Schemi Di Biologia Generale e Molecolare 2013

8/19/2019 Schemi Di Biologia Generale e Molecolare 2013

1/78

BIOLOGIA

Canale B

Altruda-De Filippi-Turco


2/78

Introduzione

Il file che vedete comprende le parti delle tre professoresse che insegnano biologia nel primo

semestre. Purtroppo, come potrete notare, la parte di genetica molecolare non ha le immagini,

dal momento che quando l’avevo fatta io, le slides erano state rese disponibili dopo che avevo

già completato il lavoro di stesura degli appunti.

Ad ogni modo, per la parte di genetica molecolare, fatta dall’Altruda, ritengo che ci sia più o

meno tutto. Una lettura ai primi capitoli dell’Alberts è consigliata, soprattutto per quanto

riguarda la riparazione del DNA che a noi è stata spiegata da una sua collega straniera non

esattamente chiara in italiano. Noterete, poi, che questa parte è fatta in maniera schematica,

ma se seguite le lezioni potete facilmente impostarci un discorso soprattutto se vi aiutate con

l’Alberts.

Seconda parte: riguarda biologia cellulare. Qui il discorso è piuttosto semplice: quello che c’è

qui sono le parole della De Filippi, quindi si potrebbe pensare che c’è tutto. Effettivamente, lei

tocca tutti gli argomenti che le interessa che voi conosciate, ma non approfondisce nulla,

mentre all’esame fa domande specifiche (vedi 2012-2013: illustrare i meccanismi di controllo

che avvengono in fase S del ciclo cellulare) cui ovviamente non saprete rispondere senza

l’aiuto dell’Alberts. Purtroppo i capitoli sono parecchi e lunghi.

Terza parte: sembra strano ma tutto quello che trovate qui, ovvero le lezioni della Turco,

serve praticamente a nulla. Farà una o massimo due domande di teoria (tipo: in quale fase

possiamo vedere i cromosomi omologhi al centro della cellula?) e il resto esercizi. Quindi,

questa parte l’ho inserita solo per completezza.

Buono studio e spero possano esservi utili,

Edoardo


3/78


4/78

amminoacidi e che il DNA da 4 nucleotidi: ecco perchè si era convinti che le informazioni ereditarie fosserocontenute nelle proteine. La dimostrazione sperimentali arrivò grazie ad esperimenti sui batteri: sono facilida crescere e il loro ciclo vitale è rapido. Griffith negli anni ’40 cercò di scoprire quale molecola nella cellula batterica portasse le informazioni: usò batteri S ( inoculandoli in un topo questo moriva perchè vi era unatossina) e batteri R (inoculandoli in un topo sopravviveva perchè non conteneva tossine). Crescendo su un

sostrato gelatinoso R e S davano origine a colonie riconoscibili. Il ceppo S veniva ucciso dal calore e neltopo portava a non morire. Ceppo S (ucciso dal calore) + ceppo R portava lo stesso alla morte del topo perchè dei batteri sono vivi. Una parte dell’informazione è ancora presente nei batteri uccisi dal calore. Nel1944 il gruppo di Avery cerca di capire se sono proteine o DNA a portare informazione. Purifica proteine eDNA dal ceppo S. Ceppo R+proteineil topo vive ; ceppo R+DNA il topo muore. Il DNA ripristina lefunzioni del ceppo S. Prima trasformazione: passaggio di DNA da un batterio a un altro. Nel 1952 Hershey eChase utilizzarono batteriofagi e marcarono selettivamente le 2 molecole componenti un fago: acido nucleicoe capside fatto di proteine poco eterogenee. Marcare= inserire un elemento radioattivo nella composizione diDNA e delle proteine. Il DNA è ricco di atomi di P (isotopo 32) e nelle proteine vi è S ( isotopo 35). Inseritigli isotopi nella coltura i fagi diventano radioattivi. Infettati fagi non marcati e centrifugandoli, i batteri si

accumulano sul fondo e lì si trova il fosforo. Con lo zolfo invece si ottiene una struttura proteica che staall’esterno della cellula. Informazione nel DNA quindi.

Struttura acido nucleico: Watson e Crick studiarono negli anni ’50 la struttura dell’acido nucleico partendoda alcuni dati:

- struttura dei nucleotidi (ribosio/desossiribosio + basi puriniche/pirimidiniche). Nucleoside: zucchero+baseazotata; nucleotide difosfato/trifosfato: idrolisi dei legami tra gruppo fosfato dà energia, reazioneesoergonica.

- Chargaff notò che le basi puriniche erano uguali in % a quelle pirimidiniche. %A=%T e %G=%C ;

- analisi cristallografica: periodicità della molecola. Il DNA è formato da 2 filamenti posti in modoantiparallelo. Orientamento 5’3’ (1° nucleotide e ultimo non legati a nulla): così si rispetta la simmetriacristallografica.

- Nucleotidi: gli zuccheri stanno all’esterno e P ancora più all’esterno. Le basi azotate stanno all’interno esono legate con legami a idrogeno. L’elica ha orientamento destroso. Distanza nucleotide-nucleotide= 0,34nm ; ripetizione dell’elica= 3,4 nm. I legami del DNA sono complementari e ciò spiega anche come sireplica. Le sequenze A-T sono meno stabili di quelle G-C. I legami idrogeno tra nucleotidi semplificano laduplicazione e la trascrizione del DNA.

Dimensione genoma: procarioti:- Escherichia coli 4,64x106 geni

Eucarioti:

- Saccaromices cerevisiae 12x106 geni

- Drosophila Melanogaster 140x106 geni

- Homo sapiens 3000x106 geni

- Salamandra 90000x106 geni

DNA nucleare: è tutto compattato grazie alla formazione del filo di perle. Si sfruttano gli istoni (circa 100amminoacidi) e sono in varie classi: Hl, H2A, H2B, H3, H4. Sono proteine più basiche del normale e tra le più


5/78

conservative (una proteina è conservata quando la sua struttura primaria è poco variabile da specie a specie).Gli istoni hanno lo scopo di contattare il DNA e dare origine al filo di perle.: queste perle sono nucleosomiformati da DNA che avvolge le proteine istoniche. Ogni istone: il DNA fa 2 giri. In ogni sacchetto istonico visono 2 proteine H2A, 2H2B, 2H3 e 2H4. Dove entra e esce il DNA dal sacchetto vi è un istone Hl.

Nell’avvolgersi sono impegnati 146 nucleotidi. Dall’avvolgimento elicoidale del filo di perle si ha la fibra

(30 nm). Essa dà origine a grandi anse, basandosi su una struttura proteica. Con ulteriori e sconosciuticompattamenti si arriva al cromosoma

DUPLICAZIONE DEL DNA

Duplicazione DNA: tutti gli organismi devono duplicare il loro DNA prima di ogni divisione cellulare. Ilciclo cellulare procariote è molto rapido ed è costituito da quasi un’unica fase, mentre quello eucariote ha piùfasi: in quella S avviene la duplicazione. La velocità del ciclo dipende dal tipo di cellula: quello delle celluleadulte è normalmente più lungo. Altre fasi:

- Fase M: fase di mitosi/meiosi

- Fase G1: dopo la divisione si ricostruiscono le strutture, gli organelli e le proteine. Alcune cellule nonvanno subito in fase M e allora restano in G1. Ecco perchè è una fase con lunghezza varia.

- Fase S: sintesi del DNA. Qualche ora in tutte le cellule

- Fase G2: tutte le modificazioni pre-fase M

Fase S: replicazione studiata per la prima volta nei batteri. Si passa da una molecola di DNA a due nuovemolecole identiche all’originale. Si aggiungono desossiribonucleotidi basandosi sul principio di

complementarità: A-T e C-G. Per creare i legami fosfodiestere occorre energia. Un meccanismo che deveessere perfetto e si suddivide in tre possibilità:

- conservativo: due molecole di DNA una del tutto nuova e l’altra è l’originale

- semiconservativo: due molecole di DNA con un filamento originale e uno nuovo.

- dispersiva (presto abbandonata): si presupponeva la formazione di nuove eliche con tratti di nuovo e trattidi vecchio

Meselson e Stahl hanno dimostrato che è semiconservativo.

Processo di duplicazione: la molecola che duplica è un enzima che catalizza l’aggiunta di

desossiribonucleotidi: DNA polimerasi. Vi sono varie isoforme di questo enzima, ma le caratteristiche sonocomuni:

- non sono in grado di idrolizzare i legami idrogeno per separare i due filamenti di DNA

- tutte le DNA polimerasi hanno bisogno di uno stampo da cui copiare (deriva da un’elica preesistente)

- sono in grado di allungare un filamento di DNA e RNA, ma non possono iniziare ex-novo la sintesi di unanuova catena

- i due filamenti di DNA sono antiparalleli: 5’3’ e 3’5’. Tutte le DNA polimerasi catalizzano l’aggiuntadi un nucleotide solo all’estremità 3’. Quindi vanno solo in 5’3’

- il substrato sono solo i 4 nucleotidi trifosfato


6/78

- dietro vi sono attaccate delle strutture che spingono la polimerasi a sintetizzare in modo processivo: lastruttura si dice pinza. Senza di essa procederebbe troppo lentamente

Luogo di duplicazione: il processo avviene in una forcella. La DNA polimerasi agisce solo più in là. In un punto i due filamenti si separano e lì si ha la forcella di replicazione. Una molecola di DNA in cui i due

filamenti sono separati lungo un tratto che funge da stampo.

I due filamenti: sono sintetizzate due molecole. Quello in cui la sintesi avviene in modo continuo si chiamafilamento guida, mentre quello dove avviene in modo discontinuo filamento ritardato. Essendo laduplicazione bidirezionale si hanno due forcelle (per procarioti no dato il DNA circolare)

DNA elicasi: si occupa di svolgere l’elica a livello della forcella e rompendo i legami a idrogeno. Come uncuneo separa i due filamenti. La sua attività richiede idrolisi di ATP. Una delle prime proteine ad agire nelladuplicazione

DNA primasi: le polimerasi non iniziano la sintesi, ma serve un 3’ libero perchè si attivino. La primasi,

appunto, forma un certo tratto di RNA (una decina di nucleotidi) che è l’innesco. L’innesco serve per la polimerasi che può catalizzare l’aggiunta di desossiribonucleotidi. Nel caso di sintesi discontinua, la

polimerasi incontra più primer e ricomincia più volte la sintesi. Gli inneschi (RNA primer) sono sintetizzatiogni 200 nucleotidi e sono eliminati successivamente da un enzima di riparazione. A rimettere insieme i vari pezzi ci pensa la DNA ligasi che ricrea i legami fosfodiestere. Questi frammenti sono detti frammenti diOkazaki

Proteine SSB: proteine leganti il singolo filamento, una volta che si aperta la molecola. Servono a impedirela riformazione dell’elica date le forze dei legami tra nucleotidi.

Modo di sintesi: nei batteri sono prodotti 1000 nucleotidi al secondo e negli eucarioti 100. Vi sono due

filamenti e due DNA polimerasi che procedono in versi antiparalleli. I due enzimi sono tenuti vicini da una proteina e se per quello continuo non si pongono problemi, per quello ritardato invece, più ci si allontana daidue centri più si cresce l’ansa.

DNA polimerasi nei batteri: sono di tipo I, II e III. Direzione 5’3’. Attività esonucleasica (indica l’attivitàdi un enzima in un tratto di DNA che trovate le estremità di un acido nucleico lo elimina; N.B. l’attivitàendonucleasica degrada il DNA non dalle estremità ma dall’interno dell’elica): 3’5’(I,II eIII) e 5’3’ (I).

Con tale attività si correggono gli errori. Solitamente la polimerasi commette un errore ogni 10000nucleotidi, ma alla fine della replicazione risulta solo 1 errore ogni 1010. Quando si ha un errore l’elica sidestabilizza e la DNA polimerasi degrada idrolizzando tutto ciò che ha sintetizzato fino all’errore che va a

correggere per poi riprendere la sintesi: funzione detta di correttore di bozze. Tuttavia: troppe mutazioni vuol

dire danni, ma nessuna vuol dire mancanza di vita. Una percentuale di errore garantisce la variabilità. Lamutazione che blocca la polimerasi 3 porta alla morte. Vi sono 400 enzimi di polimerasi I e pochi di polimerasi III.

DNA polimerasi in un mammifero: 5’3’ (α,β,γ,δ,ε) ; esonucleasica 3’5’ (γ,δ,ε); localizzazione nucleare(α,β,δ,ε) e mitocondriale (γ). Α e β servono per correggere il DNA mentre δ e ε per la sintesi: δ allunga i

primer e ε sintetizza il tratto continuo.

L’origine della replicazione: la cellula è in fase S. Nei procarioti l’origine è unica, ma negli eucarioti vi sono più origini (più cromosomi infatti). Vi sono 10000 origini per cromosoma per rendere rapida la duplicazione.Il segnale dell’origine è una sequenza specifica che fa capire che lì avviene il processo di replicazione. Siforma così la bolla. All’origine si attaccano le proteine iniziatrici. Origine ricca di A e T ( rendono più facile

l’apertura) richiama le proteine iniziatrici poi DNA con DNA elicasi e cos via...


7/78

Topoisomerasi: proteine con il ruolo di togliere gli avvitamenti dell’elica di DNA quando la cellula non è infase di mitosi: quando è una matassa. Vi è topoisomerasi I e II. Si legano in modo reversibile, ma covalenteal DNA idrolizzando e rompendo i legami tra nucleotidi. Questo porta allo srotolamento del DNA: dopoquesto legame covalente temporaneo si stacca e riunisce i due nucleotidi (la I). LA topoisomerasi II tagliaentrambi i filamenti di DNA e non uno. Si lega a uno dei tratti in modo covalente così che le maglie della

catena non siano più incatenate e poi ristabilisce il legame tra nucleotidi.

Sequenza telomerica: gli estremi di un cromosoma , dei filamenti di DNA. Sono sequenze molto ripetitive.La telomerasi genere la sequenza ripetuta e si associa con pochi nucleotidi del telomero esposto ( 3’ libero):copia e aggiunge nucleotidi di DNA complementari al filamento. Poi si riporta di nuovo nel 3’ e risintetizza

un altro tratto per molte volte. Allungato un filamento l’altro si allunga in modo complementare. Queste

sequenze non codificano proteine. Senza telomerasi a ogni ciclo i cromosomi si accorciano. Molto attivanell’embriogenesi, ma sparisce quasi nell’adulto se non nelle cellule tumorali. Sono associati

all’invecchiamento e sono importanti in medicina rigenerativa: senza di essi si arriva alla non fertilità, perchènon sono rimpiazzabili.

APPROFONDIMENTO

Nobel medicina 2012: Takahashi (Nobel 2012 con Gurdon) e Yamanaka pubblicano nel 2006 un articolosulle cellule staminali. Preso il nucleo di una cellula dell’intestino di una rana e inseritolo in un ovocellulaancora totipotente, osservarono che l’ovocellula riprogrammava il nucleo di tale cellula della rana. Pubblicadopo ulteriori studi postesperimenti del 1962 dal titolo “Induction of pluripotent stem cells froma mouse

embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors”. Aggiungendo 4 geni ha reso una cellula adulta pluripotente. I geni sono: Oct ¾, Sax 2, c-Myc e Klf4. Sono detti anche iPS (induced pluripotent stem cells). Nessun problema etico perchè una cellula adulta diventa pluripotente, ma non si prendono da un feto.

GENOMA

Genoma: si indica con tale termine l’intera sequenza del DNA specificamente per l’attività delle sequenze.

Geni procarioti ed eucariotici: i primi sono colineari (trascrizione e traduzione quasi contemporanemante)con le sequenze di RNA trascritte da quel gene. Quelli eucariotici sono detti interrotti perchè sono formati daintroni e da esoni, dove i primi non codificano. Questi non hanno lunghezze standard. Il gene più grande èquello per la distrofina che è circa 2000 kbp. I geni interrotti consentono che si formino più proteine perchèci sono più messaggeri che si possono dipartire. Si prendono solo alcuni esoni per codificare una proteina: perciò, un gene più proteine (ecco perchè bastano 25000 geni). Questa possibilità di produrre più proteine per un gene è tipica del 60% dei geni.

Organizzazione genoma: i moduli funzionanti di cui sono costituite le proteine si trovano su singoli esoni osu blocchi di esoni e questo ha fatto sì che vi fossero molti rimescolamenti di domini durante l’evoluzione.

Un dominio è codificato da alcuni esoni di un gene. Il genoma non è statico: ecco perchè così tante proteinediverse.

DNA ripetitivo: denaturato il DNA aumentando la temperatura, si procede alla rinaturazione, raffrendando lasoluzione in cui si trova: la velocità di tale processo dipende dalla quantità di sequenze uguali, ovvero itelomeri.

Genoma mitocondriale: genoma diverso da quello nucleare e molto più piccolo. Le sue dimensioni sonocomunque varie. Le proteine codificate sono molto conservate (uguali tra specie diverse)

Genoma procariotico: esso si organizza in operoni, ovvero unità trascrizionali codificanti: un insieme di genicodificanti proteine posti consecutivamente e preceduti da un’unica sequenza regolatoria/promoter.


8/78

L’operone attiva o inibisce l’espressione genica. Negli eucarioti non ci sono perchè sono pluricellulari e i procarioti vivendo da soli devono svolgere più funzioni in tempi brevi a seconda della necessità.

Suddivisione del genoma: 900 Mb di geni e sequenze associate suddivisi in due:

- codificanti (90 Mb): molti dei geni eucariotici sono geni singoli, ma vi sono anche delle famiglie (globine,istoni rRNA)

- non codificanti (810 Mb): introni (senza una funzione importanti e non sono conservativi), pseudogeni(sequenze simili a quelle geniche, ma non più funzionanti; inattivati da mutazioni puntiformi oppure peropera di trascrittasi inversa molecole di RNA sono rielaborate e inserite così nel DNA, assomigliando a geni,ma avendo struttura di RNA maturo: assorbono le mutazioni ; altro tipo di pseudogeni sono geni la cuisequenza regolatoria è perduta e non possono più essere trascritti quindi) e regioni di controllo (sequenzeregolatorie come promoter che attivano la trascrizione).

2100 Mb di DNA extragenico (non conosciamo bene il suo ruolo) diviso in due:

- DNA unico e a basso numero di copie (1680 Mb)

- DNA ripetitivo (420 Mb): esso si suddivide ulteriormente in due gruppi:

>>>>> Ripetuto in tandem (sequenze ripetute, monotone e sono grossi raggruppamenti): minisatelliti (i piùcorti), microsatelliti e satelliti (i tratti più lunghi). Hanno una funzione ad oggi sconosciuta/inutile: sonoamplificazione di certe sequenze per errori in certi punti del DNA. Per trascrizione sfalsata: appaiamentisfalsati dei due filamenti che porta a delle ripetizioni. Essi accumulano mutazioni e sono diversificate perogni organismo. Sono usate per il riconoscimento proprio perchè ognuno di noi ha sequenze diverse da unaltro.

>>>>> Disperso (sequenze ripetute disperse per il genoma: come gli istoni): SINE (più corte: shortinterdisperded elements; esse danno origine alle Alu, sequenze tagliate dall’enzima specifico Alu I : sito ditaglio riconosciuto dall’endonucleasi), LINE (long interdisperded elements: più di 1000 nucleotidi) eretrosposoni (derivano e si comportano come i virus; sono molto mobili, il che aumenta la variabilità delgenoma)

COME AVVIENE LA TRASCRIZIONE

Trascrizione: essa si occupa di produrre tutti gli RNA necessari per la sintesi. Nei batteri, vista l’assenza dinucleo, ciò avviene mentre i ribosomi traducono già l’mRNA. La membrana nucleare degli eucarioti serve

proprio a dividere le due fasi: trascrizione e traduzione.

Traduzione: sintesi di polipeptidi grazie a mRNA e ribosomi.

Riconoscimento sequenza da copiare da parte dell’RNA: RNA riconosce il promoter da cui iniziare latrascrizione. Davanti al gene da trascrivere si ha un promoter che, identificato, porta l’RNA polimerasi acominciare la sintesi (trascrizione di RNA) in direzione 5’3’ . La prima molecola di RNA è detto primario

perchè è una copia perfetto del DNA (anche introni ed esoni). Aperti i due filamenti di DNA, l’RNA

polimerasi continua la trascrizione fino alla sequenza di termine in cui sono rilasciati il trascritto e la polimerasi. Tre fasi di trascrizione: inizio, elongazione e termine.

Inizio trascrizione: RNA polimerasi riconosce un segnale fatto di sequenze nucleotidiche molto affini. Un

promoter (sequenza di start) spesso contiene la “TATA box”, che possiedono sia procarioti sia eucarioti(corta sequenza, ricca di T e A, a 25 nucleotidi dalla posizione +1 negli eucarioti, ovvero posizione del primonucleotide da sintetizzare). Alla TATA si lega la polimerasi, senza attivare la trascrizione perchè servono


9/78

altri fattori. Essa è stata trovata riconoscendo che diversi geni conservavano tale sequenza a una distanzamolto simile dalla posizione +1. Sequenza come la TATA box sono sequenze di consenso. La sequenza promoter ha lunghezza varia a seconda del gene e per i procarioti sono più brevi (rispondono solo allo stimolattiva/inibisci) , ma per gli eucarioti sono più lunghi e rispondono ai più vari stimoli. La polimerasisolitamente per riconoscere il punto di inizio scorre tutto il DNA con un legame debole, finchè, trovata la

TATA box, formano un legame più forte e iniziano la trascrizione. Il 50% ha la TATA box, il restante 50% èaffidato a altre sequenze consenso.

RNA polimerasi: si occupa della trascrizione a partire da una molecola di DNA attaccandosi a una sequenza promoter. Trascrive solo una parte del DNA. Tale enzima nei procarioti è un complesso di più unità: una parte che si può staccare (fattore σ: assiste la lettura dei segnali nel DNA per sapere dove iniziare latrascrizione) e che si attacca al nucleo dell’enzima. Quando ciò avviene si ha un RNA polimerasi oloenzima:

ciò significa che è un enzima attivo pronto a riconoscere un promoter e a iniziare la sintesi. Sintetizzati i primi 10 nucleotidi, σ si stacca.

RNA polimerasi eucariotiche: vi sono tre tipi: la I per gli rRNA, la II per mRNA (codifica la maggior partedei geni) e la III per i tRNA, l’rRNA 5S e vari altri piccoli RNA. A seconda del tipo vi sono tipi diversi di

promoter. Importante è la polimerasi II che avviene in più tappe basandosi su più fattori. I fattori generali ditrascrizione aiutano la polimerasi a posizionarsi correttamente sul promotore, a separare i due filamenti diDNA e a far rilasciare la polimerasi. Essi svolgono ruoli simili al fattore sigma dei procarioti. A riconoscere per prima la TATA box ci pensa la TBP (tata binding protein) e la TFIID che provoca un ripiegamento delDNA. Poi si attaccano altri fattori in ordine: TFIIB, TFIIF, TFIIE e TFIIH (una delle più importanti: contieneDNA elicasi che consente l’esposizione del filamento; aggiunge gruppi fosfato alla coda dell’RNA

polimerasi (detta CTD) consentendo l’inizio della sintesi). Può poi succedere che vi siano fattori

trascrizionali specifici, riguardanti particolari geni. L’insieme di tutti questi fattori che si attaccano allasequenza promoter insieme all’RNA polimerasi forma il complesso di inizio.

Enhancer: Si possono trovare altri fattori trascrizionali dietro il gene, quindi fattori necessari per latrascrizione di geni a opera di RNA polimerasi II. Non sempre c’è questa sequenza. Esso è un tratto disequenza di DNA con fattori trascrizionali che agisce sulla polimerasi e con gli altri fattori la spinge atrascrivere da regioni che non stanno all’inizio, ma in fondo o a metà. Importante regolatore che può persinoessere ruotato senza perdere la sua funzione. Sono stati individuati per la prima volta nei virus.

Sequenze CIS e TRANS: le prime sono sequenze che agiscono in modo adiacente a TATA, mentre leseconde si muovono nel nucleo e agiscono anche a distanza. Un CIS trascrive solo un gene, mentre unTRANS si attacca a più CIS.

Controllo espressione genica: i fattori spingono alla trascrizione in modo preciso per quando e dove farlo.Partiti da un fibroblasto (cellula connettivale) e introducendo un Myo D, un fattore trascrizionale, si è vistoche il fibroblasto diventava una cellula muscolare. Una cellula per la sua attività dipende da fattoritrascrizionali.

Fase di elongazione: aggiunta di nucleotidi lungo l’intera sequenza di introni/esoni fino a trovare la fine.

Fine trascrizione: conosciamo come funziona per i procarioti, ma non sappiamo se è identica per glieucarioti. Si trovano comunque sequenze complementari tra loro che formano strutture a forcina. Queste due parti di forcina si sovrappongono: si crea un segnale che fa staccare la polimerasi. La coppia DNA-RNA ètenuto insieme da legami U-A, molto deboli, che grazie alla forcina si rompono e consentono il rilascio del

trscritto

Tipi di RNA: vi sono tre tipi diversi di RNA:


10/78

- mRNA: si trova in qualsiasi tipo cellulare (eucarioti e procarioti). Hanno una minor struttura secondariarispetto agli altri RNA: infatti ha pochi ripiegamenti, così da essere facilmente associabile e d’aiuto per la

sintesi. Nel filamento vi sono due estremità non codificanti: 5’UTR e 3’UTR. Queste si trovano prima e dopola zona da tradurre: infatti 5’UTR finisce con AUG (sequenza di inizio) e 3’ UTR inizia con UAG, UAA e

UGA (sequenze di terminazione). Si occupano di dare stabilità al filamento (lo proteggono dalle nucleasi, o

meglio RNAasi o ribonucleasi: esse idrolizzano i legami tra nucleotidi) e di effettuare la regolazione genica(solo in alcuni mRNA). Data la poca struttura secondaria gli mRNA sono molto instabili e hanno vita molto breve. La ragione per cui ciò avviene è perchè gli mRNA codificherebbero una continua produzione di proteine, anche quando queste ultime non fossero necessarie. Gli mRNA sono solo il 3% di RNA totale diuna cellula, data la loro instabilità. Una mutazione/errore nell’mRNA non produce danni gravi: un mRNAinfatti non si tramanda a cellule figlie e soprattutto sono molto numerosi

- tRNA: RNA di trasferimento/trasporto, indispensabile per la traduzione. Noi conosciamo circa 40 tipi ditRNA. E’ formato da uno stelo e da tre bracci.Il braccio opposto allo stelo è l’anticodone, una serie di 3nucleotidi che si legano con il codone complementare di un mRNA: CCA. Tutti i tRNA hanno CCA alla fine

dello stelo per legare un amminoacido. Per esempio, il tRNA della fenilalanina ha due bracci: uno ψ perchècontiene pseudouridina e l’altro D perchè contiene un’altra base, la diidrouridina. I tRNA sono lunghi da 79a 100 nucleotidi, ma molto conservati. L’attacco dell’amminoacido avviene tramite l’enzima amm inoacil-tRNA sintetasi. Prima di potersi legare l’amminoacido deve essere attivato e per questo serve AMP: si ha

adenilazione dell’amminoacido che consente il legame estere con il tRNA.

- rRNA: componente strutturale dei ribosomi, molto conservata. Il ribosoma è formato da due subunità che siappaiano. Nei batteri esso ha coefficiente di sedimentazione (non si basa solo sul peso, ma anche sullaforma) di 70S: una subunità grande di 50S con 34 proteine e 2 molecole di RNA (una di 23S e l’altra di 5S) e

la minore di 30S (21 proteine e RNA di 16S). Negli eucarioti il ribosoma è di 80S: la maggiore è 60S (tremolecole di RNA: una 28S, una 5,8S e l’altra 5S) e la minore è 40S (RNA di 18S e 80 proteine). I ribosomi

possono essere sul RER e associarsi ad un tRNA su cui è legato un mRNA o si possono trovare anche nelcitoplasma. Sono molto stabili, sintetizzano proteine e sono molto attivi (quasi mai sono inattivi: ovvero ledue subunità sono sempre attaccate; quando non sono attivi le subunità dei ribosomi sono separate).

CODICE GENETICO

Codice genetico: insieme di regole e di modalità per passare da mRNA con sequenza nucleotidica allasequenza amminoacidica di una proteina (da non confondere con il genoma che indica l’insieme delleinformazioni).

Meccanismo della traduzione: il del tRNA è quello di essere un adattatore: esso infatti attacca l’anticodone

all’mRNA e dall’altra parte l’amminoacido corrispondente. Il codice genetico afferma che a ogni tripletta(codone) corrisponde un amminoacido. Vi sono quindi, date le 4 basi azotate, 64 possibili combinazioni.

Decifrazione codice genetico: Il codice fu decifrato da Nirenberg e Matthaei. Usando messaggeri sintetici, partirono da una sequenza monotona: UUU UUU UUU (Poly U). Il peptide risultante era una polifenilalanina. Poi proseguirono con sequenze semplici di Poly A (visina), Poly C (prolina) e Poly G(glicina). Successivamente passarono a sequenze complesse: quindi, cominciarono con un Poly CAottenendo un’alternanza di treonina (ACA) e istidina (CAC). Fecero così per tutte le possibili combinazioni ele uniche triplette che non codificavano erano i codoni di stop: UAA, UAG e UGA.

Proprietà codice genetico: il codice genetico è degenerato: più codoni codificano per lo stesso amminoacido.

Questa caratteristica mette al riparo dalle mutazioni (varia spesso il terzo nucleotide, mentre il secondo e il primo sono via via più conservati: una variazione del terzo porta con minor probabilità a mutazioni). Un’altra proprietà è l’universalità: la corrispondenza triplette-amminoacido è universale (dimostrazione: si prende una


11/78

molecola di DNA e un ribosoma di un’altra cellula e si osserva che le proteine prodotte sono le stesse).

L’eccezione è quella del mitocondrio che ha 2 o 3 codoni che traducono un diverso amminoacido.

Come avviene la traduzione: avviene sui ribosomi con l’aiuto di vari fattori. Ha 3 fasi che si svolgono in 3modi diversi: inizio, elongazione e termine.

- Inizio: prima di tutto la cellula deve riconoscere sull’mRNA l’amminoacido da aggiungere. Nei procariotil’inizio è segnalato come sequenza consenso, dalla cosiddetta sequenza di Shine e Dalgarno (molto corta,

poco varia: AGG AGG U e poi AUG; la sintesi inizia con AUG che dà metionina, che poi può essereidrolizzata). Tale sequenza lega con l’rRNA 16S della subunità minore e con altri fattori si richiama lasubunità maggiore. Ad ogni modo trovato AUG si crea un legame più forte e comincia la sintesi. Neglieucarioti non si è trovata questa sequenza: l’inizio è trovato grazie a una modificazione chimica dell’mRNAe al suo cappuccio. A questo punto il tRNA si lega al ribosoma, alla subunità minore, dove trova AUG.Dopodichè si lega la subunità maggiore che ha 3 posizioni diverse: quello centrale con AUG è il sito P,quello verso 5’ è il sito E e quello verso 3’ il sito P. Si forma così il complesso di inizio che richiede idrolisi

di GTP.

- elongazione: si attaccano gli amminoacidi al peptide: ogni aggiunta ha bisogno di fattori di elongazione.Sul sito P si ha un tRNA con un peptide legato. Sul sito A è richiamato un altro tRNA con un codone che hagià un amminoacido sintetizzato: questo processo richiede di nuovo idrolisi di GTP. Si forma il legame

peptidico tra l’amminoacido del sito P e quello del sito A. Si ha poi traslocazione da P ad E di uno, da A a Pdell’altro. Il sito A accetta ora un nuovo codone.

- fine: è richiamato un fattore di rilascio della catena della catena che fa deassemblare mRNA e ribosoma.

Controllo: Un unico mRNA è letto da più ribosomi e un modo per fare un controllo è vedere la frequenza ditraduzione. Si ha una sequenza consenso su AUG, o almeno vicina, che garantisce un controllo (non su tutti

gli mRNA): lo si è notato per i legami più frequenti. Questa è la sequenza di Kozak che consente unamaggior frequenza di legame e quindi traduzione

Mutazioni: le mutazioni puntiformi sono alterazioni di uno o pochi nucleotidi. Vari tipi:

- sostituzione di un nucleotide con un altro: si può avere la codificazione di un altro amminoacido. Si ha unasostituzione Missense (cambia l’amminoacido codificato, ovvero solo 1 tripletta; conseguenze ancherilevanti: anemia falciforme; conseguenze anche minime) o una sostituzione Nonsense (si codifica uno stop;conseguenze più gravi: si ha o una proteina tronca o la mancanza della proteina necessaria).

- aggiunta di un nucleotide: provoca una cornice di lettura diversa che porta allo slittamento della lettura;

tutti codoni diversi a partire dalla mutazione in poi

-delezione: vedi sopra.

COSTO ENERGETICO

Costo di sintesi di una proteina: si tratta di reazioni accoppiate perché da una parte si accumula energia sottoforma di ATP e GDP e dall’altra se ne consuma. Si chiamano endoergoniche le reazioni che richiedono

energia, esoergoniche quelle che la rilasciano. Quindi le reazioni si dicono accoppite quando combinanoquesti due elementi. Ogni amminoacido aggiunto alla catena richiede 2 gruppi fosfato per legarel’amminoacido al tRNA, 1 per legare tRNA e ribosoma e 1 per la traslocazione. Ogni amminoacido sono 4

gruppi fosfato. Ecco perché è necessario un sistema di regolazione quantitativa: produrre proteine è moltodispendioso e perciò bisogna farlo con degli attenti controlli. Molti farmaci agiscono proprio sulla sintesi di proteine bloccandone la sintesi.


12/78

REGOLAZIONE GENICA

Liveli di controllo: i livelli di controllo sono dversi e numerosi in un gene eucariotico. Primo livello:controllo trascrizionale (tutte le informazioni dei geni: non tutte le informazioni sono trascritte, perchél’RNA polimerasi agisce solo sui geni attivati dai fattori trascrizionali). Secondo controllo: RNA processing

control (controllo per passare dal primario a mRNA maturo). Terzo controllo: trasporto RNA (siamo giàfuori dal nucleo). Quarto controllo: il messaggero è tradotto. Quinto controllo: degradazione di mRNA. Sestocontrollo: la cellula sceglie se attivare o meno le proteine appena sintetizzate.

Modificazioni post-trascrizionali di RNA: attraverso il processo di splicing si ottiene RNA maturo inveceche trascritto primario che aveva anche gli esoni, inutili per la trascrizione. Il trascritto primario forma quelloche per gli eucarioti si chiama hnRNA (RNA eterogeneo). Le prime prove trovate per dimostrare l’esistenza

degli introni sono state trovate attraverso ibridizzazione di mRNA da DNA sintetico: due molecole o più diacido nucleico sono denaturate per poi essere rinaturate. Dopo di ciò si notò che un mRNA rinaturato e ilDNA si legavano per complementarietà in alcuni punti, mentre altri rimanevano lontani perché non erano presenti nella molecola di mRNA maturo.

Splicing: unica modificazione valida per tutti gli RNA. Il primo messo in evidenza fu quello del gene diovalbumina di un pollo.si formano gli spliceosomi: punti di riduzione dell’RNA. Lo splicing avviene mentreil trascritto è già in fase di trascrizione. Gli scienziati hanno trovato piccolissimi sequenze segnale/consenso(all’inizio erano così delusi che pensavano non ci fossero perché troppo piccole) che consentono la

rimozione degli introni in punti perfetti e la saldatura tra due esoni consecutivi. Le sequenze conservateerano infatti solo GU a 5’ e AG a 3’: il primo è detto donatore, mentre il secondo accettore di splicing. Dopo

GU hanno trovato conservati alcuni nucleotidi (A/G AGU) , una sequenza dopo AG (U/C….N C/U) e a metà

un A sempre conservato detto punto di ramificazione.

Processo di splicing: intervengono le snRNP (small nuclear ribonucleocells) formate da proteine e RNA.Conosciamo le U1, U2, U4, U5 e U6. Sono formate da poche proteine e da molecole di mRNA complessate.Subito interviene U1 che riconosce il sito 5’ e U2 invece riconosce il sito di ramificazione rappresentato daA. Riconosciuti i due punti si forma la struttura a cappio dove U4, U5 e U6 formano insieme lo spliceosomacon anche U1 e U2. L’adenina della ramificazione viene riconosciuta e lo spliceosoma opera il taglio al 5’ eil primo nucleotide dell’istone tagliato si lega ad A. L’esone separato si attacca all’altro pezzo e l’introneviene rilasciato insieme alle snRNP. Vari nucleoni poi degradano l’introne. La degradazione è scatenata da,3’. Meccanismo di splicing così per ogni introne da rimuovere, ma avviene non in modo comsecutivo su

introni consecutivi (ha un suo ordine).

Splicing alternativo: dipende dal fatto che in molti casi a partire da un gene si possono produrre più splicing

su diversi introni. È stato dimostrato che se le sequenze consenso non sono attive perché mutate non si ha losplicing

Modificazioni sugli mRNA: aggiunta del cappuccio al 5’. Si crea un legame 5’ e 7-metilguanosina attraversoun trifosfato. Negli eucarioti il cappuccio svolge lo stesso compito della sequenza di Shine e Dalgarno. Oltrea consentire il riconoscimento del 5’, esso protegge dalle nucleasi. Un’altra modificazione è la coda di poli-A, sintetizzata dalla poli-A polimerasi (PAP). Tale enzima aggiunge molte A al 3’, con questa sequenzaconsenso detta CPSF, e che si trova 30 nucleotidi prima della sequenza di A, fatta così: AAUAAA. Prima ditutto si opera il taglio e poi PAP aggiunge 200 nucleotidi A all’estremità 3’ prodotta dal taglio. Questa

poliadenilazione stabilizza l’mRNA e serve per la sintesi proteica.

Esportazione mRNA dal nucleo: il meccanismo è selettivo, di modo che gli mRNA inappropriati non vadanonel citoplasma, ma siano degradati. Si esportano solo le molecole utili. Spesso si tende a purificare glimRNA per vedere quali hanno la coda di A o per vedere quanti non la hanno


13/78

Regolazione genica: negli eucarioti l’espressione genica selettiva permette di svolgere ruoli specializzati edavvienea più livelli; nei procarioti un’espressione selettiva consente il risparmio di energia e il controlloavviene soprattutto a livello trascrizionale (attivo/inibito).

Regolazione nei procarioti: vi sono i geni costitutivi (house keeping), sempre attivi e geni regolati in base al

fabbisogno. Per regolare gli enzimi vi sono vie cataboliche (distruzione) o anaboliche (sintesi) a repressionedel prodotto finale. I geni nei batteri sono sotto forma di un operone (geni diversi che servono a una viametabolica, ma che sono regolati da un’unica regione).

Lac operon: tipo di operone che ha meccanismi di controllo sia positivi (una proteina si lega e attiva i geni)sia negativi (quando la proteina si lega disattiva i geni). Nell’operone vi sono tre geni distinti: LacZ produce

β-galattosidasi (demolisce lattosio in glucosio e galattosio), LacY produce lattosio permeasi (fa passare illattosio attraverso la membrana cellulare) e Lac A produce transacetilasi (aggiunge gruppi acetili al lattosio).Essendo regolato da due meccanismi esso dipende dalla presenza di lattosio e dalla quantità di glucosio. Astudiarlo per primi furono Jacob e Monod che dimostrarono che l’operono è attivo quando c’è lattosio, ma è

assente glucosio (la cellula se presenti entrambi, preferisce il glucosio). I due dimostrarono che vi è un gene Ia monte dell’operone che produce in modo costitutivo il lac-repressor che ha affinità con una regione Odell’operone adiacente a LacZ. Quando il repressore è legato il sistema è spento: RNA polimerasi è impedita

dal legame del repressore e dal fatto che tale proteina gli si pari davanti. Se nel mezzo di coltura c’è lattoso,allora l’allolattoso lega il repressore che cambia configurazione e perde affinità staccandosi dall’operone. Il

lac-repressor agisce come controllo negativo: se lega blocca la sintesi (necessario sia se manca lattoso, sia seve n’è, ma c’è anche glucoso, più vantaggioso per la cellula). Invece, il controllo positivo lo fa CAP. Per

funzionare deve essere attivato tramite un AMP ciclico che porta al blocco cAMP-CAP. Quindi più glucosio,meno cAMP. Negli eucarioti si sono trovati pochi sistemi simili, per lo più a controllo positivo.

Operone trp: 5 geni diversi dipendenti da una sequenza regolatoria, regolata dal triptofano. È una via

biosintetica e ha funzionamento a repressione. Una sufficiente presenza di trp blocca l’attività dell’operone:infatti, si lega al repressore inibendo la sintesi.

Operone σ: ci sono batteri che in situazioni ambientali particolari necessitano di produrre alcune proteine.Queste proteine, dette Heat shock, sono sintetizzate solo in base alla regolazione dell’operone σ32.Solitamente, σ

32si trova in basse concentrazioni, ma l’alta temperatura della cellula spinge il batterio ad

aumentarne la produzione, o meglio, a interromperne la distruzione. Grazie all’attivazione di questo gene il batterio può mantenere invariata la sua struttura anche ad alte temperature.

Attivazione di proteina: spesso le proteine sono attivate tramite fosforilazione, con legami ad alta energia. Inaltri casi serve che un ligando si leghi alla proteina e solo così si ha regolazione attiva dell’espressione

genica. Un altro meccanismo è quello di agire come dimero: si aggiunge una seconda subunità in modo chesi abbia attivazione della regolazione genica. Un altro caso di attivazione è legato alla presenza di uninibitore, che una volta rilasciato consente al fattore di attivarsi. Ancora un altro modo: la proteina entra nelnucleo e così si attiva (nel citosol era inattiva).

Bloccare la sintesi: vi possono essere situazioni in cui vi sono più repressori e più attivatori. In questasituazione dipende tutto da quale dei due riesce a prevalere. Più repressori si blocca la sintesi; più attivatori,la sintesi si attiva. Due siti e su uno un repressore, sull’altro un attivatore: prevale il repressore. Tuttodipende dalla concentrazione e dalla quantità: sono indipendenti l’uno dall’altro.

Isolatore: gli enhancer solitamente contribuiscono all’attività di geni distanti, ma se si trova nei paraggi

l’enhancer può funzionare anche su quel gene. Esistono allora sul DNA degli isolatori, elementi frapposti fraun gene e un enhancer per ostacolare l’influenza dell’enhancer su quel gene. Gli isolatori funzionano sulla


14/78

cromatina, ovvero il DNA quando è avvolto sui nucleosomi. Agisce sull’eucromatina (poco condensata eattiva) e non sull’eterocromatina (molto condensata e silente).

Clusters e LCR globina: vedi http://www.treccani.it/enciclopedia/globina/

Sequenze cis e trans: Le sequenze cis sono sequenze di DNA che regolano in positivo o negativol'espressione di un gene, trans sono le proteine (codificate da un altro gene) che si legano alla sequenza cis.In genere quindi una sequenza che funziona in trans vuol dire che il prodotto genico di quella sequenza va aregolare l'espressione di un'altra sequenza, mentre cis non sono altro che sequenze promotrici .

Modi intervento fattori trascrizionali: secondo il modello di Watson e Crick il DNA è a doppia elica e ha unsolco minore e uno maggiore. Molti fattori hanno affinità col maggiore. Legatosi a un fattore, il DNA cambiaforma, si ripiega... I fattori/proteine regolatrici hanno motivi strutturali differenti che riconoscono specifichesequenze di DNA. Ecco i principali:

- elica-giro-elica: costituito da due alfa-eliche unite da una corta catena di amminoacidi. Ad esempio il trp

repressore o il frammento CAP- omeodominio: forma 3 alfa-eliche, sequenza di 60 amminoacidi, si occupa di fattori trascrizionali alla basedello sviluppo

- a dita di zinco: un gruppo di amminoacidi conservati lega un atomo di zinco; allo zinco si legano semprecon una struttra ad alfa-elica da una parte e un foglietto- beta dall’altra. Al DNA si legano con l’alfa-elica,creando un tratto continuo lungo il DNA

- a cerniera di leucine: due alfa-eliche che interagiscono tra loro e che sono tenute insieme dalle leucine. Esseagiscono a cavallo del solco maggiore. Si può parlare di omodimeri o eterodimeri, a seconda che le duesubunità della proteina regolatrice siano identiche o meno. Questo può già accadere per il legame a cernieradi leucine. Per esempio AP-1 è un eterodimero, anche Fos-Jun.

- HLH (elica-ansa-elica): una breve alfa-elica unita da un’ansa a una seconda alfa-elica più lunga. Peresempio Myo D.

RNA editing: modificazione di RNA non molto esteso. Modifica in modo stabile uno o pochi nucleotididell’RNA. Nell’uomo può avvenire una modificazione minima. Cioè: da un codone del fegato CAA si ha

una proteina, mentre con editing in UAA si passa a una proteina diversa nell’intestino. Molto frequente neimitocondri. A codificare il cambiamento ci pensano gli RNA guida (40-80 nucleotidi), che hannoun’estremità 5’ complementare alla sequenza di un’estremità della regione di un trascritto da modificare,

seguita dalla sequenza che porta i nucleotidi da inserire per la modifica. Questa variazione e la lettura di unoo l’altro promotore portano a una trascrizione diversa.

Proteine allosteriche: Proteina funzionale formata dall'unione di più subunità uguali o di tipo diverso(protomeri), soggetta a regolazione allosterica. Tale regolazione è basata sul legame reversibile di piccolemolecole specifiche, dette effettori allosterici, in siti particolari di tali proteine (siti alloserici), diversi dal sitoattivo; tali combinazioni modificano i rapporti spaziali tra le subunità e quindi il comportamento dell'interamolecola. Una tipica proteina allosterica è l'emoglobina

Metabolismo del ferro: il ferro è molto importante e i suoi livelli nell’uomo vanno ampiamente regolati.(troppo alto: effetti tossici, troppo bassi: anemia). Vi sono pertanto delle proteine regolatrici, soprattutto laferritina, di cui ve ne sono più tipi, necessaria per immagazzinare il ferro. Il messaggero ha una particolarità:la sua struttura secondaria si forma per parziale complementarietà al 5’ UTR. Quando vi è poco ferro,l’aconitasi rimane legata al 5’UTR e impedisce la sintesi di ferritina. In caso di eccesso, il ferro agisce

sull’aconitasi che si stacca e consente la sintesi di ferritina. Si parla di proteina allosterica. Per regolare il


15/78

ferro vi è anche il recettore della transferrina, proteina per il trasporto del ferro. In questo caso al 3’ si lega

l’aconitasi, che invece che ostacolare la sintesi, stabilizza il recettore e consente la sintesi di transferrina. Con poco ferro il recettore è attivo perchè serve per recuperare più ferro possibile, un eccesso di ferro fa staccarel’aconitasi, ma in questo caso, tale situazione destabilizza la struttura che si degrada e blocca la sintesi.

DANNO E RIPARAZIONE DEL DNA

Mutazioni: a mutare il DNA intervengono più fattori, sia naturali, sia non naturali. Vi è il decadimento alfa(pericolose soprattutto se ingerite), raggi beta e gamma (associati a tragedie nucleari), raggi cosmici chearrivano dallo spazio e raggi UV, agenti intercalanti e raggi X. Una mutazione è un cambiamento nellasequenza del DNA che se non è riparato può danneggiare il DNA filiale. Possono essere di diverso tipo:silenti (non alterano la sequenza amminoacidica: codificano la stessa proteina), non-senso (codificano uncodon di stop), missenso (mutazioni puntiformi con sostituzione di amminoacidi e perdita/compromissionedelle funzioni della proteina), delezione e inserzione/duplicazione. Sono spesso esposti alla mutazione imicrosatelliti, che data la loro ripetitività possono causare problemi alla DNA polimerasi che subisce ilfenomeno di slippage, cioè un cattivo appaiamento dei due filamenti.

Mutazioni silenti: nella maggioranza dei casi le mutazioni risultano essere silenti: esse avvengono in un geneche controlla la sintesi di una proteina non indispensabile; il gene mutato non si esprime (zone introniche);la mutazione forma una tripletta che codifica per lo stesso aminoacido della tripletta originaria (questo puo’ avvenire perchè il codice genetico è degenerato cioè sovrabbondante e lo stesso aminoacido è codificato dadiverse triplette); la mutazione viene soppressa da un’ altra mutazione; l’ aminoacido mutante non altera lafunzionalità della proteina.

Tipi di danno: I danni possono portare alla rottura del singolo filamento (SSB), del doppio filamento (DSB) eanche dei ponti di collegamento e danneggiare le basi o i nucleotidi. Il danno endogeno coinvolge la struttura primaria piuttosto che la struttura secondaria della doppia elica. Esso può essere suddiviso in quattro classidal punto di vista chimico:ossidazione di basi, alchilazione di basi (generalmente metilazione), idrolisi di basi, come la depurinazione e la depirimidinazione (spesso la deaminazione di citosina che diventa uracile:La deaminazione produce basi non-naturali che possono essere riconosciute, con una eccezione: la 5-metil-citosina (la sequenza CGTG), mismatch (appaiamento errato) di basi. Il DNA è più soggetto a mutazione perchè il nucleo è quasi 100 volte più radiosensibile del citoplasma. Se la radiazione è eccessiva, tuttavia, siha morte cellulare.

Modi di riparazione: riparazione totalenessun dannovita ; riparazione tendente a erroremutazioneletale o meno (dipende dal tipo)neoplasie ; nessuna riparazionedanno letalemorte cellulare.

Tipi di riparazione: vi sono diversi meccanismi di riparazione:- correzione diretta: essa avviene per fotoriattivazione. Le UV possono dare dimeri di pirimidine (con legamecovalente tra due pirimidine adiacenti: mutazione). Interviene la DNA fotoliasi che rompe i legami tra le due basi adiacenti attraverso la luce

- meccanismo di escissione: rimuovono il nucleotide danneggiato sostituendolo con un nucleotide nondanneggiato complementare al nucleotide presente nel DNA non danneggiato. Questi comprendono:

- Riparazione per escissione di base (Base Excision Repair, o BER) che ripara il danno che coinvolge unsingolo nucleotide, causato da ossidazione,alchilazione, idrolisi, oppure deaminazione; il meccanismoenzimatico parte dall'attivazione di una DNA-glicosidasi che riconosce la base alterata e rompe il legame N-glicosidico (si ha un forte ripiegamento del DNA in modo che la base sbagliata salti via), poi una AP-endonucleasi 1 (AP: sito a-purinico) elimina la base azotata, lasciando il fosfato e il deossiribosio; ancora,una liasi toglie fosfato e zucchero così che una DNA-polimerasi leghi il nuovo nucleotide e la ligasi lo


16/78

incorpori nel filamento. Il BER quindi può riparare la de-aminazione della Citosina in Uracile o latrasformazione della Guanina in 8-oxo-guanina, analogo dell'adenina. Si parla di short patch repair quando sirimuove solo una base per la riparazione e long patch se si rimuovono da 2 a 10 basi per eliminare l’errore.

- Riparazione per escissione di nucleotidi (Nucleotide Excision Repair, o NER), che ripara un danno che

coinvolge filamenti lunghi da 2 a 30 nucleotidi. Questi includono danni da voluminosa distorsione dell'elica,quali i dimeri di timina causati da luce UV, come pure le rotture di un singolo filamento. La sequenzaenzimatica è: XPA (endonucleasi) che riconosce il sito da riparare, XPB e XPD (elicasi) che srotolano l'elica,XPG e XPF (endonucleasi) che tagliano ed eliminano il nucleotide, DNA-polimerasi che aggiunge il nuovonucleotide, ligasi che "ricuce" il filamento riparato. Una forma specializzata di NER nota come riparazioneassociata alla trascrizione (Transcription-Coupled Repair, o TCR) dispiega enzimi NER ad alta priorità pergeni che sono attivamente trascritti. Lo xeroderma pigmentoso porta a danni a lesioni cutanee a causadell’esposizione ai raggi UV, a un numero elevato di tumori cutanei: la cura è l’uso di creme con enzimi di

riparazione. Lo studio è avvenuto prima su E.coli dove gli enzimi si chiamano Uvr-A e così via: UvrA-UvrBcercano distorsioni del DNA; UvrB fonde il DNA e recluta UvrC che taglia il DNA 8 nt a monte e 4 nt a

valle; l’elicasi UvrD toglie il frammento tagliato; poi: DNA Pol I, ligasi.- Mismatch Repair (MMR), che corregge errori di replicazione e di ricombinazione genetica che determinanola formazione di nucleotidi male appaiati in seguito alla replicazione del DNA (viene inserita una basesbagliata). Gli enzimi coinvolti e studiati in E. Coli sono: MutS (crea una forte distorsione nel punto conmismatch), che riconosce il mismatch e vi si lega; MutL, attivato dal complesso DNA-MutS, che attiva a suavolta MutH, che insieme ad una endonucleasi taglia il frammento contenente il mismatch, dopo che la elicasiha aperto la doppia elica, così che la DNA-polimerasi possa aggiungere il frammento opportuno e la ligasiunire gli estremi dei due filamenti. I corrispettivi umani di tali enzimi sono: MSH6 e MSH2 (per MutS);MLH1 e PMS2 (per MutL). Di questi quelli generalmente mutati e coinvolti nella cancerogenesi sono ilMSH2 e MLH1 (v. ad esempio la sindrome del carcinoma del colon-retto non poliposico HNPCC).

Riconoscimento filamento da riparare: essa avviene per metilazione della A nella sequenza CTAG ad operadella Dam metilasi. MutS, infatti, si lega al filamento non metilato. Gli eucarioti hanno omologhi di Mut(s)con più alta specificità (per mismatch, indels etc), non hanno Dam Metilasi, riconoscono il filamento stampodalle incisioni dei frammenti di Okasaki. Sono associate allo sliding clamp (una serie di proteine cheassolvono la funzione di fattori di promozione o di fattori di processamento nella replicazione del DNA.Queste proteine mantengono le DNA polimerasi agganciate al filamento di DNA da replicare, con unmodello di funzionamento che viene definito a pinza scorrevole). Mutazioni dei geni predispongono aitumori.

SSB e DSB: nel primo caso si ha una riparazione esente da errore a velocità esponenziale, attraverso

asportazione. La riparazione dipende dalla temperatura (non avviene a zero gradi). In caso di non riparazionedi SSB si può arrivare a DSB (double strand break): si asporta per endonucleasi il tratto di DNAdanneggiato, poi si rimuove l’errore e si riprende la sintesi. Come le SSB, le DSB sono riparate in modo

efficace (danni al DNA influenzano il ciclo cellulare: il DSB non omologo si ha in G0 e G1, quello omologoin fase S : un errore rallenta il ciclo). In E. coli il sistema di riparazione dei double stand breaks (DSB) è ilsistema RecBCD. Il complesso si lega a DSB, ha attività elicasica e nucleasica e taglia entrambi i filamenti.Quando raggiunge un sito chi (Cross-over Hotspot Instigator, CHI) digerisce solo con polarità 5’-3’

producendo una coda 3’. Il DNA senza siti viene digerito completamente. RecA si lega al 3’- la proteina chescambia filamento. RecA copre il 3’ in maniera cooperativa e catalizza l’appaiamento con il DNA omologo. Negli eucarioti un tipo di RecA è Rad51 ed è modello per la ricerca del filamento omologo e utile per la

formazione della molecola giuntata. Vi sono diversi meccanismi di riparazione delle DSB:


17/78

- In caso di rottura del doppio filamento Non-homologous end-joining (NHEJ) lega terminazioni piatte. Lo sitrova in meccanismi di riparazione e di ricombinazione (come la ricombinazione delle immunoglobuline).The NHEJ pathway può ligare le estremità piatte del DNAduplex. Mutazioni del NHEJ pathway causanomalattie.

-Ricombinazione omologa: La ricombinazione omologa è coinvolta nel crossing over durante la meiosi,recuperare sequenze perse per danni al DNA, per far ripartire forche replicative danneggiate, può regolarel’espressione di alcuni geni, produzione di animali Knock-out. Avviene tra sequenze del tutto corrispondenti.La ricombinazione permette di separare i vari geni nel genoma e di separare le mutazioni favorevoli daquelle sfavorevoli. Le ricombinazioni avvengono tra sequenze che corrispondono perfettamente, così da non perdere nessuna base dal cromosoma ricombinante. La frequenza non è costante ma varia con effetti globalie locali. Avviene 2 volte più frequentemente nella femmina che nel maschio. Dipende dalla struttura delcromosoma ed il crossing-over non avviene in vicinanza di regioni condensate delle cromatina. Il processo ècatalizzato da vari enzimi: presinapsi (elicasi e/o nucleasi per generare DNA a singolo filamento con 3’-OHfinale (RecBCD); sinapsi: molecola di collegamento per formare una Holliday juncture (RecA); postsinapsi:

branch migration e risoluzione della Holliday juncture (RuvABC).- Se il DSB si realizza tra sequenze ripetute, si attiva un particolare meccanismo di HR noto come SSA,single strand annealing. In questo caso la degradazione delle estremità danneggiate in direzione 5’3’ portaa esporre regioni di ssDNA complementari (proprio perché appartengono a repeats) che possono appaiarsi traloro. Le code di ssDNA che non si appaiano vengono rimosse da alcune nucleasi; i gaps e i nicks che sivengono a formare sono poi riempiti da tramite una successiva sintesi riparativa e ligazione.

Processo ricombinazione: questi sono i diversi passaggi:

- allineamento di due molecole di DNA omologhe

- Introduzione di rotture del DNA: Lo scambio genetico solitamente inizia con un taglio del double strand: ilDNA ricevente si taglia. Esonucleasi agiscono e liberano un 3’. Questo invade il DNA omologo e si estende.Si forma un D-loop. Il D loop si estende e si annila al DNA ricevente, e viene ricopiato. Ci sono, dunque,due regioni unite e il DNA del donatore ha sostituito quello dell’accettore.

- Formazione di una corta regione di appaiamento (invasione del filamento e formazione della Holliday junction): I DNA si appaiano, si ha un taglio ai siti corrispondenti, le terminazioni libere si complementanoall’altro duplex: Joint molecule, e recombinant joint. Il sito di ricombinazione: DNA ibrido o heteroduplex.Esso migra e deve essere catalizzato da enzimi. La joint molecule deve essere risolta da due tagli. Se esso èsullo stesso strand si ottiene una zona heteroduplex: patch recombinant, se è sull’altro strand, tutti gli strand

sono stati tagliati e si ha ricombinazione: splice recombinant. In caso si ha una regione di heteroduplex. Lacomplementarietà è a livello dei single strand. Essi sono accessibili dopo rottura del DNA. Uno strandspiazza (invade) quello corrispondente dell’altro duplex e i due duplex rimangono fisicamente uniti

- Movimento della Holliday Junction - branch migration: la giunzione può migrare in entrambe le direzioni.RuvAB riconosce la giunzione di Holliday e ne promuove la migrazione: RuvA è un tetramero, RuvB unesamero con attività ATPasica e RuvC è una resolvasi che risolve il complesso tagliando in una delle duedirezioni

- Taglio della giunzione: risoluzione. La risoluzione della giunzione di Holliday dà luogo a ricombinanticonvenzionali o recombinant patches in base allo strand che è tagliato.

Ricombinazione negli eucarioti: nei procarioti la ricombinazione omologa serve per riparare le rotture deldsDNA, permettere alle forche bloccate di ripartire e ricombinare con DNA fagico o di coniugazione. Negli


18/78

eucarioti è anche necessaria per la meiosi per l’appaiamento dei cromosomi omologhi e la ricombinazionemeiotica.

Esempi medici di errori di controllo: ecco qui diversi casi:

- cancro al colon: è un tipo di cancro causato da un’incontrollata crescita di cellule anomale nel colon, nelretto o nell’appendice. Negli USA vi è un caso ogni 1800 persone ogni anno. Errori nella riparazione di un

mismatch portano al cancro ereditario non poliposico del colon-retto (HNPCC). È la forma più comune dicancro ereditario.

-glioblastoma: è la forma più comune di tumore primario al cervello. Colpisce 2-3 persone su 100000 ognianno e solitamente si parla di 3-4 mesi di sopravvivenza senza un trattamento. Solitamente si opera conun’asportazione chirurgica, la radioterapia e la chemioterapia per arrivare a 14,6 mesi. Serve trovare agentiradiosensitive che aumentino l’efficacia della radioterapia. L’attività del tumore causata dalla ionizzazionedelle radiazioni è strettamente legata al suo effetto sul DNA (DSB). Nel futuro: agenti FDA-approvatimodulano le proteine critiche nella risposta/riparazione al danno del DNA; si avrà una terapia personalizzata

(a seconda di quale DDR pathway viene alterata)

-leucemia: cancro del sangue o del midollo osseo o del sistema linfatico caratterizzato da un anormaleincremento di cellule immature bianche del sangue dette blasti. Nel 200 circa 256000 persone tra bambini eadulti sono stati colpiti dalla leucemia e 209000 di loro sono morti. I più giovani sono affetti da acuta e gliadulti da cronica. Come gli altri cancri deriva da mutazioni nel DNA: alcune mutazioni possono provocare laleucemia attivando oncogeni o deattivando dei geni tumore-repressori, perturbando la regolazione dellamorte cellulare, della sua differenziazione e della sua divisione. Queste mutazioni possono capitarespontaneamente o essere risultato di un esposizione a radiazioni o a sostanze cancerogene.

Strategie anti-cancro: ostacolando il meccanismo di riparazione del DNA si possono avere ottimi risultati: il

cisplatino, usato nella chemioterapia, interferisce con i normali processi cellulare causando lesioni al DNAche portano all’intervento dei sistemi di riparazione, liberandosi anche delle cellule del cancro. Tuttavia,alcune cellule possono sviluppare polimerasi che consentono di resistere al cisplatino e sfuggono allariparazione.

Riparazione del DNA e invecchiamento: tartarughe a confronto con l’uomo e altri mammiferi. Questimeccanismi dipendono dal metabolismo, dalla senescenza cellulare e dalla genetica (un danno del DNAcausa alle cellule l’impossibilità di dividersi o indurre l’apoptosi, spesso colpendo i pool delle cellule

staminali e quindi ostacolando la rigenerazione: si ha un accumulo di errori come conseguenza di probleminel sistema di riparazione).

TRANSGENESI

Transgenico: animale in cui è stato introdotto o modificato un gene. Lo sviluppo di questa tecnologia sta portando alla cura di varie malattie. Lo si fa sui topi, perchè con l’uomo sarebbe rischioso e perchè coi topivi è il 90% di geni in comune (le differenze nascono dai diversi meccanismi di controllo).

Inserimento DNA estraneo: l’evento più frequente quando si ha introduzione di DNA esterno è ladegenerazione di tale DNA. Si ha un meccanismo di difesa molto importante quindi. Quando, invece, ilDNA estraneo riesce a integrarsi si può avere come singola copia o più frequentemente con catameri, ovveroinserzioni multiple. In altri casi si ha ricombinazione omologa: il DNA genomico ha con il DNA esogenogrande identità di sequenza alle estremità dell’esogeno, mentre è diversa la sequenza all’interno. Si ha,dunque, lo scambio tra le due parti differenti e, poi, quello rimasto viene espulso.


19/78

Inserzione casuale con catameri: tecnica più semplice e efficiente. Si opera su cellule uovo fecondate, sottomicroscopio. Si usa un capillare appuntito, cavo all’interno, contenente DNA esogeno che viene introdotto

nella cellula uovo fecondata. A tenere ferma la cellula uovo ci pensa un altro capillare cavo più grosso. IlDNA da inserire deve avere tutti gli elementi di un DNA eucariotico: un promoter (con sequenze CIS efattori trascrizionali), esoni, almeno un introne (se non c’è, durante lo splicing l’RNA è degradato perchè

poco stabile) e un segnale di Poly-A. Fatta la microiniezione, l’ovocita è impiantato in topine pronte per lagravidanza e dopo 20 giorni si ottengono dei topi, di cui alcuni saranno eterozigoti per il transgene. Questi(detti fondatori) sono combinati tra loro per generare via via con le generazioni successive topi omozigoti peril transgene. Si è utilizzata tale tecnica non solo per vedere il ruolo di alcuni geni nelle malattie (inibendo oattivandoli) per poi poter sviluppare una cura, ma anche per cercare di capire dove agiscono nel corpo alcunesequenze regolatrici. Utilizzando dei geni reporter (gene la cui attività è facilmente monitorabile medianteistochimica o metodi immunologici; esso codifica per un prodotto genico che può essere utilizzato perstudiare l’attività di sequenze regolatrici di un altro gene di interesse) si sono studiate diverse sequenze. Peresempio:

- beta-galattosidasi: quando il promoter è attivo Lac-Z produce β-gal che grazie al suo legame con unasubunità dà una certa colorazione. Questo ha permesso di vedere dove agisce Lac-Z. Tecnica sviluppata siasull’animale sia in vitro: la differenza è che nel secondo caso si esamina solo un tipo cellulare, mentre nel

primo si considera l’animale nel completo.

- GFP: grazie alla sua reazione con gli UV essa dove è presente dà fluorescenza. La si è utilizzata in uncelebre esperimento per vedere in un topo una fluorescenza ubiquitaria. Molto usato come gene reporter perle staminali, perchè consente di vederle meglio.

Il limite di questa tecnica è che il DNA esogeno si può integrare a caso. Può capitare dunque che non ci sia la possibilità di studiare il gene che ci interessa. Varie possibilità: può alterare un gene causando la distruzione

di un altro gene endogeno, inserirsi in un telomero, in un promoter (il gene transgenico sarà regolato da tale promoter o inibirà il promoter), in una regione silente (il caso più frequente), nelle vicinanza di un isolatore.Un transgene va, infatti, studiato su un minimo di 3 individui per verificare se quella è la reale espressionedel transgene.

Riconoscimento topi con transgene: molto utilizzata è la tecnica del Southern Blot che sfrutta l’ibridazionedel DNA e l’utilizzo di una sonda che a seconda del legame che crea con il DNA rivela se tale molecolaeffettivamente transgenica o meno.

Gene targeting e topi knock-out: sono usate poche specie per questa tecnica che risulta anche piuttostocomplessa. Attraverso una ricombinazione omologa si sostituisce una sequenza con un’altra. Si gener ano

così topi knock-out dove un gene è inattivato (knocked-out). Ha avuto un risultato inatteso spesso perchèinattivando un gene, tuttavia non si poteva osservare il topo crescere senza l’attività di quel gene, perchè

intervenivano altri geni a occuparsi della sua funzione: grande scoperta perchè si ha un ottimo meccanismodi difesa, ma la cosa complica la ricerca. La ricombinazione omologa in natura è piuttosto rara, ma avviene proprio come un crossing-over. Molto più frequente nelle cellule embrionali pluripotenti. L’approccio fainattivare vari geni e si osserva una mutazione nel genoma dell’animale. Si prelevano le cellule pluripotentidai blastocisti (cellula fecondata dopo 3,5 giorni). Dopo poche ore ciascuna cellula ha un suo percorso.Vengono messe in coltura sopra altre cellule, un tappeto confluente di fibroblasti che non proliferano più, masono vive e scambiano con le pluripotenti dei fattori in modo da mantenere vive le ES (cellule embrionalistaminali). La legge vieta per motivi etici l’uso di ES, ma ora si usano le cellule pluripotenti sviluppate con la

ricerca di Yamanaka (cellule adulte rese pluripotenti). Le ES coltivate sono poi prelevate e introdotte in una blastula da cui si genereranno dei topi con ricombinazione omologa. Di solito si usano blastule di topi a pelonero che impiantate in topi da pelo bianco danno come risultato topi chimerici: in parte derivano dalle ES, in


20/78

parte dai genitori. Per questa ragione, anche per questa tecnica, per vedere i topi completamente dipendentidalle ES si ricombinano gli eterozigoti in modo da avere topi del tutto neri.

Meccanismo di ricombinazione: per aggiungere il gene che si desidera si fa shock elettrico, con cui si creano buchi nella membrana cellulare, che consentono il passaggio del transgene. La maggior parte è degradata, ma

una parte si riesce a inserire nel DNA. Bisogna, però, riuscire a riconoscere i topi che hanno subitoricombinazione omloga. Prima di tutto attraverso la neomicina (antibiotico a cui resistono solo quelli con iltransgene) separo gli individui che hanno il trangene da quelli che non lo hanno. Poi, si deve fare unaseconda selezione che consenta di vedere in quali topi i geni hanno avuto ricombinazione omologa e in qualisi sono insertiti casualmente. Si effettua pertanto ibridazione del genoma e poi si usa una sonda contenenteframmenti di DNA e neomicina: il DNA deve contenere un tratto che sia in grado di riconoscere solo dove siè avuto il gene targeting. A questo punto, riconosciuto dove si è avuto il gene targeting, le si iniettano nella blastula di una topina e si generano dei topi eterozigoti.

MiRNA: la loro presenza è stata chiarita con il sequenziamento del genoma, nella zona in cui vi è pococontenuto genico e non si arriva a trascrizione. I miRNA sono piccoli frammenti di RNA altamente regolati e

sintetizzati in tessuti specifici durante lo sviluppo embrionale. Trascritti nel nucleo, modificati da complessi proteici e dopo che il Drosha (enzima) li ha tagliati in una sequenza più piccola, interviene il Dicer che tagliain tratti di 20 nucleotidi che poi si complementano in modo specifico con l’mRNA. Si appaiano al 3’ di un

mRNA. A questo punto vi sono due possibilità dipendenti dall’appaiamento:

- se è esteso: portano gli mRNA a contatto con le nucleasi distruttive

- se meno esteso: si blocca la traduzione o si forma un complesso proteico che consente l’inserimento dinucleasi.

SiRNA: sono gli RNA silenziatori. A differenza dei miRNA che possono agire su diversi mRNA e

coordinare l’espressione di più geni i siRNA agiscono solo per perfetta complementarietà e per questoagiscono su un solo mRNA. Anch’essi inibiscono la traduzione.

Transgenici:il DNA è iniettato nel pronucleo dell’ovocita fertilizzato e integrato in maniera random (nel 10%dei casi distrugge un gene importante per lo sviluppo normale) e in multiple copie

Knock-out: Il DNA è iniettato prima nella cellula embrionalestaminale (ES). L’ES che ha integrato il DNAin maniera sito specifica (omologa) è identificata e iniettata in un embrione di 3.5 giorni (blastocisti)

Applicazioni: Analisi in vivo di specifiche funzioni di geni tramite l’inattivazione specifica: analisi dispecifiche proteine tramite l’inserzione di specifiche mutazioni e produzione di modelli murini che

riproducano patologie umane.

Il topo anti-cancro: questo topo per una fortunata mutazione ha ricevuto un sistema immunitario che uccidele cellule del cancro con efficacia ed è addirittura in grado con delle trasfusioni di sangue di aiutare altri topi.Per le terapie di cura del cancro è necessario studiare il percorso evolutivo della malattia.

Tumore alla prostata: è un mix eterogeneo. Vi sono cellule androgeno-dipendenti e altre indipendenti. Le prime si curano per apoptosi rimuovendo l’androgeno, mentre le altre sono resistenti a questa apoptosi. Serve pertanto trovare geni che inducano l’apoptosi nelle cellule del cancro. Il gene Par -4 provoca come rispostal’apoptosi nelle cellule cancerogene della prostata. Viene identificato come un gene apoptotico che dipendenella sua misura dall’elevata concentrazione di Ca2+ . Nell’uomo esso si colloca nel cromosoma 12q12. Il

gene comprende 7 esoni, 6 introni per circa 99 kb di DNA. Questo gene si è conservato in tutti i vertebrati econ l’uomo vi è un riscontro del 75%. Tuttavia i domini delle proteine di alta importanza sono conservate

con il 100% di uguaglianza fra topo, ratto e uomo. Domini: vi sono due zone supposte in cui si trovano le


21/78

sequenze (NLS1 e NLS2); vi è un dominio a cerniera di leucine nella regione terminale C e siti consenso perfosforilazione da chinasi PKA e PKC. I domini sono importanti nella regolazione, localizzazione,dimerizzazione e modificazione post-trascrizionale della proteina Par-4.

Par-4: è un tumore-repressore e ha un’azione che provoca apoptosi. Inoltre, Par-4 intracellulare e proteine

secrete danno la possibilità di uccidere in modo molto selettivo solo le cellule del cancro. Il recettore per la proteina prodotta dal gene Par-4 sulla superficie si chiama GRP78. È dimostrato che nei topi transgenici conPar-4 vi è un gran numero di tali proteine nel siero. Importantissimo in questo gene il SAC domain: essorappresenta la minima funzione proapoptotica del gene Par-4 che, tuttavia, induce selettivamente la mortenelle cellule del cancro, ma non in quelle normali. Si è osservato come potesse influire un’espressione del

SAC domain nel corso della vita di un topo e che livelli fisiologici fossero necessari per soddisfare lafunzione tumore-repressiva. I topi vivono regolarmente con tale dominio e con la crescita restano resistenti aitumori. Un frammento di DNA contenente il dominio SAC è stato generato da PCR usando Par-4cDNAcome stampo, grazie all’intervento di molti altri fattori. Le sequenze risultanti da tali vettori, purificate, sonoiniettate nei pronuclei di embrioni fertilizzati B6C3F1 (marroni). I topi transgenici per il dominio SAC

mostrano un espressione di tale gene ubiquitaria e una normale fertilità, vita e invecchiamento: addiritturariescono a vivere più a lungo.

Topo di Schwarzenegger : grande forza grazie a knockout di miostatina. Questo è fortuitamente accadutonegli uomini e nei bovini (supermucche). La miostatina è un fattore di crescita (anche il fattore-8 didifferenziamento nella crescita detto GDF-8) che ha un ruolo importante nello sviluppo muscolare (famigliadei TGFb). La miostatina è espressa negli stadi successivi dello sviluppo del topo e nello sviluppo di alcunimuscoli scheletrici. Con il KO di miostatina si accresce la miogenesi e si diminuisce la adipogenesi,anche seentrambi si generano dallo stesso mesenchima (tessuto embrionale connettivo). Gli inibitori di miostatinadovrebbero aiutare a migliorare le condizioni di chi soffre di distrofia.

Topo giallo: sindrome di Crigler-Najjar (ittero). I sintomi sono causati dalla bilirubina. È un pigmento della bile, liposolubile ed è un prodotto del metabolismo del gruppo eme. Una volta che eme si ossida si forma biliverdina, che ridottasi dà bilirubina che entra nel sangue. Poi, entrata nelle cellule epatiche è espulsa come bile sia come urina che come feci. Un’interferenza a questi processi porta a iperbilirubinimia (eccesso di

bilirubina) con sintomi: colore giallo della sclera, della pelle e delle membrane mucose. La si riscontra se illivello di bilirubina supera i 2mg/100mL. È molto comune nei bambini dove è causata da scarsi meccanismiepatici e per la poca RBC prodotta data la breve vita. Può portare a epatite, cirrosi e a malfunzionamenti delfegato. Tipo I (CN-I) Crigler-Najjar : allele recessivo; mutazione indotta dalla perdita dell’abilità di coniugarenegli enzimi fondamentali la glucuronosiltransferasi (problemi legati al gene Ugt1); CN-II: molto ridotta, mac’è attività dell’enzima (a causa di un gene recessivo); le funzioni enzimatiche possono essere indotte;

sindrome di Gilbert: l’attività dell’enzima è ridotta del 10-30% rispetto al normale e vi sono difetti nel ciclodella blirubina. Nell’uomo si possono ora curare grazie a piccole dosi di vettori adenovirali helper -dipendenti. In futuro ci si auspica l’utilizzo di epatociti derivati da cellule staminali.

Topo anti-obesità: questi topi sono protetti da obesità e diabete da una dieta priva acil-CoA: diacilgliceroloaciltransferasi 1 (DGAT1). Questo suggerisce come interrompendo la sintesi di alcuni trigliceridi si possaraggiungere grandi risultati nel trattamento dell’obesità.

Topo maratoneta: topi che hanno una maggior espressione nei loro muscoli di PPARδ che trasforma talimuscoli in fibre di tipo 1 ottime per coprire di corsa lunghe distanze. Hanno maggior resistenza e anche senon allenati sono resistenti all’obesità e alla fatica.

Animali transgenici: sono stati creati e si creeranno numerosi esempi di animali transgenici oltre ai topi: pecore con gene della alfa1-antitripsina, latte di capra con antitrombina, polli che danno uova con proteine


22/78

umane, maiali come risorsa per trapianti di organi e primati per studiare le nostre malattie. Importanti anchegli studi sul poliovirus che affligge l’uomo ma a cui i topi sono immuni.


23/78

MEMBRANE CELLULARI

Membrane cellulari:Vi sono diverse possibili membrane. Esse servono perseparare la cellula dall'ambiente delimitandola funzionalmente e separandola daglialtri organelli. Le membrane cellulari sono punti di contatto tra cellule vicine.Quindi, oltre a separare, costituiscono siti di specifiche funzioni, hanno proteine ditrasporto per consentire un movimento tra interno ed esterno, hanno recettoriper rilevare i segnali esterni e hanno tutto ciò che è necessario per lacomunicazione e l'adesione tra cellule diverse.Comunicazione tra cellule e adesione cellulare: grazie alla sua struttura la cellula

ha un grado di permeabilità per delimitare ambienti e far si che vi siano diverseconcentrazioni di ioni. La membrana ha una permeabilità selettiva a certesostanze e consente la divisione della cellula in compartimenti funzionali.Membrana cellulare: attraverso numerosi studi, gran parte negli anni 70, si èarrivati a dimostrare che la membrana cellulare é una struttura a fosfolipidi sullacui superficie si possono trovare proteine e altri lipidi. La membrana ha unostrato interno idrofobo (non crea legami H) e i lati esterni idrofili ( il 70%dell'ambiente cellulare è H2O), dove questi ultimi sono in maggioranza. Lamembrana è spessa 5 nm ( una cellula interna standard ha diametro di 5micrometri) ed è continua (non vi sono buchi): è un film sottile di lipidi eproteine tenute insieme da interazioni non covalenti, ma deboli. Il sistema adoppio strato (testa polare e code idrofobe) è l'unico modo in cui i lipidi dimembrana possono disporsi nello spazio con la minima energia libera. I fosfolipidihanno questa struttura: sono dei trigliceridi (glicerolopiù tre acidi grassi, ovvero lunghe sequenze di C apolari,poiché privi di OH, saturi se solo con legami semplici oinsaturi se con legami doppi), dove al posto di un acidograsso sul C3 del glicerolo si attacca un gruppo fosfato,gruppo polare e che interagisce con l'acqua. Ogni cellula

ha un tipo di fosfolipidi prevalente a seconda del tipo dicellula che rappresenta. I lipidi si muovono con un movimento detto di flip-flop(raro) e costituiscono il 50% della massa della membrana. La membrana èasimmetrica: caratteristica che comincia nella biogenesi ed è mantenuta daitraslocatori. Il doppio strato è un fluido bidimensionale e lo si è vistosperimentalmente: marcato un lipide con -N-O attraverso un elettrone spaiato,con la spettroscopia di risonanza magnetica o attraverso dei marcantifluorescenti, si è notato che i lipidi si muovono. Se il flip-flop è raro essi possonoruotare, diffondere lateralmente e trasversalmente. Tale fluidità è importante per iprocessi di trasporto e le attività enzimatiche, ma dipende dalla composizione deilipidi e dalla temperatura (superiore alla temperatura di transizione di fase dove


24/78

congela o fonde).Molecole di membrana: vi sono altre molecole sulla membrana fra cui ilcolesterolo che fa parte degli steroidi: anelli di C che danno alla molecola unastruttura piatta e molto rigida. È un lipide idrofobo e l'unico componente idrofiloè un gruppo OH: aumentano la proprietà di barriera della membrana esolitamente ve n'è uno ogni 2/3 fosfolipidi (la sua presenza influisce sulla fluidità dimembrana rendendola più rigida). Vi sono anche i glicolipidi (soprattuttogangliosidi) dove la testa polare presenta l'aggiunta di uno zucchero e solitamentesi trovano all'esterno della membrana e mai nel plasma. Le loro funzioni (ancora

da scoprire tutte): effetti protettivi, effetti elettrici, isolamento elettrico,riconoscimento e mediano l'adesione cellulare. Molto importanti sono le proteinedi membrana che servono alle comunicazioni tra interno ed esterno: riduconoparzialmente l'impermeabilità della membrana. Spesso sono glicosilate. Per esserestudiate si è operata la criofrattura della membrana lungo lo strato idrofobo: datauna carica + a tutte le proteine attraverso la SDS (sodio-dodecilsolfato), esse sisono mosse tutte verso l'anodo e le si è separate così con un setaccio in base alpeso. Le proteine si dividono in categorie diverse: integrali monopasso emultipasso (proteine sia all'interno che all'esterno della membrana che laattraversano una o più volte grazie alla struttura ad alfa-elica e alla presenza digruppi idrofobi), ancorate ai lipidi (o all'interno o all'esterno) attraverso i quali silegano alla membrana con un'ancora di acido miristico, palmitico o un farnesile ele proteine periferiche che funzionano solo se associate alle proteine integrali.

SMISTAMENTO

Organuli con membrane: si può a questo punto andare a vedere il processo dismistamento. Tra i vari compartimenti c'è un'importante relazione. Il mitocondrioè stato spesso visto come un batterio simbionte (lo si è pensato come unprocariote molto specializzato inglobato dalla cellula).ER, Golgi, lisosomi e vescicole trasportatrici sono

della stessa Le proteine sono sintetizzare spesso neiribosomi presenti nel citosol. Esse hanno dei segnaliintrinsechi di smistamento che le indirizza in variedirezioni (vedi immagine). La sintesi avviene semprenel citosol, ma quello che cambia è la direzione versocui vanno le proteine. Nucleo: la membrana nucleare deriva da unainvaginazione della membrana citoplasmatica a cui siaggiungono anche i pori nucleari. Tra nucleo ecitoplasma vi è continuità topologica: vi è movimentodi alcune molecole. Esso ha doppia membrana. Si


25/78


26/78


27/78

oligosaccaride su una catena laterale (N-acetilglucosammina, mannosio eglucosio). Tale evento avviene in contemporanea con la sintesi e richiede varienzimi. L'oligosaccaride è già sulla membrana legato a un lipide detto dolicolo cheserve come punto di fissazione sulla membrana.- trasporto vescicolare: vescicole di trasporto passano da un compartimentoall'altro. Le vescicole si formano attraverso delle bolle dalla membrana (budding) eattraverso estroflessione della membrana si ha la vescicola: dopodiché si fondecon il compartimento bersaglio che sarà diverso a seconda della proteina. Neltraffico vescicolare le vescicole gemmano da un compartimento e si fondono con

un altro. Si basa su due processi: esocitosi (fuoriuscita di vescicole) e endocitosi(entrata nella cellula). Il trasporto che avviene non é aspecifico: ogni vescicolacontiene proteine selezionate e si fonde con un compartimento specifico,permettendo di mantenere l'identità di ogni tipo di organello. Vi sono due vie: lavia biosintetica-secretoria (esocitosi: ER, Golgi, superficie cellulare (lisosomi)) e lavia endocitica (assunzione di macromolecole, passaggio in endosomi e lisosomi). Ènecessario fare una distinzione tra ER e Golgi dato anche che hanno proteinediverse. La proteina BiP è una chaperon che trattiene le proteine nell'ER finché laproteina non è completamente matura: la aiuta a ripiegarsi e a farle raggiungere lastruttura secondaria attraverso la formazione di ponti disolfuro e laGlicosilazione. Dopodiché le proteine passano al Golgi per vie di default (nonservono segnali specifici). Golgi è una struttura particolare, fatta di vari sacchettidi membrana associati tra di loro, suddivisa in tre compartimenti: Golgi CIS(riceve da ER), Golgi stack (quello di mezzo) e Golgi trans (fuoriuscita divescicole). Il reticolo anche se sono molti sacchetti vicini è continuo e in essoavviene rielaborazione delle catene glucidiche: l'oligosaccaride attaccato in Nviene modificato in oligosaccaridi complessi (2 acetil glucosammine+galattosio eacido sialico ; oligosaccaridi ad alto tenuto di mannosio; si ha glicosidasi, sistaccano quelli dell'ER e li si rimaneggia in mannosi).

Lisosomi: organello dedito al catabolismo di sostanze che ormai non servono più.Da Golgi alcune vescicole possono arrivare nei lisosomi. Al loro interno vi sonovari enzimi per la digestione detti idrolasi lisosomali. Nel lisosoma si ha un pHdiverso rispetto al resto della cellula (cellula: 7,2-7,4 ; lisosoma: 5, ovvero moltoacido). Per arrivare al lisosoma si hanno vie diverse: autofagia (ER diventalisosoma), fagocitosi, endosomi precoci e tardivi. Alcune proteine vannodirettamente nel lisosoma poiché hanno il segnale KFERQ (lys, phe, glut, arg,glutammina). Per mantenere questa acidità ha delle pompe sulla membrana chespostano protoni al suo interno. Vi sono tre vie di degradazione:- endocitosi: delle particelle sono inglobate dalla cellula e derivano dallamembrana cellulare. Si fondono poi con il lisosoma per essere digeriti (gli


28/78

endosomi)

- fagocitosi: vengono assunte non solo sostanze, ma interi microrganismiformando i fagosomi, i quali si fondono col lisosoma che li digerisce (elimina lesostanza di scarto, ma recupera le sostanze utili) - autofagia: degradazione delle proteine cellulare tramite vescicole lisosomialiderivanti dell'ER. Alcune cellule eliminano alcune loro parti o loro stesse. Le idrolasi lisosomiali hanno un gruppo specifico, ovvero il mannosio-6-fosfato(M6P), che le fa riconoscere da un recettore specifico presente sul trans Golgi:tale gruppo è aggiunto agli oligosaccaridi legati all'asparagina nel reticolo CIS di

Golgi. L'unione avviene a pH 7 e poi via via scende fino a pH 6. Unita la vescicolaal lisosoma la struttura a cestino (recettore) si stacca e viene riciclata poichéritorna sul trans Golgi. Vi sono malattie da accumulo lisosomale: le idrolasi sonoalterate per difetti genetici recessivi. Malattia di Hurler: si accumulano substratinon digeriti poiché i lisosomi non sono attivi e si creano così delle inclusionicellulari.Endocitosi: vi sono diversi tipi di endocitosi: fagocitosi, pinocitosi e endocitosimediata da recettori. L'endocitosi è un processo che parte dalla superficiecellulare e porta verso i lisosomi. La fagocitosi di grandi particelle avviene tramitedei fagosomi. Solitamente sono gli anticorpi che riconoscono le particelleestranee e le presentano ai fagociti. È una forma specializzata nei macrofagi e neineutrofili. Per l'assunzione di specifiche macromolecole dall'esterno e l'endocitosiin fase fluida si sfruttano le fosse rivestite di clatrina (2% dell'area di membrana):forma un cesto sotto la membrana che fa formare una vescicola rivestita diclatrina che si fonde poi con gli endosomi precoci: la clatrina ha una struttura atriskelion, precisamente 36, che serve a formare la vescicola, ma che una voltaformatasi la struttura (la dinamina aiuta a fare andare via la vescicola) si stacca eviene riutilizzata dalla membrana. Tale processo richiede energia e una sottoclassedi proteine, le proteine RAB. L'assunzione di energia è fondamentale poiché

aggiungendo un fosfato si cambia la forma della proteina che così in molti fasirisulta ora attiva. Spesso l'energia non deriva da idrolisi di ATP, ma a partire daGTP: a una molecola di GPP attaccata alla proteina si attacca un gruppo fosfatoche attiva l'intero complesso. Le proteine RAB sono un tipo di proteina Gmotore del processo di

Schemi Di Biologia Generale e Molecolare 2013

Documents

Transcript of Schemi Di Biologia Generale e Molecolare 2013