Sistemi per omogeneizzare e frazionare tessuti e cellule

Per poter essere studiati in dettaglio le molecole biologiche e i vari complessi sub-cellulari devono essere isolati dal

materiale di partenza.

IL primo passaggio consiste nella distruzione della struttura cellulare o dei

tessuti.

Coltura cellulareo tessuto

• 1-Scelta del materiale di partenza

• 2-Metodo di rottura delle cellule

• 3-Proprietà chimico-fisiche delle soluzioni impiegate.

Metodi per rompere le cellule

• -metodi blandi: • lisi per osmosi• digestione enzimatica• solubilizzazione chimica• omogenizzatori• -metodi moderati • omogenizzatori a lama• mortaio• -metodi vigorosi • French press• Sonicazione• Macinazione con microsfere

Na+, Ca2+

Le cellule animali riescono a man- tenere costante la concentrazione intracellulare di soluti scambiando attivamente (consumo di ATP) ionicon l’esterno.

K+

Mg2+

Shock osmotico

Un abbassamento drastico della pressio-ne osmotica esterna (immersione in acqua distillata) provoca un rigonfiamento delle cellule ed una ‘esplosione’ delle membrane.

Lisi per osmosi

METODI BLANDI

Lisi della parete+shock osmotico

Digestione enzimatica

O SO3 Na+-

Sodio dodecil solfato

Solubilizzazione chimica

Omogeneizzazione con potter

Omogeneizzatori con lama (frullatore)

Macinazione con mortaio

METODI MODERATI

Camera di compressione

Valvola a spillo

Pistone

SONICAZIONE (ultrasuoni)

French press

METODI VIGOROSI

SOLUZIONI

• Il tampone ideale deve possedere le seguenti qualità:– Tamponare a pH vicino alla neutralità– Essere altamente solubile.– Non penetrare attraverso le membrane (se si studiano

organelli).– Essere stabile chimicamente ed enzimaticamente – Non assorbire luce nelle regioni dello spettro UV-

visibile– Non essere tossico.

Acido acetico 4.75 È efficace come tampone solo a pH acidi (4-5.5).

Acido citrico 4.76 (pKa2)6.4 (pKa3)

È efficace come tampone a pH <7. Tende a chelare gli ioni polivalenti.

MES acido 2-(N-morfolino)-etansulfonico

6.1 È uno dei cosiddetti ‘Good buffers’ (dal nome di chi ne ha esplorato l’uso in biochimica e biologia cellulare), come anche Bicina, PIPES, HEPES ed altri. Poco tossico per le cellule.

Acido carbonico 6.35 (pKa1)10.3 (pKa2)

La forma diprotonata tende a formare CO2. Più utile come tampone per la biochimica, a pH alcalini, lo ione monoacido.

PIPESacido 1,4piperazinodietansulfonico

6.8 Relativamente costoso, ma valido. Interagisce pochissimo con i metalli divalenti (Ca2+, Mg2+, Mn2+). Può interferire con il metodo di Lowry per la determinazione della concentrazione proteica.

Imidazolo 7.0

Acido fosforico 7.2 (pKa2)12.3 (pKa3)

Poco costoso. È spesso metabolita o inibitore di sistemi enzimatici. Tende a precipitare i cationi polivalenti.

HEPES acido N-2-idrossietil-piperazina-N’-2-etansulfonico

7.5 Vedi PIPES.

TrisTris(idrossimetil)aminometano

8.1 Poco costoso e molto usato. Tuttavia può dare effetti inibitori con molti sistemi enzimatici ed interagire fortemente con I metalli di transizione. Il suo pKa varia sensibilmente con la temperatura

BicinaN,N’-bis-(2-idrossietil)glicina

8.35 Un ‘Good buffer’.

Acido borico 9.2 Forma complessi con gli acidi nucleici.

Glicina 9.8 (pKa2)

ACIDO O BASE pK note

• Ioni Mg2• Composti tiolici (2-mercaptoetanolo, ditiotreitolo,

glutatione, cisteina…) vengono utilizzati per mantenere ridotti i gruppi sulfidrilici delle proteine essenziali).

• Inibitori di proteasi..• Per gli acidi nucleici, RNA in particolare,

occorrerà usare degli inibitori di nucleasi (RNAsina, cocktails di anticorpi specifici per le ribonucleasi, vanadil nucleotidi…).

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