S e J: proprietà sistemiche

* Le questioni del controllo non possono essere trattate guardando solamente allo stadio isolato.

* Ciascuna variabile (metabolita o flusso) non è determinata da un singolo stadio ma dipende in generale da tutti, magari in maniera diversa. Come possiamo formalizzare questo in maniera quantitativa?

* Se vogliamo risposte quantitative dobbiamo porre domande quantitative

Se il RLS non va bene con cosa possiamo sostituirlo?

Le vie metaboliche

Serie di intermedi metabolici (A,B,C…) “collegati” tra di loro da enzimi (E1, E2 …).

Nel mare magnum delle possibili reazioni a cui i metaboliti possono dare luogo, la specificità e peculiarità della catalisi enzimatica permettono, rispettivamente, una selezione molto ristretta e condizioni molto blande di reazione.

E1

E2

E3

E4

Le quantità di enzima e le relative leggi cinetiche determinano i flussi

Come descrivo in termini quantitativi una via metabolica?

Definire la via metabolica e i suoi confiniCercare leggi cinetiche adeguate per tutti gli enzimi/processiScrivere il sistema di equazioni che, una volta risolte, portino a esprimere le variabili (ad es. la concentrazione dei metaboliti o il flusso) in funzione dei parametri del sistema e del tempo

J = f(A, B, P1, P2, X1,X2, t…)

Una via metabolica: qualche concetto in più

X0 S1 S2 S3 ….. X1

E1 E2 E3 E4 … En

Attenzione: vie ramificate, cicliche con cofattori…

• n enzimi (ciascuno con la sua legge cinetica) e.g. vE2= f (A1, A2, A5, VmaxE2 …)

• n-1 substrati

• 2 metaboliti esterni (X0 and X1)

Come impostare (e risolvere) il problema?

2322

322 SG

dt

dV

V

S

dt

dS vvvv

V = volume

VVdt

)VS(d 32

2 vv

VVdt

dSV

dt

dVS 32

22 vv

Equazione per S2: Ricordate che il volume delle

cellule può variare! (per crescita, con o senza divisione cellulare)

G: tasso di crescita (dV/dt)/V

Se fate lo stesso per tutti i metaboliti (scrivere un’equazione) arrivate ad un insieme di equazioni non lineari

Per S2 vale la relazione: (dS2/dt) = v2 - v3 - GS2

(dS2/dt) = v2 - v3 - GS2

(dS3/dt) = v3 – v4 - GS3

(dS4/dt) = v4 - v5 - GS4

…..e così via

Allo steady state = 0 (flusso costante) e con G=0 (la cellula/ tessuto non cresce di volume), il sistema si semplifica

0 = v2 - v3

0 = v3 – v4

0 = v4 – v5

…..e così via (in presenza di diramazioni la cosa si complica)

C’è bisogno di strumenti adeguati per affrontare il problema; inizieremo con un breve ripasso delle cinetiche enzimatiche.

E’ possibile scrivere il sistema, ma non è facile risolverlo!

Perché v = f (E2, S2, S3, P1, P2, X0, X1…)

cioè funzione della concentrazione di substrati e prodotti, della quantità di enzima, della temperatura, dei metaboliti esterni (distinzione tra parametri e variabili)

Provando a risolvere il sistema…

Quanto un parametro influenza un flusso?

Come varia il flusso se vario la quantità di enzima? Poco o tanto?

Quanto varia il flusso se vario la quantità di enzima?

X0 S1 S2 S3 ….. X1

E1 E2 E3 E4 … En

v1 v2 v3 v4 … vn

Per spiegare il controllo del flusso abbiamo bisogno di introdurre il concetto di elasticità, una proprietà locale

Elasticità o ordine di reazione

Breve introduzione all’elasticità

Occorre meditare sui concetti e rileggere la letteratura

Elasticità (ε)

L’elasticità è una proprietà locale e ci dice come varia la velocità di un enzima al variare della concentrazione di un metabolita con cui l’enzima interagisce (S, P, I ,…)

Viene anche definita come ordine di reazione

E’ la pendenza sul grafico v funzione di S (e ci si aspetta che sia funzione di S) quando la scala è logaritmica.

ΔS Δv δS δv

La differenza può essere grande (Δ) o piccola (δ)

angolareCoeff .S

v

ES

S ln

vln

S

v

v

S

S

v

v

S

SS

v v

Siccome la variabile è, in questo caso, il substrato (S), allora si parla di elasticità al substrato.

Elasticità: coefficiente angolare nello spazio logaritmico

Il coefficiente angolare si ottiene passando al limite...

Elasticità al substrato per una MM irrev.

ε

S/KMProvate a esercitarvi con vExplorer

Elasticità e derivata prima

Elasticità

Derivata prima

v, v' o ε

S/KM e a P?

Potete arrivare lo stesso risultato derivando la formula di MM?

L’elasticità varia tra 1 e 0 (corrispondenti a S=0 e infinito)

?S ln

K

V ln

S ln

vln M

M

S

S

ES

Prova prima a risolverlo, altrimenti vai a vedere

Elasticità al substrato per una MM rev.

L’elasticità varia tra + infinito e – infinito; (attenti a v= 0)

Come si ricava?

?Cosa

succede?

Elasticità e derivata prima MMrev

Elasticità Derivata prima

v v

PS

SES

KP

KS

1

KS

ρ -1

1ε

L’elasticità al substrato di un enzima reversibile possiede due componenti:

* Una di natura termodinamica che dipende da quanto la reazione è spostata dall’equilibrio

* Una di natura cinetica che dipende da quanto l’enzima è saturato rispetto al substrato (prodotto)

L’elasticità distingue tra i contributi termodinamici e cinetici in maniera additiva (invece che moltiplicativa) come accadeva per l’espressione della velocità

Prova a ricavarlo! (soluzione…)

Un enzima può possedere diversi tipi di elasticità

PS

SES

KP

KS

1

KS

ρ -1

1ε

PS

PEP

KP

KS

1

KP

ρ -1

ρ -ε

Elasticità al prodotto

Elasticità al substrato

Elasticità alla quantità di enzima, attivatori, inibitori…

Quanto più lontana è una reazione dall’equilibrio tanto maggiore è il potenziale per la regolazione

Il termine cinetico è la chiave della regolazione

PS

SES

KP

KS

1

KS

ρ -1

1ε

Quando ρ 1 (siamo vicini all’equilibrio) questo termine assume valori molto grandi

Quando ρ 0 (siamo lontani dall’equilibrio) questo termine diventa significativo

Elasticità al substrato per un enzima cooperativo

Usando l’equazione di Hill con n=2, l’elasticità varia 0 e 2

Derivazione della formula per l’elasticità al substrato (enzima tipo MM irrev.)

SK

K

SK

S-SK

SK

S1

SK

V

v

S

S)(K

SV

SK

V

v

S

S

SK

SV

v

S

S

v

v

S

S

v

M

M

M

M

MM

M2

M

M

M

M

M

M

ln

lnES

L’elasticità è indipendente da VM

Derivazione di εs per un enzima reversibile

Ricordando che le espressioni cinetiche possono essere scritte spesso come (numeratore/denominatore)

PS

eqS

f

P/KS/K1

)P/K(SK

V

v

D

Nv

Come semplificare le derivate

lnS

lnD

lnS

lnN

S

D

D

N

S

N

N

S

S

D

D

N

S

N

D

1

N

DS

S

D

D

N

S

N

D

1

DNS

S D

DNS

S

v

v

S

2

N

ES

PS

eqS

f

P/KS/K1

)P/K(SK

V

v

S

f

K

V

S

N

SK

1

D

N

S

D

D

N

SS

f

eqS

f K

1

D

N

K

V

)P/K(SK

VS

S

D

D

N

S

N

N

S

SS

f

eqS

f K

1

D

N

N

S

K

V

)P/K(SK

VS

ρ -1

1

S

P -1

1

eqK SK

S

D

1

PS

SES

KP

KS

1

KS

ρ -1

1ε

L’elasticità al substrato di un enzima reversibile possiede due componenti:

* Una di natura termodinamica che dipende da quanto la reazione è spostata dall’equilibrio

* Una di natura cinetica che dipende da quanto l’enzima è saturato rispetto al substrato (prodotto)

Ritorna al grafico εs

1EP

ES εε Derivando l’elasticità per il prodotto si trova:

Flux Control Coefficient (CJ)

Cosa sono, a cosa servono e come posso misurarli

X0 S1 S2 S3 ….. X1

E1 E2 E3 E4 … En

v1 v2 v3 v4 … vn

Operiamo una variazione nell’enzima E2,

quale sarà la variazione di J corrispondente?

Se siamo allo steady state, v1 = v2 = v3 = v4 = vn = J

ΔE2 ΔJ

δE2 δJ

Operando una variazione piccola di J (ma sufficiente per una misura affidabile) ci avviciniamo alla derivata della curva J= J(E2)

angolareCoeff .E

J

2

Misura di CJ

Per misurare CJ con precisione occorre fare piccole variazioni nella quantità di un enzima (e uno solo!!)

Questo non è sempre fattibile dal punto di vista sperimentale

JEi

C

JEC 2

22

2

2

2

2

2 Eln

Jln

E

J

J

E

E

J

J

E

E

E JJ

Per ogni flusso (reazione), ci sono tanti CJ quanti enzimi; (se ci sono più flussi…)

Il tipo di definizione è simile a quella dell’elasticità, ma il CJ non è una proprietà di tipo locale, bensì di tipo sistemico

Che forma avrà la curva J(E)?

A valori bassi di E

A valori alti di E

Derivata e derivata con scaling

CJ in un grafico log-log

In questa zona la pendenza è 45% cioè il coeffic. Angolare (che è il CJ), è 1

La relazione enzima flusso in un caso reale:

% reduct. Aldolase

% inhibit. Photosynt.

35-78 10-45

Photosynthesis (Calvin cycle) Haake et al. (1998) Plant J. 14:147-57

CJaldolase in wt ≈ 0.24 (normal conditions)

Reduction of plastidial aldolase (reaction close to equilibrium)

Light 400 μmol/m2*s

Enzyme (% wt)

L’aldolasi plastidiale è un enzima che lavora vicino all’equilibrio ma che è limitante

Light at 220, 350, 700 μE

Condition CJTK for wt plants

CO2 amb., light at 220 μE 0.14CO2 amb., light at 700 μE 0.32

Reduction of plastidial transketolase (reaction close to equilibrium)

La transketolasi è un enzima che lavora vicino all’equilibrio ma che è limitante

CJRubisco= 0.1 in wt conditions

Rubisco (%) 57 100 (wt)

“ Vmax31.1 54.1

Activation % 93.5 62.5

Assimilation 6.35 6.80

Rubisco

La Rubisco è un enzima che lavora molto lontano dall’equilibrio e che NON è limitante

Flux control in photosynthesisA significant share of flux control is in

enzymes ‘close to equilibrium’Highly regulated enzymes working far from

equilibrium show less flux controlWhen light is switched on, flux increases:

many reactions are activated through changes in pH, Mg2+, redox status (thioredoxins), carbamylation, inhibitor degradation…

Attivazione parallela (no sign for a RLS!)

Biosintesi del Triptofano in Saccharomyces cerevisiae:

5 enzimi trasformano l’Acido Corismico in Triptofano

Una via metabolica reale: biosintesi di Trp in lievito

AAS (TRP2) PRT (TRP4) PRAI (TRP1)

TrpS (TRP5)InGPS (TRP3)

A rigore le variazioni dovrebbero essere piccole…

Due conclusioni importanti

- I valori di CJ in vivo, nelle condizioni wt, sono bassi

- Incominciano a salire solo per riduzioni notevoli della quantità di enzima (<50%)

La figura testimonia due fatti:

* La sovraespressione non porterà un grande (quanto?) aumento nel flusso!

* Molti enzimi hanno un CJ basso per cui una buona parte dell’attività di ciascuno di essi è dispensabile e questo significa che molte mutazioni sono recessive!

* Easy: Stopping flux to a product through a pathway.

(Pick any enzyme; knock out by mutation or inhibition).

* Hard: Increasing flux to a product through a pathway.

Flux change: an asymmetric problem

Verifica sperimentale della prima conclusione

Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i geni causa un ΔJ paragonabile al ΔEi (ΔJ CJ x ΔEi )

Alcune proprietà dei CJ

143210 XSSSSX

54321 E E E E E

Facciamo un esperimento con il pensiero…

aumentiamo l’enzima E1 di una quantità δE1

es. incremento frazionario dell’1% (δE1 / E1)

01.0%1E

E

1

1

Immaginiamo di fare lo stesso per tutti gli enzimi

Otterremo un aumento di flusso δJ, la cui entità sarà:

JEC

1

1

J

J E

E1 E2 E3 E4 E5

δE1

δE2

δE5

δE3

δE4

δJ

δJ

δJ

δJ

δJ

J J J J J

indica l’aumento di flusso determinato dall’enzima 11EJ

Teorema della somma

n

JE

JE

JE

JE

JE

JE

JE

JE

JE

i

n

n

C

CCCC

CCCC

1

EEEEtot

)...(

...

J

J ...

J

J

J

J

J

J

J

J

321

321

n321

11

n

JEi

C

A moment's reflection should show that such a change is equivalent to changing the time scale of the measurements: thus it should change all steady-state fluxes through the system by exactly a factor of α.

Se la somma di tutti i coefficienti CJ deve valere 1, allora si spiega perché in una via metabolica molti (se non addirittura tutti) gli enzimi hanno un CJ basso!

Questo darebbe ragione della recessività dei geni (95%)!!! (nessuna spiegazione alternativa rende ragione dei dati)

Phenotype is flux!

(non sempre…)

A cosa servono i CJ ? Ci permettono di predire il flusso in funzione della quantità di enzima. La bontà della predizione sarà tanto maggiore quanto più piccola sarà la variazione di enzima.

iJE ECJ

ilnln

Viene però usata di solito questa formula per predire le variazioni di flusso, perchè l’approssimazione è minore

E

E

J

J

JEC

ΔE

ΔJ

E1 E2

Se il flusso dipende dalla quantità di enzima con la legge di un’iperbole rettangola,

i

i

EB

AEJ

…allora è possibile ricavare il CJ anche quando avvengono grandi variazioni di E (cosa che in genere non si può fare)

212

212

J)E(E

E )JJ(

JEC

Si usano in pratica i valori di E e di J non di “partenza”, ma di arrivo

Usando questa formula si può derivare una formula più generale per predire le variazioni di flusso in funzione dell’entità della sovraespressione di un enzima:

Note that this differs from the small-change estimate of the flux control coefficient in that the scaling factor is E2/J2, not E1/J1 (the ratio at the original operating point).

JEi

Cr

rf

11

1

JEi

Cf

1

1

Quando r è grande

Se sovrasprimo di 5 volte un enzima con CJ di 0.6, basta usare la curva “5” (r = 5) e trovare dove incontra la retta x=0.6, il risultato sarà un flusso relativo f~2

f flusso relativo

Coefficienti di controllo delle concentrazioni

j

i

SEC

Ci dicono come varia la concentrazione dell’intermedio j-esimo (Sj) al variare della quantità di enzima i.

Attenzione che non è l’inverso dell’elasticità.

E’ di nuovo una proprietà sistemica e ve ne sono in totale: (n enzimi) x (m substrati)

“j” è l’indice da far variare su tutti i substrati “i” è l’indice da far variare su tutti gli enzimi

Definizione formale di CS

3

2

S

E2

3

2

3

3

2

2

3

3

2

2

2

3

3

CEln

Sln

E

S

S

E

E

S

S

E

E

E S

S

j

i

S

Ei

j CEln

Sln

Ci dice come varia la concentrazione di un metabolita al variare di un enzima.

Proprietà sistemica: variando anche un solo enzima è possibile che cambino TUTTI i metaboliti variabili

Esistono n x m CS (n reazioni, m metaboliti)

Se tutti gli enzimi aumentano in quantità (velocità) dello stesso fattore, quale sarà la variazione di SJ ?

Per i vari CS valgono relazioni analoghe al teorema della somma

nSE

SE

SE

SE

SE

SE

SE

SE

SE

SE

SE

SE

SE

j

i

j

n

jJj

j

n

jjj

j

n

jjj

CCCCC

CCCC

CCCC

1

n

n

3

3

2

2

1

1

j

j

)...(

...

E

E ...

E

E

E

E

E

E

S

S

321

321

321

Vale 0!

Per ogni S la somma dei CS vale 0

01

n

SEi

j

iC Teorema della somma

Che significato ha? Alcuni enzimi aumentano la concentrazione di SJ

Altri enzimi diminuiscono la concentrazione di SJ

ReferenzePer il concetto di elasticità, vedi

Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 5;

Vedi anche il cap. 10 di “Fundamentals of Enzyme kinetics”,  di A. Cornish Bowden

Go to chapter 10 “Fundamentals of enzyme kinetics”

Ottima ed approfondita (anche sin troppo in certi capitoli) panoramica sulla MCA: Hofmeyr, Snoep and Westerhoff (2002) Kinetics, Control and Regulation of Metabolic Systems (disponibile da me il file Snoep+Westerhoff.pdf)

Rohwer and Hofmeyr (2010) Kinetic and Thermodynamic Aspects of Enzyme Control and Regulation. J. Phys. Chem. B, 114:16280–16289.

Continua...

ReferenzeArticolo sulla via del Trp in Saccharomyces:

Niederberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H. (1992) A strategy for increasing an in vivo flux by genetic manipulations. The tryptophan system of yeast. Biochem J. 287:473-9.

Per il concetto di CJ e di elasticità:

Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 5; vedi anche http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca3.htm#1 e http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/mca4.htm

Per la dimostrazione dei teoremi si veda anche la ristampa dell’articolo originale:

Kacser, Burns, Fell (1995) The control of flux. Biochem. Soc. Trans. 23, 341-366

Vedi anche il cap. 10 di “Fundamentals of Enzyme kinetics”,  di A. Cornish Bowden

Go to chapter 10 “Fundamentals of enzyme kinetics”