Sindrome di Alport

XIII CORSO RESIDENZIALEDALLA DIAGNOSI PRENATALE ALLA TERAPIA POSTNATALE

NEFROLOGIA, DIAGNOSI PRENATALE NON INVASIVA, GENOMICA

Carrara 23-24 ottobre 2014

Alessandra RenieriU.O. Genetica Medica, Università di Siena

ASHGAmerican Society of Human Genetics

ASHG 1995 Oct, Minneapolis

ASHGAmerican Society of Human Genetics

ASHG 1995 Oct, Minneapolis

Renieri A. Bruttini M, Galli L, Neri, TM …..De Marchi M. Mutation scanning of the entire COL4A5 coding sequence in Alport syndrome and genotype phenotype correlation.

Mencarelli MA., Hedet L, Storey H, van Geel M …… Renieri A. Digenic inheritance in Alport syndrome.

24 anni di attività

oltre 1000 famiglie oltre 1000 famiglie per un totale di 3.248 individui

consulenze genetiche inconsulenze genetiche inoltre 500 oltre 500 famiglie famiglie

arrivo sangue e datiarrivo sangue e datiddi altre 500 i altre 500 famigliefamiglie

RD-Connect:

Biobanca Genetica di Sienawww.biobank.unisi.it

Cell lines and DNA bank of Rettsyndrome, X-linked mental

retardation andother genetic diseases

Cell lines and DNA bank of

hereditary cancers

GBSGenetic Biobank

of Siena

Biobanca Alport3.248 campioni di DNA

261 campioni di sangue 213 campioni di plasma

45 linee cellulari

Registro Italiano Sindrome di Alport

oltre 1000 famiglie oltre 1000 famiglie

Scientific board del RegistroGhiggeri Marco Nefrologia Ist Gaslini GenovaGiani Marisa Nefrologia Policlinico MilanoMassella Laura Ospedale Bambino Gesù RomaManno Carlo Nefrologia BariLa Manna Angela Pediatria Sec Univ di NapoliPecoraro Carimine Nefrologia A.O.Santobono NapoliPennesi Marco Pediatria TriestePeruzzi Licia, Nefrologia, Ospedale Inf R M Torino

Sindrome di Alport (ATS)

Nefropatia ereditaria progressiva eterogenea dal punto vista

clinico e genetico

Collagene alfa 3-4-5 eterotrimero

Componente essenziale della Membrana Basale Glomerulare matura Prodotto esclusivamente dai podociti

4. Network del Collagene

Tipi di eredità monogenicanella ATS

• legata al cromosoma X - COL4A5

• autosomica recessiva - COL4A3 e COL4A4

• autosomica dominante - COL4A3 e COL4A4

Gubler MC (2008) Inherited diseases of the glomerular basement membraneNat Clin Pract Nephrol 4: 24–37, 2007

I

II

III

64aa IRC lieve

ESRD a 33aa

ipoacusia

ESRD a 18aa

ipoacusiaESRD a

22aaipoacusia

Microematuria intermittente

Alport X-legata

COL4ACOL4A55

65%

Alport Autosomica Recessiva

Longo I, et al. Nephrol Dial Transplant 2006;21(3):665-71.

3209insA w

3386del27 w

3209insA 3386del273209insA 3386del27ww

COL4A317 yMicrohematuriamacrohematuriaCRF (creatininemia 2 mg%)Bilateral mixed hearing lossDelayed growth

9 yMicrohematuriamacrohematuriaCreatinininemia 0,4 mg%

43 yMicrohematuriaMacrohematuriaCreatininemia 0,9 mg%

COL4ACOL4A33

4%

Alport Autosomica Dominante

Pescucci C, et al. Kidney Int. 2004;65(5):1598-603.

54 y CRF

88 y deathDialysis since the age of 84Bilateral neurosensory hearing loss

67 yMicrohematuria - ProteinuriaCRF (creatininemia 1,4mg%)Bilateral neurosensoryhearing loss

G1045Vw

43-20 yMicrohematuria

COL4A3

G1045Vw

COL4ACOL4A33

30%

Clinical evaluation

X-linked

COL4A5

DHPLC

Sequencing

MLPA

Autosomal

COL4A3

DHPLC

Sequencing

COL4A4

DHPLC

Sequencing

Test Genetico con Sequenziamento Tradizionale

Analizzato un gene alla volta = Tempo risposta 12 mesi

Fino a Settembre 2010

Test Genetico con Sequenziamento massivo

paralleloda Ottobre2010

COL4A5COL4A4COL4A3

Tutti e 3 i geni analizzati insieme = Tempo risposta 15 gg !!

Sequenziamento massivo parallelo

Sequenziamento massivo parallelo

COL4A3 c.2746+1G>T

COL4A4 c.1553G>A

COL4A3

COL4A4COL4A5

Sequenziamento Massivo Parallelo

MM

7 yMicrohematuriaMacrohematuria since 4y

45 yMicrohematuria

wtwt

M wtwtwtM

wtwt

wt

p.Gly518Glu

c.2746+1G>T

forma digenica

Famiglia 1

M1 = COL4A4 p.Gly1151Ala

M2 = COL4A3 p.Gly300Arg

Microhaematuria

M2wtwt

M1wtwt

wtwt

55 yCRFSNHL

M1M2wtwt M1

M2wt

wt

wtwt M1

wt

36 yMicrohaematuria

M1M2wt

wt

M2 = COL4A3 p.Gly520Arg

M1 = COL4A4 p.Cys1566Trpfs*37

I:2I I:1

II:2

I:2

II:1

I:1I

II

IIMicrohaematuria

M2wt wt

wt

II:3

M2wt wt

wt

II:120 yIntermittenthaematuria

60 yPreemptiverenaltransplantation

28 yHaematuria

23 yIntermittenthaematuria

wt

Famiglia 2 e 3

Famiglia 2

Famiglia 3

Ipotesi: Ereditarietà DigenicaL’eterogeneità clinica nella ATS è dovuta

a varianti polimorfiche con effetto modificatore???

COL4A4COL4A4

12 mutations

COL4A3COL4A38 mutations+

COL4A5COL4A54 mutations

+

12 Famiglie con 12 Famiglie con Ereditarietà Ereditarietà DigenicaDigenica

EuropeanEuropean collaborative collaborative studystudy

Eredità digenica autosomica con mutazioni concatenate in trans

COL4A3 p.Gly520Arg

60 yESRD

COL4A4 p.Cys1566Trpfs*37

28 yMicro-hematuria

55 yCRFSNHL

MMwt

wtM

Mwt

wt

Mwt wt

wt

rischio di ricorrenza come autosomica recessiva = 25%

Eredità digenica autosomica con mutazioni concatenate in cis

40 yCRF at 20

COL4A4 p.Ser969X

COL4A3 p.Cys1665Tyr

32 yintermittenthematuria 45 y

hematuriaproteinuriaCRF, SNHL

40 y ESRD

COL4A3 del ex1

COL4A4 del ex1-4

MM

wtwt

wtwt

wtwt

MM

wtwt

wtwt

wtwt

rischio di ricorrenza come

autosomica dominante = 50%

Eredità digenica mistaautosomica e X-legata

COL4A5 Gly644Asp

COL4A4 Gly692Val

69 yMicro-hematuria

45 yHematuriaproteinuriaSNHL

M

wt

wt

wt

M

wtM

wt

COL4A5 p.Gly953Val COL4A4 c.3817+1G>T

54 yESRD at 44

17 yHematuria

Mwt

wt

M

wt

wt

M

rischio di ricorrenza

complesso da valutare caso per

caso

Eredità triallelica

COL4A5 p.Gly684Val

COL4A4 c.1623+5G>T

ESRD

Hematuria Hematuria HematuriaHematuria HematuriaProteinuria

HematuriaProteinuria

COL4A4 p.Pro1587Arg

wtM

M

wt

M

wtM

M wt MM

wtM

wtM M

wtM

wtM M

M

M

wtwt

wt

wt

rischio di ricorrenza

complesso da valutare caso per

caso

M1

M2

M1

M2

M1

M1

50% delle molecole di tripla elica sono difettose

75%delle molecole

di tripla elica sono difettose

Combinazioni di tripla elica con collagene alfa mutato

Normale

Eterozigote

Omozigote

100% delle molecole di tripla elica sono difettose

Doppio Eterozigote

La forma digenicaha gravità intermedia

tra la dominate e la recessiva

Inheritance AD DI AR

% triple helixdisrupted 50 75 100

ESRD age 56 y 40-44 y 31 y

sommariosommario 11

ØAbbiamo dimostrato per la prima voltaEderitàEderità DigenicaDigenica

nnellaella sindromesindrome di di AlportAlport

sommariosommario 22

ØEredità digenicaautosomica con mutazioni concatenate in cisha RR come la forma dominate ma è più grave

? 50%wtMM

wt

wtwtwt

wtwt

MM

wt

ØEredità digenicaautosomica con mutazionconcatenate in trans ha RR come la forma recessiva ma è più lieve

? 25%MMwt

wt

Mwtwt

wtwt

Mwt

wt

sommariosommario 33

ØEredità triallelica

? 0 ---> 50%; A MX wt

M

wtM

wtwt

X MA M wt

? 0 ---> 50%A MX wt

wt

wtwtwt

wtX MA M wt

ØEreditò digenicanon concatenata mista autosomica/XL

Metà di questi fenotipo grave

sommariosommario 44

ØAlport digenico ha gravità intermediarispetto a dominate e recessivo

ØL’analisi di tutti e 3 i geni insieme in un pannello next gen è fortemente

raccomandato per stabilire il correttorischio di ricorrrenza e la corretta prognosi

DIAGNOSI PRENATALE1. Amniocentesi 2. Villocentesi

• presenza del cffDNA nel plasma materno;

• concentrazione progressiva: da 3,4 % al 6,2%;

• origine:1. Placentare;2. Cellule fetali;3. Diffusione passiva.

3. NIPT (Non invasive prenatal test)

Estrazione DNA da plasma donne in gravidanza

Plasma

Next Generation Sequencing

c.1721 C>T (p.P574L) nell’esone 25 di COL4A3

CC TT

CT

Reference Variante EsoneVariante

dopo mappatura

Patogenicità Ref.DNA

madre (%)

DNA padre (%)

COL4A3107351

C>T25

c.1721C>T p.P574L

polimorfismo Slajpah* 100 (46) 0 (41)

Padre

Madre

Reference Variant3 EsoneVariante

dopo mappatura

Patogenicità Ref.DNA da plasma F

(%)

DNA da plasma R

(%)

COL4A3107351

C>T25

c.1721C>T p.P574L

polimorfismo Slajpah* 95,5 (222) 91,95 (87)

cffDNA

94,5% allele T5,5 % allele C

fetoaffetto

Impossibile v isualizzare l'immagine. La memoria del computer potrebbe essere insufficiente per aprire l'immagine oppure l'immagine potrebbe essere danneggiata. Riavviare il computer e aprire di nuovo il file. Se v iene visualizzata di nuovo la x rossa, potrebbe essere necessario eliminare l'immagine e inserirla di nuovo.

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Cellule delliquidoamniotico

Sorting

Presursorirenali

Differenziazione in podociti

AKSCs

ATS e terapia cellulare

fetosano

Dic 2013Feto con mutazione COL4A5

Feb 2014Feto con mutazione COL4A4

AKSCs

ATS e terapia cellulareAffected podocyte Control podocyte

RNASeq RNASeq

Comparison

Data analysis

Immunofluorescence & western analysis

Immunofluorescence & western analysis

Cellule staminali del liquido amniotico

Exome Sequencing

ExomeSequencing II

10 controls

Cell culture

GBSGenetic Biobank of Siena

Cellule staminali dal liquido amniotico

Ringraziamenti

“Banca di DNA e linee cellulari da pazienti con syndrome di Rett, ritardo mentale X-linked e altre malattie genetiche” nell’ambito del Telethon Network of Genetic Biobanks

Donazione in favore di “Graziano and Marco Laurini”

Genetica Medica Siena

COL4A4

COL4A3

COL4A3

COL4A3

COL4A3

COL4A5

NPHS2

SegregationSegregationanalisysanalisys

ClinicalClinical revaluationrevaluation

Ereditarietà DigenicaMutazioni Patogenetiche

COL4A4

c.2996G>Ap.Gly999Glu

MAF 0.007/16

c.1634G>C p.Gly545Ala

MAF 0.0266/57

Varianti Funzionali?

COL4A41

COL4A32

COL4A51

COL4A5+

COL4A31

COL4A34

Variazioni Polimorfiche