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Dispense di Chimica Fisica per Biotecnologie Dr.ssa Rosa Terracciano

S P E T T R O S C O P I AS P E T T R O S C O P I AS P E T T R O S C O P I A


SPETTROSCOPIA

II PARTE• Spettroscopia IR

• Spettroscopia NMR

• Spettrometria di massa


Un legame chimico tra due atomi può essere consideratocome un semplice oscillatore armonico.

m2m1

Le radiazioni infrarosse non hanno sufficiente energia da eccitaregli elettroni su livelli più alti, ma possono indurre transizioni tralivelli di energia vibrazionale e rotazionale.

SPETTROSCOPIA INFRAROSSA



Atomi differenti hanno masse differenti.

Legami chimici differenti hanno energie di legame differenti.

I legami interatomici si allungano e si accorciano continuamente(stretching o stiramento) e si piegano gli uni verso gli altri (bending o piegamento).

Gli atomi legati con un legame covalente hanno determinati valorGli atomi legati con un legame covalente hanno determinati valori dii dienergia vibrazionale: l’eccitazione di una molecola da un livellenergia vibrazionale: l’eccitazione di una molecola da un livelloovibrazionale ad un altro avviene solo quando il composto assorbevibrazionale ad un altro avviene solo quando il composto assorbe unaunaradiazione IR di determinata frequenza: l’energia è quantizzata.radiazione IR di determinata frequenza: l’energia è quantizzata.

OH H

stiramento

OH H

piegamento

C OO

piegamento


Normalmente si prepara un film in una placca di cloruro di sodio oppure

si frantuma il materiale insieme al bromuro di potassio, KBr, facendone

una pastiglia. Questi sali vengono utilizzati perché sono invisibili per la luce IR.

La spettroscopia IR è in pratica una tecnica analitica molto semplice.


Nella spettroscopia IR è consuetudine registrare la luce trasmessa e non quella assorbitada un valore 0 a un valore 100%.


Un tipico spettro infrarosso

4000 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 10000

10

20

3040

50

60

70

80

90

100

Frequenza (cm-1)

trasm

ittan

za (%

)


SPETTROSCOPIA NMR

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare è la tecnica che fornisce

la maggior quantità di informazioni strutturali rispetto alle altre tecniche

(IR, UV, MS) nell’identificazione di un composto organico.

Dallo spettro NMR di un composto ricaviamo infatti la natura degli atomi,

il loro intorno chimico e il loro rapporto quantitativo. E’ possibile inoltre,

conducendo esperimenti più sofisticati, risalire alla conformazione anche

di molecole molto complesse.


SPETTROSCOPIA NMR

Tutti i nuclei hanno una massa e una carica. Quelli che hanno ilnumero di massa oppure il numero atomico, o entrambi dispari,posseggono un momento angolare ossia uno “spin”.

La risonanza magnetica è un fenomeno completamente differentedalla “teoria della risonanza”.

Qualunque nucleo che possegga uno spin può essere studiato con l’NMR.

Il nucleo dell’idrogeno 1H è quello che fornisce il maggior numerodi informazioni, mentre l’isotopo più comune del del carbonio 12Cnon compare nello spettro NMR perché non ha uno spin nucleare.


SPETTROSCOPIA NMRCome funziona uno spettrometro NMR?

Quando un composto contenente idrogeno è introdotto in un fortecampo magnetico ed è irradiato con una radiazione elettromagnetica,i nuclei di idrogeno assorbono energia. Naturalmente, come tutti ifenomeni che avvengono su scala atomica, anche questo assorbimento è quantizzato e si verifica solo quando la forza del campo magnetico e la frequenza della radiazione non raggiungono determinati valori.

Gli spettrometri NMR sono in grado di misurare tale assorbimento.Uno spettrometro è costituito da un magnete molto potente ed è ingrado di generare un campo di radiofrequenze mediante il passaggio dicorrente elettrica in una bobina avvolta intorno al campione.


Come funziona uno spettrometro NMR?

Per ottenere lo spettro NMR si colloca il campione all’interno dellostrumento e lo si irradia con energia elettromagnetica di frequenzacostante: la grandezza che varia è l’intensità del campo magnetico.Quando il campo magnetico raggiunge l’intensità appropriata, i nucleientrano in risonanza (cioè assorbono energia). Questo fenomeno generauna debole corrente elettrica che viene amplificata e trasformata in unsegnale su di un foglio di carta calibrata.

Uno spettro NMR è dato dalla registrazione del voltaggio indotto infunzione della variazione del campo magnetico.L’area sotto il picco dipende dal numero totale di nuclei che hanno compiuto il salto.


SPETTROSCOPIA NMRNMR (nuclear magnetic resonance)

Oscillatore aradiofrequenza

Magnete

Tubicino NMR contenente il campione

Registratoredel segnale

Amplificatore


SPETTROMETRIA DI MASSAE’ un metodo fisico per l’indagine strutturale di molecole

organiche e biologiche.

Questa disciplina si avvale di una serie di tecniche che permettono:1) la determinazione del peso molecolare dei composti2) la determinazione della loro struttura3) la misura quantitativa delle molecole anche in presenza

di miscele molto complesse (fluidi bilogici, tessuti, ecc…)

Tutto questo può essere effettuato con quantità di campione estremamente limitate (fino a 10-12 grammi)l’analisi è di tipo distruttivo ed il campione utilizzato non puòessere recuperato dopo la misura.


LA SPETTROMETRIA DI MASSAIN CAMPO BIOLOGICO

•Identifica la struttura di biomolecole: proteine, carboidrati, acidi nucleici, steroidi.

•Stabilisce la sequenza di biopolimeri come proteine e oligosaccaridi.•Studia il metabolismo dei farmaci.

APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE

• Omocisteina (marcatore metabolismo metionina, malattie cardivascolari)• Emoglobina (glicata, marcatore diabete, anemia falciforme)• Acido Omovanilinico e Acido Vanilmandelico (marcatori oncologici, metaboliti catecolammine)• Acido Metilmalonico (Acidemia metil-malonica)• Acidi biliari (acido colico, acido chedeoxicolico, disfuzioni epato-biliari)


LO SPETTROMETRO DI MASSA

Unità di misuraMassa = Dalton (Da): 1 da è 1/12 della massa di un atomo di

carbonio-12 (12C).Carica = intesa come carica elementare di un elettrone (negativa)

o di un protone (positiva) z

m/zIoni monocarica z = 1Ioni multicarica z > 1

Misura il rapporto massa/carica delle molecole dopo che queste sono state ionizzate, cioè dopo che gli è stata impartita una carica elettrica.


Principio di funzionamento• Produzione di ioni• Separazione degli ioni in base al rapporto massa/carica

(m/z).• Rivelazione


2e -e - + ·

massa


Abbondanza relativa di elementi comuni

98.081Br10079BrBromo

32.537Cl10035ClCloro

4.434S0.7833S10032SZolfo

0.218O0.0417O10016OOssigeno

0.3815N10014NAzoto

0.0162H1001HIdrogeno

1.10713C10012CCarbonio

Abbond.relativa

IsotopoAbbond.relativa

IsotopoAbbond.relativa

IsotopoElemento


• Massa monoisotopica– rappresenta la massa della specie molecolare isotopica

più abbondante in natura.• Massa media

– rappresenta la media tra tutte le specie isotopiche presenti nella molecola

• Massa nominale– 128 (strumenti a bassa risoluzione: quadrupolo)

• Massa accurata– strumenti ad alta risoluzione (TOF, Settori magnetici)

• Glutammina 128.058• Lisina 128.094


Rappresentazione schematica di uno spettrometro di massa

Sistema di introduzione del

campione

Sorgente ionica Analizzatore Rivelatore

Separazione ioni Rivelazione ioni

Alto vuoto (10-6 Torr)

Sistema di elaborazione

Elaborazione dati

Dati in uscita


UNO SPETTROMETRO DI MASSA

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