SBOBINATUREdel corso di

BIOCHIMICA I

(Lezioni del Prof. Raugei)

A/A 2008/09

ATTENZIONEQueste sbobinature sono state realizzate da studenti, e come tali possono contenere errori. Lo scopo di queste sbobinature NON quello di sostituire la frequenza personale dei corsi, ma di fornire del materiale in pi utile alla preparazione dell'esame; gli studenti sono pertanto invitati a seguire le lezioni e a prendere personalmente gli appunti, rimediando cos agli errori e alle imprecisioni che possono essere presenti in queste pagine.

Biochimica - Lezione del 28-04-09 [Prof. Raugei]

La volta precedente avevamo esaminato la struttura del DNA, la cui comprensione molto importante per gli argomenti che andremo ad affrontare, e da qui riprendiamo.

Prima di andare avanti, ricordiamo che il DNA ha una sua direzionalit o polarit che dir si voglia: molto importante la direzione 5'--> 3', lungo la quale usualmente si svolge la sintesi.

Ricordiamo anche che DNA ed RNA sono molto simili: le differenze principali consistono nella presenza della timina e un -H in posizione 2' nel DNA, laddove nell'RNA abbiamo uracile (che si ottiene togliendo un gruppo -CH3 dalla timina), e la presenza di un -OH in posizione 2'.

Concentriamo adesso la nostra attenzione sui legami ad idrogeno: si formano due legami ad idrogeno tra adenina e timina e tre legami ad idrogeno tra guanina e citosina. Si tratta di legami deboli in generale, i legami deboli rivestono una grandissima importanza nelle interazioni molecolari; sono gli enzimi, che entrano in gioco nel metabolismo, ad agire soprattutto sui legami covalenti. Nella struttura del DNA sono importanti sia legami covalenti, nella costruzione della sua impalcatura di pentoso-fosfato-base azotata (quest'ultima intrattiene un legame N-glicosidico), sia i legami deboli, che tengono insieme le due catene a formare una doppia elica. La caratteristica del legame debole quella di essere facilmente reversibile. Il legame debole tipicamente spezzato tanto facilmente quanto facilmente pu essere riformato. In effetti, i legami ad idrogeno che tengono insieme le due catene del DNA sono importanti, grazie a quest'ultima caratteristica, per numerosi processi che interessano questa molecola (es. trascrizione), mentre zone a doppio filamento intramolecolari invece danno la peculiare forma al tRNA.

Il legame ad idrogeno tipicamente coinvolge (1) un H legato ad un atomo elettronegativo come N, O o, pi raramente, S e (2) un atomo con parziale carica negativa.

Rottura e formazione di legami covalenti entrano in gioco solamente durante la replicazione. Nel normale funzionamento del DNA (cio, il funzionamento in cellule in fase G) si rompono e si formano legami deboli. Per normale funzionamento si intende soprattutto la trascrizione, processo che implica la rottura di legami deboli preesistenti per l'apertura della doppia elica, e il nuovo instaurarsi di altri legami deboli per dirigere la sintesi dell'RNA dal punto di vista di quest'ultimo, entrano in gioco anche legami covalenti, ma dal punto di vista del DNA sono coinvolti solo legami deboli.

Il DNA , come abbiamo visto, una doppia elica. All'esterno abbiamo l'impalcatura di zucchero-fosfato, mentre all'interno sono poste le basi. Le basi sono orientate parallelamente al piano immaginario su cui poggia la molecola, e sono impilate una sopra l'altra. La doppia elica pu esistere in diverse forme, si parla di DNA A, DNA Z e DNA B, dove quest'ultimo quello pi interessante perch fisiologicamente presente nelle cellule. La struttura a doppia elica del DNA B ha una particolarit: l'asse dei legami ad idrogeno non passa per l'asse della doppia elica. L'elica in qualche modo si avvolge intorno al suo asse, senza per toccarlo, perch i legami ad idrogeno che legano le due basi affacciate verso l'interno passerebbero per l'asse se i due zuccheri fossero a 180; in realt, gli zuccheri stanno a 120. Quindi l'elica ha una sorta di andamento a zig zag, con la formazione di un solco maggiore e uno minore.

Questa nozione ci permette di introdurre un altro concetto. Il DNA una molecola che funziona interagendo con proteine, che sono in grado di leggerlo. Un esempio l'RNA polimerasi, che deve legarsi ad un promotore per iniziare la trascrizione: deve quindi esistere un meccanismo che renda le proteine capaci d riconoscere particolari sequenze del DNA ancora chiuso. Questo riconoscimento reso possibile in quanto particolari posizioni delle basi azotate sono esposte all'esterno della molecola grazie alla presenza dei solchi a cui abbiamo accennato. Non facile da visualizzare. Un osservatore esterno che si ponesse nel solco maggiore potrebbe osservare, a livello di una purina, le posizioni 6, 7 e 8. La posizione 6 permette di distinguere tra le due purine (l'adenina ha un -NH2, la guanina un doppio legame con l'O), mentre le posizione 7 e 8 non sono diagnostiche. Anche il solco minore consente delle esposizioni, a livello del carbonio in posizione 2. Le proteine hanno una conformazione tale da poter interagire selettivamente con

certi gruppi funzionali, cos da distinguere i nucleotidi. Per quando riguarda le pirimidine, solo la parte esposta nel solco maggiore permette di differenziare una citosina e una timina. La differenza molto grande: la posizione 4 diversa, inoltre la timina metilata in posizione 5, dove la citosina ha solo un H. A livello del solco minore invece questa distinzione non pu essere fatta.

Tutto questo fa s che una certa sequenza di DNA sia riconoscibile grazie ai gruppi chimici esposti a livello del solco maggiore (sia per purine che per pirimidine) o del solco minore (solo per le purine), offrendo siti di lettura anche per il DNA chiuso.

Ci sono poi delle sequenze aminoacidiche, conservate in molte proteine diverse, che sono tanto diffuse da consentire, qualora vengano ritrovate su proteine dalla funzionalit ignota, di dedurre con una certa sicurezza che queste abbiano a che fare con il DNA. Queste strutture sono essenzialmente di tre tipi:

Elix-Turn-Elix; ovvero, una zona costituita da un dominio ad -elica, seguita da una corta sequenza aminoacidica senza una struttura secondaria particolare, che permette una certa libert di piegamento, seguita a sua volta da una seconda -elica. In genere queste proteine sono dei dimeri. Le -elica sono le zone della proteina che prendono contatto con i gruppi chimici esposti a livello dei solchi.

Zinc Fingers, una struttura curiosa, dove si hanno delle zone quasi a forma di dita, che si inseriscono nelle scanalature del solco maggiore e del solco minore prendendo contatto con i gruppi chimici esposti. Si tratta di una struttura di tipo terziario, dove uno ione zinco si coordina con gruppi -SH di cisteine, formando le dita. Le cisteine per ogni dito in genere sono quattro: due sono separate da 3-4 aminoacidi circa, poi in genere presente un loop (qualche decina di aminoacidi), e infine le altre due, sempre vicine tra loro. Questa struttura piuttosto peculiare, ed spesso ripetuta a distanze regolare (ognuna rappresenta un dito) permettendo cos di riconoscere gli zinc fingers gi a livello della struttura primaria. Si possono trovare fino a 9 zinc fingers.

Leucyn Zipper (cerniere a leucina); in realt questa struttura non serve tanto per interagire con il DNA, quanto per formare dimeri. La struttura sfrutta interazioni tra leucine, che un aminoacido dotato di una lunga catena di tipo idrocarburico, quindi apolare. Questo significa che former facilmente interazioni di tipo Van der Waals con altre leucine. In genere, le strutture di tipo leucyn zipper coinvolgono delle -eliche, in cui tra le leucine sono interposti aminoacidi in numero tale da far s che queste sporgano tutte dalla stessa parte dell' -elica. In genere ci sono 3,5 aminoacidi per ogni giro di -elica, per un totale di 7 aminoacidi per ogni 2 giri. facile immaginare come le leucine siano presenti ogni 7 aminoacidi, cos da risultare impilate una sopra l'altra. Alla fine, si hanno due -eliche, con una fila di leucine su un lato, che si interagiscono tra loro attraverso interazioni di tipo idrofobico.

Ricordiamo inoltre che in genere le proteine che interagiscono con il DNA sono cariche positivamente (hanno cio un punto isoelettrico di tipo basico) al contrario della gran parte delle altre proteine, cariche negativamente. Ovviamente la carica positiva facilita di per s l'interazione con il DNA, dato che quest'ultima molecola carica negativamente: una proteine carica negativamente genererebbe interazioni di tipo repulsivo.

Il funzionamento del DNA, come abbiamo visto, coinvolge essenzialmente legami deboli; tuttavia, il DNA ha un suo metabolismo: viene prodotto e pu essere anche catabolizzato. In genere in un organismo quest'ultima attivit viene evitata. A differenza di tutte le altre molecole (proteine, RNA, etc.), che sono in gran parte usa e getta, il DNA tende ad essere mantenuto. La replicazione del DNA infatti di tipo semiconservativo, il che significa, tra l'altro, che da qualche parte nel nostro organismo due cellule probabilmente contengono uno dei due filamenti di DNA che si trovava nello zigote da cui ci siamo originati.

Il catabolismo del DNA entra in gioco soprattutto quando ci nutriamo: quasi sempre ingeriamo anche cellule, il cui DNA deve essere digerito. Deve esistere quindi una classe di enzimi in grado, all'occorrenza, di smantellare la struttura del DNA. Si tratta di idrolasi (quindi in grado di agire a livello del legame fosfodiesterico), nucleasi (agiscono sugli acidi nucleici), fosfodiesterasi (agiscono su un legame fosfodiesterico). Si possono poi distinguere esonucleasi, endonucleasi, desossiribonucleasi, ribonucleasi, etc.

La classificazione comunque molto varia.

Ad ogni modo, particolarmente importante la distinzione tra esonucleasi ed endonucleasi. Sono esonucleasi quegli enzimi che, avendo un filamento con entrambe le estremit libere, tagliano il primo legame fosfodiesterico dopo il primo o l'ultimo nucleotide: esistono infatti le esonucleasi 5' (che iniziano a digerire il DNA a partire dall'estremit 5'), e le esonucleasi 3' (che iniziano a digerire il DNA dall'estremit 3'). Il taglio di tipo P, di gran lunga il pi comune, taglia tra il 3' e il fosfato, lasciando attaccato il gruppo fosfato al 5'; il taglio di tipo T, molto pi raro, taglia tra il 5' e il fosfato, lasciando attaccato il gruppo fosfato al 3'. Le endonucleasi sono enzimi che tagliano il legame fosfodiesterico all'interno della catena. Anche in questo caso, esistono tagli di tipo P e T, ed esistono endonuclasi specifiche per RNA e DNA, cos come endonucleasi aspecifiche. In entrambi i casi, l'azione soltanto su UNO solo dei due filamenti di DNA.

In sintesi, si tratta di due classi di enzimi che hanno lo scopo di frammentare il DNA a scopi catabolici, ottenendo un pool di dNTP, monomeri che consistono di deossinucleosidi dei quattro tipo possibili (nel caso del DNA) proprio come le proteasi catabolizzando le proteine portano ad ottenere un pool di aminoacidi.

La differenza tra endonuclesi ed esonucleasi anche nella specificit riguardo alla sequenza di basi azotate di DNA. Come si pu immaginare, il DNA pu essere danneggiato. Uno dei danni pi tipici che pu subire questa molecola la rottura di un singolo legame fosfodiesterico, cosa che di solito , fortunatamente, priva di conseguenze. La rottura in s infatti non un grosso danno, in quanto il DNA una doppia elica che trova stabilit nella interazione tra i due filamenti singoli. La struttura della molecola non viene turbata dal nick; la sua struttura stessa garantisce, attraverso i legami ad idrogeno, che la conformazione rimanga inalterata; i nick sono in genere riparate da ligasi. Un filamento di appena 20 nucleotidi implica decine di legami ad idrogeno. Se, tuttavia, il nick avviene in corrispondenza di un altro nick, oppure molto vicino, si pu verificare un danno gravissimo: una soluzione di continuit nella doppia elica; i legami a idrogeno non sono abbastanza numerosi da garantire l'integrit. Tuttavia, in condizioni normali, estremamente improbabile che avvenga una cosa del genere.

L'azione di una endonuclasi si esplica su uno dei due filamenti, casualmente, introducendo dei nick, che possono o meno portare ad una rottura. Le endonucleasi in genere non riescono a frammentare il DNA sino a portare al singolo monomero; in genere frammentano il filamento in oligomeri, e poi delle esonucleasi finiscono il lavoro. Tuttavia, per la funzionalit del DNA, anche una singola rottura un evento disastroso. Esiste poi una classe particolare di endonucleasi che hanno la caratteristica di essere estremamente specifiche riguardo alla sequenza di taglio: sono le endonucleasi di restrizione. Questi enzimi tagliano la doppia elica con due nick ravvicinati (uno su un filamento e uno sull'altro) in corrispondenza di particolari sequenze. In altre parole, se si mettono in contatto questi enzimi con un filamento di acido desossiribonucleico di sequenza conosciuta, saremo in grado di predire i punti in cui saranno creati i nick, e il numero di pezzi in cui verr tagliata la molecola. Questi enzimi sono stati, e anche se in misura minore, ancora sono, un importantissimo strumento per l'ingegneria genetica; sono utilizzate spesso per rompere il DNA in modo da poter inserire delle sequenze desiderate all'interno delle molecole. Sono presenti in moltissimi batteri, che esprimono questi enzimi per difendersi dagli attacchi mediati dal DNA. Tipici agenti di questi attacchi sono virus, come i batteriofagi. Questi infettano la cellule trasferendo il proprio materiale genetico all'interno di esse e sfruttando i loro apparati metabolici per riprodursi. Diviene intuibile come avere degli enzimi di restrizione in grado di frammentare certe sequenze aiuti i batteri a difendersi.

EcoR1 stato uno dei primi enzimi di restrizione scoperti e attualmente uno dei meglio conosciuti; stato fondamentale per la comprensione della struttura di questi enzimi, e della struttura della sequenza che viene riconosciuta. Il nome di questi enzimi costituito da un acronimo che deriva dal nome del batterio da cui sono stati isolati. EcoM1 deriva da Escherichia coli, ceppo R, 1 in quanto stato il primo ad essere scoperto (finora ne sono stati caratterizzati 4); HinD3 deriva da Haemophilus influentiae, etc. Ognuno di questi enzimi ha un suo sito di restrizione (le sequenze nucleotidiche specifiche che sono in grado di riconoscere), la cui struttura peculiare: deve essere infatti a simmetria centrale; sono dei palindromi, in sostanza. Il sito di restrizione riconosciuto da EcoR1 ad esempio questo:

5'-G A A T T C-3'3'-C T T A A G-5'

Questa struttura fa s che su due filamenti ci sia esattamente la stessa sequenza (letta secondo 5'--> 3'). Grazie alla loro simmetria centrale le due sequenze sono identiche. Questo sito di restrizione come vediamo ha 6 basi di riconoscimento; altri siti sono solo a 4 basi di riconoscimento.

Il taglio della endonucleasi pu essere di due tipi. Un primo tipo ( il caso di EcoR1) prevede che la endonucleasi tagli un certo legame fosfodiesterico (es. quello tra la G e la A, vedi freccia) sia su un filamento che sull'altro: quindi la endonucleasi riconosce uno dei due filamenti e taglia tra G ed A; in un secondo momento, riconosce la stessa sequenza sull'altro filamento ed effettua il secondo taglio.

Nel caso che abbiamo visto sopra, saremo in una situazione di due nick ravvicinati su due filamenti: pochi legami ad idrogeno tengono insieme la doppia elica in seguito all'inserimento dei due nick.

Un secondo tipo di taglio prevede che i due nick avvegano in corrispondenza dello stesso legame fosfodiesterico.

Il taglio del primo tipo tipicamente produce le cosiddette estremit coesive: i legami ad idrogeno non sono sufficienti per tenere insieme i due monconi, ma esiste una certa complementariet, che rende appiccicosi le due estremit, anche se il legame, di fatto, non pu tenere insieme la doppia elica. Nel tempo, ci possono essere tuttavia degli istanti in cui questo legame diviene stabile. Il taglio del secondo tipo invece porta alle estremit piatte: in questo caso, i due monconi non hanno possibilit di riunione, dato che non si formano legami ad idrogeno.

L'importanza di questi enzimi sta anche nel fatto che si formano delle estremit coesive specifiche, che potranno essere riunite da delle ligasi, enzimi che in pratica effettuano un'azione antagonista rispetto alle endonucleasi, restaurando i legami fosfodiesterici e revertendo l'azione di taglio. Notare tuttavia che si pu riunire il DNA tagliato da un solo enzima di restrizione; far agire due diverse endonucleasi di restrizione significherebbe compromettere la compatibilit delle estremit coesive. Un'altra cosa interessante da notare riguardo l'utilizzo di endonucleasi e ligasi che, se separiamo una molecola di DNA in due monconi utilizzando EcoR1, possiamo poi sfruttare una ligasi per unire queste estremit ai monconi di una molecola di DNA di origine diversa, tagliata con lo stesso enzima di restrizione, formando una nuova molecola di DNA. Questo il principio su cui si basa la tecnica del DNA ricombinante: mettere insieme frammenti di DNA che in natura non si incontrerebbero mai, creando per esempio plasmidi batterici con geni umani, etc. Nel nostro organismo, la ricombinazione genica avviene praticamente solo a livello della gametogenesi e nelle cellule deputate alla produzione di anticorpi. In generale, la ricombinazione del DNA proveniente da organismi diversi possibile perch, dal punto di vista chimico, il DNA identico in tutte le forme di vita. Quello che cambia tra gli organismi soltanto la sequenza.

A questo punto, adesso che abbiamo esaminato a grandi linee gli enzimi di restrizione, sorge spontanea una domanda. Gli enzimi endonucleasici sono enzimi potenzialmente pericolosi, come tutti gli enzimi litici in generale. Per esempio, nella necrosi dovuta ad ipossia, il contenuto lisosomiale viene riversato al di fuori dei lisosomi, liberando pericolosissime proteasi e anche nucleasi; la necrosi quindi anche dovuta alla digestione degli acidi nucleici. Come possono quindi le cellule produrre degli enzimi potenzialmente letali per il proprio DNA? Questo possibile perch si sono evoluti sistemi di protezione del DNA. Questi sistemi sono interessanti anche perch ci permettono di prendere in esame una prima forma di modifica del DNA: la metilazione. In questo corso parleremo di metilazione in almeno tre casi diversi tra loro, ma vedremo sempre che la metilazione ha una funzione di marker, una sorta di bandierina che serve a segnalare qualcosa. A questo punto, possiamo precisare che l'attivit di restrizione non comprende solamente il taglio endonucleasico, di cui abbiamo parlato finora, ma anche la modificazione del DNA, a livello della sequenza

di riconoscimento, la quale consiste di una metilazione. Cio, il batterio ha un enzima che riconosce la sequenza EcoR1 ed esercita a livello di questa un'attivit endonucleasica, ed un secondo enzima che riconosce la stessa sequenza ma esercita un'attivit di metilazione, in particolare sulla prima adenina del sito di restrizione. Quindi, dobbiamo immaginare che il DNA del batterio sia metilato a livello di ogni adenina di ogni sito di restrizione. Questa modificazione impedisce il taglio da parte dell'enzima di restrizione che il batterio stesso produce.

Cosa succede quando il batterio si duplica? Le due cellule figlie, in seguito al processo di replicazione del DNA, che, come sappiamo, avviene con meccanismo semiconservativo, posseggono ciascuna una molecola di DNA formata da un filamento vecchio e uno nuovo; quest'ultimo non metilato. In altre parole, un filamento protetto, ed uno no. Questo per non costituisce un problema: al massimo, potr formarsi un solo nick, che da solo non sufficiente a compromettere la struttura dell'acido desossiribonucleico, e sar riparato da una ligasi. Possiamo essere ragionevolmente sicuri che prima della successiva replicazione del DNA, con il tempo, la attivit di metilasi sar esercitata anche sul filamento nuovo. Alla successiva duplicazione, entrambi i filamenti saranno protetti.

Se dall'esterno giunge del materiale genetico esogeno ( il caso del DNA virale, ma anche di altro DNA batterico), questo sar un DNA nudo dal punto di vista della metilazione e sar prontamente digerito. Gli enzimi di restrizione furono proprio scoperti grazie alla caratteristica di alcuni batteri di restringere la capacit infettiva dei virus.

Biochimica - Lezione del 29-04-09 [Prof. Raugei]

La volta scorsa avevamo parlato degli enzimi di restrizione, che avevamo visto essere un interessante sistema di difesa batterico contro agenti infettivi che utilizzano il DNA. Essendo questa molecola una componente essenziale del virus (che formato da materiale genetico contenuto in capside proteico), in quanto porta con s le informazioni necessarie alla sintesi delle proteine virali, se il batterio possiede un sistema per frammentare il DNA virale pu neutralizzarne l'attacco e rendere inoffensivo il virus. Avevamo anche visto come il sito di restrizione, ovvero la sequenza di DNA che normalmente viene attaccata dall'enzima di restrizione, venga protetto dall'azione delle endonucleasi da una metilazione sulla prima adenina della sequenza stessa: questo impedisce che il DNA del batterio stesso venga frammentato. La metilazione a carico di enzimi detti metilasi, enzimi di modificazione del DNA che riconoscono le stesse sequenze riconosciute dagli enzimi di restrizione, ma invece che eseguire un taglio, metilano. Avevamo visto anche come, quando il DNA va incontro a replicazione semiconservativa, vi sia un momento iniziale in cui uno solo dei due filamenti (il filamento parentale, o stampo) metilato; con il tempo, la metilasi agir anche sul filamento nuovo. Nel frattempo, vero che solo un filamento protetto dai tagli, mentre l'altro no, ma sappiamo anche che un taglio su un solo filamento non sufficiente a compromettere la stabilit della struttura della doppia elica, e in definitiva non un danno preoccupante.

Tra parentesi, vi sono var tipi di metilazione del DNA: l'adenina diviene N-6-metil-adenina; in altre situazioni si possono avere metilazioni a livello della guanina e della citosina peraltro, la metil-citosina estremamente simile alla timina. In tutti i casi comunque la metilazione utilizza come donatore di metili la Solfo-adenosin-metionina, che nel processo di donazione del metile diventa Solfo-adenosin-omocisteina.

I siti di restrizione sono, in gran parte, a 4 o a 6 basi; statisticamente, nel DNA, sar pi frequente trovare dei siti di restrizione formati casualmente dalla giustapposizione delle basi quando sono a 4 basi che non quando sono a 6. La probabilit teorica di trovare una sequenza particolare di 4 basi in un DNA casuale 1/256, da 44. La stessa probabilit teorica calcolata per una sequenza di 6 basi d come risultato 1/4096, da 46. La probabilit di trovare sequenze di un numero maggiore di basi cala esponenzialmente, come si pu immaginare. Naturalmente, queste sono soltanto stime che forniscono un'ordine di grandezza, se non altro perch la sequenza del DNA di un organismo non casuale (tanto vero che la ricchezza relativa in GC

varia da organismo a organismo). Possiamo affermare comunque che, tendenzialmente, una certa sequenza di 4 basi comparir ogni qualche centinaia di basi, una a 6 basi ogni qualche migliaio di basi, una a 8 ogni qualche decina di migliaia di basi. Per cui, un enzima che ha un sito di restrizione di 4 basi taglia in media ogni qualche centinaia di basi, etc.

Ci sono diverse classi di enzimi di restrizione. Quelli di cui stiamo parlando sono gli enzimi di tipo II; in questa classe di enzimi, vi sono due diversi enzimi, uno che taglia e uno che protegge la stessa sequenza. Entrambi quindi presenteranno almeno due domini: uno, in comune, che avr una di quelle strutture viste la volta scorsa e che in grado di riconoscere la stessa sequenza; un secondo dominio, diverso tra i due enzimi, che in un caso sar endonucleasico, in un caso avr la capacit di metilazione. Vi sono altri enzimi di restrizione in cui c' un unico enzima con tre domini: uno di riconoscimento, uno di taglio, e uno di modificazione. Nelle biotecnologie si utilizzano solo gli enzimi di restrizione di tipo II.

Soffermiamoci, prima di andare avanti, su questa domanda: quante molecole di DNA ci sono in una cellula somatica umana? Nel nucleo vi sono normalmente 46 molecole (ogni cromosoma una molecola, quindi in caso di aberrazioni questo numero pu variare), pi una molecola per ogni mitocondrio (ogni mitocondrio possiede il suo piccolo cromosoma circolare); il numero di mitocondri varia da cellula a cellula, ma, mediamente, siamo nell'ordine delle migliaia.E in un batterio? In genere una, perch ha un solo cromosoma circolare (anche se nel momento appena precedente la scissione cellulare abbiamo due cromosomi nella stessa cellula), pi i plasmidi, il cui numero pu variare: in genere ne abbiamo decine. Ricordiamo che i plasmidi sono elementi genetici accessori che alcuni batteri possono contenere.

Al di fuori del numero di molecole, qual la grandezza del genoma? Un genoma batterico tipico dell'ordine di grandezza del milione di basi. Nell'ambito degli eucarioti, si ha una grande variazione. I lieviti, eucarioti molto semplici, hanno genomi dell'ordine di grandezza delle decine di milioni di basi, mentre il genoma dei mammiferi di qualche miliardo di basi (circa 3 miliardi come corredo aploide). Un cromosoma, in media, ospita centinaia di milioni di basi (108). Il pi piccolo cromosoma umano, il cromosoma 22, grande 3 x 107 basi; molti altri cromosomi sono grandi 5-6 x 108. Questo significa che una molecola di DNA tendenzialmente pi lunga di 100 milioni di basi.

Per quanto riguarda procarioti, il genoma in entrambi i casi costituito da DNA a doppio filamento; la differenza sta nel fatto che il genoma procarioti circolare, negli eucarioti lineare. Nei virus, il genoma , in molti casi, costituito da RNA. Peraltro, questa la ragione per cui i virus mutano cos velocemente: l'enzima che sintetizza le molecole di RNA, detto RNA polimerasi, commette molti pi errori della DNA polimerasi.

Prima abbiamo menzionato i plasmidi; ne parliamo adesso perch stato l'altro elemento decisivo per l'ingegneria genetica e la nascita della tecnologia del DNA ricombinante. L'enzima di restrizione lo strumento che ci serve per aprire una molecola di DNA, inserirvi un DNA diverso, e richiuderlo; il plasmide il vettore di questo DNA. Fare questa operazione a livello cromosomico un problema: come abbiamo visto i cromosomi sono molecole enormi; un plasmide invece una sorta di piccolo cromosoma, anche questo circolare: ospita dei geni, ma rispetto ai cromosomi umani pi gestibile e maneggevole, in quanto ha una grandezza di qualche migliaio di basi. In genere i plasmidi contengono geni cosiddetti dispensari: geni non strettamente necessari alla vita del batterio, ma che possono rivelarsi utili in certe condizioni.

Qual' la struttura di un plasmide? Prima di tutto abbiamo un'origine di replicazione, una zona che rende possibile il processo di inizio della duplicazione del DNA; se rimuoviamo questa sequenza, il plasmide non si duplica e prima o poi sparir da una popolazione batterica. I plasmidi in genere si duplicano quando avviene la duplicazione del DNA, e al momento della scissione della cellula vengono ripartiti tra le cellule; in questo modo, la quantit di plasmidi rimane costante nel tempo. Se la loro sintesi cessa di essere messa in atto, con i cicli di divisione il loro numero si ridurr progressivamente finch non scompariranno. Oltre all'origine, in un plasmide vi sono var geni. La differenza tra il cromosoma batterico e un plasmide che il primo contiene molti pi geni (un batterio ha circa 8-10,000 geni); un plasmide ha pochi ma caratteristi geni.

Geni classici che si trovano a livello dei plasmidi sono quelli per la resistenza agli antibiotici. Come sappiamo, gli antibiotici sono strumenti farmacologici attivi contro le malattie batteriche; funzionano perch

discriminano tra i meccanismi metabolici di procarioti ed eucarioti. In pratica, sono veleni cellulari (che possono colpire ad es. la trascrizione o la traduzione) per i procarioti, ma che hanno poco o nessun effetto sugli eucarioti. Purtroppo, gli antibiotici sono sempre meno efficaci perch i batteri diventano resistenti: il loro DNA muta, e, casualmente, si pu sviluppare un qualche sistema di difesa. Per questo motivo, l'abuso di antibiotici sconsigliato, in quanto aumenta la probabilit che vengano selezionati ceppi resistenti anche a farmaci di nuova generazione. Tornando ai plasmidi, la resistenza agli antibiotici spesso veicolata da queste molecole. Dato che in molti batteri abbastanza facile il trasferimento di plasmidi da un batterio all'altro, la resistenza ad un antibiotico si pu rapidamente espandersi ad una intera popolazione batterica molto rapidamente. Il fenomeno che rende possibile tutto questo la coniugazione, il passaggio di un plasmide da un batterio ad un altro. Facciamo un esempio: supponiamo che un batterio possegga un plasmide con un gene per la resistenza all'amphicilina; significa che in grado di crescere in presenza di amphicilina, in quanto i geni producono sostanze in grado di proteggere il batterio dall'azione dell'antibiotico. In questo caso, l'amphicilina un antibiotico -lattamico; il gene per la resistenza all'amphicilina codifica per una -lattamasi che viene riversata dal batterio sul terreno di coltura e idrolizza la molecola dell'antibiotico.

Altri geni classici che possono essere veicolati da plasmidi sono quelli per la produzione di tossine; i batteri, nella loro evoluzione, hanno sviluppato meccanismi che consentissero loro di occupare tutto lo spazio possibile. Oltre alla crescita estremamente rapida, un altro sistema, utile per eliminare altre specie batteriche o microorganismi, proprio quello di eliminare la concorrenza attraverso sostanze venefiche. Infine, sono molto diffusi i geni che consentono di utilizzare fonti di carbonio atipiche, come il petrolio. Es. lo pseudomonas in grado di utilizzare il petrolio come fonte di carbonio grazie a dei geni che consentono l'espressione di particolari enzimi idrolitici. Questi geni ovviamente aumentano la fitness dei batteri.

Ritornando all'ingegneria genetica, vediamo come si possono utilizzare i plasmidi come vettori di DNA esogeno. Supponiamo di avere un plasmide di 4000 basi circa; grazie al computer, si possono ricercare i siti di restrizione dei var enzimi di restrizione (EcoR1, EcoR5, etc.). In altre parole, si viene a creare una mappa dove sono segnate le posizioni a livello delle quali tagliano gli enzimi di restrizione. A questo punto, si pu scegliere un enzima che riconosca un sito di restrizione che compare una sola volta; in questo modo siamo sicuri che taglier in un solo punto, in modo da rendere il plasmide un filamento lineare anzich circolare. Questo si pu verificare effettuando un'elettroforesi su gel di agarosio. L'agar un polisaccaride che si ottiene da un'alga chiamata Agar agar; una sorta di gelatina, che forma una maglia e contrasta la migrazione di molecole di DNA; queste, essendo cariche negativamente, vengono trascinate verso il polo positivo quando sottoposte ad un campo elettrico. Le maglie del gel tendono a frenare questa migrazione in maniera inversamente proporzionale alla carica del DNA: per cui le pi piccole si fanno strada pi facilmente attraverso il gel di agarosio e migrano pi velocemente; quelle pi grandi procedono pi lentamente. Il DNA viene visualizzato perch trattato con bromuro di etidio, una molecola che lo colora. Eseguendo un'elettroforesi su gel, si pu verificare quante volte stato tagliato il DNA: se vediamo una sola striscia, vuol dire che c' un solo tipo di molecola. In generale, avremo tante strisce quanti sono i frammenti in cui stato tagliato il DNA.

Abbiamo introdotto i plasmidi a questo punto soprattutto per accennare ad un argomento in particolare: una superstruttura del DNA che molto importante. Abbiamo esaminato la struttura del singolo filamento; abbiamo poi visto la doppia elica formata da due filamenti; in vivo per il DNA ha una superstruttura. Il DNA di cui abbiamo parlato finora un DNA rilassato, in una situazione di equilibrio; in vivo, il DNA una molecola che ha accumulato dell'energia, che lo fa assomigliare ad una molla: stiamo parlando del superavvolgimento del DNA. Ci sono degli enzimi che, con spesa di ATP, torcono il DNA, che accumula tensione; altri enzimi eseguono il lavoro inverso, senza spesa di energia ( un processo esoergonico) e fanno s che il DNA rilasci la tensione. Abbiamo parlato dei plasmidi perch questo fenomeno, nonostante sia valido per tutte le molecole di DNA, pi facile da capire se ci si riferisci ai plasmidi. In effetti, nei plasmidi che questo fenomeno stato scoperto. Il plasmide una molecola di DNA relativamente piccola, di qualche migliaio di basi, di cui possibile calcolare il peso molecolare. Effettuando l'elettroforesi su gel dei plasmidi, emergeva un fatto apparentemente inspiegabile: le specie molecolari sembravano due. Il fatto si spieg ipotizzando che il DNA, nella cellula batterica, non fosse in una stato rilassato, ma superavvolto. Con superavvolto si intende che, oltre all'avvolgimento destrorso, intrinseco alla doppia elica, la molecola di DNA nel suo complesso pu avere degli ulteriori avvolgimenti; questi superavvolgimenti possono essere positivi se sono nello stesso senso dell'avvolgimento della doppia elica (questo in natura non esiste), oppure

negativi se sono nel senso opposto. Il superavvolgimento negativo fa s che si crei una ultrastruttura: il DNA tende a compattarsi. Una delle ragioni dell'esistenza del superavvolgimento infatti proprio quella di avere un DNA pi compatto. Nella cellula il superavvolgimento si ottiene aprendo il plasmide; il resto del doppio filamento viene poi fatto passare attraverso la rottura, che infine viene riparata. In altre parole, le cellule creano dei nodi; il DNA in questo modo non in equilibrio, accumula energia; la sua struttura viene distorta da un punto di vista tridimensionale in modo che diventi pi compatto.

Gli enzimi che si occupano di queste attivit enzimatiche sono le topoisomerasi di tipo II (dette girasi in E. coli); il nome eloquente: gli enzimi di questa famiglia non cambiano niente dal punto di vista chimico; cambiano solo la topologia della molecola. Le girasi sono topoisomerasi che con spesa di energia superavvolgono negativamente il DNA. Le topoisomerasi di tipo I invece eseguono il lavoro inverso, togliendo i superavvolgimenti del DNA. Nella cellula batterica comunque le girasi sono pi attive, sicch il plasmide , per la maggior parte del tempo, superavvolto cos come il cromosoma.

Come dicevamo prima, una prima ragione per l'esistenza di questo fenomeno quella di avere un DNA pi compatto. Il DNA infatti una molecola gigantesca: difficile anche solo immaginare come questa struttura possa compattarsi all'interno di un batterio. Per quanto riguarda la seconda ragione, prima dobbiamo chiarire un concetto. Il superavvolgimento negativo (ribadiamo che con negativo si intende che avviene in senso opposto rispetto all'avvolgimento della doppia elica) fa s che nella cellula ci sia un equilibrio non enzimatico tra la forma superavvolta negativamente e una forma pi rilassata. La forma rilassata per non pu essere uguale alla forma rilassata del DNA che conosciamo, dato che la molecola ha acquistato energia: dove viene spesa l'energia accumulata? Nella rottura di alcuni legami ad idrogeno. Notiamo che un superavvolgimento positivo porterebbe ad una maggiore chiusura della doppia elica, con il risultato che per aprire la doppia elica sarebbe necessario spendere ancora pi energia. Invece, il superavvolgimento negativo sottrae energia: per aprire la doppia elica basta una energia minore. Quindi, la seconda probabile ragione che spiega l'esistenza di questo fenomeno che il DNA cos pu anche essere pi facilmente aperto a singolo filamento. Questo importante perch le due principali attivit in cui coinvolto il DNA sono la replicazione e la trascrizione, ed entrambe prevedono come prima tappa l'apertura della doppia elica. Questo sembra confermato anche dal fatto che, sperimentalmente, si vede che i batteri che hanno delle topoisomerasi II difettose si duplicano molto pi lentamente del ceppo di controllo.

In un plasmide, introdurre superavvolgimenti abbastanza facile, in quanto un dominio topologico chiuso, ovvero una molecola che non ha estremit libere. Se, con un enzima di restrizione, si linearizzasse un plasmide per poi tentare di superavvolgerlo, la molecola semplicemente ruoterebbe su s stessa.

La topoisomerasi II un enzima eterotetramerico che con consumo di ATP taglia un filamento e forma un nodo facendo passare l'altro filamento attraverso il taglio. Questo equivale a superavvolgere il DNA: da un plasmide rilassato, la girasi, con consumo di ATP, in grado di produrre la struttura superavvolta. Il superavvolgimento in natura stato osservato solo negativo; un superavvolgimento positivo sarebbe una sorta di inibizione all'apertura di una doppia elica, dunque poco conveniente. Le topoisomerasi I, come abbiamo visto, tolgono i superavvolgimenti. Questa una operazione piuttosto semplice. Gi soltanto tagliando uno dei due filamenti si pu svolgere la doppia elica. Inoltre, l'enzima non ha nemmeno bisogno di ATP: il processo spontaneo.

Il superavvolgimento del DNA non riguarda solo i plasmidi batterici: un fenomeno comune a tutto il DNA di tutti gli organismi, compreso il nostro. Tuttavia, sorge spontanea una domanda: come possiamo pensare a dei domini topologici chiusi, dato che i cromosomi sono lineari? Non abbiamo ancora esaminato la struttura della cromatina, ma per il momento ci basti sapere che i nostri cromosomi possono essere considerati dei domini topologici chiusi. Una molecola lineare pu diventare un dominio topologico chiuso qualora se ne fissino le estremit cos da tenerle ferme. Nel nucleo c' una gigantesca quantit di proteine; il DNA nel nucleo non certo una molecola libera, ma strettamente legata ad altre molecole. Questo fa s che il DNA, di fatto, sia costituito da tanti domini topologici chiusi, e questo permette l'avvolgimento. Se assumiamo che i cromosomi siano domini topologici chiusi, questo significa che la topoisomerasi II pu agire su di essi, e quindi anche per i cromosomi avremo un equilibrio tra una ultrastruttura compatta e una forma rilassata con una zona a singolo filamento. Si pu capire che il DNA superavvolto esaminandolo a livello degli ottameri nucleosomici, intorno ai quali il DNA avvolto a rocchetto. Non a caso, quando il DNA viene trascritto, la struttura nucleosomica deve essere smantellata. La trascrizione quindi anche negli eucarioti viene favorita

perch il DNA energeticamente pronto ad aprirsi. Il DNA viene tenuto fermo ai capi dagli istoni, e i nucleosomi che si trovano in mezzo ai due capi vengono smantellati, cos si pu instaurare l'equilibrio. Quando si purifica il DNA dagli istoni, la forma superavvolta viene persa, per cui non ci si accorti di questa ultrastruttura se non esaminando i plasmidi.

Parliamo adesso della replicazione del DNA. Diamo per scontato che siano ben compresi alcuni concetti base: che si tratta di una replicazione semiconservativa; che la direzione di sintesi 5'-->3', per cui la sintesi avviene in sensi opposti sui due filamenti; che su un filamento la sintesi continua, mentre sull'altro discontinua.

A differenza della trascrizione, che, vedremo, coinvolge un solo filamento di DNA, la replicazione del DNA coinvolge entrambi i filamenti. Si tratta di un processo sorprendentemente efficiente per replicare una enorme molecola come quella del DNA, anche se un processo complesso da organizzare per gli enzimi coinvolti. A livello del singolo filamento abbiamo la copiatura, sulla base della sequenza del filamento stampo, di un filamento complementare. Per cui le DNA polimerasi non inventano niente dal punto di vista della sequenza di DNA. La premessa per l'azione di questi enzimi la presenza di un filamento che faccia da stampo.

Tranne quando diversamente specificato, parleremo di questi fenomeni in riferimento ai procarioti. Prima di tutto perch in genere i processi metabolici sono meglio conosciuti nei procarioti che negli eucarioti, e poi perch finora, quando un processo stato approfondito anche per quanto riguarda i procarioti, si sempre visto che i meccanismi erano estremamente simili. Naturalmente, vi sono casi in cui due processi sono molto diversi; alcuni processi poi esistono solo negli eucarioti (es. lo splicing).

La duplicazione del DNA inizia in un punto ben preciso, detto origine di replicazione, o, abbreviato, OriC. Nei cromosomi eucariotici ci sono diverse origini di replicazione, ma il significato lo stesso. Si tratta di zone del DNA con una sequenza particolare, che viene riconosciuta dagli enzimi che devono interagire con Ori C. Solitamente le origini di replicazione sono sequenze di 13 nucleotidi ripetute 3 volte. Altre sequenze sono di 9 nucletidi e sono ripetute 4 volte (in una direzione o nell'altra). Le sequenze consenso sono sequenze medie: sono sequenze che non sono sempre perfettamente uguali, ma molte posizioni sono conservate. Una tipica sequenza consenso :

G A T C T N T T N T T T T

N significa che pu esservi qualunque nucleotide come abbiamo detto, le sequenze consenso sono molto conservate, ma non identiche. Questa sequenza di 13 nucleotidi ripetuta 3 volte. L'altra, di 9 nucleotidi, ripetuta 4 volte, :

T T A T N C A N A

Queste sequenze, come si vede, sono particolarmente ricche in T ed A. Queste basi rappresentano, come sappiamo, dei punti di debolezza del doppio filamento. Quindi, non solo qui saremo verosimilmente in presenza di DNA superavvolto negativamente (il che, abbiamo visto, facilita l'apertura della doppia elica), ma abbiamo anche delle sequenze la cui composizione di basi azotate molto ricca di T ed A, che formano solo 2 legami ad idrogeno. In questa zona, la doppia elica si apre con relativamente poca energia. La presenza di queste sequenze serve quindi non solo come riconoscimento per quegli enzimi deputati ad iniziare il processo di replicazione, ma anche come zona favorevole all'apertura.

Abbiamo dei fattori proteici, detti DNA A, DNA B e DNA C, che interagiscono con l'origine di replicazione per formare un complesso aperto da cui inizia il fenomeno della replicazione del DNA.

Per primo si lega DNA A, in una struttura che ricorda vagamente quella di un nucleosoma. Si forma quindi una sorta di complesso ottamerico grazie all'interazione tra la DNA A e le sequenze viste prima; il DNA si apre a singolo filamento, con formazione di una forcella di replicazione a destra e una a sinistra, ed entrano in gioco DNA B e DNA C. DNA B una elicasi che scorre sul DNA e, con consumo di ATP, rompe i legami ad idrogeno. l'attivit enzimatica che serve ad ampliare la forcella di replicazione. Nel complesso, ci

saranno due elicasi, una per ogni forcella di replicazione: procedendo in due direzioni opposte, ampliano le rispettive forcelle di replicazione. A questo punto, la sintesi a carico della DNA polimerasi III. In natura, tutte le DNA polimerasi sintetizzano in direzione 5'-->3'. Grazie al filamento stampo, l'enzima effettua la sintesi del nuovo filamento. L'enzima necessita di un -OH libero in 3', a livello del quale catalizza la formazione di un nuovo legame fosfodiesterico con un nuovo deossinucleoside trisfosfato, stabilito secondo la complementariet delle basi. La DNA polimerasi ha infatti affinit per i deossinucleosidi trifosfato - la sintesi avviene perch abbiamo substrati gi attivati con un gruppo trifosfato: da un punto di vista termodinamico, sono identici all'ATP. Il legame si forma senza ulteriore dispendio energetico perch l'energia gi presente in questi legami. Formatosi il legame fosfodiestere con attacco nucleofilo, viene perso un gruppo pirofosfato, che l'enzima pirofosfatasi trasforma prontamente in due gruppi fosfato, rendendo la reazione ancora pi esoergonica (G ancora pi negativo). Insomma, la reazione di sintesi viene resa esoergonica dall'idrolisi dei due legami anidridici tra i fosfati, che sono ad alta energia; prima l'idrolisi avviene a livello dei nucleosidi trifosfato, poi a livello del pirofosfato. L'equilibrio della reazione quindi si sposta verso i prodotti grazie al fatto che viene utilizzato un substrato attivato.

La DNA polimerasi, come enzima, affine al suo substrato: i 4 deossinucleosidi trifosfato. Per ognuno di questi ha la stessa identica affinit. La scelta di quale dei quattro deossinuclesidi trifosfato possibili verr inserita viene fatta, in pratica, dal filamento stampo. La DNA polimerasi procede per tentativi: inserisce i deossinucleosidi trifosfato uno per volta, finch, sulla base della complementariet con le basi del filamento stampo, non trova quello adatto. La sintesi, vale la pena ribadirlo, sempre in direzione 5'--> 3' dal punto di vista del filamento stampo, quantomeno. La notazione 5' 3' significa che viene utilizzato il 3' libero per legare il 5' di un nuovo nucleotide. Questo ha anche un'altra conseguenza: la DNA polimerasi ha bisogno di un -OH libero in 3' per iniziare la sintesi; questo significa che serve un qualcosa per iniziare la sintesi. La cellula risolve questa situazione cos: nel momento iniziale della sintesi, viene posto un innesco sotto forma di RNA, che presenta un 3' -OH libero; per la DNA polimerasi questo substrato sufficiente, e cos pu iniziare la sintesi del DNA. I primer di RNA sono due: uno per ogni filamento. Chiaramente, se il filamento stampo ha una direzionalit di tipo 5'-->3', il filamento stampo sar 3'-->5', e viceversa.

Ci sar un filamento su cui la DNA polimerasi pu procedere sintetizzando in maniera continua. Su uno dei due filamenti per la DNA polimerasi costretta a sintetizzare in direzione opposta. Su questo filamento, nel momento in cui la DNA elicasi apre la forcella di replicazione, vengono deposti via via nuovi inneschi, ciascuno ogni 1000 basi circa; la DNA polimerasi sintetizza quei frammenti di DNA, di circa 1000 basi, che si trovano tra un innesco e l'altro: i frammenti di Okazaki.

La sintesi sul filamento discontinuo verr completata con l'eliminazione dell'innesco di RNA e la sintesi del DNA mancante; infine, una ligasi unir i frammenti di DNA tra loro. A sintesi completata, la differenza non si vedr.

In E. coli, vi sono tre tipi di DNA polimerasi (I, II, III); in E. coli, la DNA pol III l'enzima pi coinvolto nel processo di sintesi, che sintetizza quasi tutto il DNA. La DNA pol I l'enzima che sintetizza il DNA mancante sul filamento discontinuo. La DNA pol II invece non coinvolta nella sintesi, ma nella riparazione.

Dal punto di vista strutturale, la DNA polimerasi III un enzima estremamente complesso, composto da 8 o 12 subunit diverse. Le subunit sono nominate con lettere greche: , , , , . Possiamo considerare l'enzima come diviso in due met: alcune subunit (es. , che sono come delle pinze per mantenere il contatto con il DNA, , , che la subunit catalitica) sono presenti in entrambe le met dell'enzima, altre invece sono presenti solo in una delle due, con il risultato che una delle due unit di cui composto l'enzima pi grande. Le subunit servono a connettere le due met e a tenerle insieme. L'unit pi piccola cura la sintesi del filamento continuo, l'unit pi grande si occupa della sintesi del filamento discontinuo. Quindi le sintesi avvengono insieme.

Di fatto, come avviene la sintesi? Come possono la sintesi lenta e la sintesi veloce avvenire insieme, visto che procedono in direzioni diverse? La sintesi avviene a livello del grosso complesso multienzimatico chiamato replisoma, che comprende una DNA polimerasi III (l'enzima che, come abbiamo visto, opera la sintesi del DNA), una elicasi (l'enzima che apre la doppia elica), e una primasi (l'enzima che deposita gli inneschi). Per far avvenire insieme le due sintesi, uno dei due filamenti, quello della sintesi lenta, viene ruotato di 180 grazie alla formazione di una ansa: in questo modo la sintesi, da un punto di vista topologico,

pu procedere nella stessa direzione. L'ansa di circa un migliaio di basi, vale a dire una quantit corrispondente ad un frammento di Okazaki. Quindi, la parte sinistra dell'enzima, che cura la sintesi continua, opera su un filamento; sul filamento piegato ad ansa la primasi deposita l'innesco, mentre la parte pi complessa della DNA polimerasi proceder alla sintesi di un frammento di circa 1000 basi. La struttura poi si smantella, il complesso scorre di circa mille basi, e si forma un'altra ansa, che equivale ad un altro frammento di Okazaki.

Essendo le due parti di enzima legate insieme, la sintesi lenta rallenta la sintesi veloce, perch di fatto le due sintesi procedono alla stessa velocit chiamata sintesi veloce perch di fatto andrebbe molto veloce. Se la sintesi veloce procedesse alla velocit massima, e la sintesi lenta fosse un processo separato, avremmo il formarsi di una grande quantit di DNA a singolo filamento, perch, dei due filamenti separati dalla elicasi, uno sarebbe rapidamente coperto, mentre l'altro, nell'attesa di passare dalla DNA polimerasi, rimarrebbe spaiato. Questa una situazione estremamente pericolosa per la cellula: se il singolo filamento subisse un nick, avremmo una rottura della doppia elica. Durante la replicazione del DNA infatti, esistono delle proteine dette SSBPs (Single Strand Binding Proteins) che si legano al singolo filamento e che hanno la duplice funzione di mantenere il DNA aperto stabilizzando il singolo filamento e di proteggerlo dalle rotture.

Quindi: una situazione in cui vi molto DNA a singolo filamento libero indesiderata; la maniera che l'evoluzione ha trovato per ovviare a questa situazione stata quella di legare insieme le due sintesi.

Biochimica - Lezione del 4-05-09 [Prof. Raugei]

Lo scopo di questa parte del corso cercare di capire, a partire descrizione di ci che avviene nella cellula, la conoscenza di questi fenomeni abbia reso possibile il loro utilizzo in vitro e nell'ingegneria genetica.

Per quanto riguarda la replicazione del DNA, abbiamo visto che a livello della forca di replicazione si monta questo grosso complesso proteico composto, oltre che da elicasi (un enzima a forma di cuneo che, con consumo di ATP, rompe i legami a idrogeno e apre la doppia elica) e primasi (un enzima che sintetizza gli inneschi a RNA), dalla DNA polimerasi, che in E. coli la III questo enzima cura la gran parte della sintesi del DNA. Si tratta di un enzima composto da due unit: uno si occupa della sintesi veloce, l'altro della sintesi lenta quest'ultima ha 5 subunit in pi; il resto delle subunit sono uguali tra le due parti dell'enzima. Di queste, le subunit sono quelle responsabili dell'attivit polimerasica; le subunit sono quelle che tengono insieme le due met dell'enzima; la forma una sorta di struttura a pinza che si associa al DNA; la che ha attivit esonucleasica, responsabile della capacit di proof reading tipica delle attivit DNA polimerasiche (che vedremo dopo). Secondo la teoria pi accreditata, si formerebbe una sorta di ansa, di circa 1000 basi, che permetterebbe alle due sintesi di procedere contemporaneamente. La primasi una RNA polimerasi che si occupa della sintesi degli inneschi a partire dai quali pu iniziare la sintesi dei frammenti di Okazaki; durante la sintesi i frammenti di Okazaki sono frammisti agli inneschi di RNA, che vengono in seguito eliminati da un enzima detto eraser; nelle zone a singolo filamento che si formano dove prima vi erano gli inneschi sintetizzato prontamente del DNA dalle DNA polimerasi I e III, a partire stavolta dai 3'OH dei frammenti di Okazaki.

La DNA polimerasi I un altro enzima fondamentale nella duplicazione del DNA, ma che non partecipa direttamente alla sintesi; rifinisce il lavoro, ed coinvolto anche nella riparazione del DNA. un enzima molto importante anche perch forse il principale enzima utilizzato nell'ingegneria genetica. Verosimilmente, in tutto il mondo, ogni giorno ne viene utilizzato qualche Kg, perch viene utilizzato nelle tecniche pi disparate, a partire dalla PCR fino alle tecniche di sequenziamento del DNA. Perch questo enzima cos diffuso? La DNA polimerasi III molto complesso come enzima, essendo formato da numerose subunit: difficile anche solo da studiare. La DNA polimerasi I invece un enzima molto semplice, poich monomerico. un unico polipeptide, nemmeno molto grande, di circa 100 kDa questo significa che formato da circa 900 aminoacidi: 100 kDa = 100,000 Da; dato che il peso medio di un

aminoacido circa 110 Da, 100,000 / 110 900 aminoacidi. Questo un peso tutto sommato medio per una proteina. La cosa interessante che, nonostante sia un unico polipeptide, si possono riconoscere dei domin in generale, in una proteina si possono riconoscere dei domin se questa ha attivit o capacit diverse. Per esempio, se una proteina ha la capacit di riconoscere un recettore ed ha anche una attivit enzimatica, verosimile che abbia due domin; oppure, quando una proteina ha diverse attivit enzimatiche, spesso possibile riconoscere dei domin quasi come se fossero diversi quartieri di una citt. In questo caso, le attivit possedute dalla DNA polimerasi I sono - polimerasi 5'-->3', che ci attendiamo- una esonucleasi 3'-->5' , responsabile del proof reading- nucleasi 5'-->3'

Quindi questo enzima ha anche delle attivit esonucleasiche; come vedremo, l'attivit di esonucleasi 3'-->5' comune a tutte le DNA polimerasi: permette di correggere eventuali errori, il che risulta in una aumentata fedelt di copia. In pi, abbiamo anche una attivit 5'-->3' esonucleasica. Questo enzima, dal punto di vista della attivit di DNA polimerasi, non molto efficace, dato che molto pi lento della DNA polimerasi III, ed poco processivo. Cos' la processivit? Nel caso della sintesi del DNA, non dobbiamo pensare che l'enzima inizi la sintesi, e si fermi solo in fondo alla sequenza da duplicare, a replicazione ultimata. Questo raramente vero per una reazione; nel caso della DNA polimerasi si attacca alla forcella di replicazione, procede per qualche migliaio di basi, poi in genere si stacca e se ne attacca un altro. La processivit quanto dura il lavoro di una singola molecola; DNA polimerasi III molto processiva, ed anche veloce. DNA pol I lenta e poco processiva per, dato che deve sostituire gli inneschi, non importante che sia molto veloce n processiva, dato che si tratta di decine di basi. Inoltre, anche se una singola DNA polimerasi I non dovesse farcela, ci sono molte altre molecole in grado di prendere il suo posto. In effetti, si chiama DNA polimerasi I perch stata scoperta per prima, e questo successo perch particolarmente abbondante: si parla di decine di migliaia di copie. Klenow, ricercatore degli anni '50, riusc, con un taglio endopeptidasico operato con un enzima che casualmente aveva questa specificit, ad eliminare una parte dell'enzima detto frammento piccolo, ottenendo il cosiddetto frammento grande di Klenow, che mantiene l'attivit polimerasica ed esonucleasica 3'-->5'. Si tratta di una sorta di versione ridotta dell'enzima, che per in vitro funziona perfettamente, sotto certi aspetti anche meglio dell'enzima completo, perch in vivo l'altra attivit esonucleasica tendeva a rallentare la reazione. Nell'ingegneria genetica si utilizza in effetti questo frammento, per lo pi. La polimerasi I, come struttura tridimensionale, si pu assimilare ad una mano in cui indice e pollice formano un orifizio attraverso il quale passa il DNA appena sintetizzato. Il dominio polimerasico dato dalle dita; nel palmo c' l'attivit esonucleasica di proof reading.

Tutte le DNA polimerasi hanno capacit di proof reading, ovvero di correzione delle bozze. Questo nome deriva dalla figura, tipica del giornalismo di un tempo, del correttore delle bozze (proof reader), che correggeva gli errori di ortografia nelle bozze degli articoli scritti dai giornalisti, cosicch queste fossero corrette prima di andare in stampa.

Alcuni enzimi fanno qualcosa di simile al correttore di bozze: sono le DNA polimerasi, e un altro enzima chiamato Aminoacil-tRNA sintetasi, che lega l'aminoacido al proprio tRNA corrispondente enzima che vedremo a suo tempo. Dunque sono pochissimi gli enzimi in grado di esercitare questa attivit.

Supponiamo di avere un filamento stampo con la sua sequenza, con una DNA polimerasi che sta sintetizzando. Pu succedere che l'enzima commetta un errore, per esempio appaiando una G ad una T. Questo errore genererebbe una mutazione, ma l'enzima pu sentire l'errore in virt della sua particolare struttura. Dato che il DNA una doppia elica antiparallela, questa mantiene il suo calibro solamente se vi sono degli appaiamenti corretti tra le basi: abbiamo una purina (leggermente pi voluminose) che si accoppia con una pirimidina (leggermente pi piccole), e questo fa s che sul piano di legame vi siano sempre tre anelli, due della purina e uno della pirimidina. Se, in seguito ad un errore, avviene un appaiamento non corretto (es. due purine) l'elica si distorce inevitabilmente; anche se si accoppiasse una purina con una pirimidina, il fatto che non si instaurino le giuste interazioni deboli perturba la struttura della doppia elica. Con un effetto di tipo allosterico, l'attivit polimerasica si ferma immediatamente appena la DNA polimerasi avverte l'errore. La stessa distorsione induce anche un altro: l'enzima torna indietro, un po' come facciamo noi quando, scrivendo al computer, ci accorgiamo di aver commesso un errore: premiamo il tasto delete, cancelliamo la parola sbagliata tornando indietro, e riscriviamo. La DNA polimerasi allo stesso modo, esercita la sua attivit esonucleasica 3'-->5', che fa s che l'enzima torni indietro rispetto alla direzione di

sintesi di 5-10 nucleotidi. A quel punto, si blocca l'attivit esonucleasica e riprende la normale attivit polimerasica. L'evoluzione ha portato a mettere a punto, come si vede, un sistema di replicazione del DNA estremamente preciso e raffinato si pu capire, dato che il DNA il nostro patrimonio genetico, ed fondamentale che venga replicato adeguatamente. Questo vero soprattutto per gli organismi pi semplici, che hanno cicli di replicazione velocissimi. Le mutazioni sono quasi sempre negative.

Abbiamo visto quasi tutte le attivit enzimatiche di questo processo molto complesso che la replicazione del DNA (negli eucarioti sono stati evidenziati meccanismi simili, leggermente pi complessi, ma in cui la logica di fondo rimane la stessa la differenza pi grossa tra procarioti ed eucarioti che questi ultimi hanno pi origini di replicazione per cromosoma):

DNA B: inizia lo svolgimento dell'elica Primasi DNA A, poi sostituita da Elicasi con consumo di ATP, spezza i legami ad idrogeno della doppia

elica. SSBP stabilizzano il singolo filamento DNA polimerasi III Eraser elimina gli inneschi di RNA DNA polimerasi I riempie gli spazi lasciati dagli inneschi di RNA eliminati DNA Ligasi unisce i frammenti di Okazaki tra loro con consumo di ATP formando il legame

fosfodiesterico tra il 3' OH e un 5' P; formare questo legame un processo endoergonico. Durante la sintesi il processo viene portato avanti dal fatto che si utilizzano substrati attivati, ma qui non avviene.

DNA Girasi

Ci rimane da vedere l'ultima, la DNA girasi, una topoisomerasi con un ruolo molto importante. Abbiamo detto che l'elicasi apre il doppio filamento. L'elicasi, in questa operazione, crea superavvolgimenti positivi ( come se stesse chiudendo la doppia elica); se non ci fosse un meccanismo per togliere i superavvolgimenti positivi il processo si fermerebbe. Per questo, esiste la DNA girasi che introduce superavvolgimenti negativi, permettendo in pratica la rotazione del DNA e annullando i superavvolgimenti positivi.

Tuttavia, c' un problema nella sintesi del DNA. Pensiamo ad un cromosoma circolare, o ad un plasmide. Si forma una apertura a livello dell'origine di replicazione, le due forche di replicazione procedono una in senso orario, l'altra in senso antiorario, e infine si incontrano. La sintesi allora completata. I procarioti non hanno problemi, perch il cromosoma, essendo circolare, viene automaticamente copiato per intero. Ma per un cromosoma lineare, come quelli eucariotici? Alla fine della sintesi emerge un problema a livello dei telomeri, le zone terminali dei cromosomi lineari. Arrivate al rispettivo telomero, le due forche di replicazione ad un certo punto separeranno completamente i due filamenti di DNA. Un filamento sar copiato per sintesi veloce, che non crea problemi. L'altro filamento sar copiato per sintesi discontinua: dato che la primasi pone inneschi ogni 1000 basi circa, cosa succede se l'ultimo innesco prima della fine del cromosoma a 100 basi di distanza? La primasi non pu a questo punto porre l'innesco, e la DNA polimerasi non potr sintetizzare il DNA. Inevitabilmente, il filamento si accorcia, e una parte di DNA viene perso: ad ogni generazione del DNA, si verifica un accorciamento dei telomeri, che nei batteri non avviene perch il genoma circolare.

Come fanno gli eucarioti a risolvere il problema? Prendiamo in esame un eucariota molto semplice, come un lievito -questi, in sostanza, si coltivano come batteri, e, quasi come i batteri, sono abbastanza rapidi a crescere. Se non avessero strategie per difendersi dall'accorciamento dei telomeri, con le generazioni i cromosomi tenderebbero ad accorciarsi, e ad un certo punto i cromosomi verrebbero intaccati in zone codificanti. Questo prima o poi porterebbe alla impossibilit di riprodursi. Esistono delle attivit enzimatiche dette telomerasi che allungano le estremit dei cromosomi. Questi enzimi aggiungono ai telomeri segmenti di DNA non codificante, cosicch l'accorciamento elimini DNA inutile. Quindi le telomerasi aggiungono DNA tampone alla fine del cromosoma, cosicch l'accorciamento dei telomeri riguardi DNA inessenziale dal punto di vista genico. Le telomerasi aggiungono sequenze ripetute (vedremo tra un attimo di che si tratta) in set diversi, di decine, centinaia o migliaia di basi (a seconda della specie) allungando il 3'OH. Questi prolungamenti possono essere perduti senza conseguenze.

Le telomerasi sono sempre attive negli eucarioti molto semplici che si riproducono spesso (come i lieviti);

negli animali le telomerasi non sono sempre attive, ma sono attive solo in momenti precisi e circoscritti: a livello della gametogenesi, e nelle prime fasi dell'embriogenesi. In quest'ultimo caso, nelle cellule post-zigotiche, le telomerasi sono attive, e si accumulano telomeri molto lunghi. I nostri cromosomi hanno telomeri lunghissimi all'inizio della nostra vita; le cellule hanno una sorta di patrimonio di telomeri, che viene progressivamente speso, nella vita dell'organismo, durante le generazioni. Il nostro organismo, con i suoi 300 tessuti diversi, formato da miliardi di cellule. In genere, le cellule proliferano prima di differenziarsi; quando si differenziano terminalmente, smettono di riprodursi (es. neuroni, globuli rossi). Naturalmente, queste cellule non proliferano, ma svolgono la loro funzione nell'economia dell'organismo. La proliferazione necessaria per arrivare alla variet di cellule esistenti per ogni tessuto; alcune cellule differenziate del nostro organismo hanno alle spalle non pi di 100 generazioni, e possiamo considerare questo come un tetto massimo. I telomeri devono essere sufficienti per sopperire alla perdita di DNA per circa 100 generazioni, quindi. Alcune teorie ipotizzano che l'accorciamento dei telomeri sia una delle cause dell'invecchiamento, insieme agli errori che si accumulano nel DNA e ai danni ossidativi. Per quanto sia improbabile che l'accorciamento dei telomeri rappresenti l'unico fattore che porta all'invecchiamento, certamente probabile che abbiano un ruolo. I telomeri sono importanti anche nei tumori. Almeno nel 50% dei tumori analizzati le telomerasi hanno ripreso a funzionare. Una delle ragioni per cui la cellula cancerosa pu continuare a proliferare anche perch supera il problema dei telomeri, che tenderebbero ad accorciarsi. C' da dire che in molti tumori le telomerasi non sono attive, per cui ci dev'essere qualche altro meccanismo per bypassare il problema, che potrebbe coinvolgere il riarrangiamento di aberrazioni cromosomiche. Si era pensato a strategie antitumorali che andassero ad inibire le telomerasi, ma si sono rivelate un fallimento completo, e anche questo denuncia la probabile esistenza di altri meccanismi.

Quindi, normalmente le telomerasi sono attive solo per un breve periodo del nostro ciclo vitale. Gi dallo stadio di feto e per tutto il resto della vita, le telomerasi non dovrebbero essere pi attive se non a livello delle gonadi.

interessante esaminare il funzionamento delle telomerasi. Dal punto di vista enzimatico, si tratta di DNA polimerasi, dato che sintetizzano DNA. Devono quindi sottostare alle condizioni a cui sottostanno le DNA polimerasi: (1) ha bisogno di un 3'OH per iniziare la sintesi; (2) ha bisogno di una sequenza stampo su cui impostare la sintesi.

Per quanto riguarda la prima condizione, l'innesco semplicemente il tratto di DNA prima del telomero. A soddisfare la seconda condizione vi un filamento di RNA. Quindi, si tratta di una DNA polimerasi RNA dipendente, perch sintetizza DNA sulla base di uno stampo di RNA. Un'altra celeberrima DNA polimerasi RNA dipendente la trascrittasi inversa dei retrovirus, nota per costituire una clamorosa eccezione al dogma centrale della biologia (DNA trascrizione--> RNA traduzione--> proteine). La cosa davvero curiosa, tuttavia, che lo stampo di RNA legato all'enzima. La telomerasi composta da una parte proteica che utilizza come gruppo prostetico una corta molecola di RNA. C' una zona dell'RNA che normalmente trova una certa complementariet a livello del telomero, associandosi; l'RNA presenta poi una zona libera che pu essere copiata dall'attivit polimerasica della telomerasi.

L'RNA viene copiato con un movimento a bruco: la sequenza viene copiata, e poi si ritrae. La sequenza presenta uno stelo in cui, bizzarramente, G accopiato a T; questo accoppiamento non contribuisce alla stabilit dell'elica, per non la destabilizza poi molto. Il G del legame a idrogeno tra T e G leggermente negativo, e si forma. Abbiamo quindi uno stelo, piuttosto lungo (di 500-3000 basi). Il fatto che si formi questo stelo con accoppiamenti esotici ma permessi, con T-G, T-T, G-G, un meccanismo che serve a far s che non vi sia DNA a singolo filamento libero: i momenti in cui esiste DNA a singolo filamento libero sono momenti di debolezza per la cellula.

Il risultato dell'attivit della telomerasi produce quindi una serie piuttosto lunga di sequenze ripetute che formano i telomeri. Nelle normali cellule somatiche, possiamo aspettarci dei lunghi telomeri in una cellula giovane, poco distante dallo zigote come generazioni; in una cellula terminalmente differenziata, che si gi riprodotta diverse volte, i telomeri sono considerevolmente ridotti. Nel momento in cui una cellula diventa cancerosa,spesso le telomerasi ritornano attive, e la proliferazione pu andare avanti senza problemi.

Focalizziamoci adesso sulla capacit del DNA di replicare s stesso con estrema precisione. Qualunque

attivit enzimatica commette degli errori. Qualunque sia la reazione catalizzata, verosimilmente saranno commessi errori, come gruppi funzionali attaccati in posizioni aberranti, etc. Se il tasso di errori si mantiene basso, non ci sono di solito effetti significativi: tra le centinaia di molecole sintetizzate correttamente, un prodotto difettivo solitamente non crea problemi e viene semplicemente distrutto. Questo discorso si pu estendere all'RNA ma non al DNA. L'RNA viene sintetizzato, e occasionalmente potranno essere presenti degli errori: al massimo questo potr portare ad un certo numero di proteine con aminoacidi sbagliati. L'RNA dopo poco (in genere minuti od ore, massimo giorni) viene degradato. Il DNA per una molecola che, come abbiamo visto, ha una certa eternit: rimane costante nelle generazioni. Un errore commesso a livello del DNA ha conseguenze che si estendono ben al di l del breve termine: ogni mutazione viene ereditata e sar presente nelle molecole successive. Ovviamente, una sintesi perfetta non possibile, ma si sono evoluti dei meccanismi che tendono a minimizzare gli errori. Le DNA polimerasi hanno un tasso di errore tutto sommato basso, e riconoscono gli errori pi grossolani, ma si calcola che commettano errori con frequenza 10-4. Se si pensa che ogni errore una mutazione, ci si rende ben conto che un tasso di mutazioni simile sarebbe enorme, probabilmente incompatibile con la vita (ricordiamo che ogni mutazione un errore). La capacit di proof reading delle DNA polimerasi corregge gi alcuni errori a livello della sintesi, facendo scendere il tasso di errori a 10-7. Questo significa che su 1000 errori commessi, 999 vengono riconosciuti subito. L'evoluzione per ha ulteriormente abbassato questo tasso di mutazione: si sviluppato un ulteriore livello di controllo, un proof reading a valle della replicazione, che fa scendere la frequenza di errori definitiva a 10-9 per i batteri e tra 10-9 e 10-10 per gli eucarioti. Questa stata la frequenza di mutazioni che l'evoluzione ha sancito essere compatibile con la vita.

Si possono trovare mutanti, in specie tra i batteri, in cui tale tasso di errori sia pi alto, per difetti nei meccanismi di correzione. Questi batteri, in genere, accumulano troppi errori, con conseguenze deleterie. interessante notare per che sono stati trovati mutanti con tasso di mutazione ancora inferiore, nei quali cio la mutazione aveva perfezionato i meccanismi di proof reading. Questo significa che il meccanismo di proof reading che si stabilizzato non il pi preciso possibile, ma per qualche motivo si rivelato migliore. Questo lascia intendere che le mutazioni, in parte, sono necessarie. Quindi, possiamo aggiornare la lista delle funzioni del DNA.

Il DNA: replica s stesso viene trascritto in RNA muta

L'evoluzione non sarebbe stata possibile senza un minimo di mutazioni. Le mutazioni, per quanto in gran parte negative, sono alla base della capacit dei batteri di diventare resistenti agli antibiotici. Se non ci fossero mutazioni, il batterio non potrebbe mai fare una cosa del genere. Questo un sistema di adattamento dei batteri: casualmente, possono comparire mutanti pi adatti a sopravvivere a certe condizioni ambientali. In una popolazione di batteri che venga posta in un ambiente con una temperatura che non consente un adeguato funzionamento delle attivit cellulari (per esempio, a causa di proteine che tendono a denaturarsi etc.), un batterio nel quale una mutazione casuale rendesse la DNA polimerasi funzionante anche alle nuove temperature prenderebbe il sopravvento.

Vediamo qual' il fenomeno chimico alla base degli errori: la tautomeria cheto-enolica. Ognuna delle basi del DNA (cos come molte altre molecole) pu esistere in diverse forme, dette tautomeri, che cambiano per la disposizione degli elettroni. Ognuna delle basi ha un tautomero principale, nella cui forma si trova per la maggior parte del tempo, e diversi tautomeri minori, che nel tempo esistono raramente e per pochissimo tempo. Il tautomero principale della timina, per esempio, corrisponde alla timina come siamo abituati a vederla, ed quello che si lega alla adenina. Tuttavia questa base azotata pu esistere anche in forma di tautomero enolico, che si forma quando si instaura un doppio legame temporaneo tra la N e la C dell'anello pirimidinico, con uno spostamento di un elettrone a formare un gruppo -OH. La timina esiste in forma di tautomero enolico per pochissimo tempo, ma se, casualmente, la tautomeria si verifica proprio nel momento in cui sta arrivando la DNA polimerasi, pu presentarsi l'occasione per un errore. L'ossigeno del gruppo carbonilico, che normalmente un accettore di legami a idrogeno, nella forma enolica un -OH, che un donatore di legami a idrogeno. Si presenta quindi la possibilit per la timina in conformazione enolica di legare la guanina con tre legami ad idrogeno.

Quindi: quando la DNA polimerasi arriva a livello della timina, normalmente questa sotto forma di tautomero chetonico e lega una adenina; se per la timina in conformazione enolica, viene legata una guanina. Questo non un vero e proprio errore della DNA polimerasi, quindi. Pochi istanti dopo, La DNA polimerasi prosegue, ma la timina ha assunto nuovamente la sua conformazione chetonica standard. A questo punto, abbiamo una timina con una guanina, il che provoca la distorsione dell'elica che induce la DNA polimerasi a fermarsi. La stragrande maggioranza delle volte, un errore come questo viene corretto dalla DNA polimerasi improbabile che, tornando indietro, la timina sia nuovamente in conformazione enolica.

Lo stesso avviene anche per l'adenina, che per ha una tautomeria amino-imminica. L'adenina ha un gruppo aminico -NH2 in posizione 6 dell'anello esaatomico; si pu avere il passaggio di un elettrone in modo tale che si ha la formazione di un doppio legame con l'azoto, che diventa imminico. Come tautomero imminico, l'adenina stabilizza una citosina. Si pu avere quindi un accoppiamento adenina-citosina che rappresenta un errore, il quale per il pi delle volte corretto poich l'adenina ritorna quasi subito nella sua conformazione aminica.

I tautomeri sono presenti nelle forme minori sono per tempi limitatissimi, e questo consente agli errori di venire corretti la maggior parte delle volte, perch la doppia elica distorta viene sentita dalla DNA polimerasi. Tuttavia, potremmo chiederci come fa la DNA polimerasi a distinguere, tra le due basi sbagliate, quale la base da cancellare? In realt la risposta semplice, perch la DNA polimerasi in grado di distinguere tra filamento stampo e filamento neosintetizzato. E se il meccanismo di correzione della DNA polimerasi fallisce? A questo punto, abbiamo una situazione in cui la sintesi finita l'errore non stato corretto. Supponiamo di avere una adenina appaiata ad una citosina. Questo accaduto perch l'adenina era diventata tautomerica stabilizzando una citosina, e il sistema di proof reading della DNA polimerasi ha fallito. Se questo errore non venisse separato, alla successiva duplicazione, in una delle due eliche figlie verrebbe fissata una mutazione. Abbiamo visto per che c' una seconda possibilit di correggere l'errore. Il problema per un altro. Come si pu stabilire, a duplicazione avvenuta, qual il nucleotide corretto e quale quello sbagliato? Nel caso precedente, la DNA polimerasi poteva distinguere il filamento in corso di sintesi e quello stampo, ma in questo caso come si pu fare?

Nelle cellule sia eucariotiche che procariotiche c' un sistema di marcatura del DNA in modo che il sistema di riparazione possa identificare con certezza qual' stato dei due il filamento stampo. Questo possibile perch il DNA viene metilato in maniera asimmetrica. C' una metilasi detta DAM (Deossi Adenosin Metilasi) che metila le adenine che compaiono all'interno della sequenza GATC. Questa sequenza, in media, presente ogni 100-200 basi; quindi ogni 100-200 basi c' una adenina metilata. Nel momento immediatamente successivo alla replicazione del DNA, solo il filamento stampo metilato, mentre il filamento di nuova sintesi no. Con il tempo, anche nuovo filamento verr metilato, ma c' una finestra temporale tra la duplicazione del DNA e la metilazione del filamento nuovo nella quale la doppia elica metilata asimmetricamente. Grazie a questa asimmetria, non ci sono dubbi su quale filamento correggere. L'assenza di metilazione rende il DNA di nuova sintesi riconoscibile, e i meccanismi di riparazione sfruttano questo fenomeno per cercare gli errori di accoppiamento e sostituire la base che sta sul filamento nuovo, dando per scontato che la copia giusta sul filamento vecchio.

Il meccanismo di riparazione pi conosciuto in E. coli chiamato Mut H, Mut S, Mut L, dal nome delle tre proteine che partecipano al processo.

Mut S una proteina che scorre sul DNA nei momenti immediatamente successivi alla replicazione alla ricerca di zone in cui l'accoppiamento dei due filamenti non corretto. Mut H una endonucleasi, che riconosce e si lega alla sequenza metilata sul filamento vecchio e introduce un nick sull'altro filamento. A livello del nick agisce una esonucleasi che cancella la porzione di filamento tra il nick e il punto dove ha aderito Mut S. Si forma a questo punto un gap che ricorda in tutto e per tutto il gap che si forma dopo l'eliminazione dei primer a RNA. La DNA polimerasi I quindi l'enzima che colma il gap risintetizzando il frammento mancante. Una DNA ligasi poi ultima il lavoro.

Questo processo deve avvenire subito dopo la replicazione del DNA: se avviene troppo tardi, anche il filamento nuovo verr metilato e reso indistinguibile dal filamento vecchio.

Questo uno dei meccanismi che portano ad una fedelt di copia intorno a 10-9.

Biochimica - Lezione del 5-05-09 [Prof. Raugei]

Abbiamo visto che il primo meccanismo di correzione degli errori nella replicazione ad opera della polimerasi stessa; se questo meccanismo fallisce, c' una seconda chanche, molto ben conosciuta nei batteri (un meccanismo simile presente anche negli eucarioti), e che il sistema visto ieri, composto dalle tre proteine Mut S, Mut H, Mut L. Rivediamo meglio le caratteristiche principali di questo sistema.

Per correggere un miss match (cio un accoppiamento di basi sbagliato che deriva da un errore nella duplicazione) necessario un sistema per distinguere il filamento corretto da quello sbagliato: questa distinzione operata da una metilazione asimmetrica del DNA. Subito prima della duplicazione del DNA possiamo supporre che entrambi i filamenti della doppia elica siano metilati a livello di particolari sequenze; subito dopo la replicazione, il filamento nuovo non ancora metilato. Mut S una sorta di scanner del DNA, su cui scorre alla ricerca di appaiamenti non corretti, aderendo alla doppia elica laddove ne identifichi uno. Mut H in grado sia di riconoscere il filamento metilato, sia, essendo una endonucleasi, di operare un nick a livello dell'altro filamento. Il nick diventa un punto di attacco per una esonucleasi che digerisce il filamento nuovo fino al punto in cui si adesa Mut S. Mut H e Mut S sono quindi gli estremi del campo d'azione su cui lavora l'esonucleasi che digerisce una porzione di filamento nuovo fino a digerire anche il punto contenente l'errore. Mut L crea una sorta di ansa nel DNA che limita l'azione della DNAasi. Si crea quindi una zona a singolo filamento, una situazione che nel DNA , solitamente, temporanea. Questa situazione viene facilmente riparata dalla DNA polimerasi I, enzima presente in molte copie nella cellula, quindi pronto a riempire il gap. Infine, una ligasi salda il frammento neosintetizzato con il resto del filamento nuovo corretto. Con il tempo, anche questo verr metilato. Questo sistema di correzione quindi efficace solo nella finestra temporale che si trova tra la duplicazione e la metilazione, perch solo in questo lasso di tempo si pu distinguere il filamento stampo da quello di nuova sintesi.

Il DNA una molecola che ha una sua fragilit, nel senso che pu subire una serie di modificazioni, soprattutto a livello delle basi, dovute, nella maggior parte dei casi, ad agenti chimici. Si tratta di modificazioni non enzimatiche, spesso ossidative, che creano basi modificate. Queste basi modificate possono portare a mutazioni. Modificazioni di questo genere hanno modi diversi di essere riparate, ma possono essere riparate. Sono eventi che possono capitare in qualunque momento, indipendentemente dalla fase del ciclo cellulare (possono interessare anche cellule che passano la loro vita in fase G0, senza mai duplicare il loro DNA, ovvero senza mai entrare in fase S). In queste cellule, i meccanismi di riparazione che abbiamo visto finora non sono pi attivi, dato che il DNA non viene duplicato; tuttavia, il DNA pu essere sempre modificato, da raggi UV, agenti ossidanti, sostanze chimiche, etc. Anche nella cellula il cui DNA non si duplica esistono per questo motivo sistemi che monitorano il DNA e quando possibile lo riparano. Questo processo detto safeguarding del DNA. Dato che il sistema molto complesso, faremo solo alcuni cenni.

Affronteremo per primo un caso molto particolare. Tutti questi effetti che vedremo provengono in gran parte dall'ambiente; nel mondo moderno ci sono molte sostanze aggressive per il DNA rispetto al passato; tuttavia, anche prima dell'industrializzazione o della comparsa dell'uomo il DNA veniva modificato: esistono molti ossidanti naturali, tossine, radiazioni, etc. forse meno concentrate rispetto a oggi, per sono sempre esistiti agenti con la potenzialit di danneggiare il DNA e con l'evoluzione si sono anche sviluppati sistemi di riparazione.

Un caso particolare di modificazione pu avvenire normalmente in ogni momento nel nostro DNA. Una citosina pu subire una deaminazione ossidativa. Questo accade perch all'interno della cellula si producono normalmente dei ROS, potenti ossidanti derivati dall'ossigeno (es. H2O2), soprattutto a livello dei mitocondri. Le cellule hanno dei sistemi enzimatici per neutralizzare queste molecole molto reattive che si generano per

il semplice fatto che le nostre cellule utilizzano ossigeno nella respirazione cellulare: superossido dismutasi e altri enzimi che quasi sempre eliminano queste sostanze tossiche. Tuttavia, alcune di queste molecole sfuggono ai sistemi di difesa, e possono andare a danneggiare una serie molto ampia di molecole (RNA, proteine, che per essendo usa e getta non creano problemi) tra cui il DNA. Quindi, poich normale che alcuni ROS diffondano all'interno del citoplasma, non insolito che la citosina subisca deaminazione ossidativa, per circostanze del tutto naturali. La citosina dopo aver subito questa reazione non enzimatica diventa un uracile. Come mai questo pu portare ad una mutazione? Se questa modificazione non viene corretta, alla successiva duplicazione un filamento stampo avr una G, e si accoppier con una C generando una doppia elica non mutata, ma il filamento stampo con l'uracile si accoppier con una A, perch l'uracile un sinonimo della timina, che dunque stabilizza l'adenina. Questo introdurrebbe una mutazione. L'uracile, essendo molto simile alla timina, non destabilizza la doppia elica, quindi all'interno del DNA non crea distorsioni della molecola. Tuttavia, l'uracile si trova nell'RNA e non nel DNA: alla base del meccanismo di riparazione c' proprio il fatto che l'uracile non deve essere presente nella seconda molecola, dunque non ci sono dubbi su quale sia la base da correggere. Questo un principio che sta alla base dei sistemi di riparazione che vedremo dopo: esistono meccanismi per riconoscere tutta una serie di basi alterate (in questo caso l'uracile) del DNA, e per il fatto stesso di essere modificate vengono corrette.

Anche l'adenina tende, meno della citosina per, a deaminare, diventando una inosina. Anche in questo caso viene prontamente riconosciuta per il fatto di essere una base anomala rispetto alle quattro classiche.

Il meccanismo di riparazione prevede l'escissione della base: una N-glicosidasi il legame N-glicosidico che lega la base allo scheletro zucchero fosfato del DNA. Notiamo che l'assenza della base azotata non compromette la stabilit del doppio filamento: in quel punto non si formano legami a idrogeno, ma le molecole circostanti li formano, e questo sufficiente a stabilizzare la doppia elica.

Quindi, il principio che sta alla base di tutti i meccanismi che vedremo sempre questo: prima un sistema per riconoscere le basi anomale, seguito dall'escissione della base stessa.

Il risultato un sito abasico o sito aP (apirimidinico o apurinico): i meccanismi successivi riconoscono la carenza di una base che sar ripristinata a partire dalla complementariet con la base rimasta sull'altro filamento.

Il processo detto nick translation. Nel caso della nostra citosina deaminata ad uracile, per prima cosa una N-glicosidasi specifica per l'uracile taglia il legame N-glicosidico e forma il sito abasico. Il sito abasico a questo punto viene riconosciuto da una specifica DNAasi, una endonucleasi che opera un nick sul filamento da riparare, nelle vicinanze del sito. Il nick rende possibile l'azione di una esonucleasi 5'-->3' che digerisce il singolo filamento che conteneva il sito abasico. Infine, la DNA polimerasi I riempie il gap a partire da un 3' OH libero e utilizzando come stampo il filamento singolo rimasto; una DNA ligasi salder il tutto. Il processo si chiama nick translation perch viene formato un primo nick; dopo l'azione della DNA polimerasi I, ma prima dell'intervento della ligasi, sembra che questo nick si sia trasferito qualche base pi in l. Naturalmente il nick non si trasferisce realmente, ma il nome rimasto questo. In definitiva, il meccanismo non cos diverso dal sistema delle Mut che abbiamo visto la volta scorsa: in entrambi i casi, abbiamo prima l'intervento di una endonucleasi che forma un nick, poi una esonucleasi che cancella il frammento di singolo filamento contenente l'errore, e infine la DNA Polimerasi I e la ligasi che restituiscono integrit della doppia elica.

Si crede che una delle ragioni che hanno evolutivamente favorito l'affermarsi della timina nella struttura del DNA (ricordiamo che le teorie attuali prevedono un iniziale mondo a RNA: il DNA si sarebbe evoluto successivamente) sia la possibilit di questa riparazione. Se la struttura del DNA prevedesse l'uracile, in caso di deaminazione della citosina sarebbe problematico capire quale filamento riparare. Al contrario, la presenza della timina rende possibile il riconoscimento delle deaminazioni della citosina.

Una quota notevole di deaminazioni ossidative di citosina e adenina sono naturali; vediamo adesso qualche caso di modificazioni indotte da sostanze chimiche. Le sostanze mutagene sono un numero enorme. In generale, qualunque agente ossidante ha una potenziale azione mutagena. La attuale popolarit dei prodotti contenenti antiossidanti dovuta anche al fatto che possibile che questi composti tamponino lo stress ossidativo a cui sottoposto il DNA. Un esempio di sostanza ossidante mutagena l'acido nitroso, che

favorisce la deaminazione della citosina a uracile. Il sistema di riparazione presente nelle cellule basato su una frequenza di mutazione naturale; se questa frequenza aumenta, per esempio in seguito ad esposizione a sostanze chimiche ossidanti, il sistema entra in crisi e diventa probabile la fissazione di molte mutazione.

Agenti chimici ossidanti aumentano anche la quota di modificazioni a carico del