“TECNICHE DI ANALISI STRUMENTALE E STATISTICHE” · DNA RNA PROTEINA La biologia molecolare. Le...
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“TECNICHE DI ANALISI STRUMENTALE E STATISTICHE”
Docente: Dott. Agostino Sorgonà
Dipartimento di Biotecnologie per il Monitoraggio Agroalimentare ed Ambientale
(BIO.M.A.A.)
0965801266 (ufficio)0965801223 (lab)[email protected]
Corso di Formazione Interna
Università Mediterranea di Reggio Calabria
MERCOLEDI’ 30 GENNAIO ORE 8:30
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria
ACIDI NUCLEICI
Lezione frontale (1 ora)
Esercitazioni da laboratorio (3 ore): Estrazione e purificazione, analisi spettrofotometrica, reazione a catena della polimerasi (PCR), elettroforesi su
gel di agarosio.
MERCOLEDI’ 6 FEBBRAIO ORE 9:30
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria
ANALISI D’IMMAGINE
Lezione frontale (1 ora)
Esercitazioni da laboratorio (1 ora): analisi morfologica ed architettonica dell’apparato radicale
mediante il sistema informatico WinRhizo.
VENERDI’ 8 FEBBRAIO 8:30
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria
LA FOTOSINTESI E LA RESPIRAZIONE
Lezione frontale (1 ora)
Esercitazioni da laboratorio (3 ore): misurazione della respirazione del suolo mediante il sistema LiCOR.
VENERDI’ 22 FEBBRAIO ORE 9:00
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria
METODOLOGIE STATISTICHE
Lezione frontale (1 ora): Disegno sperimentale, ANOVA, test post-hoc, Regressione lineare e
correlazione, Regressione non lineare
Esercitazioni da laboratorio (2 ore): utilizzo di alcuni software di statistica ed approfondimento su
articoli scientifici.
MARTEDI’ 26 FEBBRAIO ORE 8:30
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria
MICROSCOPIA
Lezione frontale: (1 ora)
Esercitazioni da laboratorio (3 ore): dal microscopio ottico a quello a fluorescenza
VENERDI’ 29 FEBBRAIO ORE 9:00
AULA M – Laboratorio di Agrochimica ed Agrobiologia Facoltà di Agraria
VERIFICA FINALE CON TEST A RISPOSTA MULTIPLA (3 ore)
IL LABORATORIO DI BIOLOGIA MOLECOLARE:
TECNICHE DI BASE ED APPLICAZIONI
Che cosa è il DNA o il RNA?
Che cosa è il gene o l’espressione genica?
Quali campi scientifici sono interessati a queste molecole o
strutture funzionali cellulari o processi biologici?
Quali sono le tecniche per la loro quantificazione?
La biologia molecolare studia i meccanismi molecolari
che sottintendono i processi biochimici, fisiologici e
morfologici degli esseri viventi.
Quali sono i meccanismi molecolari?
Le interazioni tra le macromolecole quali le
proteine e gli acidi nucleici (DNA e RNA)
DNA RNA PROTEINA
La biologia molecolare
Le tecniche e le nozioni della biologia molecolare
Obiettivi
genetica biologia l’evoluzionistica filogenetica
la genetica classica si occupa di come i
caratteri sono ereditati nelle
progenie; la biologia molecolare, invece, studia l’ereditarietà
dei caratteri a livello molecolare,
cioè di DNA
Confrontando il patrimonio genetico di individui differenti
attraverso le tecniche di biologia molecolare, si possono
determinare le relazioni ancestrali fra specie note (filogenetica) oppure il
cambiamento di tale patrimonio (evoluzionistica).
GLI ACIDI NUCLEICI: IL DNA E IL RNA
Gli acidi nucleici sono dei composti (acidi) presenti nel nucleo della cellula o comunque lì prodotti
Macromolecole: struttura abbastanza grande
macromolecole polimeriche lineari
DNAOgni filamento può contenere diversi milioni di nucleotidi. Ad esempio, il più grande cromosoma
umano (il cromosoma 1) contiene quasi250 milioni di paia di basi
Struttura RNA
Nucleotide = base azotata + zucchero pentoso + gruppo fosfato
La struttura basilare degli acidi nucleici è il nucleotide.
Nucleoside = zucchero + base azotata
Struttura del DNA
Zucchero del DNA è il deossiribosio;
le basi azotate sono Adenina(A)
Guanina (G)Citosina (C)Timina (T).
scheletro lateraledeterminato da legami fosfodiesterici tra il gruppo fosfato di un
nucleotide ed il carbonio in posizione 5’ dello zucchero del successivo nucleotide. Il gruppo
fosfato fa da ponte per il legame del carbonio 3’ dello zucchero di un
nucleotide con quello 5’
del nucleotide successivo
ogni filamento di DNA ha un senso:estremità 5’ se si inizia con il
legame del carbonio in posizione 5’viceversa, si definisce estremità 3’
se il filamento inizia con il carbonio 3’..
La parte interna presenta la base azotata legata allo zucchero
Doppio filamento o doppia elica: associazione tra i due filamenti
mediante legami ad idrogeno tra le due basi opposte
↓Appaiamento delle basi dove l’Adenina
(composto purinico) può legare solamente la Tiamina (composti
pirimidinico), così come la Guaninalega solamente la Citosina.
Doppia elica che, con l’avvitarsi su sé stessi dei due filamenti, restano esposti dei solchi definiti maggiore e
minore.
Funzioni biologiche del DNA
L’acido deosirbunucleico (DNA) contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto
funzionamento della maggior parte degli organismi viventi.
come l’informazione genetica è contenuta nel DNA?come questa viene tradotta materialmente in proteine?
Il DNA è solitamente presente all'interno di
cromosomi lineari (circolari nei
procarioti) che sono presenti nel nucleo
cellulare
La somma di tutti i cromosomi di una cellula costituisce il genoma che è l’insieme dei geni di un organismo e pertanto viene anche definito patrimonio
genetico
Il genoma umano è costituito da 46 cromosomi e da circa 3 miliardi di paia di basi.
Organismo Numerodi cromosomi
Numero di copiedi cromosomi Tipo Dimensione (Mbps)
Mycoplasma genitalium 1 1 circolare 0,58
Escherichia coli K12 1 1 circolare 4,6
Agrobacterium tumefaciens 4 1 3 circolari1 lineare 5,67
Sinorizhobium melioti 3 1 circolare 6,7
Saccharomyces cerevisiae 16 1 o 2 lineare 12,1
Schizosaccharomyces pombe 3 1 o 2 lineare 12,5
Caenorhabditis elegans 6 2 lineare 97
Drosophila melanogaster 4 2 lineare 180
Tetrahymena termophila m: 5M: 225
m: 2M: 10-10000 lineare 220 (M)
Fugu rubripes 22 2 lineare 365
Mus musculus 19+X+Y 2 lineare 2500
Homo sapiens 22+(X o Y) 2 lineare 2900
Perché il DNA contiene l’informazione genetica? E che cos’è l’informazione genetica?
L’informazione genetica è scritta nella catena del DNA secondo un codice detto Codice Genetico che mette in corrispondenza le basi
azotate con gli aminoacidi (unità strutturali delle proteine).
Ciascuna parola del codice è costituita da una serie di tre basi, detta codoneche indica agli organi
effettori (RNA e ribosomi) di prelevare un
determinato amminoacido e di legarlo alla catena polipeptidica della proteina costituenda
Utilizzando gruppi di tre lettere si possono avere fino a 64 combinazioni diverse (43), in grado di
codificare per i venti diversi amminoacidi esistenti
La timina ripetuta in una serie di tre (TTT) rappresenta in particolare l'amminoacido fenilalanina
Il codice genetico è detto ridondante (o degenere): alcuni amminoacidi possono infatti essere codificati da più triplette diverse.
64 triplette 20 Aminoacidi
Esistono infine tre triplette che non codificano per amminoacidi ma per codoni di stop (o nonsense), ovvero
indicano il punto in cui in un gene termina la parte che codifica per la proteina corrispondente: si tratta di TAA,
TGA e TAG.
Che cos’è un gene?
Il gene è l’unità ereditaria degli organismi viventi
Strutturalmente, i geni sono sequenze di DNA che codificano per una proteina
1. Gli esoni sono la sequenza di DNA che poi viene tradotta in
proteina;2. gli introni sono delle sequenze che spaziano gli esoni e che non vengono
tradotte o meglio vengono eliminate attraverso la maturazione del RNA;
3. i promotori e i terminatorisono regioni del gene che
regolano l’espressione genica.
Struttura del RNA
L'acido ribonucleico (RNA o ARN) è un polimero organico, risultante dalla polimerizzazione di
ribonucleotidi.
Le molecole di RNA differiscono da quelle di DNA perché:
1. contengono lo zucchero ribosio (con un gruppo OH legato al carbonio 2') anziché il deossiribosio (da qui il nome)
2. una delle basi, la timina, è sostituita dall'Uracile(U). In questo caso è l'uracile a legarsi all'adenina,
mentre la guanina si lega sempre alla citosina;
3. sono di solito a singolo filamento, anziché a filamento doppio.
L'RNA messaggero(noto con
l'abbreviazione di mRNA o con il termine più generico di
trascritto) è un tipo di RNA che codifica e porta
informazioni durante la
trascrizione dal DNA ai siti della sintesi proteica,
per essere sottoposto alla
traduzione
1. un cappuccio 5’ (nucleotide guaninico
metilato in posizione 7) che è importante per il
riconoscimento e l'aggancio appropriato
dell'mRNA al ribosoma;
2. Regioni codificanti che sono composte da codoni
che vengono decodificati e tradotti in proteine
dai ribosomi. Le regioni codificanti cominciano
con un codone di inizio e terminano con tre
possibili codoni di stop;
3. Regioni non codificanti che sono posizionate
prima del codone d'inizio (3' UTR, untranslated
region) e dopo il codone di stop (5' UTR,
untranslated region) e non sono tradotte in
proteine. La loro funzione è quella di
stabilizzare e di localizzare il mRNA e di rendere
più efficiente il processo di traduzione.
L'RNA transfer (o RNA di
trasporto), abbreviato in tRNA, è una
piccola catena di RNA (di 74-93 nucleotidi) che trasferisce un amminoacido
specifico ad una catena
polipeptidica in crescita al sito ribosomiale della sintesi proteica
durante la traduzione.
La struttura secondaria o a trifoglio del tRNA:
1. braccio accettorechiamato anche braccio amminoacidico che ha la
funzione di attacco dell’aminoacido;
2. un trinucleotide molto conservato dalla sequenza CCA (detta anche coda CCA) presente alla terminazione
3' del braccio, che è importante per il
riconoscimento dei tRNAdurante la traduzione;
3. braccio D che è una regione contenente un loop
4. braccio A o braccio
dell'anticodone che è composto da 5 paia di basi e termina in un loop contenente
l'anticodone;
5. braccio T, composto da 5 paia di basi, contiene una sequenza molto
conservata TTC
L’anticodone è costituito da tre nucleotidi che
corrispondono alle tre basi del codone letto dal mRNA. Quindi, ogni specifico anticodone di
tRNA contiene una sequenza (tripletta) che può appaiarsi ad uno o più codoni per
uno stesso amminoacido.
Ad esempio, consideriamo il tRNAdella fenilalanina il cui anticodone è AAG
questo si appaia con il codone della
fenilalanina che è TTC
L'RNA ribosomiale (o RNA
ribosomale, abbreviato
come rRNA) è il tipo di
RNA più abbondante
presente nella cellula.
Non codifica direttamente
le proteine, ma è il
componente essenziale
(circa i due terzi) dei
ribosomi, macchine
catalitiche che
provvedono
all'assemblaggio delle
proteine, presenti in
tutte le cellule viventi.
Il dogma centrale della biologia
“Il flusso dell'informazione genetica è monodirezionalee parte dagli acidi nucleici ed arriva alla formazione
delle proteine” (Crick, 1957)
1. l'informazione genetica è conservata nel DNA;2. l'informazione genetica viene trascritta sotto forma di
RNA (processo di trascrizione);3. l'informazione genetica viene successivamente tradotta
a proteine, la forma "operativa" dell'informazione contenuta nel genoma (processo di traduzione).
Il dogma centrale costituisce il meccanismo di base dell'espressione dei geni
Il processo di trascrizione
Il processo di trascrizione è quello mediante il quale le
informazioni (sequenza delle basi) contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente(grazie alle RNA polimerasi) in una
molecola complementare di RNA
(mRNA).
RNA polimerasi
mRNA
DNA
La trascrizione procede in direzione 5' → 3'. Più precisamente, il
filamento lungo il quale il DNA viene scansìto, detto filamento stampo, è percorso dall'enzima
RNA polimerasi in direzione 3' → 5'.
Operativamente, viene costruito un filamento di
mRNA con delle basi azotate complementari a
quelle del DNA
1a fase
riconoscimento del
promotore da parte
della proteina TBP
(TATA Binding
Protein) che ha la
funzione di
produrre due forti
piegature al DNA (o
kink) a livello
della sequenza TATA
che inducono in
questo punto un
angolo di circa 90°
proteina TBP
DNA
2a fasepulizia del promotore(eliminazione dei
fattori che legavano il promotore)
3a faseAllungamento (aggiunta di ribonucleotidi con codoni complementari al filamento stampo del
DNA)
4a faseInfine, la trascrizione
si conclude con il processo di terminazione
L'enzima responsabile di questo processo è la
Trascrittasi inversa, e deve il nome proprio al fatto
che è in grado di compiere il passaggio inverso
rispetto agli altri enzimi responsabili della
trascrizione, che cioè sintetizzano RNA a partire da
DNA
La retrotrascrizione è utilizzata in esperimenti di ingegneria genetica dove a partire da mRNA purificato si sintetizza del DNA complementare (cDNA), normalmente privo di introni che può venire
utilizzato per il clonaggio e la manipolazione del gene corrispondente
La retrotrascrizione (o trascrizione inversa) è la
capacità da parte di particolari enzimi di sintetizzare
una molecola di DNA a partire da RNA.
Il processo di traduzione
La traduzione o detta anche sintesi proteica è un meccanismo attraverso il quale il filamento mRNA, dopo essere stato trascritto, viene "letto" dalle unità di
rRNA e tradotto in proteine
1a fase
L'inizio della sintesi
avviene grazie al legame
tra i ribosomi con il
codone di avvio (start)
dell'mRNA, che indica il
punto in cui inizia la
codificazione della
proteina. Questo codone
negli eucarioti è
generalmente AUG (adenina-
uracile-guanina) a cui
corrisponde l'amminoacido
metionina. La subunità
ribosomiale che si lega al
mRNA è quella superiore
Ribosoma
mRNA
tRNA
2a fase
A questo punto entra in
gioco il tRNA iniziatore
che accoppia le sue basi
con quelle del codone di
avvio e si lega al sito
P del ribosoma (sito
posto nella subunità
inferiore). La sub-unità
maggiore forma quindi un
complesso con quella
minore.
3a fase
Successivamente avviene la
cosiddetta fase di
allungamento. Un nuovo
tRNA entra sul sito A
(posto nella subunità
inferiore) del ribosoma ed
accoppia le sue basi con
quelle dell'mRNA
4a fase
L'enzima peptidil
transferasi crea un legame
peptidico tra gli
amminoacidi vicini.
Quindi, l'amminoacido sul
sito P si stacca dal suo
tRNA.
Il ribosoma si muove lungo
l'mRNA spostando il tRNA dal
sito A al sito P liberando
nel contempo il tRNA vuoto.
Questo processo è noto come
traslocazione.
5a fase
Questo processo continua finché il ribosoma non incontra uno
dei tre possibili codoni di arresto (stop), che sono UAG,
UAA, UGA. Questa è la fase di terminazione. La crescita della
proteina si interrompe ed i fattori di rilascio, proteine che
simulano l'azione del tRNA, si legano al sito A e liberano la
proteina nel citoplasma
Il DNA nell’ingegneria genetica
Organismi geneticamente modificati (OGM): sequenze di DNA
(geni) interessanti possono essere inseriti all'interno del
loro genoma.
In questo caso si parla di DNA ricombinante cioè di segmenti
di DNA realizzati e assemblati artificialmente.
Agricoltura Alimentazione Medicina Industria
Batteri
batteri che introdotti nel suolo ne migliorano le caratteristiche (es. batteri azoto-fissatori) o proteggono le piante dal gelo (batteri ice-minus)
produzione di sostanze medicinali come l'insulina
biorimedi (es. batteri che degradano idrocarburi)
Agricoltura Alimentazione Medicina Industria
Miceti
1. produzione di enzimi usati nell'industria alimentare, 2. miglioramento dei processi di fermentazione (es. produzione della birra)
produzione di biomedicine
Agricoltura Alimentazione Medicina Industria
Piante
1. miglioramento delle pratiche agronomiche: es. piante tolleranti allo stress idrico o salino,
colture tolleranti a specifici erbicidi 2. introduzione di
caratteri di resistenza specifica: es. piante
resistenti agli insetti o ai virus
3. produzione di energia: varietà con piùelevato potere calorico
e minori richieste di input chimici utilizzabili anche su aree marginali
miglioramenti nelle qualità nutrizionali e organolettiche: es.
riso ad elevato contenuto in beta-
carotene, pomodoro a maturazione
rallentata
produzione di farmaci/composti in
pianta (molecularfarming): produzione a
basso costo di sostanze
farmaceutiche e chimiche, riduzione degli scarti chimici
industriali (es. vaccino contro
l'epatite, produzione di amilasi).
1. miglioramento delle caratteristiche richieste a livello industriale delle
materie prime (es. pioppo con un tasso di lignite inferiore per
facilitare il processo di fabbricazione
della pasta da carta) 2. fitodepurazione(es. piante capaci di
estrarre metalli quali oro, rame e uranio, piante in
grado di degradare il tritolo o di segnalare la presenza di radiazioni)
Agricoltura Alimentazione Medicina Industria
Animali
produzioni animali con migliori caratteristiche nutrizionali o organolettiche: es. latte con più alto contenuto in caseina, latte senza lattosio
1. produzione di biomedicine2. modelli per la ricerca su malattie umane (es. l'oncotopo) 3. animali donatori di organi per xenotrapianti
Il DNA nella medicina forense
La medicina forense si serve del DNA
presente nel sangue, nella pelle,
nella saliva, nei capelli e in altri
tessuti e fluidi biologici per
identificare il responsabile di un
delitto.
Il processo mediante cui è possibile
realizzare ciò è il fingerprinting
genetico: tale tecnica consiste nel
comparare la lunghezza delle sezioni
variabili del DNA ripetitivo che
possono risultare molto diverse tra
i diversi individui.
Il DNA nella bioinformatica
La bioinformatica è una branca della biologia che
comprende la manipolazione, la ricerca dei dati
relativi a sequenze di DNA.
L’obiettivo della bioinformatica è quello di risolvere problemi biologici con metodi informatici.
Gli algoritmi di ricerca (o appaiamento) di stringhe sono in grado di individuare la presenza di una sequenza di lettere all'interno di sequenze
molto più ampie quali quelle presenti nel DNA.
Identificano le sequenze omologhe ed individuano le specifiche mutazioni che le rendono differenti. Queste tecniche sono utilizzate per studiare le
relazioni filogenetiche e la funzione delle proteine.
Il DNA nella storia ed antropologia
Grazie alla proprietà del DNA di subire delle mutazioni che a
loro volta vengono ereditate, esso contiene informazioni
preziose che possono essere utilizzate dai genetisti per
studiare l'evoluzione degli organismi e la loro filogenesi
L’espressione genica
L’espressione genica è quel processo attraverso il
quale l'informazione contenuta in un gene viene
convertita in una macromolecola funzionale,
tipicamente una proteina.
La regolazione dell'espressione genica è fondamentale per la
cellula, perché le permette di controllare le proprie
funzioni interne ed esterne, come la differenziazione
cellulare, la morfogenesi o i vari processi di adattamento
alle necessità dell'organismo.
Come si misura l’espressione genica? E soprattutto che cosa si misura?
Misura del trascrittoma
Trascrittoma: insieme di tutti i trascritti (mRNA) di un dato organismo o tipo cellulare
La quantità di mRNA è un dato di
notevole interesse nella
misura dell'espressione
genica.
siRNA, piccole molecole di RNA in grado di portare alla
degradazione del trascritto
Northern blot: processo attraverso il quale un estratto
di RNA proveniente dal sistema biologico da analizzare
viene dapprima separato in un gel di agarosio, quindi
ibridato con una sonda radioattiva (sequenza di DNA
complementare all'RNA da identificare, marcata con un
isotopo radioattivo quale 32P) complementare al solo RNA
di interesse.
Il Northern blot è una tecnica utilizzata sempre più raramente, a causa delle problematiche
correlate all'uso di reagenti radioattivi e della scarsa sensibilità nella quantizzazione.
Real-time polymerase chain reaction (real-time PCR) o
la reverse transcriptase-polymerase chain reaction
(RT-PCR): permettono di quantificare la presenza di
un determinato trascritto anche in pochi nanolitri di
estratto cellulare
Costi per gli strumenti ed i reagenti sono proibitivi
DNA microarray: fornisce un'analisi contemporanea di
migliaia di differenti mRNA attraverso l'utilizzo di
supporti che contengono migliaia di sonde di DNA
complementari ai trascritti della cellula
Misura del proteoma
Il proteoma indica l’insieme di proteine presenti in
un organismo o le proteine prodotte da un genoma
Western blot attraverso il quale, in seguito alla
separazione su un gel di poliacrilammide delle
proteine contenute in un estratto cellulare, è
possibile individuare e quantificare una singola
proteina attraverso l'uso di un anticorpo specifico.
Tale anticorpo, infatti, può essere legato da un
altro anticorpo (detto secondario) a cui è coniugato
un sistema di rivelazione quale un fluorocromo che
permetta la quantificazione.
Per quantizzare una particolare proteina si può
fondere il gene che codifica per tale prodotto
proteico con un gene reporter, come la Green
Fluorescent Protein (marcatore nelle indagini di
identificazione e localizzazione subcellulare delle
proteine), che può essere agevolmente visualizzata
attraverso un microscopio a fluorescenza.
Tecniche di base e applicazioniTecniche di base e applicazioni
GENOMICA GENOMICA PROTEOMICAPROTEOMICA
Dna Dna RnaRna ProteinaProteina
ESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNA11a a FASEFASE
Lisi: Lisi: rialasciorialascio di DNA solubile ad alto peso molecolare da parte delle cellule di DNA solubile ad alto peso molecolare da parte delle cellule con parete e con parete e membrane membrane dannegiatedannegiate;;
22a a FASEFASE
Estrazione: dissociazione dei complessi DNAEstrazione: dissociazione dei complessi DNA--PROTEINE (denaturazione e/o proteolisi);PROTEINE (denaturazione e/o proteolisi);
33a a FASE FASE
Purificazione: separazione del DNA dalle altre MACROMOLECOLE (prPurificazione: separazione del DNA dalle altre MACROMOLECOLE (proteine, oteine, polissacaridipolissacaridi, ecc.), ecc.)
Batteri Lieviti Batteri Lieviti Tessuti animali Tessuti vegetaliTessuti animali Tessuti vegetali
Fortemente dipendente dal materiale Biologico di partenzaFortemente dipendente dal materiale Biologico di partenza
ESTRAZIONE DEL DNAESTRAZIONE DEL DNA
LISI CELLULARELISI CELLULARE
Si utilizzano tamponi contenenti SDS o CTAB; Tris Si utilizzano tamponi contenenti SDS o CTAB; Tris ––HCLHCL; EDTA; Proteinasi K.; EDTA; Proteinasi K.
Con aggiunta di agenti denaturanti per le proteine come la guaniCon aggiunta di agenti denaturanti per le proteine come la guanidina dina idroclorideidrocloride..
Durata: dai 30 minuti alle 3 ore (a seconda del tipo di matrice Durata: dai 30 minuti alle 3 ore (a seconda del tipo di matrice utilizzato) alla temperatura di 60utilizzato) alla temperatura di 60--65°C, in costante agitazione.65°C, in costante agitazione.
ESTRAZIONEESTRAZIONE
Aggiunta di cloroformio o fenolo alla fase acquosa del lisato (qAggiunta di cloroformio o fenolo alla fase acquosa del lisato (quest’azione provoca la uest’azione provoca la denaturazione delle proteine).denaturazione delle proteine).
PURIFICAZIONEPURIFICAZIONE
Aggiunta di Aggiunta di isopropanoloisopropanolo alla fase acquosa ottenuta dopo il passaggio in cloroformio o falla fase acquosa ottenuta dopo il passaggio in cloroformio o fenolo. enolo. Questo passaggio provoca la precipitazione del DNA sul fondo delQuesto passaggio provoca la precipitazione del DNA sul fondo della provetta.la provetta.
LAVAGGIO LAVAGGIO
AggiutaAggiuta di etanolo 75% al di etanolo 75% al pelletpellet (DNA puro).(DNA puro).
Aggiunta di acqua sterile (40Aggiunta di acqua sterile (40--60 60 µl).µl).
PREPARAZIONE DI DNA BATTERICOPREPARAZIONE DI DNA BATTERICO
ESTRAZIONEESTRAZIONE
- Centrifugazione della coltura in Centrifugazione della coltura in sospensionesospensione
--RisospensioneRisospensione delle cellule in delle cellule in tampone contenente tampone contenente RnaseRnase
-- Rottura della parete Rottura della parete peptidoglicanicapeptidoglicanica mediante lisi mediante lisi alcalina o enzimatica (alcalina o enzimatica (NaOHNaOH o o Lisozima) in presenza di Lisozima) in presenza di guanidioguanidioisotiocianatoisotiocianato
-- Centrifugazione e recupero del Centrifugazione e recupero del sopranatante contenente l’estratto sopranatante contenente l’estratto cellularecellulare
PREPARAZIONE DI DNA BATTERICOPREPARAZIONE DI DNA BATTERICO
PURIFICAZIONEPURIFICAZIONE
DNA CromosomicoDNA Cromosomico
DNA DNA PlasmidicoPlasmidico
Cromosoma Cromosoma battericobatterico
PlasmidiPlasmidi
VALUTAZIONE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DEL DNAVALUTAZIONE QUANTITATIVA E QUALITATIVA DEL DNA
Conoscere la concentrazione del DnaConoscere la concentrazione del Dna
Verificare il suo grado di purezzaVerificare il suo grado di purezza
METODO SPETTROFOTOMETRICOMETODO SPETTROFOTOMETRICO
METODO ELETTROFORETICOMETODO ELETTROFORETICO
QUANTIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DEL DNAQUANTIZZAZIONE SPETTROFOTOMETRICA DEL DNA
CENNI TEORICICENNI TEORICI
•• Metodo spettroscopicoMetodo spettroscopico
•• Specifica Specifica λλ per ogni sostanzaper ogni sostanza
•• Utilizza la legge di Lambert e Utilizza la legge di Lambert e BeerBeer
•• T= IT= I00/I/I11
•• OD= OD= --log 1/Tlog 1/T
•• OD= OD= l•kl•kee•C•C
• In una cuvetta di quarzo porre 1ml di acqua (bianco) e azzerare lo strumento.
• Preparare una cuvetta di quarzo contenente 698ul di H20 e qaggiungere 2ul della soluzione di DNA (diluizione 1:350).
• Coprire con parafilm e miscelare capovolgendo delicatamente la cuvetta.
• Introdurre la cuvetta nello spettrofotometro e leggere l'assorbanza (A) a 260 nm.
• Tornare sul bianco spostare la lunghezza d'onda a 280nm. Azzerare lo strumento.
• Passare al campio e leggere l'A280. • Coi risultati ottenuti, calcolare la concentrazione di DNA
sapendo che in una cuvetta con un cammino di 1 cm, il DNA a doppio filamento alla concentrazione di 50ug/ml ha un assorbimento di 1 a 260nm:
Concentrazione DNA /ug/ml)= A260nm x 50/ 1 unita’ di
assorbanza Calcolare il rapporto delle letture a 260nm e 280nm. Tale rapporto dovrebbe essere >= 1.7 per una preparazione pura di DNA. Se il rapporto è < di 1.7 significa che è presente una contaminazione da parte delle proteine.
POLYMERASE CHAIN REACTION:POLYMERASE CHAIN REACTION:
CHE COSA E’ LA PCR?CHE COSA E’ LA PCR?
La PCR (La PCR (PolymerasePolymerase ChainChain ReactionReaction) ) è un metodo attraverso cui una è un metodo attraverso cui una sequenza di acido nucleico più essere sequenza di acido nucleico più essere amplificata esponenzialmente in vitro. amplificata esponenzialmente in vitro. Lo stesso metodo può essere usato per Lo stesso metodo può essere usato per modificare la sequenza amplificata o modificare la sequenza amplificata o per aggiungerle nuova informazione di per aggiungerle nuova informazione di sequenza. Requisito fondamentale e’ sequenza. Requisito fondamentale e’ che le estremità della sequenza da che le estremità della sequenza da amplificare siano conosciute con amplificare siano conosciute con sufficiente precisione per poter sufficiente precisione per poter sintetizzare degli sintetizzare degli oligoprimersoligoprimers che che fungano da innesco per la reazione di fungano da innesco per la reazione di amplificazioneamplificazione
3- POLIMERASI TERMOSTABILE (NON VIENE DENATURATA SE PORTATA A 95° C)
1- DUE OLIGONUCLEOTIDI COMPLEMENTARIA DUE REGIONI SITUATE SU FILAMENTI OPPOSTI DEL DNA STAMPO AI LATI DELLA REGIONE CHE SI VUOLE AMPLIFICARE
2- DNA STAMPO CHE CONTENGA LA REGIONE DA AMPLIFICARE
ELEMENTI NECESSARI ALLA REAZIONE:
4- I 4 DESOSSIRIBONUCLEOSIDI TRIFOSFATI
2-APPAIAMENTO: TEMP. 50-60°C . I PRIMERS SI APPAIANO CON IL DNA STAMPO
PROCESSO DI PCR PREVEDE UN CERTO NUMERO DI CICLI. OGNI CICLO CONSISTE DI 3 PASSAGGI:
1- DENATURAZIONE: TEMP. 94°C. IL DNA STAMPOVIENE DENATURATO
3- SINTESI: TEMP.72°C E’ OTTIMALE PER IL FUNZIONAMENTO DELLA Taq (Termus aquaticus) POLIMERASI
5’ -3’3’ 5’
5’ -3’
3’ 5’
Denaturazione
5’ -3’
3’ 5’
Annealing5’
5’
3’
3’
5’ -3’
3’ 5’
Estensione5’
5’
3’
3’
POLYMERASE CHAIN REACTION:POLYMERASE CHAIN REACTION:
COMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCRCOMPONENTI DELLA REAZIONE DI PCR
•• Dna Genomico, Dna Genomico, plasmidicoplasmidico, , fagicofagico (100(100--200 ng)200 ng)
•• PrimersPrimers di innesco (02di innesco (02--05 µM) 05 µM)
•• dNTPdNTP (150(150--250 µM)250 µM)
•• Tampone di reazione (50mM Tampone di reazione (50mM KClKCl, 50 mM , 50 mM TrisTris--HClHCl pH 8.3, 1.5mM pH 8.3, 1.5mM Mg(Mg(OacOac))2 2
•• Dna polimerasi (Dna polimerasi (TaqTaq, , PfuPfu, 5U/100 µl reazione) , 5U/100 µl reazione)
•• Additivi (DMSO, glicerolo, Additivi (DMSO, glicerolo, FormamideFormamide BSA) BSA)
POLYMERASE CHAIN REACTION:POLYMERASE CHAIN REACTION:
Criteri di scelta e ottimizzazione dei singoli compCriteri di scelta e ottimizzazione dei singoli componentionenti
PRIMERSPRIMERSA) A) Complementarieta’Complementarieta’ con le sequenze che precedono e seguono il con le sequenze che precedono e seguono il frammento da amplificareframmento da amplificare
5’5’
3’3’
3’3’
5’5’
B) Lunghezza del B) Lunghezza del primerprimer: Tale parametro influisce sia sulla temperatura : Tale parametro influisce sia sulla temperatura di di annealingannealing sia sulla sia sulla specificita’specificita’. Il valore ottimale e’ compreso tra 18 . Il valore ottimale e’ compreso tra 18 --24 24 bpsbps
C) C) Assenza di Assenza di autocomplementarieta’autocomplementarieta’
5'-CGATAGTGGGATCTAGATCCC-3'
3'-CCCTAGATCTAGGGTGATACG-5'
D) Temperatura di D) Temperatura di meltingmelting::
Temperatura alla quale la meta’ di una popolazione di molecole dTemperatura alla quale la meta’ di una popolazione di molecole di Dna i Dna si trova ancora nello stato di doppia elicasi trova ancora nello stato di doppia elica
Esprime una misura della stabilita’ tra Dna Esprime una misura della stabilita’ tra Dna templatotemplato e e primerprimer
La La TmTm di un ibrido in soluzione dipende dalla concentrazione di un ibrido in soluzione dipende dalla concentrazione salina, dalla composizione in basi e dalla presenza di agenti salina, dalla composizione in basi e dalla presenza di agenti denaturanti. Gli effetti di questi parametri sono combinati in denaturanti. Gli effetti di questi parametri sono combinati in un’unica equazione [un’unica equazione [MienkothMienkoth e e WahlWahl, 1984]:, 1984]:TmTm = 81,5 +16,6 (log M) + 0,41 (% G+C) = 81,5 +16,6 (log M) + 0,41 (% G+C) -- 0,61 (% 0,61 (% formform) ) --dove M è la molarità dei cationi monovalenti, (% G+C) è la dove M è la molarità dei cationi monovalenti, (% G+C) è la percentuale di guanine e citosine nel DNA, (% percentuale di guanine e citosine nel DNA, (% formform) è la ) è la percentuale di percentuale di formammideformammide nella soluzione.nella soluzione.La formula empirica che nell’uso pratico viene adottata e’:La formula empirica che nell’uso pratico viene adottata e’:
TmTm = 2 (A+T) + 4 (G+C)= 2 (A+T) + 4 (G+C)
E) Contenuto in GC e AT: compreso tra 50 e 45 % e le basi devonoE) Contenuto in GC e AT: compreso tra 50 e 45 % e le basi devono essere essere distribuite in modo uniforme distribuite in modo uniforme
Importante Importante perche’perche’ determina non solo la determina non solo la TmTm ma anche la ma anche la possibilita’possibilita’ di di annealingannealing aspecifico e la formazione di bolle interne al aspecifico e la formazione di bolle interne al primerprimer ((hairpinhairpinloopsloops) che ne danneggiano la capacita’ di ) che ne danneggiano la capacita’ di annealingannealing
ATCGTAGTAGG TACTATCGTAGTAGG TACTCC--GGGG--CC
SOFTWARE E PROGRAMMI PER LA GESTIONE DELLA SOFTWARE E PROGRAMMI PER LA GESTIONE DELLA SCELTA DEI PRIMERSSCELTA DEI PRIMERS
••UniStSUniStS
••BlastBlast
••GenomeGenome
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezentrez//query.fcgiquery.fcgi??db=unistsdb=unists
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrezentrez//query.fcgiquery.fcgi??db=genomedb=genome
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastblast//
PrimerPrimer 33 http://http://frodo.wi.mit.edufrodo.wi.mit.edu//cgicgi--binbin/primer3/primer3_www.cgi/primer3/primer3_www.cgi
POLYMERASE CHAIN REACTION:POLYMERASE CHAIN REACTION:
Protocollo di partenzaProtocollo di partenza
LAVORANDO IN GHIACCIO:LAVORANDO IN GHIACCIO:
••Preparare una diluizione del Dna da amplificare alla concentraziPreparare una diluizione del Dna da amplificare alla concentrazione di 100ng/µlone di 100ng/µl
•• Preparare un numero di Preparare un numero di microtubimicrotubi pari al numero dei campioni da analizzare pari al numero dei campioni da analizzare piu’piu’un tubo per il controllo di contaminazioneun tubo per il controllo di contaminazione
•• Dispensare in ogni tubo campione 100ng/1µl di DNA genomicoDispensare in ogni tubo campione 100ng/1µl di DNA genomico
1 2 3 Con1 2 3 Controllotrollo
•• Preparare la Mix di reazione il cui volume finale Preparare la Mix di reazione il cui volume finale dipendera’dipendera’ dal numero dei dal numero dei campioni e dal volume di reazione di ogni campione. Nel nostro ecampioni e dal volume di reazione di ogni campione. Nel nostro esempio, il volume di sempio, il volume di reazione reazione sara’sara’ di 20 µl /campione, il numero dei campioni e’ quattro, quindi idi 20 µl /campione, il numero dei campioni e’ quattro, quindi il volume l volume della mix della mix sara’sara’ di 80. di 80.
PrimerPrimer F………………F……………….. 1.. 1PrimerPrimer R………………R………………. 1. 1Buffer 10 Buffer 10 X……………X……………. 10. 10dNTPS…………………dNTPS…………………. 1 . 1 Taq……………………Taq…………………….. 1.. 1HH2 2 O……………………O……………………. 86. 86
100100
MIXMIX
•• Dispensare 20µl di Mix in ciascun tubo Dispensare 20µl di Mix in ciascun tubo riri reazionereazione
•• Impostare i parametri di temperatura, durata e numero dei Impostare i parametri di temperatura, durata e numero dei cicli : cicli :
Denaturazione iniziale 95°C per 5’Denaturazione iniziale 95°C per 5’
Denaturazione 95°C per 1’Denaturazione 95°C per 1’AnnealingAnnealing 55°C per 1’ per 3055°C per 1’ per 30ExtensionExtension 68°C per 1’68°C per 1’
ExtensionExtension finale 68°C per 10 ‘finale 68°C per 10 ‘HoldHold 4°C4°C
•• Caricare i campioni e avviare il Caricare i campioni e avviare il ciclizzatoreciclizzatore
CONTROLLO DEL PRODOTTO DI PCR: ELETTROFORESI SU CONTROLLO DEL PRODOTTO DI PCR: ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSOGEL DI AGAROSO
PRINCIPI GENERALIPRINCIPI GENERALI
•• Una molecola provvista di una carica netta ,in opportune condizUna molecola provvista di una carica netta ,in opportune condizioni, si ioni, si muove quando immessa in un campo elettricomuove quando immessa in un campo elettrico
•• Il fenomeno e’ chiamato elettroforesi e Il fenomeno e’ chiamato elettroforesi e puo’puo’ essere sfruttato per separare un essere sfruttato per separare un qualsiasi tipo di molecola carica all’interno di una miscela comqualsiasi tipo di molecola carica all’interno di una miscela complessaplessa
•• La La velocita’velocita’ di migrazione della molecola immessa nel campo elettrico e’ espdi migrazione della molecola immessa nel campo elettrico e’ espressa ressa dalla formula: v= dalla formula: v= EzEz/f con E = alla differenza di potenziale del campo elettrico, z=/f con E = alla differenza di potenziale del campo elettrico, z=alla carica netta della molecola ed f= al coefficiente di attritalla carica netta della molecola ed f= al coefficiente di attrito o frizionaleo o frizionale
•• In particolare il coefficiente frizionale f= 6πIn particolare il coefficiente frizionale f= 6πηηr dove r dove 6πr rappresenta il raggio di 6πr rappresenta il raggio di ingombro della molecola ed ingombro della molecola ed ηη il coefficiente di il coefficiente di viscositaviscosita’’ del mezzo. Questo significa del mezzo. Questo significa che molecole con dimensione diversa a che molecole con dimensione diversa a paritaparita’’ di carica elettrica ( di carica elettrica ( intensitaintensita’’ e e segno) migreranno con segno) migreranno con velocitavelocita’’ differenti nella stessa direzionedifferenti nella stessa direzione
••La condizione di La condizione di paritaparita’’ di carica elettrica in di carica elettrica in realtarealta’’ non non puopuo’’ essere essere realizzata in un sistema elettroforetico che operi su molecole drealizzata in un sistema elettroforetico che operi su molecole della stessa ella stessa natura (Dna) ma di dimensioni differenti. Infatti molecole natura (Dna) ma di dimensioni differenti. Infatti molecole piupiu’’ grandi grandi avrebbero una carica netta maggiore ma la maggiore avrebbero una carica netta maggiore ma la maggiore velocitavelocita’’ di migrazione di migrazione dovuta a tale dovuta a tale densitadensita’’ di carica sarebbe contrastata dal maggiore coefficiente di carica sarebbe contrastata dal maggiore coefficiente frizionale dovuto alle maggiori dimensioni con annullamento del frizionale dovuto alle maggiori dimensioni con annullamento del fenomeno fenomeno della migrazione. Lo stesso vale per le molecole della migrazione. Lo stesso vale per le molecole piupiu’’ piccole e con minore piccole e con minore coefficiente frizionale, che avrebbero perocoefficiente frizionale, che avrebbero pero’’ una carica netta minore.una carica netta minore.
•• Per separare quindi molecole con lo stesso tipo di carica ma coPer separare quindi molecole con lo stesso tipo di carica ma con differente n differente dimensione occorre utilizzare uno specifico supporto costituito dimensione occorre utilizzare uno specifico supporto costituito da un gel da un gel piuttosto che una soluzione libera. Il gel si comporta come un spiuttosto che una soluzione libera. Il gel si comporta come un setaccio molecolare etaccio molecolare annullando le differenze di annullando le differenze di velocita’velocita’ dovute alle differenze di dovute alle differenze di densita’densita’ elettrica e elettrica e separando le molecole solo in separando le molecole solo in virtu’virtu’ della loro dimensione relativadella loro dimensione relativa
•• Le molecole con dimensioni inferiori ai pori del gel migrerannoLe molecole con dimensioni inferiori ai pori del gel migreranno quindi quindi piu’piu’velocemente, quelle con dimensioni maggiori velocemente, quelle con dimensioni maggiori piu’piu’ lentamente e quelle con lentamente e quelle con dimensioni intermedie con dimensioni intermedie con velocita’velocita’ intermedie e apprezzabilmente differenti. Su intermedie e apprezzabilmente differenti. Su questo principio di questo principio di selettivita’selettivita’ poggia la separazione dei frammenti di PCR poggia la separazione dei frammenti di PCR mediante elettroforesi su gel di mediante elettroforesi su gel di agarosioagarosio
•• La natura chimica del gel e la sua concentrazione relativa , chLa natura chimica del gel e la sua concentrazione relativa , che possono essere e possono essere opportunamente scelte, determineranno sia l’ampiezza dei pori siopportunamente scelte, determineranno sia l’ampiezza dei pori sia la loro a la loro deformabilita’deformabilita’ permettendo quindi di separare con ottima risoluzione molecole permettendo quindi di separare con ottima risoluzione molecole di dimensioni anche molto simili.di dimensioni anche molto simili.
•• Normalmente un gel di Normalmente un gel di agarosoagaroso al 2al 2--2,5% riesce a separare in modo 2,5% riesce a separare in modo apprezzabile molecole con dimensioni comprese tra 2500 e 50 bps.apprezzabile molecole con dimensioni comprese tra 2500 e 50 bps. Tale tipo di Tale tipo di gel si presta bene all’analisi dei frammenti di PCR. Per risoluzgel si presta bene all’analisi dei frammenti di PCR. Per risoluzioni maggiori si ioni maggiori si possono utilizzare gel differenti (possono utilizzare gel differenti (acrilammideacrilammide) con opportune variazioni nelle ) con opportune variazioni nelle condizioni di preparazione e corsa del campione. condizioni di preparazione e corsa del campione.
•• Tecniche elettroforetiche particolari sono disponibili per la sTecniche elettroforetiche particolari sono disponibili per la separazione e eparazione e l’analisi di frammenti di DNA particolari come la PFGE per la sel’analisi di frammenti di DNA particolari come la PFGE per la separazione parazione dei cromosomi artificiali di Lievito o l’elettroforesi capillaredei cromosomi artificiali di Lievito o l’elettroforesi capillare per l’analisi dei per l’analisi dei frammenti di sequenza e dei marcatori frammenti di sequenza e dei marcatori microsatellitarimicrosatellitari
PREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIOPREPARAZIONE DEL GEL DI AGAROSIO
•• Pesare la Pesare la quantita’quantita’ di polvere di di polvere di agarosioagarosio ncessariancessaria
•• Disciogliere la polvere in un opportuno volume di Disciogliere la polvere in un opportuno volume di tampone elettroforetico TAE (0,4 M Tristampone elettroforetico TAE (0,4 M Tris--acetato 2mM acetato 2mM EDTA pH 8)EDTA pH 8)
•• Portare a ebollizione in forno a microondePortare a ebollizione in forno a microonde
•• Assemblare lo stampo per la solidificazione del gel (gel Assemblare lo stampo per la solidificazione del gel (gel TrayTray) e posizionare il pettine () e posizionare il pettine (combcomb) necessario alla ) necessario alla formazione dei pozzetti di caricamentoformazione dei pozzetti di caricamento
•• Dopo avere fatto raffreddare il gel (50Dopo avere fatto raffreddare il gel (50--60°C), aggiungere 60°C), aggiungere 1 µl di Soluzione madre di Bromuro di 1 µl di Soluzione madre di Bromuro di EtidioEtidio e versare e versare nello stamponello stampo
•• Dopo raffreddamento (1 ora) il pettine viene rimosso Dopo raffreddamento (1 ora) il pettine viene rimosso delicatamente ed il gel e’ pronto per il caricamento dei delicatamente ed il gel e’ pronto per il caricamento dei campionicampioni
••Preparare i campioni aggiungendo a 10 µl di PCR 5 µl di Preparare i campioni aggiungendo a 10 µl di PCR 5 µl di Sample Buffer 2X Sample Buffer 2X costitutitocostitutito da 0.2% Blue di da 0.2% Blue di BromofenoloBromofenolo, , 0,1% 0,1% XyleneXylene CyanolCyanol, 0,2mM EDTA e 50 % glicerolo in , 0,2mM EDTA e 50 % glicerolo in acquaacqua
•• Riempire a meta’ la camera di migrazione con tampone Riempire a meta’ la camera di migrazione con tampone elettroforetico e adagiare il gel nell’apposito supporto. elettroforetico e adagiare il gel nell’apposito supporto. Completare il riempimento della camera fino a ricoprire di Completare il riempimento della camera fino a ricoprire di tampone la superficie del geltampone la superficie del gel
••Caricare i campioni nei pozzetti direttamente sotto la Caricare i campioni nei pozzetti direttamente sotto la superficie del tampone; (Il colorante presente nel campione superficie del tampone; (Il colorante presente nel campione facilita questa operazione, mentre il glicerolo aumentandone facilita questa operazione, mentre il glicerolo aumentandone la la densita’densita’ ne impedisce la fuoriuscita) ne impedisce la fuoriuscita)
•• Connettere la camera al sistema di alimentazione e avviare Connettere la camera al sistema di alimentazione e avviare la corsa. (90V, 50mA) Bloccare la migrazione quando il la corsa. (90V, 50mA) Bloccare la migrazione quando il bleubleudi di bromofenolobromofenolo (scuro) e quello di (scuro) e quello di cyanolocyanolo (chiaro) si sono (chiaro) si sono nettamente separatinettamente separati
Visualizzare le bande di migrazione colorate con Visualizzare le bande di migrazione colorate con EtBrEtBr sotto raggi UVsotto raggi UV
PRINCIPALI PROBLEMI DELLA PCRPRINCIPALI PROBLEMI DELLA PCR
1)1) PRESENZA DI CONTAMINAZIONEPRESENZA DI CONTAMINAZIONE
1) Eseguire un esperimento pilota utilizzando1) Eseguire un esperimento pilota utilizzandoun solo campione, e 5 Mix differentiun solo campione, e 5 Mix differenticiascuna contenente tutti i reattivi utilizzaticiascuna contenente tutti i reattivi utilizzatinel primo esperimento e cambiando unnel primo esperimento e cambiando unsolo componente ( solo componente ( primersprimers, buffer , buffer etcetc))
2)Pulire accuratamente tutte le superfici di lavoro 2)Pulire accuratamente tutte le superfici di lavoro con con NaOHNaOH , usare sempre materiale , usare sempre materiale autoclavatoautoclavato eepuntali con filtro anti contaminazionepuntali con filtro anti contaminazione
2)2) Presenza di prodotti aspecifici Presenza di prodotti aspecifici piu’piu’ lunghi del prodotto desideratolunghi del prodotto desiderato
Ridurre il tempo di Ridurre il tempo di annealingannealingAumentare la temperatura di Aumentare la temperatura di annealingannealingRidurre il tempo di estensioneRidurre il tempo di estensioneRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di di primersprimersRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di Dnadi DnaRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di di TaqTaqCambio della coppia di Cambio della coppia di primersprimers
SpecificoSpecifico
Aspecifico AltoAspecifico Alto
3)3) Presenza di prodotti aspecifici Presenza di prodotti aspecifici piu’piu’ corti del prodotto desideratocorti del prodotto desiderato
Aumentare il tempo di Aumentare il tempo di annealingannealingAumentare la temperatura di Aumentare la temperatura di annealingannealingAumentare il tempo di estensioneAumentare il tempo di estensioneRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di di primersprimersRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di Dnadi DnaRidurre la Ridurre la quantita’quantita’ di di TaqTaqCambio della coppia di Cambio della coppia di primersprimers
SpecificoSpecifico
Aspecifico bassoAspecifico basso
4)4) Assenza di amplificatoAssenza di amplificato
Ricontrollare tutti i reattiviRicontrollare tutti i reattiviRiquantizzareRiquantizzare il Dnail DnaCambiare la miscela di Cambiare la miscela di dNTPsdNTPs molto sensibile ai cicli molto sensibile ai cicli di congelamento e scongelamentodi congelamento e scongelamentoRidurre di 4Ridurre di 4--6°C la temperatura di 6°C la temperatura di annealingannealingRisintetizzareRisintetizzare i i PrimersPrimers
4)4) Prodotto specifico ma in Prodotto specifico ma in quantita’quantita’ ridottaridotta
Aumentare la Aumentare la quantita’quantita’ dei dei primersprimersAumentare la Aumentare la quantita’quantita’ della della TaqTaqAumentare la Aumentare la quantita’quantita’ di Dnadi DnaRidurre gradualmente la temperatura di Ridurre gradualmente la temperatura di annealingannealingUtilizzare DMSO o gliceroloUtilizzare DMSO o glicerolo
Real time PCR
La PCR in tempo reale è una implementazione della PCR che permette di avere informazioni quantitative più precise sulle concentrazioni relative di cDNAamplificati e dei loro mRNA corrispondenti.
Il modo più facile per identificare, al suo primo apparire, un prodotto di PCR è quello di monitorare di continuo l’andamento della reazione, senza dover interrompere la reazione per poterla visualizzare su gel. La real time PCR risolve questo problema utilizzando precursori fluorescenti, come il SYBR Green, che vengono incorporati nel prodotto in formazione o che si intercalano alla doppia elica, man mano che si forma. In ogni caso sarà possibile monitorare in tempo reale la formazione del prodotto di amplificazione seguendone l’assorbimento con un sistema spettrofotometrico, in un sistema automatizzato che provvede anche alla routine della PCR.
0
200000000
400000000
600000000
800000000
1000000000
1200000000
1400000000
1600000000
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR CYCLE NUMBER
AM
OU
NT
OF
DN
A
CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512
10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000
Nel corso di un’amplificazione per PCR il numero deiprodotti aumenta esponenzialmente ad ogni ciclo, perpoi arrivare a plataux dopo circa 30 cicli. Se riportiamoIn un grafico l’accumulo dei prodotti di PCR, in scalaaritmetica, non riusciamo ad evidenziare alcuna ampli-ficazione durante i primi 20-25 cicli, mentre riusciamo Ad apprezzare bene la parte della curva che da 25 a 30cicli appare lineare
Curve di accumulo teoriche
NIN7 NIN7 proteinprotein localisation, localisation, transienttransient expressionexpression
Arabidopsis Protoplast
35S::NIN7-GFP
NIN7-GFP is localised in the nucleus but excluded of the nucleoleand agregates in speckle-like structures. It is consistent with the putative role of NIN7 as a transcription regulator.
Pictures:
Lionel Gissot
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cNIN7
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