“TECNICHE DI ANALISI STRUMENTALE E STATISTICHE” · DNA RNA PROTEINA La biologia molecolare. Le...

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“TECNICHE DI ANALISI STRUMENTALE E STATISTICHE” Docente: Dott. Agostino Sorgonà Dipartimento di Biotecnologie per il Monitoraggio Agroalimentare ed Ambientale (BIO.M.A.A.) 0965801266 (ufficio) 0965801223 (lab) [email protected] Corso di Formazione Interna Università Mediterranea di Reggio Calabria

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“TECNICHE DI ANALISI STRUMENTALE E STATISTICHE”

Docente: Dott. Agostino Sorgonà

Dipartimento di Biotecnologie per il Monitoraggio Agroalimentare ed Ambientale

(BIO.M.A.A.)

0965801266 (ufficio)0965801223 (lab)[email protected]

Corso di Formazione Interna

Università Mediterranea di Reggio Calabria

…. ben ritornati!

GRAZIE!

MERCOLEDI’ 30 GENNAIO ORE 8:30

AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria

ACIDI NUCLEICI

Lezione frontale (1 ora)

Esercitazioni da laboratorio (3 ore): Estrazione e purificazione, analisi spettrofotometrica, reazione a catena della polimerasi (PCR), elettroforesi su

gel di agarosio.

MERCOLEDI’ 6 FEBBRAIO ORE 9:30

AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria

ANALISI D’IMMAGINE

Lezione frontale (1 ora)

Esercitazioni da laboratorio (1 ora): analisi morfologica ed architettonica dell’apparato radicale

mediante il sistema informatico WinRhizo.

VENERDI’ 8 FEBBRAIO 8:30

AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria

LA FOTOSINTESI E LA RESPIRAZIONE

Lezione frontale (1 ora)

Esercitazioni da laboratorio (3 ore): misurazione della respirazione del suolo mediante il sistema LiCOR.

VENERDI’ 22 FEBBRAIO ORE 9:00

AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria

METODOLOGIE STATISTICHE

Lezione frontale (1 ora): Disegno sperimentale, ANOVA, test post-hoc, Regressione lineare e

correlazione, Regressione non lineare

Esercitazioni da laboratorio (2 ore): utilizzo di alcuni software di statistica ed approfondimento su

articoli scientifici.

MARTEDI’ 26 FEBBRAIO ORE 8:30

AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria

MICROSCOPIA

Lezione frontale: (1 ora)

Esercitazioni da laboratorio (3 ore): dal microscopio ottico a quello a fluorescenza

VENERDI’ 29 FEBBRAIO ORE 9:00

AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria

VERIFICA FINALE CON TEST A RISPOSTA MULTIPLA (3 ore)

IL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE:

TECNICHE DI BASE ED APPLICAZIONI

Che cosa è il DNA o il RNA?

Che cosa è il gene o l’espressione genica?

Quali campi scientifici sono interessati a queste molecole o

strutture funzionali cellulari o processi biologici?

Quali sono le tecniche per la loro quantificazione?

La biologia molecolare studia i meccanismi molecolari

che sottintendono i processi biochimici, fisiologici e

morfologici degli esseri viventi.

Quali sono i meccanismi molecolari?

Le interazioni tra le macromolecole quali le

proteine e gli acidi nucleici (DNA e RNA)

DNA RNA PROTEINA

La biologia molecolare

Le tecniche e le nozioni della biologia molecolare

Obiettivi

genetica biologia l’evoluzionistica filogenetica

la genetica classica si occupa di come i

caratteri sono ereditati nelle

progenie; la biologia molecolare, invece, studia l’ereditarietà

dei caratteri a livello molecolare,

cioè di DNA

Confrontando il patrimonio genetico di individui differenti

attraverso le tecniche di biologia molecolare, si possono

determinare le relazioni ancestrali fra specie note (filogenetica) oppure il

cambiamento di tale patrimonio (evoluzionistica).

GLI ACIDI NUCLEICI: IL DNA E IL RNA

Gli acidi nucleici sono dei composti (acidi) presenti nel nucleo della cellula o comunque lì prodotti

Macromolecole: struttura abbastanza grande

macromolecole polimeriche lineari

DNAOgni filamento può contenere diversi milioni di nucleotidi. Ad esempio, il più grande cromosoma

umano (il cromosoma 1) contiene quasi250 milioni di paia di basi

Struttura RNA

Polimeriche: costituite da più unità (monomeri) chiamate nucleotidi

Nucleotide

Lineari: i nucleotidi si legano secondo una linea e non formano delle ramificazioni.

Nucleotide = base azotata + zucchero pentoso + gruppo fosfato

La struttura basilare degli acidi nucleici è il nucleotide.

Nucleoside = zucchero + base azotata

Struttura del DNA

Zucchero del DNA è il deossiribosio;

le basi azotate sono Adenina(A)

Guanina (G)Citosina (C)Timina (T).

scheletro lateraledeterminato da legami fosfodiesterici tra il gruppo fosfato di un

nucleotide ed il carbonio in posizione 5’ dello zucchero del successivo nucleotide. Il gruppo

fosfato fa da ponte per il legame del carbonio 3’ dello zucchero di un

nucleotide con quello 5’

del nucleotide successivo

ogni filamento di DNA ha un senso:estremità 5’ se si inizia con il

legame del carbonio in posizione 5’viceversa, si definisce estremità 3’

se il filamento inizia con il carbonio 3’..

La parte interna presenta la base azotata legata allo zucchero

Doppio filamento o doppia elica: associazione tra i due filamenti

mediante legami ad idrogeno tra le due basi opposte

↓Appaiamento delle basi dove l’Adenina

(composto purinico) può legare solamente la Tiamina (composti

pirimidinico), così come la Guaninalega solamente la Citosina.

Doppia elica che, con l’avvitarsi su sé stessi dei due filamenti, restano esposti dei solchi definiti maggiore e

minore.

Funzioni biologiche del DNA

L’acido deosirbunucleico (DNA) contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto

funzionamento della maggior parte degli organismi viventi.

come l’informazione genetica è contenuta nel DNA?come questa viene tradotta materialmente in proteine?

Il DNA è solitamente presente all'interno di

cromosomi lineari (circolari nei

procarioti) che sono presenti nel nucleo

cellulare

La somma di tutti i cromosomi di una cellula costituisce il genoma che è l’insieme dei geni di un organismo e pertanto viene anche definito patrimonio

genetico

Il genoma umano è costituito da 46 cromosomi e da circa 3 miliardi di paia di basi.

Organismo Numerodi cromosomi

Numero di copiedi cromosomi Tipo Dimensione (Mbps)

Mycoplasma genitalium 1 1 circolare 0,58

Escherichia coli K12 1 1 circolare 4,6

Agrobacterium tumefaciens 4 1 3 circolari1 lineare 5,67

Sinorizhobium melioti 3 1 circolare 6,7

Saccharomyces cerevisiae 16 1 o 2 lineare 12,1

Schizosaccharomyces pombe 3 1 o 2 lineare 12,5

Caenorhabditis elegans 6 2 lineare 97

Drosophila melanogaster 4 2 lineare 180

Tetrahymena termophila m: 5M: 225

m: 2M: 10-10000 lineare 220 (M)

Fugu rubripes 22 2 lineare 365

Mus musculus 19+X+Y 2 lineare 2500

Homo sapiens 22+(X o Y) 2 lineare 2900

Perché il DNA contiene l’informazione genetica? E che cos’è l’informazione genetica?

L’informazione genetica è scritta nella catena del DNA secondo un codice detto Codice Genetico che mette in corrispondenza le basi

azotate con gli aminoacidi (unità strutturali delle proteine).

Ciascuna parola del codice è costituita da una serie di tre basi, detta codoneche indica agli organi

effettori (RNA e ribosomi) di prelevare un

determinato amminoacido e di legarlo alla catena polipeptidica della proteina costituenda

Utilizzando gruppi di tre lettere si possono avere fino a 64 combinazioni diverse (43), in grado di

codificare per i venti diversi amminoacidi esistenti

La timina ripetuta in una serie di tre (TTT) rappresenta in particolare l'amminoacido fenilalanina

Il codice genetico è detto ridondante (o degenere): alcuni amminoacidi possono infatti essere codificati da più triplette diverse.

64 triplette 20 Aminoacidi

Esistono infine tre triplette che non codificano per amminoacidi ma per codoni di stop (o nonsense), ovvero

indicano il punto in cui in un gene termina la parte che codifica per la proteina corrispondente: si tratta di TAA,

TGA e TAG.

Che cos’è un gene?

Il gene è l’unità ereditaria degli organismi viventi

Strutturalmente, i geni sono sequenze di DNA che codificano per una proteina

1. Gli esoni sono la sequenza di DNA che poi viene tradotta in

proteina;2. gli introni sono delle sequenze che spaziano gli esoni e che non vengono

tradotte o meglio vengono eliminate attraverso la maturazione del RNA;

3. i promotori e i terminatorisono regioni del gene che

regolano l’espressione genica.

Struttura del RNA

L'acido ribonucleico (RNA o ARN) è un polimero organico, risultante dalla polimerizzazione di

ribonucleotidi.

Le molecole di RNA differiscono da quelle di DNA perché:

1. contengono lo zucchero ribosio (con un gruppo OH legato al carbonio 2') anziché il deossiribosio (da qui il nome)

2. una delle basi, la timina, è sostituita dall'Uracile(U). In questo caso è l'uracile a legarsi all'adenina,

mentre la guanina si lega sempre alla citosina;

3. sono di solito a singolo filamento, anziché a filamento doppio.

L'RNA messaggero(noto con

l'abbreviazione di mRNA o con il termine più generico di

trascritto) è un tipo di RNA che codifica e porta

informazioni durante la

trascrizione dal DNA ai siti della sintesi proteica,

per essere sottoposto alla

traduzione

1. un cappuccio 5’ (nucleotide guaninico

metilato in posizione 7) che è importante per il

riconoscimento e l'aggancio appropriato

dell'mRNA al ribosoma;

2. Regioni codificanti che sono composte da codoni

che vengono decodificati e tradotti in proteine

dai ribosomi. Le regioni codificanti cominciano

con un codone di inizio e terminano con tre

possibili codoni di stop;

3. Regioni non codificanti che sono posizionate

prima del codone d'inizio (3' UTR, untranslated

region) e dopo il codone di stop (5' UTR,

untranslated region) e non sono tradotte in

proteine. La loro funzione è quella di

stabilizzare e di localizzare il mRNA e di rendere

più efficiente il processo di traduzione.

L'RNA transfer (o RNA di

trasporto), abbreviato in tRNA, è una

piccola catena di RNA (di 74-93 nucleotidi) che trasferisce un amminoacido

specifico ad una catena

polipeptidica in crescita al sito ribosomiale della sintesi proteica

durante la traduzione.

La struttura secondaria o a trifoglio del tRNA:

1. braccio accettorechiamato anche braccio amminoacidico che ha la

funzione di attacco dell’aminoacido;

2. un trinucleotide molto conservato dalla sequenza CCA (detta anche coda CCA) presente alla terminazione

3' del braccio, che è importante per il

riconoscimento dei tRNAdurante la traduzione;

3. braccio D che è una regione contenente un loop

4. braccio A o braccio

dell'anticodone che è composto da 5 paia di basi e termina in un loop contenente

l'anticodone;

5. braccio T, composto da 5 paia di basi, contiene una sequenza molto

conservata TTC

L’anticodone è costituito da tre nucleotidi che

corrispondono alle tre basi del codone letto dal mRNA. Quindi, ogni specifico anticodone di

tRNA contiene una sequenza (tripletta) che può appaiarsi ad uno o più codoni per

uno stesso amminoacido.

Ad esempio, consideriamo il tRNAdella fenilalanina il cui anticodone è AAG

questo si appaia con il codone della

fenilalanina che è TTC

L'RNA ribosomiale (o RNA

ribosomale, abbreviato

come rRNA) è il tipo di

RNA più abbondante

presente nella cellula.

Non codifica direttamente

le proteine, ma è il

componente essenziale

(circa i due terzi) dei

ribosomi, macchine

catalitiche che

provvedono

all'assemblaggio delle

proteine, presenti in

tutte le cellule viventi.

Il dogma centrale della biologia

“Il flusso dell'informazione genetica è monodirezionalee parte dagli acidi nucleici ed arriva alla formazione

delle proteine” (Crick, 1957)

1. l'informazione genetica è conservata nel DNA;2. l'informazione genetica viene trascritta sotto forma di

RNA (processo di trascrizione);3. l'informazione genetica viene successivamente tradotta

a proteine, la forma "operativa" dell'informazione contenuta nel genoma (processo di traduzione).

Il dogma centrale costituisce il meccanismo di base dell'espressione dei geni

Il processo di trascrizione

Il processo di trascrizione è quello mediante il quale le

informazioni (sequenza delle basi) contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente(grazie alle RNA polimerasi) in una

molecola complementare di RNA

(mRNA).

RNA polimerasi

mRNA

DNA

La trascrizione procede in direzione 5' → 3'. Più precisamente, il

filamento lungo il quale il DNA viene scansìto, detto filamento stampo, è percorso dall'enzima

RNA polimerasi in direzione 3' → 5'.

Operativamente, viene costruito un filamento di

mRNA con delle basi azotate complementari a

quelle del DNA

1a fase

riconoscimento del

promotore da parte

della proteina TBP

(TATA Binding

Protein) che ha la

funzione di

produrre due forti

piegature al DNA (o

kink) a livello

della sequenza TATA

che inducono in

questo punto un

angolo di circa 90°

proteina TBP

DNA

2a fasepulizia del promotore(eliminazione dei

fattori che legavano il promotore)

3a faseAllungamento (aggiunta di ribonucleotidi con codoni complementari al filamento stampo del

DNA)

4a faseInfine, la trascrizione

si conclude con il processo di terminazione

L'enzima responsabile di questo processo è la

Trascrittasi inversa, e deve il nome proprio al fatto

che è in grado di compiere il passaggio inverso

rispetto agli altri enzimi responsabili della

trascrizione, che cioè sintetizzano RNA a partire da

DNA

La retrotrascrizione è utilizzata in esperimenti di ingegneria genetica dove a partire da mRNA purificato si sintetizza del DNA complementare (cDNA), normalmente privo di introni che può venire

utilizzato per il clonaggio e la manipolazione del gene corrispondente

La retrotrascrizione (o trascrizione inversa) è la

capacità da parte di particolari enzimi di sintetizzare

una molecola di DNA a partire da RNA.

Il processo di traduzione

La traduzione o detta anche sintesi proteica è un meccanismo attraverso il quale il filamento mRNA, dopo essere stato trascritto, viene "letto" dalle unità di

rRNA e tradotto in proteine

1a fase

L'inizio della sintesi

avviene grazie al legame

tra i ribosomi con il

codone di avvio (start)

dell'mRNA, che indica il

punto in cui inizia la

codificazione della

proteina. Questo codone

negli eucarioti è

generalmente AUG (adenina-

uracile-guanina) a cui

corrisponde l'amminoacido

metionina. La subunità

ribosomiale che si lega al

mRNA è quella superiore

Ribosoma

mRNA

tRNA

2a fase

A questo punto entra in

gioco il tRNA iniziatore

che accoppia le sue basi

con quelle del codone di

avvio e si lega al sito

P del ribosoma (sito

posto nella subunità

inferiore). La sub-unità

maggiore forma quindi un

complesso con quella

minore.

3a fase

Successivamente avviene la

cosiddetta fase di

allungamento. Un nuovo

tRNA entra sul sito A

(posto nella subunità

inferiore) del ribosoma ed

accoppia le sue basi con

quelle dell'mRNA

4a fase

L'enzima peptidil

transferasi crea un legame

peptidico tra gli

amminoacidi vicini.

Quindi, l'amminoacido sul

sito P si stacca dal suo

tRNA.

Il ribosoma si muove lungo

l'mRNA spostando il tRNA dal

sito A al sito P liberando

nel contempo il tRNA vuoto.

Questo processo è noto come

traslocazione.

5a fase

Questo processo continua finché il ribosoma non incontra uno

dei tre possibili codoni di arresto (stop), che sono UAG,

UAA, UGA. Questa è la fase di terminazione. La crescita della

proteina si interrompe ed i fattori di rilascio, proteine che

simulano l'azione del tRNA, si legano al sito A e liberano la

proteina nel citoplasma

Il DNA nell’ingegneria genetica

Organismi geneticamente modificati (OGM): sequenze di DNA

(geni) interessanti possono essere inseriti all'interno del

loro genoma.

In questo caso si parla di DNA ricombinante cioè di segmenti

di DNA realizzati e assemblati artificialmente.

Agricoltura Alimentazione Medicina Industria

Batteri

batteri che introdotti nel suolo ne migliorano le caratteristiche (es. batteri azoto-fissatori) o proteggono le piante dal gelo (batteri ice-minus)

produzione di sostanze medicinali come l'insulina

biorimedi (es. batteri che degradano idrocarburi)

Agricoltura Alimentazione Medicina Industria

Miceti

1. produzione di enzimi usati nell'industria alimentare, 2. miglioramento dei processi di fermentazione (es. produzione della birra)

produzione di biomedicine

Agricoltura Alimentazione Medicina Industria

Piante

1. miglioramento delle pratiche agronomiche: es. piante tolleranti allo stress idrico o salino,

colture tolleranti a specifici erbicidi 2. introduzione di

caratteri di resistenza specifica: es. piante

resistenti agli insetti o ai virus

3. produzione di energia: varietà con piùelevato potere calorico

e minori richieste di input chimici utilizzabili anche su aree marginali

miglioramenti nelle qualità nutrizionali e organolettiche: es.

riso ad elevato contenuto in beta-

carotene, pomodoro a maturazione

rallentata

produzione di farmaci/composti in

pianta (molecularfarming): produzione a

basso costo di sostanze

farmaceutiche e chimiche, riduzione degli scarti chimici

industriali (es. vaccino contro

l'epatite, produzione di amilasi).

1. miglioramento delle caratteristiche richieste a livello industriale delle

materie prime (es. pioppo con un tasso di lignite inferiore per

facilitare il processo di fabbricazione

della pasta da carta) 2. fitodepurazione(es. piante capaci di

estrarre metalli quali oro, rame e uranio, piante in

grado di degradare il tritolo o di segnalare la presenza di radiazioni)

Agricoltura Alimentazione Medicina Industria

Animali

produzioni animali con migliori caratteristiche nutrizionali o organolettiche: es. latte con più alto contenuto in caseina, latte senza lattosio

1. produzione di biomedicine2. modelli per la ricerca su malattie umane (es. l'oncotopo) 3. animali donatori di organi per xenotrapianti

Il DNA nella medicina forense

La medicina forense si serve del DNA

presente nel sangue, nella pelle,

nella saliva, nei capelli e in altri

tessuti e fluidi biologici per

identificare il responsabile di un

delitto.

Il processo mediante cui è possibile

realizzare ciò è il fingerprinting

genetico: tale tecnica consiste nel

comparare la lunghezza delle sezioni

variabili del DNA ripetitivo che

possono risultare molto diverse tra

i diversi individui.

Il DNA nella bioinformatica

La bioinformatica è una branca della biologia che

comprende la manipolazione, la ricerca dei dati

relativi a sequenze di DNA.

L’obiettivo della bioinformatica è quello di risolvere problemi biologici con metodi informatici.

Gli algoritmi di ricerca (o appaiamento) di stringhe sono in grado di individuare la presenza di una sequenza di lettere all'interno di sequenze

molto più ampie quali quelle presenti nel DNA.

Identificano le sequenze omologhe ed individuano le specifiche mutazioni che le rendono differenti. Queste tecniche sono utilizzate per studiare le

relazioni filogenetiche e la funzione delle proteine.

Il DNA nella storia ed antropologia

Grazie alla proprietà del DNA di subire delle mutazioni che a

loro volta vengono ereditate, esso contiene informazioni

preziose che possono essere utilizzate dai genetisti per

studiare l'evoluzione degli organismi e la loro filogenesi

L’espressione genica

L’espressione genica è quel processo attraverso il

quale l'informazione contenuta in un gene viene

convertita in una macromolecola funzionale,

tipicamente una proteina.

La regolazione dell'espressione genica è fondamentale per la

cellula, perché le permette di controllare le proprie

funzioni interne ed esterne, come la differenziazione

cellulare, la morfogenesi o i vari processi di adattamento

alle necessità dell'organismo.

Come si misura l’espressione genica? E soprattutto che cosa si misura?

Misura del trascrittoma

Trascrittoma: insieme di tutti i trascritti (mRNA) di un dato organismo o tipo cellulare

La quantità di mRNA è un dato di

notevole interesse nella

misura dell'espressione

genica.

siRNA, piccole molecole di RNA in grado di portare alla

degradazione del trascritto

Northern blot: processo attraverso il quale un estratto

di RNA proveniente dal sistema biologico da analizzare

viene dapprima separato in un gel di agarosio, quindi

ibridato con una sonda radioattiva (sequenza di DNA

complementare all'RNA da identificare, marcata con un

isotopo radioattivo quale 32P) complementare al solo RNA

di interesse.

Il Northern blot è una tecnica utilizzata sempre più raramente, a causa delle problematiche

correlate all'uso di reagenti radioattivi e della scarsa sensibilità nella quantizzazione.

Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) o

la reverse transcriptase-polymerase chain reaction

(RT-PCR): permettono di quantificare la presenza di

un determinato trascritto anche in pochi nanolitri di

estratto cellulare

Costi per gli strumenti ed i reagenti sono proibitivi

DNA microarray: fornisce un'analisi contemporanea di

migliaia di differenti mRNA attraverso l'utilizzo di

supporti che contengono migliaia di sonde di DNA

complementari ai trascritti della cellula

Misura del proteoma

Il proteoma indica l’insieme di proteine presenti in

un organismo o le proteine prodotte da un genoma

Western blot attraverso il quale, in seguito alla

separazione su un gel di poliacrilammide delle

proteine contenute in un estratto cellulare, è

possibile individuare e quantificare una singola

proteina attraverso l'uso di un anticorpo specifico.

Tale anticorpo, infatti, può essere legato da un

altro anticorpo (detto secondario) a cui è coniugato

un sistema di rivelazione quale un fluorocromo che

permetta la quantificazione.

Per quantizzare una particolare proteina si può

fondere il gene che codifica per tale prodotto

proteico con un gene reporter, come la Green

Fluorescent Protein (marcatore nelle indagini di

identificazione e localizzazione subcellulare delle

proteine), che può essere agevolmente visualizzata

attraverso un microscopio a fluorescenza.

Immagine confocale di cellule di guardia di Arabidopsis con GFP (verde) e cloroplasti (rossi)

Tecniche di base e applicazioniTecniche di base e applicazioni

GENOMICA GENOMICA PROTEOMICAPROTEOMICA

Dna Dna RnaRna ProteinaProteina

ESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNA11a a FASEFASE

Lisi: Lisi: rialasciorialascio di DNA solubile ad alto peso molecolare da parte delle cellule di DNA solubile ad alto peso molecolare da parte delle cellule con parete e con parete e membrane membrane dannegiatedannegiate;;

22a a FASEFASE

Estrazione: dissociazione dei complessi DNAEstrazione: dissociazione dei complessi DNA--PROTEINE (denaturazione e/o proteolisi);PROTEINE (denaturazione e/o proteolisi);

33a a FASE FASE

Purificazione: separazione del DNA dalle altre MACROMOLECOLE (prPurificazione: separazione del DNA dalle altre MACROMOLECOLE (proteine, oteine, polissacaridipolissacaridi, ecc.), ecc.)

Batteri Lieviti Batteri Lieviti Tessuti animali Tessuti vegetaliTessuti animali Tessuti vegetali

Fortemente dipendente dal materiale Biologico di partenzaFortemente dipendente dal materiale Biologico di partenza

ESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNA

LISI CELLULARELISI CELLULARE

Si utilizzano tamponi contenenti SDS o CTAB; Tris Si utilizzano tamponi contenenti SDS o CTAB; Tris ––HCLHCL; EDTA; Proteinasi K.; EDTA; Proteinasi K.

Con aggiunta di agenti denaturanti per le proteine come la guaniCon aggiunta di agenti denaturanti per le proteine come la guanidina dina idroclorideidrocloride..

Durata: dai 30 minuti alle 3 ore (a seconda del tipo di matrice Durata: dai 30 minuti alle 3 ore (a seconda del tipo di matrice utilizzato) alla temperatura di 60utilizzato) alla temperatura di 60--65°C, in costante agitazione.65°C, in costante agitazione.

ESTRAZIONEESTRAZIONE

Aggiunta di cloroformio o fenolo alla fase acquosa del lisato (qAggiunta di cloroformio o fenolo alla fase acquosa del lisato (quest’azione provoca la uest’azione provoca la denaturazione delle proteine).denaturazione delle proteine).

PURIFICAZIONEPURIFICAZIONE

Aggiunta di Aggiunta di isopropanoloisopropanolo alla fase acquosa ottenuta dopo il passaggio in cloroformio o falla fase acquosa ottenuta dopo il passaggio in cloroformio o fenolo. enolo. Questo passaggio provoca la precipitazione del DNA sul fondo delQuesto passaggio provoca la precipitazione del DNA sul fondo della provetta.la provetta.

LAVAGGIO LAVAGGIO

AggiutaAggiuta di etanolo 75% al di etanolo 75% al pelletpellet (DNA puro).(DNA puro).

Aggiunta di acqua sterile (40Aggiunta di acqua sterile (40--60 60 µl).µl).

PREPARAZIONE DI DNA BATTERICOPREPARAZIONE DI DNA BATTERICO

ESTRAZIONEESTRAZIONE

- Centrifugazione della coltura in Centrifugazione della coltura in sospensionesospensione

--RisospensioneRisospensione delle cellule in delle cellule in tampone contenente tampone contenente RnaseRnase

-- Rottura della parete Rottura della parete peptidoglicanicapeptidoglicanica mediante lisi mediante lisi alcalina o enzimatica (alcalina o enzimatica (NaOHNaOH o o Lisozima) in presenza di Lisozima) in presenza di guanidioguanidioisotiocianatoisotiocianato

-- Centrifugazione e recupero del Centrifugazione e recupero del sopranatante contenente l’estratto sopranatante contenente l’estratto cellularecellulare

PREPARAZIONE DI DNA BATTERICOPREPARAZIONE DI DNA BATTERICO

PURIFICAZIONEPURIFICAZIONE

DNA CromosomicoDNA Cromosomico

DNA DNA PlasmidicoPlasmidico

Cromosoma Cromosoma battericobatterico

PlasmidiPlasmidi

VALUTAZIONE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DEL DNAVALUTAZIONE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DEL DNA

Conoscere la concentrazione del DnaConoscere la concentrazione del Dna

Verificare il suo grado di purezzaVerificare il suo grado di purezza

METODO SPETTROFOTOMETRICOMETODO SPETTROFOTOMETRICO

METODO ELETTROFORETICOMETODO ELETTROFORETICO

QUANTIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DEL DNAQUANTIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DEL DNA

CENNI TEORICICENNI TEORICI

•• Metodo spettroscopicoMetodo spettroscopico

•• Specifica Specifica λλ per ogni sostanzaper ogni sostanza

•• Utilizza la legge di Lambert e Utilizza la legge di Lambert e BeerBeer

•• T= IT= I00/I/I11

•• OD= OD= --log 1/Tlog 1/T

•• OD= OD= l•kl•kee•C•C

• In una cuvetta di quarzo porre 1ml di acqua (bianco) e azzerare lo strumento.

• Preparare una cuvetta di quarzo contenente 698ul di H20 e qaggiungere 2ul della soluzione di DNA (diluizione 1:350).

• Coprire con parafilm e miscelare capovolgendo delicatamente la cuvetta.

• Introdurre la cuvetta nello spettrofotometro e leggere l'assorbanza (A) a 260 nm.

• Tornare sul bianco spostare la lunghezza d'onda a 280nm. Azzerare lo strumento.

• Passare al campio e leggere l'A280. • Coi risultati ottenuti, calcolare la concentrazione di DNA

sapendo che in una cuvetta con un cammino di 1 cm, il DNA a doppio filamento alla concentrazione di 50ug/ml ha un assorbimento di 1 a 260nm:

Concentrazione DNA /ug/ml)= A260nm x 50/ 1 unita’ di

assorbanza Calcolare il rapporto delle letture a 260nm e 280nm. Tale rapporto dovrebbe essere >= 1.7 per una preparazione pura di DNA. Se il rapporto è < di 1.7 significa che è presente una contaminazione da parte delle proteine.

POLYMERASE CHAIN REACTION:POLYMERASE CHAIN REACTION:

CHE COSA E’ LA PCR?CHE COSA E’ LA PCR?

La PCR (La PCR (PolymerasePolymerase ChainChain ReactionReaction) ) è un metodo attraverso cui una è un metodo attraverso cui una sequenza di acido nucleico più essere sequenza di acido nucleico più essere amplificata esponenzialmente in vitro. amplificata esponenzialmente in vitro. Lo stesso metodo può essere usato per Lo stesso metodo può essere usato per modificare la sequenza amplificata o modificare la sequenza amplificata o per aggiungerle nuova informazione di per aggiungerle nuova informazione di sequenza. Requisito fondamentale e’ sequenza. Requisito fondamentale e’ che le estremità della sequenza da che le estremità della sequenza da amplificare siano conosciute con amplificare siano conosciute con sufficiente precisione per poter sufficiente precisione per poter sintetizzare degli sintetizzare degli oligoprimersoligoprimers che che fungano da innesco per la reazione di fungano da innesco per la reazione di amplificazioneamplificazione

3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C)

1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARIA DUE REGIONI SITUATE SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE

2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE

ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:

4- I 4 DESOSSIRIBONUCLEOSIDI TRIFOSFATI

2-APPAIAMENTO: TEMP. 50-60°C . I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO

PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:

1- DENATURAZIONE: TEMP. 94°C. IL DNA STAMPOVIENE DENATURATO

3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI

5’ -3’3’ 5’

5’ -3’

3’ 5’

Denaturazione

5’ -3’

3’ 5’

Annealing5’

5’

3’

3’

5’ -3’

3’ 5’

Estensione5’

5’

3’

3’

POLYMERASE CHAIN REACTION:POLYMERASE CHAIN REACTION:

COMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCRCOMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCR

•• Dna Genomico, Dna Genomico, plasmidicoplasmidico, , fagicofagico (100(100--200 ng)200 ng)

•• PrimersPrimers di innesco (02di innesco (02--05 µM) 05 µM)

•• dNTPdNTP (150(150--250 µM)250 µM)

•• Tampone di reazione (50mM Tampone di reazione (50mM KClKCl, 50 mM , 50 mM TrisTris--HClHCl pH 8.3, 1.5mM pH 8.3, 1.5mM Mg(Mg(OacOac))2 2

•• Dna polimerasi (Dna polimerasi (TaqTaq, , PfuPfu, 5U/100 µl reazione) , 5U/100 µl reazione)

•• Additivi (DMSO, glicerolo, Additivi (DMSO, glicerolo, FormamideFormamide BSA) BSA)

POLYMERASE CHAIN REACTION:POLYMERASE CHAIN REACTION:

Criteri di scelta e ottimizzazione dei singoli compCriteri di scelta e ottimizzazione dei singoli componentionenti

PRIMERSPRIMERSA) A) Complementarieta’Complementarieta’ con le sequenze che precedono e seguono il con le sequenze che precedono e seguono il frammento da amplificareframmento da amplificare

5’5’

3’3’

3’3’

5’5’

B) Lunghezza del B) Lunghezza del primerprimer: Tale parametro influisce sia sulla temperatura : Tale parametro influisce sia sulla temperatura di di annealingannealing sia sulla sia sulla specificita’specificita’. Il valore ottimale e’ compreso tra 18 . Il valore ottimale e’ compreso tra 18 --24 24 bpsbps

C) C) Assenza di Assenza di autocomplementarieta’autocomplementarieta’

5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3'

3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'

D) Temperatura di D) Temperatura di meltingmelting::

Temperatura alla quale la meta’ di una popolazione di molecole dTemperatura alla quale la meta’ di una popolazione di molecole di Dna i Dna si trova ancora nello stato di doppia elicasi trova ancora nello stato di doppia elica

Esprime una misura della stabilita’ tra Dna Esprime una misura della stabilita’ tra Dna templatotemplato e e primerprimer

La La TmTm di un ibrido in soluzione dipende dalla concentrazione di un ibrido in soluzione dipende dalla concentrazione salina, dalla composizione in basi e dalla presenza di agenti salina, dalla composizione in basi e dalla presenza di agenti denaturanti. Gli effetti di questi parametri sono combinati in denaturanti. Gli effetti di questi parametri sono combinati in un’unica equazione [un’unica equazione [MienkothMienkoth e e WahlWahl, 1984]:, 1984]:TmTm = 81,5 +16,6 (log M) + 0,41 (% G+C) = 81,5 +16,6 (log M) + 0,41 (% G+C) -- 0,61 (% 0,61 (% formform) ) --dove M è la molarità dei cationi monovalenti, (% G+C) è la dove M è la molarità dei cationi monovalenti, (% G+C) è la percentuale di guanine e citosine nel DNA, (% percentuale di guanine e citosine nel DNA, (% formform) è la ) è la percentuale di percentuale di formammideformammide nella soluzione.nella soluzione.La formula empirica che nell’uso pratico viene adottata e’:La formula empirica che nell’uso pratico viene adottata e’:

TmTm = 2 (A+T) + 4 (G+C)= 2 (A+T) + 4 (G+C)

E) Contenuto in GC e AT: compreso tra 50 e 45 % e le basi devonoE) Contenuto in GC e AT: compreso tra 50 e 45 % e le basi devono essere essere distribuite in modo uniforme distribuite in modo uniforme

Importante Importante perche’perche’ determina non solo la determina non solo la TmTm ma anche la ma anche la possibilita’possibilita’ di di annealingannealing aspecifico e la formazione di bolle interne al aspecifico e la formazione di bolle interne al primerprimer ((hairpinhairpinloopsloops) che ne danneggiano la capacita’ di ) che ne danneggiano la capacita’ di annealingannealing

ATCGTAGTAGG TACTATCGTAGTAGG TACTCC--GGGG--CC

SOFTWARE E PROGRAMMI PER LA GESTIONE DELLA SOFTWARE E PROGRAMMI PER LA GESTIONE DELLA SCELTA DEI PRIMERSSCELTA DEI PRIMERS

••UniStSUniStS

••BlastBlast

••GenomeGenome

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezentrez//query.fcgiquery.fcgi??db=unistsdb=unists

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezentrez//query.fcgiquery.fcgi??db=genomedb=genome

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastblast//

PrimerPrimer 33 http://http://frodo.wi.mit.edufrodo.wi.mit.edu//cgicgi--binbin/primer3/primer3_www.cgi/primer3/primer3_www.cgi

POLYMERASE CHAIN REACTION:POLYMERASE CHAIN REACTION:

Protocollo di partenzaProtocollo di partenza

LAVORANDO IN GHIACCIO:LAVORANDO IN GHIACCIO:

••Preparare una diluizione del Dna da amplificare alla concentraziPreparare una diluizione del Dna da amplificare alla concentrazione di 100ng/µlone di 100ng/µl

•• Preparare un numero di Preparare un numero di microtubimicrotubi pari al numero dei campioni da analizzare pari al numero dei campioni da analizzare piu’piu’un tubo per il controllo di contaminazioneun tubo per il controllo di contaminazione

•• Dispensare in ogni tubo campione 100ng/1µl di DNA genomicoDispensare in ogni tubo campione 100ng/1µl di DNA genomico

1 2 3 Con1 2 3 Controllotrollo

•• Preparare la Mix di reazione il cui volume finale Preparare la Mix di reazione il cui volume finale dipendera’dipendera’ dal numero dei dal numero dei campioni e dal volume di reazione di ogni campione. Nel nostro ecampioni e dal volume di reazione di ogni campione. Nel nostro esempio, il volume di sempio, il volume di reazione reazione sara’sara’ di 20 µl /campione, il numero dei campioni e’ quattro, quindi idi 20 µl /campione, il numero dei campioni e’ quattro, quindi il volume l volume della mix della mix sara’sara’ di 80. di 80.

PrimerPrimer F………………F……………….. 1.. 1PrimerPrimer R………………R………………. 1. 1Buffer 10 Buffer 10 X……………X……………. 10. 10dNTPS…………………dNTPS…………………. 1 . 1 Taq……………………Taq…………………….. 1.. 1HH2 2 O……………………O……………………. 86. 86

100100

MIXMIX

•• Dispensare 20µl di Mix in ciascun tubo Dispensare 20µl di Mix in ciascun tubo riri reazionereazione

•• Impostare i parametri di temperatura, durata e numero dei Impostare i parametri di temperatura, durata e numero dei cicli : cicli :

Denaturazione iniziale 95°C per 5’Denaturazione iniziale 95°C per 5’

Denaturazione 95°C per 1’Denaturazione 95°C per 1’AnnealingAnnealing 55°C per 1’ per 3055°C per 1’ per 30ExtensionExtension 68°C per 1’68°C per 1’

ExtensionExtension finale 68°C per 10 ‘finale 68°C per 10 ‘HoldHold 4°C4°C

•• Caricare i campioni e avviare il Caricare i campioni e avviare il ciclizzatoreciclizzatore

CONTROLLO DEL PRODOTTO DI PCR: ELETTROFORESI SU CONTROLLO DEL PRODOTTO DI PCR: ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSOGEL DI AGAROSO

PRINCIPI GENERALIPRINCIPI GENERALI

•• Una molecola provvista di una carica netta ,in opportune condizUna molecola provvista di una carica netta ,in opportune condizioni, si ioni, si muove quando immessa in un campo elettricomuove quando immessa in un campo elettrico

•• Il fenomeno e’ chiamato elettroforesi e Il fenomeno e’ chiamato elettroforesi e puo’puo’ essere sfruttato per separare un essere sfruttato per separare un qualsiasi tipo di molecola carica all’interno di una miscela comqualsiasi tipo di molecola carica all’interno di una miscela complessaplessa

•• La La velocita’velocita’ di migrazione della molecola immessa nel campo elettrico e’ espdi migrazione della molecola immessa nel campo elettrico e’ espressa ressa dalla formula: v= dalla formula: v= EzEz/f con E = alla differenza di potenziale del campo elettrico, z=/f con E = alla differenza di potenziale del campo elettrico, z=alla carica netta della molecola ed f= al coefficiente di attritalla carica netta della molecola ed f= al coefficiente di attrito o frizionaleo o frizionale

•• In particolare il coefficiente frizionale f= 6πIn particolare il coefficiente frizionale f= 6πηηr dove r dove 6πr rappresenta il raggio di 6πr rappresenta il raggio di ingombro della molecola ed ingombro della molecola ed ηη il coefficiente di il coefficiente di viscositaviscosita’’ del mezzo. Questo significa del mezzo. Questo significa che molecole con dimensione diversa a che molecole con dimensione diversa a paritaparita’’ di carica elettrica ( di carica elettrica ( intensitaintensita’’ e e segno) migreranno con segno) migreranno con velocitavelocita’’ differenti nella stessa direzionedifferenti nella stessa direzione

••La condizione di La condizione di paritaparita’’ di carica elettrica in di carica elettrica in realtarealta’’ non non puopuo’’ essere essere realizzata in un sistema elettroforetico che operi su molecole drealizzata in un sistema elettroforetico che operi su molecole della stessa ella stessa natura (Dna) ma di dimensioni differenti. Infatti molecole natura (Dna) ma di dimensioni differenti. Infatti molecole piupiu’’ grandi grandi avrebbero una carica netta maggiore ma la maggiore avrebbero una carica netta maggiore ma la maggiore velocitavelocita’’ di migrazione di migrazione dovuta a tale dovuta a tale densitadensita’’ di carica sarebbe contrastata dal maggiore coefficiente di carica sarebbe contrastata dal maggiore coefficiente frizionale dovuto alle maggiori dimensioni con annullamento del frizionale dovuto alle maggiori dimensioni con annullamento del fenomeno fenomeno della migrazione. Lo stesso vale per le molecole della migrazione. Lo stesso vale per le molecole piupiu’’ piccole e con minore piccole e con minore coefficiente frizionale, che avrebbero perocoefficiente frizionale, che avrebbero pero’’ una carica netta minore.una carica netta minore.

•• Per separare quindi molecole con lo stesso tipo di carica ma coPer separare quindi molecole con lo stesso tipo di carica ma con differente n differente dimensione occorre utilizzare uno specifico supporto costituito dimensione occorre utilizzare uno specifico supporto costituito da un gel da un gel piuttosto che una soluzione libera. Il gel si comporta come un spiuttosto che una soluzione libera. Il gel si comporta come un setaccio molecolare etaccio molecolare annullando le differenze di annullando le differenze di velocita’velocita’ dovute alle differenze di dovute alle differenze di densita’densita’ elettrica e elettrica e separando le molecole solo in separando le molecole solo in virtu’virtu’ della loro dimensione relativadella loro dimensione relativa

•• Le molecole con dimensioni inferiori ai pori del gel migrerannoLe molecole con dimensioni inferiori ai pori del gel migreranno quindi quindi piu’piu’velocemente, quelle con dimensioni maggiori velocemente, quelle con dimensioni maggiori piu’piu’ lentamente e quelle con lentamente e quelle con dimensioni intermedie con dimensioni intermedie con velocita’velocita’ intermedie e apprezzabilmente differenti. Su intermedie e apprezzabilmente differenti. Su questo principio di questo principio di selettivita’selettivita’ poggia la separazione dei frammenti di PCR poggia la separazione dei frammenti di PCR mediante elettroforesi su gel di mediante elettroforesi su gel di agarosioagarosio

•• La natura chimica del gel e la sua concentrazione relativa , chLa natura chimica del gel e la sua concentrazione relativa , che possono essere e possono essere opportunamente scelte, determineranno sia l’ampiezza dei pori siopportunamente scelte, determineranno sia l’ampiezza dei pori sia la loro a la loro deformabilita’deformabilita’ permettendo quindi di separare con ottima risoluzione molecole permettendo quindi di separare con ottima risoluzione molecole di dimensioni anche molto simili.di dimensioni anche molto simili.

•• Normalmente un gel di Normalmente un gel di agarosoagaroso al 2al 2--2,5% riesce a separare in modo 2,5% riesce a separare in modo apprezzabile molecole con dimensioni comprese tra 2500 e 50 bps.apprezzabile molecole con dimensioni comprese tra 2500 e 50 bps. Tale tipo di Tale tipo di gel si presta bene all’analisi dei frammenti di PCR. Per risoluzgel si presta bene all’analisi dei frammenti di PCR. Per risoluzioni maggiori si ioni maggiori si possono utilizzare gel differenti (possono utilizzare gel differenti (acrilammideacrilammide) con opportune variazioni nelle ) con opportune variazioni nelle condizioni di preparazione e corsa del campione. condizioni di preparazione e corsa del campione.

•• Tecniche elettroforetiche particolari sono disponibili per la sTecniche elettroforetiche particolari sono disponibili per la separazione e eparazione e l’analisi di frammenti di DNA particolari come la PFGE per la sel’analisi di frammenti di DNA particolari come la PFGE per la separazione parazione dei cromosomi artificiali di Lievito o l’elettroforesi capillaredei cromosomi artificiali di Lievito o l’elettroforesi capillare per l’analisi dei per l’analisi dei frammenti di sequenza e dei marcatori frammenti di sequenza e dei marcatori microsatellitarimicrosatellitari

PREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIOPREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO

•• Pesare la Pesare la quantita’quantita’ di polvere di di polvere di agarosioagarosio ncessariancessaria

•• Disciogliere la polvere in un opportuno volume di Disciogliere la polvere in un opportuno volume di tampone elettroforetico TAE (0,4 M Tristampone elettroforetico TAE (0,4 M Tris--acetato 2mM acetato 2mM EDTA pH 8)EDTA pH 8)

•• Portare a ebollizione in forno a microondePortare a ebollizione in forno a microonde

•• Assemblare lo stampo per la solidificazione del gel (gel Assemblare lo stampo per la solidificazione del gel (gel TrayTray) e posizionare il pettine () e posizionare il pettine (combcomb) necessario alla ) necessario alla formazione dei pozzetti di caricamentoformazione dei pozzetti di caricamento

•• Dopo avere fatto raffreddare il gel (50Dopo avere fatto raffreddare il gel (50--60°C), aggiungere 60°C), aggiungere 1 µl di Soluzione madre di Bromuro di 1 µl di Soluzione madre di Bromuro di EtidioEtidio e versare e versare nello stamponello stampo

•• Dopo raffreddamento (1 ora) il pettine viene rimosso Dopo raffreddamento (1 ora) il pettine viene rimosso delicatamente ed il gel e’ pronto per il caricamento dei delicatamente ed il gel e’ pronto per il caricamento dei campionicampioni

••Preparare i campioni aggiungendo a 10 µl di PCR 5 µl di Preparare i campioni aggiungendo a 10 µl di PCR 5 µl di Sample Buffer 2X Sample Buffer 2X costitutitocostitutito da 0.2% Blue di da 0.2% Blue di BromofenoloBromofenolo, , 0,1% 0,1% XyleneXylene CyanolCyanol, 0,2mM EDTA e 50 % glicerolo in , 0,2mM EDTA e 50 % glicerolo in acquaacqua

•• Riempire a meta’ la camera di migrazione con tampone Riempire a meta’ la camera di migrazione con tampone elettroforetico e adagiare il gel nell’apposito supporto. elettroforetico e adagiare il gel nell’apposito supporto. Completare il riempimento della camera fino a ricoprire di Completare il riempimento della camera fino a ricoprire di tampone la superficie del geltampone la superficie del gel

••Caricare i campioni nei pozzetti direttamente sotto la Caricare i campioni nei pozzetti direttamente sotto la superficie del tampone; (Il colorante presente nel campione superficie del tampone; (Il colorante presente nel campione facilita questa operazione, mentre il glicerolo aumentandone facilita questa operazione, mentre il glicerolo aumentandone la la densita’densita’ ne impedisce la fuoriuscita) ne impedisce la fuoriuscita)

•• Connettere la camera al sistema di alimentazione e avviare Connettere la camera al sistema di alimentazione e avviare la corsa. (90V, 50mA) Bloccare la migrazione quando il la corsa. (90V, 50mA) Bloccare la migrazione quando il bleubleudi di bromofenolobromofenolo (scuro) e quello di (scuro) e quello di cyanolocyanolo (chiaro) si sono (chiaro) si sono nettamente separatinettamente separati

Visualizzare le bande di migrazione colorate con Visualizzare le bande di migrazione colorate con EtBrEtBr sotto raggi UVsotto raggi UV

PRINCIPALI PROBLEMI DELLA PCRPRINCIPALI PROBLEMI DELLA PCR

1)1) PRESENZA DI CONTAMINAZIONEPRESENZA DI CONTAMINAZIONE

1) Eseguire un esperimento pilota utilizzando1) Eseguire un esperimento pilota utilizzandoun solo campione, e 5 Mix differentiun solo campione, e 5 Mix differenticiascuna contenente tutti i reattivi utilizzaticiascuna contenente tutti i reattivi utilizzatinel primo esperimento e cambiando unnel primo esperimento e cambiando unsolo componente ( solo componente ( primersprimers, buffer , buffer etcetc))

2)Pulire accuratamente tutte le superfici di lavoro 2)Pulire accuratamente tutte le superfici di lavoro con con NaOHNaOH , usare sempre materiale , usare sempre materiale autoclavatoautoclavato eepuntali con filtro anti contaminazionepuntali con filtro anti contaminazione

2)2) Presenza di prodotti aspecifici Presenza di prodotti aspecifici piu’piu’ lunghi del prodotto desideratolunghi del prodotto desiderato

Ridurre il tempo di Ridurre il tempo di annealingannealingAumentare la temperatura di Aumentare la temperatura di annealingannealingRidurre il tempo di estensioneRidurre il tempo di estensioneRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di di primersprimersRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di Dnadi DnaRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di di TaqTaqCambio della coppia di Cambio della coppia di primersprimers

SpecificoSpecifico

Aspecifico AltoAspecifico Alto

3)3) Presenza di prodotti aspecifici Presenza di prodotti aspecifici piu’piu’ corti del prodotto desideratocorti del prodotto desiderato

Aumentare il tempo di Aumentare il tempo di annealingannealingAumentare la temperatura di Aumentare la temperatura di annealingannealingAumentare il tempo di estensioneAumentare il tempo di estensioneRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di di primersprimersRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di Dnadi DnaRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di di TaqTaqCambio della coppia di Cambio della coppia di primersprimers

SpecificoSpecifico

Aspecifico bassoAspecifico basso

4)4) Assenza di amplificatoAssenza di amplificato

Ricontrollare tutti i reattiviRicontrollare tutti i reattiviRiquantizzareRiquantizzare il Dnail DnaCambiare la miscela di Cambiare la miscela di dNTPsdNTPs molto sensibile ai cicli molto sensibile ai cicli di congelamento e scongelamentodi congelamento e scongelamentoRidurre di 4Ridurre di 4--6°C la temperatura di 6°C la temperatura di annealingannealingRisintetizzareRisintetizzare i i PrimersPrimers

4)4) Prodotto specifico ma in Prodotto specifico ma in quantita’quantita’ ridottaridotta

Aumentare la Aumentare la quantita’quantita’ dei dei primersprimersAumentare la Aumentare la quantita’quantita’ della della TaqTaqAumentare la Aumentare la quantita’quantita’ di Dnadi DnaRidurre gradualmente la temperatura di Ridurre gradualmente la temperatura di annealingannealingUtilizzare DMSO o gliceroloUtilizzare DMSO o glicerolo

Real time PCR

La PCR in tempo reale è una implementazione della PCR che permette di avere informazioni quantitative più precise sulle concentrazioni relative di cDNAamplificati e dei loro mRNA corrispondenti.

Il modo più facile per identificare, al suo primo apparire, un prodotto di PCR è quello di monitorare di continuo l’andamento della reazione, senza dover interrompere la reazione per poterla visualizzare su gel. La real time PCR risolve questo problema utilizzando precursori fluorescenti, come il SYBR Green, che vengono incorporati nel prodotto in formazione o che si intercalano alla doppia elica, man mano che si forma. In ogni caso sarà possibile monitorare in tempo reale la formazione del prodotto di amplificazione seguendone l’assorbimento con un sistema spettrofotometrico, in un sistema automatizzato che provvede anche alla routine della PCR.

0

200000000

400000000

600000000

800000000

1000000000

1200000000

1400000000

1600000000

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR CYCLE NUMBER

AM

OU

NT

OF

DN

A

CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512

10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000

Nel corso di un’amplificazione per PCR il numero deiprodotti aumenta esponenzialmente ad ogni ciclo, perpoi arrivare a plataux dopo circa 30 cicli. Se riportiamoIn un grafico l’accumulo dei prodotti di PCR, in scalaaritmetica, non riusciamo ad evidenziare alcuna ampli-ficazione durante i primi 20-25 cicli, mentre riusciamo Ad apprezzare bene la parte della curva che da 25 a 30cicli appare lineare

Curve di accumulo teoriche

NIN7 NIN7 proteinprotein localisation, localisation, transienttransient expressionexpression

Arabidopsis Protoplast

35S::NIN7-GFP

NIN7-GFP is localised in the nucleus but excluded of the nucleoleand agregates in speckle-like structures. It is consistent with the putative role of NIN7 as a transcription regulator.

Pictures:

Lionel Gissot

KanaR

pMDC 83

cNIN7

attB1

attB2Hyg

roR

2X35S

RB

B

GFP6