotettiva nei confronti dei radicali liberi indotti dalle

radiazioni UVA, grazie alla sua capacità di potenziare le difese antiossidanti fisiologiche dei

cheratinociti. In conclusione, l'assunzione di alimenti vegetali con elevato contenuto di SUL, e più

in generale di glucosinolati, potrebbe essere consigliata nella prevenzione del danno cutaneo indotto

da UVA.

SABATO 31 MAGGIO

SEEING WITHOUT LOOKING: MODELS AND MECHANISMS OF

NON-VISUAL PHOTORECEPTION

Silvia Santillo, Antonio Cotugno, Carlo Musio Istituto di Cibernetica “E. Caianiello”, C.N.R., Via Campi Flegrei 34, 80078 Pozzuoli (NA) About two thirds of animal species, besides proper eyes or obvious light-sensitive organs, have

auxiliary extraocular photoreceptor systems (EOP) suitable for light detecting and non-visual (non-

image forming) functions. Photic information mediated by EOP integrates visual activity being

involved in circadian vision (i.e. the measurement of daily environmental irradiance to serve

photoentrainment of circadian rhythms), and in temporal and behavioral physiology of the animal

(e.g. photoperiodism in locomotion and reproduction, timing circadian rhythms). Extraocular

photoreceptors, namely extraretinal, are currently termed as non-image-forming or non-visual

photosensitive cells in invertebrates and non-rod non-cone photoreceptors in vertebrates (after the

discovery of ipRGCs, retinal photosensitive ganglion cells). Such photosensitive cells are located

within central and peripheric regions of the nervous system and share with retinal photoreceptors

the same photopigment, an opsin-based protein, and the same G-coupled phototransduction scheme

varying in some molecular and functional events. To date, so-called “non-visual” opsins have been

identified in retinal and extraretinal photoneurons in both vertebrate and invertebrate species. The

comparative/phylogenetic analysis of molecular and functional primary mechanisms of

phototransduction is a crucial task to understand the evolutionary course of the visual process.

Therefore, “simple” animal models, in which the homologues of the major signaling pathways can

be better searched, have been proved as useful tools of investigation. Since last decades, we have

been studying the invertebrate Hydra - the first metazoan having a nervous system and exerting

only non-visual photoreception - in which we have first identified a rhodopsin-like protein and we

are unraveling molecular issues regarding the identification and the circadian expression of its

opsins. This talk will survey similarities and differences among animal visual and non-visual

photoreception, most of all opsin families, stressing common strategies for light-detection and

photosignaling in Metazoa. Finally, non-visual photoreception is a new and exciting area of

photosensory biology as well as it faces important clinical implications for several pathological

conditions (e.g. blindness, deficits in the circadian physiology and sleep/wake timing) whose

defects should be examined together with defects in the non-visual phototransduction pathway.

He-Ne LASER IRRADIATION OF Ocimum basilicum L. SEEDS RESULTS IN INCREASE OF BOTH THE

RATE OF SEED GERMINATION AND PLANT GROWTH AND IN A RISE OF THE TOTAL CONTENT OF

TERPENES

Pinelli P1, Paventi G.2, Pizzuto R.2, Maiuro L.3, Rapparini F.4, Alvino A.1, Ognissanti M.1, Marcellino G.1, and Passarella S.2 1Dip. di Scienze Animali, Vegetali e dell’Ambiente, Università del Molise, via de Sanctis, 86100

Campobasso. 2Dip. di Scienze per la Salute, Università del Molise, via de Sanctis, 86100

Campobasso. 3 Dip. di Scienze e Tecnologie Agro-Alimentari, Ambientali e Microbiologiche,

Università del Molise, via de Sanctis, 86100 Campobasso. 4IBIMET-CNR, Via P. Gobetti 101,

40129 Bologna

In order to gain some insight into the effect He-Ne laser irradiation on plant production we

investigated whether irradiation of Ocimum basilicum L. seeds by He-Ne laser (1-4 J/cm2) could

result in physiological and/or biochemical changes. To do this we compared normal and irradiated

seeds with respect to: germination rate, plant growth, carbon dioxide uptake.

We found that:

i) He-Ne laser irradiation resulted in a strong enhancement of germination rate (200-300 %

increase);

ii) plants from irradiated seeds exhibited increase of roots’ dry weight, of stem length and dry

weight and leaves’ surface and dry weight;

iii) RuBisCO reaction rate, as measured at low internal concentration of CO2, was increased in

plant from irradiated seeds.

In another series of experiments we measured in both seedling and flowering plants the total

terpenes content which was higher (about 100 % increase) in plants from irradiated seeds. Finally,

He-Ne laser irradiation of seeds affects the number of the capitate and peltate oil gland in both leaf

surfaces.

Take together these data show that He-Ne laser irradiation of seeds results in widespread

stimulation of Ocimum basilicum L. physiology and biochemistry, perhaps to be used in

commercial production. The mechanism by which this occurs will be discussed.

Acknowledgment

This work was financed by FIRB RBNE03B8KK_003 (to S.P.).

STUDIO CINETICO DELLE PROPRIETA’ DEL SITO DI LEGAMEQB DEL CENTRO DI

REAZIONE FOTOSINTETICO DI RHODOBACTER SPHAEROIDES

F. Milano1, F. Ciriaco2, A. Agostiano1,2, F. Mavelli2 and M. Trotta1

1Istituto per i Processi Chimico Fisici e 2Dipartimento di Chimica - Università di Bari

Via Orabona ,4 – 70124 Bari

Il centro di reazione (RC) dei batteri rossi fotosintetici agisce essenzialmente da chinone-

reduttasi foto-indotta. La sua facilità di estrazione, stabilità in vari detergenti, possibilità di

ricostituzione in sistemi biomimetici in forma attiva, e la conoscenza dettagliata della sua struttura

tridimensionale rende questa proteina un sistema modello ideale per lo studio dettagliato dei

rapporti struttura-funzione1.

In questo studio è stato elaborato un modello matematico per descrivere le oscillazioni binarie

indotte nel centro di reazione da una serie di flash quando la proteina si trova in presenza di un

donatore esogeno di elettroni ferrocene e di un limitato pool di chinone esogeno UQ10. I precedenti

modelli erano stati sviluppati per descrivere il comportamento del sistema in presenza di un largo

eccesso di chinoni in (pari ad un pool UQ10/RC superiore a 10). In tali condizioni lo smorzamento

delle oscillazioni è dovuto esclusivamente all’equilibrio di scambio elettronico tra gli accettori

chinonici primario e secondario2, 3 descritto dalla costante LAB. Quando le oscillazioni sono

registrate in presenza di un limitato pool di chinoni (UQ10/RC inferiore a 10) il loro smorzamento è

dovuto oltre che alla reazione di scambio, anche all’esaurirsi del pool stesso. In queste condizioni è

possibile ricavare dai dati sperimentali tanto alla costante di equilibrio LAB che la costante

dell’equilibrio della reazione di associazione fra il chinone e la proteina.

Il modello è stato applicato in due situazioni tipo: (a) RC solubilizzati in detergente (Triton X-

100) e (b) RC ricostituiti in liposomi di POPC. I valori delle costanti LAB ottenuti sono in accordo

con i dati di letteratura ricavati ad alta concentrazione di chinone. Le costanti di legame ottenute ed

altri parametri riguardanti la stabilità dei semichinoni e del chinolo sono presentati e discussi. 1. J. P. Allen and J. C. Williams, Photosynthetic reaction centers, FEBS Lett, 1998, 438, 5-9. 2. D. Kleinfeld, E. C. Abresch, M. Y. Okamura and G. Feher, Damping of oscillations in the semiquinone absorption in reaction centres after

succesive flashes, Biochim Biophys Acta, 1984, 765, 406-409. 3. V. P. Shinkarev, The general kinetic model of electron transfer in photosynthetic reaction centers activated by multiple flashes, Photochem

Photobiol, 1998, 67, 683-699.

PHOTOPHYSICAL PROPERTIES OF QUINONES AND THEIR INTERACTION WITH THE PHOTOSYNTHETIC REACTION CENTRE

Arianna Barbafina1, Fausto Elisei1, Loredana Latterini1, Francesco Milano2, Massimo Trotta2,

Angela Agostiano2. 1 Chemistry Department, University of Perugia, via elce di sotto, 8. 06123 Perugia. 2 CNR – IPCF, c/o Chemistry Department University of Bari, via Orabona 4, 70124 Bari.

The electronic excited state properties of tetramethyl-1,4-benzoquinone (TMBQ), 2,6-dimethoxy-

1,4-benzoquinone (DMOBQ) and 2-(β-hydroxyl ethylamine)-1,4 benzoquinone (TQ) candidate to

be used as probes for proteic structures were investigated in this work by means of fluorescence and

nanosecond laser flash photolysis.

Measurements of fluorescence and laser flash photolysis were carried out also for TQ, TMBQ and

DMOBQ in the presence of the Rhodobacter sphaeroides reaction centre. Fluorescence

measurements show that TQ significantly induces fluorescence emission of the RC

bacteriochlorophyll possibly due to the reduced efficiency of the charge transfer reaction within the

protein. In the case of TMBQ and DMOBQ the interaction mechanism with the protein, having a

charge transfer nature, can be modulated by the quinone properties.

The presence of RC does not alter the properties of the triplet state of DMOBQ suggesting that

interactions are negligible; on the other side RC efficiently quenches the T1 state of TMBQ. The

behavior is rationalized in terms of redox potentials of quinones and kinetic characteristics of their

transients.

Namely for TMBQ the charge transfer from RC to quinone involves the triplet excited state of the

quinone (RC•••3Q* → RC+Q−), while for DMOBQ the route is inhibited by the fact that 3DMOBQ*

is not oxidizing enough to extract electrons form the RC.

DELAYED LUMINESCENCE E PERFORMANCE GERMINATIVA DI SINGOLI SEMI

E. Costanzo1,4, M. Gulino2,3 L. Lanzanò2,3, F. Musumeci2,3, A. Scordino2,3, L. Sui3,5, S.

Tudisco3 1Dipartimento di Fisica e Astronomia, Università di Catania 2Dipartimento di Metodologie Fisiche e Chimiche per l’Ingegneria, Università di Catania 3Laboratori Nazionali del Sud dell’ Istituto Nazionale di Fisica Nucleare, Catania 4Istituto Nazionale di Fisica Nucleare, Sezione di Catania 5Dipartimento di Fisica Nucleare dell’Istituto Cinese per l’Energia Atomica, Beijing, Cina

La possibilità di valutare il vigore vegetativo di semi mediante tecniche non invasive assume

certamente un aspetto importante in applicazioni agricole ed alimentari. Ancor più se è possibile

effettuare valutazioni su singolo seme, permettendo così lo sviluppo di tecniche di selezione. A

questo riguardo, lo studio della luminescenza a tempi lunghi (Delayed Luminescence, DL) emessa

da sistemi biologici si è rivelata essere un buon indicatore dello stato del sistema ed è stata

evidenziata la sua possibilità di utilizzo come tecnica diagnostica non invasiva in vari campi di

applicazione.

Gli autori hanno messo a punto un sistema in grado di misurare l’andamento temporale del pur

debole segnale in DL emesso da un singolo seme, effettuandone anche l’analisi spettrale. L’analisi è

stata condotta su un lotto di semi di soia verde, caratterizzati da una elevata germinabilità (98%),

selezionati in maniera da avere mediamente le stesse dimensioni e lo stesso peso. La funzionalità

dei semi è stata alterata sottoponendoli a un trattamento termico, in condizione di umidità

controllata, che simula un invecchiamento artificiale. Effetti differenti sono stati ottenuti variando il

tempo di incubazione. Dopo il trattamento, sono state effettuate le misure di DL di ogni singolo

seme e successivamente è stata seguita per 6 giorni la crescita di ogni singolo seme, in condizioni

controllate di temperatura e umidità. Come parametri germinativi sono stati considerati il peso e

l’allungamento delle radichette, mentre dai decadimenti temporali delle singole componenti

spettrali sono stati valutati sia il numero totale di fotoni emessi sia la probabilità di decadimento in

seguito a fotoeccitazione con luce laser a 337 nm. Gli studi di correlazione tra parametri germinativi

e di luminescenza hanno in particolare evidenziato un parametro intensivo, legato alla probabilità di

decadimento, che consente di individuare con elevata significatività statistica (p<0.0001) i semi non

che non daranno luogo a germinazione, e con buona significatività (p<0.02) quelli che sicuramente

germineranno. Questo risultato fa pensare allo sviluppo di una tecnica, basata su misure di DL,

rapida e non invasiva per determinare la qualità di semi ed effettuarne la selezione.

IDENTIFICAZIONE DELLE REGIONI DI REGOLAZIONE DEI GENI DELLA FAMIGLIA MULTIGENICA

LHCB1 IN SPINACIO MEDIANTE GENOME WALKING.

Claudia Leoni1, Raffaele Gallerani1 and Luigi R. Ceci2

1Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare, Univ. di Bari, Via Amendola 165/A,

70126Bari 2Istituto di Biomembrane e Bioenergetica, CNR, Via Corato 17,70059 Trani

Il Light Harvesting Complex II (LHCII) delle piante superiori è uno dei complessi proteici più

abbondanti sulla terra. Il complesso contiene tre proteine altamente omologhe (Lhcb1, Lhcb2,

Lhcb3) coinvolte nella formazione di omo- ed etero-trimeri. I polipeptidi Lhcb1, Lhcb2 ed Lhcb3

oltre che catturare la luce solare hanno anche il compito di regolare la distribuzione dell’energia di

eccitazione tra il fotosistema II (PSII) e il fotosistema I (PSI), determinando la transizione tra lo

Stato1 e lo Stato2 dei fotosistemi. Il processo è avviato da specifiche fosforilazioni a carico di

Lhcb1 e Lhcb2.

Il polipeptide Lhcb1 è generalmente codificato da una famiglia multigenica, variabile in

composizione da pianta a pianta. Nello spinacio studi proteomici hanno identificato a livello della

membrana tilacoidale tre sequenze amminoacidiche di 21 residui, corrispondenti a tre possibili

isoforme di Lhcb1, indicate come Lhcb1.1, Lhcb1.2, Lhcb1.3 (Walcher et al., 2003), la cui funzione

è ancora sconosciuta. Da tali sequenze è stato possibile risalire, attraverso amplificazione del DNA

genomico e analisi RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), alle sequenze complete dei cDNA

dei geni codificanti le tre isoforme (Rea et al., 2007). I geni risultano essere espressi in modo

diverso quando le foglie vengono sottoposte a stress luminoso.

Allo scopo d’identificare le regioni di regolazione dei tre geni, abbiamo messo a punto una strategia

di genome walking, indipendente dall’uso di enzimi di restrizione e che non richiede la ligazione di

specifici adattatori (Leoni et al., 2008). Grazie a questa procedura sono stati identificati altri geni

della famiglia Lhcb1.

Verranno presentati i dati relativi alla caratterizzazione della famiglia genica Lhcb1 in spinacio e dei

relativi segnali di regolazione, insieme con una dettagliata analisi degli approcci metodologici messi

a punto nella procedura di genome walking.

- Walcher W. et al., 2003. Characterization of a Variant of Spinach PSII Type I light-harvesting protein using kinetically controlled digestion and

RP-HPLC-ESI-MS. Anal. Chem, 75: 6775-6780. - Rea G. et al., 2007. Characterization of three members of the multigene family coding for isoforms of the chlorophyll a/b binding protein LHCb1 in

spinach. Physiologia plantarum, 130: 167-176. - Leoni C. et al., 2008. A genome walking approach for the identification of eukaryotic nucleotide sequences adjacent to known regions.

BioTechniques 44:229-235.

SCATTERING DI LUCE LASER E MICROSCOPIA A FORZA ATOMICA SU FRAMMENTI DI

BETACONNETTINA DEL MUSCOLO CARDIACO UMANO S. Marchetti1,2, F. Sbrana1,3, R. Raccis1, L. Lanzi1, C. M. C. Gambi1,2, M. Vassalli3,4, B. Tiribilli3,4, A. Pacini5,A. Toscano5

1 Dipartimento di Fisica e CNISM, Università di Firenze, Via G. Sansone 1, 50019 Sesto Fiorentino, Firenze, Italia 2 CRS–Soft Matter (CNR-INFM), Università di Roma “La Sapienza,” Piazzale A. Moro 2, 00185 Roma, Italia 3 CSDC, Dipartimento di Fisica, Università di Firenze, Firenze, Italia 4 Istituto dei Sistemi Complessi del CNR (ISC-CNR), Firenze, Italia 5 Dipartimento di Anatomia, Istologia e Medicina Legale, Università di Firenze, Firenze, Italia

Nell'intento di studiare il processo di folding-unfolding delle proteine, scattering dinamico di luce

laser (DLS) e topografia a microscopia a forza atomica (AFM) sono state impiegate per studiare due

frammenti di una proteina del muscolo cardiaco umano, la beta-connettina, meglio conosciuta

come titina. Entrambi i frammenti appartengono alla banda I del sarcomero e sono composti

rispettivamente di quattro domini immunoglobulinici, dall' I27 a I30 per il tetramero, e di otto

domini immunoglobulinici, dall' I27 a I34 per l'ottamero.

Le misure di DLS hanno fornito le dimensioni di entrambi i frammenti in funzione della

temperatura tra 20 e 86 °C e mostrano l'effetto della denaturazione termica dovuta all'aumento della

temperatura.

Le immagini di topografia AFM di entrambi i frammenti nello stato nativo forniscono una

distribuzione uniforme ed omogenea di strutture di dimensioni comparabili. Le tecniche di DLS e

AFM si rivelano così complementari per la determinazione delle dimensioni dei frammenti e degli

aggregati di frammenti. Un risultato sorprendente è che l'ottamero si compatta in una struttura di

dimensioni più piccole del tetramero e tale comportamento si riscontra anche nello stato denaturato.

Questa proprietà sembra essere strettamente correlata all'importanza delle interazioni idrofobiche

tra i domini dei frammenti. Più il frammento è lungo, più facilmente le parti idrofobiche dei domini

interagiscono l'un l'altra. In più, è stato studiato anche il comportamento di aggregazione dei

frammenti in particolari condizioni della soluzione. Entrambe le tecniche usato hanno rivelato che

questo processo corre parallelamente alla transizione di folding-unfolding proteico.

INDICE DEGLI ABSTRACT Agati; 43 Agostiano; 47; 48 Alongi; 22; 23 Alvino; 46 Angeloni; 44 Banfi; 30; 34 Barbafina; 48 Barbieri; 34 Barsanti; 25; 26 Basile; 31 Berg; 21 Bini; 13 Bonan; 37 Boncompagni; 16 Bonsted; 21 Bonvicini; 15 Bottiroli; 16 Caffieri; 27 Calzavara-Pinton; 32; 33; 38; 39 Camerin; 24 Campolmi; 37 Cannarozzo; 37 Cantelli Forti; 44 Capezzera; 32; 33; 39 Caruso; 30; 34 Ceci; 50 Cercignani; 18 Chirico; 14 Cialdai; 15; 31 Cicchi; 43 Ciriaco; 47 Colautti; 41 Colombetti; 18 Coltelli; 25; 26 Conti; 15; 31 Costanzo; 49 Cotugno; 45 Croce; 16 Dall’Acqua; 20 De Simone; 16 Del Bianco; 12 Del Carratore; 18 Dell’Unto; 17 Denaro; 29 Elisei; 48 Evangelista; 25; 26 Fabris; 41 Facchinetti; 39 Fantetti; 22; 23

Faraone; 29 Farisoglio; 38 Ferrigno; 16 Forconi; 13 Fortuna; 40 Frassanito; 25; 26 Freitas; 16 Friso; 41 Fusi; 15; 31 Gallerani; 50 Gambi; 51 Gariboldi; 30 Giubileo; 17 Giulio; 41 Graça H; 41 Grobelny; 20 Gualtieri; 25; 26 Gulino; 49 Høgset; 21 Hrelia; 44 Ismaelli; 12 Jori; 24 Lanzanò; 49 Lanzi; 51 Latterini; 48 Leoni; 50 Lotti; 36; 37 Magaraggia; 24 Maiuro; 46 Manganoni; 38 Marcellino; 46 Marchesi; 44 Marchetti; 51 Martelli; 12 Marzano; 27 Matteini; 42; 43 Mavelli; 47 Menabuoni; 42 Menchini; 13 Mercatelli; 19 Merlicco; 44 Meschini; 30 Milano; 47; 48 Miolo; 27 Mirabella; 40 Molteni; 30 Monici; 15; 31 Monti; 30; 35 Moreno; 24

Moro; 41 Morroni; 44 Motta; 35 Musio; 45 Musumeci; 49 Naldi; 22 Norum; 21 Ognissanti; 46 Orlandi; 34 Pacini; 51 Parrinello; 32 Passarella; 46 Passarelli; 25; 26 Passerini; 13 Paventi; 46 Pavone; 43 Pedretti; 39 Peng; 21 Pinelli; 46 Pini; 42; 43 Pizzuto; 46 Pratesi; 11 Puiu; 17 Raccis; 51 Rapparini; 46 Ratto; 42; 43 Ravizza; 30 Remedi; 18 Romano; 15; 31 Roncucci; 22; 23 Rosi; 41 Rossi F.; 42; 43 Rossi M. T.; 32; 33; 38; 39 Rossi R.; 36 Ruello; 29

Ruggeri; 29 Russell; 24 Sala; 32 Salvador; 20 Sansotta; 29 Santillo; 45 Sbrana; 51 Scarmato; 29 Scommegna; 23 Scordino; 49 Selbo; 21 Sodi; 13 Soncin; 41 Specchia; 32 Sui; 49 Tarozzi; 44 Testagrossa; 29 Tiribilli; 51 Tiwari; 42 Torricelli; 13 Trotta; 47; 48 Tucci; 38 Tudisco; 49 Vairetti; 16 Vassalli; 19; 51 Vedaldi; 20 Venturi; 15 Venturini; 32; 38 Vermiglio; 29 Vesentini; 25; 26 Viola; 20 Weyergang; 21 Zaccanti; 12 Zane; 32; 33; 39 Zanieri; 36