Seminari di approfondimento sulla Biochimica per docen di ...Alessio Scarafoni DeFENS Università...
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SeminaridiapprofondimentosullaBiochimicaperdocen4discienze
organizza4daCusMiBio
nell’ambitodelproge;oILinceiperunanuovadida?canellaScuola
30novembre2016–AulaV10viaVenezian15ore15.00
Titolo:GlienzimiediloroinibitorinaturaliDo;.AlessioScarafoniDipar'mentodiScienzepergliAlimen',laNutrizioneel’Ambiente,SezioneScienzeChimicheeBiomolecolari,UniversitàdegliStudidiMilanoTitolo:Cibo,prevenzioneesaluteDo;.MauroCortelliniDipar'mentodiMedicinaPreven'vaePrediBva,FondazioneIRCCSIs'tutoNazionaledeiTumoriMilano
E’previstalaconsegnadelcer'ficatodipartecipazionevalidoperl’aggiornamentodocen'
Obie?vi• Promuovereunaggiornamentocon'nuosuitemipiùaJualidellebioscienze.• CoinvolgereaBvamentegliinsegnan'nellacostruzionedinuoveunitàdidaBcheteorico-pra'chesutema'cheaJualielegateainuoviobieBvidiapprendimento.Programma• Seminaridiapprofondimento,tenutidadocen'universitari,sutema'chechehannocomenucleoprincipalelabiochimica.• Cos'tuzionedigruppidilavorocoordina'dacollaboratoridelCusMiBio,chesvolgerannounaaBvitàdiformazionecon'nuaconlarealizzazionedipercorsididaBcidiapprofondimentosullabiochimica.
Alessio Scarafoni
DeFENS Università degli Studi di Milano
Via Celoria 2 20133 Milano
Tel. 02 50316820
Le reazioni enzimatiche
Una reazione chimica è un processo che porta alla formazione di nuove sostanze (prodott i ) trasformando le molecole di partenza (reagenti)
S P
Keq = P S
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Le reazioni enzimatiche
Gli enzimi
Sono macromolecole biologiche (proteine) con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze - CATALIZZATORI
Gli enzimi sono catalizzatori biologici
Gli enzimi aumentano la velocità con cui l’equilibrio di una reazione viene raggiunto
Presentano alta specificità di substrato e prodotto
Catalizzano reazioni in condizioni blande (fisiologiche) rendono più moderate le condizioni di reazione
Gli enzimi
Gli enzimi
Gli enzimi
Gli enzimi
Cinetica enzimatica Equazione di Michaelis Menten
Fasi di una reazione enzimatica
Gli enzimi
Cinetica enzimatica Equazione di Michaelis Menten
Gli enzimi
Cinetica enzimatica Equazione di Michaelis Menten
Il valore della Km è importante perché:
a) è una costante specifica per ogni enzima
b) è una stima della affinità per il substrato
c) lo studio dell' effetto di diversi composti sulla Km permette di identificare eventuali inibitori.
Gli enzimi
Gli enzimi
Gli enzimi
Solo una parte della molecola è coinvolta nella catalisi MA Tutta la molecola è importante. Alterazioni a siti distanti dal sito catalitico possono variare (ridurre) l’attività enzimatica
Modello chiave nella serratura
Gli enzimi
Gli enzimi
Esochinasi
Gli enzimi
Gli enzimi
T Temp
Atti
vità
Atti
vità
0
pH
Denaturazione
Gli enzimi
Gli inibitori
Una sostanza che diminuisce o annulla la velocità di una reazione biochimica è detta inibitore
Inibitori irreversibili (inattivazione) Inibitori reversibili:
Incompetitiva Non competitiva
Competitiva
L’inibizione
L’inibizione
Inibizione non competitiva
L’inibizione
L’inibizione
Inibitori competitivi
Inibizione competitiva
Inibitori competitivi
Inibitori competitivi
Gli inibitori competitivi sono inibitori reversibili che si legano al sito attivo, alterando la Km ma non la Vmax
L’inibizione
L’inibizione da feedback è resa possibile da una proprietà detta ALLOSTERIA Possiede due siti: uno per il substrato (s.a.) ed uno allosterico dove si lega l’inibitore Quando l’inibitore si lega, conformazione dell’enzima varia ed il substrato non più legarsi
CLASSIFICAZIONEENZIMI
classe 4podireazionecatalizzata
1ossidoredu;asi reazionidiossido-riduzione
2transferasi trasferimen'digruppidiatomidaun donatoreadunacceJore
3idrolasi idrolisidilegami
4liasi roJuralegamiC-C,C-O,C-N,comprese reazionicheeliminanoacqua
5isomerasi interconversionediisomeri
6ligasi unionediduemolecoleconaccoppiata idrolisidiATP
Gli enzimi
Gli inibitori naturali
Cosa sono gli inibitori naturali? Quale ruolo hanno?
Gli inibitori naturali
Ruolo di difesa contro: - Predatori - Patogeni
“Inibiscono enzimi chiave per la vita dell’aggressore”
Ruolo di regolazione cellulare: germinazione
Gli inibitori naturali
Gli inibitori naturali
Inibitori di proteasi Inibitori di amilasi Inibitori di glucanasi
Quindi agiscono su enzimi digestivi
Sono conosciuti anche con il nome di fattori antinutrizionali
Hanno natura proteica
Protein family
Examples Type of protein Source Adverse activity Beneficial activity
Proteinase inhibitors
BBI Small, compact Many seeds Inhibition of endogenous
proteolytic enzymes
Anticarcinogenic, anti-inflammatory
Amylase inhibitors
2S albumin Small Many seeds Inhibition of endogenous
amylolytic enzymes
Anti-obesity, diabetes, metabolic
syndrome
Storage proteins
Conglycinin α’ subunit
Large chain Soybean Not applicable Hypolipidemic
Gamma conglutin
Large chain Lupin Not applicable
Hypoglycemic
Vicilin Fragment Lupin Not applicable Lectin
Lectins PHA Medium size Many legume seeds
Hemagglutination Immuno-modulation
Peptides ACEIn Small Few seeds Not known Hypotensive
Thiamine BP PA2 Small Many seed Not applicable Vitamin vehiculation
Gli inibitori naturali
Gli inibitori naturali
Presenti in tutte le piante
Possono trovarsi accumulati in certi organi (es: semi)
Oppure Venire sintetizzati al bisogno (in seguito ad un attacco)
La proteolisi
Le proteasi
• Tripsina: estremità –COOH di K e R (n-1 diverso da P)
• Chimoripsina: estremità –COOH di F, Y, W
• Lys-C: estremità –COOH di R
• Clostripaina: estremità –COOH di R
• Carbossipeptidasi A: rilascia tutti tranne P, R e K
• Carbossipeptidasi B: rilascia tutti tranne P
Gli inibitori naturali
Inibitori competitivi
Gli inibitori naturali
Inibitore di Kunitz
Gli inibitori naturali
Inibitore di Bowman-Birk
L’attività di un enzima si misura in U.I.
Le unità enzimatiche si definiscono per ogni enzima
Misurare l’attività di un enzima
Misurare l’attività di un enzima
1/2
L’attivitàdegliinibitoridellatripsinavienevalutataattraversoil
TrypsinInhibitorActivity(TIA),unparametrochecorrelailrapportotralamassadell’enzimainibitoelamassadelcampioneanalizzatoincuisipresumepossaessercil’inibitore
proteico.
SeguendolaNormaISO14902:2001,
l’attivitàinibitorianeiconfrontidellatripsinavienemisurataaggiungendo
adaliquotedeicampioniilbenzoil-L-arginina-para-nitroanilide
(L-BAPA).
TIA=
i=[(Ar-Abr)-(As-Abs)]\(Ar-Abr)mi=massadellatripsinainmilligrammidi=diluizionedelcampionemo=massadelcampioneingrammi
Misurare l’attività di un enzima
SEMEDISOIA
Minerali
Vitamine Proteine
Lipidi Carboidrati
Un esempio
PRO– B u o n a f o n t e
nutrizionale– Proteine– Isoflavonoidi– Omega3eOmega6– Fitoestrogeni
CONTRO– Inibitoriproteici– Lectine– Ureasi– Acidifitici– Lipossigenasi
Un esempio
BowmanBirkInhibitor KunitzInhibitor
PM:8kDa
Termostabile
PM:20kDa
Termolabile
(pdb:1K9B) (pdb:1AVU)
Un esempio
Un esempio
Gli inibitori naturali
Inibitori di amilasi
Amilasi
Gli inibitori naturali
Inibitore non competitivo
Le attività criptiche
Many kinds of bioactive peptides which might prevent
lifestyle-related diseases are released from food
proteins after enzymatic digestion.
Le attività criptiche
Proteolysis
Gastrointestinal digestion
Germination
Fermentation
Food processing
Le attività criptiche
Source Protein Produced by Activity
Soybean Storage Enz. digestion Immunostimulation
Soybean Storage Fermentation Antihypertensive ACE inhibition
Soybean 7S globulin Enz. digestion Hypocholesterolemic
Soybean Storage Germination Lipases inhibition
Lupin 7S globulin Germination Antitumoral
Le attività criptiche
Le attività criptiche
Porzione della proteina esposta al solvente = regione
superficiale
Le attività criptiche
Le attività criptiche
Le attività criptiche
L’enzima umano Angiotensin Converting Enzyme (ACE) rappresenta una tappa fondamentale nel meccanismo del controllo della pressione sanguigna
Gli inibitori naturali
Gli inibitori naturali
Peptidi con attività ACE-inibitoria da proteine di legumi e patata
ACE inibitori
Peptidi con attività ACE-inibitoria da proteine del muscolo