DIPARTIMENTO MEDICINA SPERIMENTALE E PATOLOGIA

Dottorato di Ricerca in Patologia Umana-XVIII ciclo-

TESI DI DOTTORATO

Ruolo del fattore di crescita delle cellule endoteliali (VEGF)

sulla maturazione delle cellule dendritiche

DOTTORANDA: Dott.ssa Germana Castelli

Dip. Ematologia, Oncologia e Medicina molecolare Istituto Superiore di Sanità

RELATORE: Dott.ssa Cristiana Chelucci

Dip. Ematologia, Oncologia e Medicina molecolare Istituto Superiore di Sanità

CORRELATORE: Prof. Matteo Antonio Russo

Dip. Medicina Sperimentale e Patologia Università “La Sapienza” Roma

INDICE

1. SCOPO DELLA TESI ……………………………….1

2. INTRODUZIONE …………………………………3

LA DIFESA IMMUNITARIA ………………………………….3

LE CELLULE DENDRITICHE ……………………………….4

ORIGINE E LOCALIZZAZIONE DIFFERENZIAMENTO IN VITRO MATURAZIONE RUOLO NELL’ATTIVAZIONE DELLA RISPOSTAIMMUNITARIA

• Captazione e processazione dell’antigene

• Presentazione dell’antigene e attivazione linfocitaria

IL FATTORE DI CRESCITA VASCOLARE ENDOTELIALE(VEGF) E I SUOI RECETTORI ………………………….11

VEGF: STRUTTURA E FUNZIONE I RECETTORI DEL VEGF (VEGFRs)FUNZIONE DEI VEGFRs

• Flt1

• KDR

• Ftl4TRASDUZIONE DEL SEGNALE DI VEGF/VEGFRsESPRESSIONE DEI VEGFRs NEL LINEAGE DENDRITICO

LA RISPOSTA IMMUNITARIA NEI TUMORI ……………..19LE CELLULE DENDRITICHE NELLA RISPOSTAIMMUNITARIA DEI TUMORILE CELLULE DENDRITICHE E IL VEGF

3. MATERIALI E METODI …………………………...22

FATTORI DI CRESCITA EMATOPOIETICI E MEZZI DICOLTURAPURIFICAZIONE DI MONOCITI

COLTURE DI MONOCITI

DIFFERENZIAMENTO DI CELLULE DENDRITICHE DAMONOCITI

COLTURE DI CELLULE DENDRITICHE CON VEGF E PlGF

ANALISI MORFOLOGICA

ANALISI CITOFLUORIMETRICA

SAGGIO ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

ANALISI DELLA VITALITÁ

SAGGIO DI PROLIFERAZIONE

TEST DI VALUTAZIONE DELL'APOPTOSI

INCORPORAZIONE DEL DESTRANO

MLR (Mixed Leukocyte Reaction)

ANALISI DELL’RNA DEI VEGFRs

STIMOLAZIONE CELLULARE E WESTERN BLOTTING

4. RISULTATI …………………………………………32

CARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONE DENDRITICADERIVATA DA MONOCITI MATURIANALISI FUNZIONALE DELLE CELLULE DENDRITICHE ESPRESSIONE DEI VEGFRs NELLA POPOLAZIONEMONOCITARIA E DENDRITICAATTIVAZIONE DI ERK-pathway DA PARTE DI VEGF E PlGF

ANALISI DALLA PRODUZIONE DI VEGF E PlGF DA PARTEDI COLTURE MONOCITARIE E DENDRITICHE

ANALISI DI CULTURE DENDRITICHE TRATTATE CONVEGF E PlGF

• Condizioni di coltura

• Crescita e vitalità cellulare

• Fenotipo

• Funzionalità

• Produzione di IL-12

5. DISCUSSIONE ……………………………………….63

6. BIBLIOGRAFIA ………………………………………..69

7. ACRONIMI ………..………………………………80

1

1. SCOPO DELLA TESI

Il fattore di crescita delle cellule endoteliali (VEGF, Vascular Endothelial

Growth Factor) è una citochina multifunzionale che stimola l’angiogenesi, la

rigenerazione vascolare e i processi infiammatori. Il ruolo fisiologico del

VEGF e dei suoi recettori nello sviluppo dei tessuti vascolari è stato

ampiamente dimostrato, mentre la sua importanza nel sistema ematopoietico

umano è suggerita dal fatto che diverse popolazioni cellulari producono

VEGF e/o esprimono i suoi recettori.

Il VEGF sembra svolgere un ruolo significativo anche nei processi tumorali in

quanto è prodotto da gran parte delle cellule neoplastiche ed è responsabile

della proliferazione delle cellule endoteliali, essendo determinante per la

neovascolarizzazione dei tumori solidi.

Si ipotizza, inoltre, che aumentati livelli di VEGF nel microambiente

tumorale possano svolgere un importante ruolo nella risposta immunitaria

antitumorale e, più generalmente, nei processi infiammatori agendo

direttamente sulle cellule dendritiche (DC) o sui loro precursori.

Le DC sono cellule specializzate nella cattura degli antigeni e altamente

efficienti nell’induzione della risposta immunitaria.

Diversi studi, sia in vivo che in vitro, hanno dimostrato che il VEGF inibisce

la differenziazione delle DC agendo direttamente sui loro precursori. Non è

stato invece ancora ben chiarito se il VEGF eserciti un effetto direttamente

sulla popolazione di DC.

2

Considerato il ruolo determinante sia delle DC che del VEGF nella risposta

immunitaria antitumorale, ci siamo proposti di approfondire l’effetto del

VEGF sulla differenziazione e sulla funzionalità delle DC.

Il sistema di differenziamento dendritico da monociti (Mo) maturi, utilizzato

in questo lavoro di tesi, consente di ottenere una popolazione omogenea di DC

di cui è possibile studiarne la maturazione e la funzionalità.

Inizialmente è stata analizzata l’espressione dei recettori del VEGF, Flt1 e

KDR, sulle DC ai diversi stadi maturativi. Poiché, a differenza del KDR, il

Flt1 è espresso dalla totalità della popolazione immatura, abbiamo ipotizzato

che eventuali effetti del VEGF fossero mediati da tale recettore.

Al fine di verificare questa ipotesi sono state coltivate le DC in presenza di

VEGF o PlGF (Placental Growth Factor), un omologo del VEGF in grado di

legare esclusivamente Flt1, e sono state effettuate analisi morfologiche,

citofluorimetriche e funzionali.

3

2. INTRODUZIONE

LA DIFESA IMMUNITARIA

L’evoluzione ha fornito all’uomo due distinti e sofisticati meccanismi di

difesa immunitaria nei confronti degli agenti patogeni ambientali:

1) il sistema dell’immunità innata (detto anche immunità naturale),

deputato a reagire rapidamente e in modo piuttosto semplice;

2) il sistema dell’immunità acquisita (detto anche immunità specifica),

caratterizzato da un tipo di risposta difensiva altamente specifica.

I meccanismi che sono alla base dell’immunità acquisita implicano diverse

fasi di riconoscimento e reazioni nelle quali vengono impegnati molti tipi di

cellule. Inizialmente intervengono le cellule che presentano l’antigene

(Antigen Presenting Cell, APC), ossia cellule in grado d’internalizzare

l’antigene, processarlo e riesprimerlo modificato sulla membrana cellulare in

modo da renderlo riconoscibile alle cellule immunocompetenti, deputate ad

innescare la risposta immunitaria specifica. Tra le cellule in grado di

presentare l’antigene, le DC esplicano una funzione cardine nel fornire

informazioni sugli agenti patogeni invasivi ad altri partners cellulari (cellule

effettrici) del sistema immunitario (Abbas A.K. et al. 1998).

4

LE CELLULE DENDRITICHE

ORIGINE E LOCALIZZAZIONE

Le DC sono cellule specializzate nella cattura degli antigeni e altamente

efficienti nella stimolazione dei linfociti T: sono ritenute, infatti, le cellule

APC maggiormente coinvolte nell’induzione della risposta immunitaria.

Nonostante rappresentino una popolazione estremamente eterogenea, si

possono distinguere due gruppi con origine, caratteristiche e funzioni

differenti (Hart D.N.J. 1997; Banchereau J. et al. 2000):

a) DC generate da cellule staminali ematopoietiche che possono

appartenere alla linea mieloide o linfoide;

b) DC che non derivano da precursori ematopoietici midollari, ma da

elementi stromali.

I precursori delle DC presenti nel midollo osseo passano nel sangue e si

distribuiscono nei vari organi, localizzandosi negli epiteli e negli spazi

interstiziali. In queste sedi acquisiscono le caratteristiche tipiche delle DC che

le rendono particolarmente adatte a svolgere il ruolo di sorveglianza

immunitaria. Dopo l’esposizione a stimoli antigenici o infiammatori, le DC

interstiziali migrano nei linfonodi regionali o nella milza, rispettivamente

attraverso la via linfatica o ematica; in questa fase le DC acquisiscono la loro

peculiare morfologia (vedi oltre) e modificano il loro fenotipo principalmente

esponendo sulla membrana le molecole costimolatorie necessarie per

l’attivazione dei linfociti T. Infine, una volta giunte negli organi linfatici,

possono localizzarsi nell’area parafollicolare e attivare i linfociti T “naive”, o

migrare nel centro germinativo dove presentano l’antigene a linfociti T della

memoria, avviando risposte immunitarie di tipo secondario.

5

Al gruppo mieloide, appartengono le DC presenti nei tessuti interstiziali di

molti organi, nella cute o nelle mucose epiteliali dove sono conosciute come

cellule di Langerhans.

Alla linea linfoide appartengono le DC localizzate nel timo, nelle tonsille,

negli organi linfoidi periferici e nel sangue.

Le DC del secondo gruppo, che derivano da elementi stromali, sono

denominate DC follicolari e appaiono nei centri germinativi dei follicoli

linfatici linfonodali, nonché nei tessuti associati alle mucose. Il loro ruolo è di

catturare l’antigene complessato ad immunoglobuline o a proteine

d’attivazione del complemento e, dopo averlo processato, esporlo sulla

superficie offrendolo al riconoscimento da parte dei linfociti B della memoria

che, a loro volta, stimolano ulteriormente le risposte T linfocitarie

(Banchereau J. and Steinman R.M. 1998).

La migrazione delle DC dai siti periferici agli organi linfatici secondari è un

fenomeno strettamente correlato al loro differenziamento e maturazione

funzionale non ancora completamente chiarito. Alcune molecole, dette

chemoattrattanti, quali SDF-1, MIP1α e MIP1β nonché le citochine TNFα e

IL-1 sembra svolgano un ruolo fondamentale in tale processo (Caux C. et al.

2000).

6

DIFFERENZIAMENTO IN VITRO

Le DC sono localizzate in gran parte dei tessuti, tranne il cervello, ma la loro

bassa percentuale (0,1 % in tonsille, timo, milza; < 1% nel sangue; 1-3%

nell’epidermide) ne rende difficile l’isolamento.

Frazioni cellulari numericamente abbondanti e altamente arricchite in DC si

ottengono da espianti di pelle, da progenitori ematopoietici CD34+ isolati da

midollo osseo, da sangue di cordone ombelicale o sangue periferico (PB) o da

Mo maturi purificati da PB (Hart D.N.J. 1997; Chapius F. et al. 1997).

E’ importante sottolineare che per la differenziazione/maturazione dendritica

possono essere utilizzate diverse condizioni di coltura (Montesoro E. et al.

2005): in particolare sono descritte varie combinazioni delle tre citochine più

comunemente usate GM-CSF, IL-4 e TNFα che possono essere aggiunte in

quantità e tempi diversi (Sallusto F. and Lanzavecchia A. 1994).

Le DC utilizzate in questo lavoro di tesi sono state ottenute da Mo maturi,

isolati da PB, coltivati in presenza di GM-CSF e IL-4.

MATURAZIONE

Sebbene rappresentino una popolazione cellulare estremamente eterogenea, le

DC presentano importanti caratteristiche comuni: il profilo citoplasmatico, la

motilità e la presenza di specifici antigeni di membrana, che permettono di

distinguerle dai rimanenti leucociti e di suddividerle in DC immature e

mature.

7

Le DC immature, presenti nella cute e nei tessuti interstiziali di molti organi,

sono cellule piccole con dendriti molto sottili e lunghi fino a 10 µm

(Banchereau J. & Steinman R.M. 1998). Caratteristica comune di tutte le DC

immature è l’espressione sulla membrana cellulare di alti livelli dei recettori

per immunoglobuline e di recettori per chemochine CCR1, CCR5, CCR6 che

sono persi in seguito alla maturazione. La maturazione delle DC è un evento

cruciale per l’inizio della risposta immunitaria e può essere indotta da batteri

o da componenti della loro parete come il lipopolisaccaride (LPS), da

molecole infiammatorie come CD40, TNFα, IL-1β, IFNα, IFNβ, o da

prostaglandine. Una volta attivate, le DC migrano nei linfonodi dove si

verifica un incremento dell’espressione di MHC di classe I e II, del recettore

CD83, delle molecole di adesione (CD45 e CD58) e costimolatorie quali

CD40, CD80, CD86 (Adams S. et al. 2005; tabella 1).

Teorie contrastanti riguardano l’espressione del marcatore CD1a: in alcuni

studi è indicato come recettore caratteristico delle DC immature (Steinman

R.M. et al. 1997; Young J.W. et al. 1999) altri autori affermano, al contrario,

che tale molecola compare solo in seguito alla maturazione (Hart D.N.J.

1997; Weissman D. and Fauci A. 1997).

Oltre ad un cambiamento fenotipico, le DC mature modificano il loro profilo

morfologico, in seguito allo sviluppo di lunghi processi citoplasmatici

(dendriti). Esse acquisiscono infine la capacità di secernere diverse citochine

tra cui IL-12, che favorisce la presentazione antigenica, la loro migrazione nei

linfonodi e quindi l’attivazione linfocitaria (Adams S. et al. 2005).

8

ANTIGENI DC IMMATURE DC MATURE

CD1a −+

+ (1) (2)

− (3)

CD4 + +/−

CD11a (LFA-1) ++ ++

CD13 + +CD14 − −

CD54 (ICAM-1) + +++

CD50 (ICAM-2) + +

CD102 (ICAM-3) +++ +++

CD58 (LFA-3) + ++

CD33 + +CD40 +/− ++

CD80 (B7-1) − ++CD83 − +

CD86 (B7-2) − ++CD45RO − ++

CCR1 + −CCR5 + −CCR6 + −CCR7 − +

CXCR4 − +

HLA-ABC (MHC-I) ++ +++

HLA-DR (MHC-II) ++ +++

Tabella 1

Espressione dei principali antigeni di membrana delle DC immature e mature.

(1) Hart D. N.J. 1997(2) Weissman D. and Fauci A. 1997(3) Steinman R.M. et al.1997

9

RUOLO NELL’ATTIVAZIONE DELLA RISPOSTA IMMUNITARIA

• Captazione e processazione dell’antigene

Nella maggior parte dei tessuti sono presenti DC in forma immatura incapaci

di stimolare linfociti T ma altamente specializzate nel catturare l’antigene.

Le DC possono legare diverse proteine, dotate di scarsa o nulla affinità per

molecole di superficie, e internalizzarle mediante un processo di fagocitosi o

pinocitosi. Gli antigeni internalizzati vengono compartimentati in vescicole

intracellulari (endosomi e lisosomi) e processati. Le proteine processate danno

origine a peptidi che si legano a molecole MHC di classe II; i complessi

risultanti, MHC-II/peptide sono esposti sulla membrana cellulare e

riconosciuti dai linfociti T CD4+.

I peptidi derivati da antigeni proteici endogeni, come le proteine virali, sono

invece generati proteoliticamente nel citoplasma, quindi trasportati nel

reticolo endoplasmatico dove si legano alle molecole MHC di classe I. I

complessi che si formano, presentati sulla membrana cellulare, sono

riconosciuti dai linfociti T CD8+ (Abbas A.K. et al. 1997; Banchereau J. et

al. 2000).

• Presentazione dell’antigene e attivazione linfocitaria

In seguito alla captazione ed esposizione dell’antigene, le DC migrano nei

linfonodi dove completano la maturazione e attraggono i linfociti T o B

attraverso il rilascio di citochine specifiche.

I linfociti T helper CD4+ attivati esprimono nuove molecole di membrana

(CD40L, Fas e il recettore per IL-2), producono citochine che favoriscono la

loro proliferazione, inducono la produzione di anticorpi da parte dei linfociti

10

B e attivano cellule dell’immunità naturale. La presentazione dell’antigene ai

linfociti CD8+ ne induce la maturazione e l’attivazione delle capacità litiche.

Gli eventi di attivazione linfocitaria hanno inizio quando i complessi MHC-

peptide presenti sulle APC si legano al TCR (T cell receptor). Oltre al

complesso TCR, numerose molecole accessorie costimolatorie (quali CD4,

CD8, CD28 e le integrine LFA-1 e VLA-4) svolgono un ruolo importante

nell’attivazione linfocitaria interagendo con i ligandi espressi sulle APC

(quali CD80, CD86, ICAM, VCAM-1) e fornendo forze che stabilizzano

l’adesione e permettono la trasduzione dei segnali.

Ai segnali stimolatori delle molecole accessorie si uniscono quelli di fattori

solubili secreti dalle APC in seguito all’interazione con i linfociti. Il

principale fattore che induce rilascio di citochine è il CD40 ligando (CD40L)

che è espresso dai linfociti T attivati. Il legame del CD40L con il suo recettore

(CD40) espresso sulle DC, induce queste ultime a secernere IL-12 e favorisce

la produzione di IFNγ da parte dei linfociti T. L’IFNγ, infine, favorisce le

risposte immuni verso antigeni virali o patogeni endocellulari (Banchereau J.

and Steinman R.M.1998; Adams S. et al. 2005).

11

IL FATTORE DI CRESCITA VASCOLARE ENDOTELIALE (VEGF)

E I SUOI RECETTORI

VEGF: STRUTTURA E FUNZIONE

La famiglia del VEGF comprende numerosi fattori: VEGF-A, VEGF-B,

VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PlGF che si distinguono in base alla diversa

capacità di legare tre recettori Flt1, KDR/Flk1 e Flt4. L’isoforma più

abbondante del VEGF è il VEGF-A una glicoproteina omodimerica composta

da 121 amminoacidi; VEGF-A è presente anche nelle forme da 165, 189 e

206 amminoacidi, ottenute in seguito al taglio alternativo degli 8 esoni e dei 6

introni del trascritto (figura 1; Ferrara N. et al. 1997; Neufeld G. et al. 1999;

Ferrara N. et al. 2003). Essendo il VEGF-A l’isoforma più abbondante, ogni

volta che parlerò di studi condotti sul VEGF, mi riferirò appunto al VEGF-A.

Tutti i fattori appartenenti alla famiglia del VEGF sono espressi

endogenamente nei mammiferi, ad eccezione del VEGF-E che è un fattore

prodotto dal virus Orf (un poxvirus; Shibuja M. et al. 2003).

Il VEGF, inizialmente identificato per la sua capacità di aumentare la

permeabilità della parete vascolare (Dvorak H.F. et al 1995), è in grado di

stimolare le cellule endoteliali (Gerber H.P. et al.1998) e di indurre la

migrazione dei Mo (Clauss M. et al. 1990). Esso svolge, inoltre, un ruolo

essenziale nell’angiogenesi, nell’ematopoiesi (Broxmayer H.E. et al. 1995;

Gerber H.P. et al. 2002) e nell’induzione della neovascolarizzazione correlata

con la crescita tumorale (Barleon B. et al. 1996; Ferrara N. et al. 2004).

12

Figura 1

Struttura genica della famiglia del VEGF (Shibuya M. et al. 2001).

Nell’embrione, il VEGF è un fattore essenziale per la formazione della prima

rete vascolare (vasculogenesi). Nell’adulto, promuove la formazione dei vasi

sanguigni a partire da strutture preesistenti, sia in condizioni normali che in

seguito a danni (angiogenesi e neoangiogenesi; Shibuya M. et al. 2001).

Negli ultimi anni, numerosi studi hanno evidenziato il ruolo fondamentale del

VEGF nell’espansione e nel mantenimento della cellula staminale e dei

progenitori ematopoietici, sia nell’embrione che nell’adulto.

13

Ha destato molto interesse la scoperta che il VEGF svolge un ruolo anche

nell’espansione tumorale; esso è infatti prodotto da quasi tutte le cellule

tumorali (Gerber H.P. et al. 2003). Il VEGF favorisce il reclutamento dei

precursori ematopoietici midollari nelle aree tumorali (Larrivee B. et al. 2003)

e agisce sulle cellule endoteliali promuovendone la vasodilatazione e

l’angiogenesi tumorale (Barleon B. et al. 1996; Ferrara N. et al. 2003). Nel

caso dei tumori solidi, il VEGF causa la fenestrazione dei vasi sanguigni, con

successivo accumulo di fibrina extravasale, che fornisce, a sua volta, il

supporto per la crescita della massa tumorale (Dvorak H. et al.1992). Infine

sembra svolgere un ruolo importante nei processi infiammatori, delle aree

tumorali, agendo direttamente sulle DC e sui loro precursori (vedi più avanti).

I RECETTORI DELVEGF (VEGFRs)

I recettori del VEGF (VEGF Receptors, VEGFRs) sono tre:

• Il recettore del fattore di crescita vascolare endoteliale 1 (VEGFR-1),

oppure Fms-like-tyrosine kinase 1 (Flt1);

• Il recettore del fattore di crescita vascolare endoteliale 2 (VEGFR-2),

oppure Kinase insert Domain-containing Receptor (KDR);

• Il recettore del fattore di crescita vascolare endoteliale 3 (VEGFR-3),

oppure Fms-like-tyrosine kinase 4 (Flt4).

I recettori del VEGF appartengono alla famiglia delle tirosin chinasi. Tali

recettori sono caratterizzati dalla presenza di 7 domini immunoglobulinici-

simili, da una regione che lega il ligando nella parte extracellulare, e da un

dominio intracitoplasmatico tirosin chinasico (figura 2; Neufeld G. et al.

1999; Ferrara N. et al. 2001). In seguito al legame con le varie isoforme del

14

VEGF, i recettori omodimerizzano e si transfosforilano nel loro dominio

intracellulare.

Le diverse isoforme del VEGF interagiscono in modo diverso con i recettori:

il VEGF-A può legare sia il KDR che il Flt1; il VEGF-B e il PlGF

interagiscono esclusivamente con il Flt1; il VEGF-E lega il KDR; mentre il

VEGF-C e il VEGF-D legano sia il KDR che il Flt4.

Inizialmente era stata riportata l’espressione dei recettori Flt1 e KDR solo

sulle cellule endoteliali (Brown L.F. et al. 1993). Recenti studi descrivono la

presenza di questi recettori su precursori ematopoietici, Mo, DC,

megacariociti, osteoblasti, e differenti cellule tumorali (Ferrrara N. et al.

2003; Casella I. et al. 2003; bTakahashi A. et al.2004).

Figura 2

Meccanismi d’interazione tra le varie isoforme del VEGF e i relativi recettori;

sVEGFR-1 è la forma solubile del Flt1 (Karkkainen M.J. et al. 2000).

15

FUNZIONE DEI VEGFRs

• Flt1

Il Flt1 è stato il primo recettore del VEGF ad essere scoperto; esso presenta il

44% di omologia amminoacidica con il KDR, ma lega il VEGF con

un’affinità 10 volte superiore. Il gene del Flt1 codifica due polipeptidi: uno di

membrana, codificato dal gene di lunghezza completa (Flt1), e uno solubile

(sFlt1), contenente solo uno dei sette domini immunoglobulinici-simili, senza

il dominio tirosin chinasico (He Y. et al. 1999).

Al sFlt1 è stata attribuita la funzione di regolatore negativo del VEGF in

quanto, legando tale molecola, ne inibisce l’attacco ai recettori di membrana e

di conseguenza l’azione (Kendal R.L. and Thomas K.A. 1993).

Il Flt1 di membrana è importante come mediatore dell’angiogenesi e

dell’infiammazione, ed è responsabile della mobilizzazione delle cellule

endoteliali adulte (Kanno S. et al. 2000; Hattori K. et al. 2002; Ferrara N. et

al. 2003). Può mediare, inoltre, il reclutamento e la mobilizzazione delle

cellule staminali ematopoietiche ed è coinvolto nella proliferazione, nel

mantenimento, nel differenziamento e nell’attivazione del sistema

ematopoietico adulto.

E’ stato dimostrato che, attraverso la stimolazione del Flt1, il VEGF potenzia

la megacariopoiesi (Casella I. et al. 2003).

Infine alcuni autori hanno mostrato che il signaling mediato dal Flt1 è

sufficiente a bloccare l’attivazione del fattore trascrizionale NF-κB in DC

derivate da cellule staminali embrionali murine e pertanto di bloccarne la

maturazione (vedi oltre; Dikov M.M. et al. 2005).

16

• KDR

Il KDR è il maggior recettore che media gli effetti vasculogenici, angiogenici

e di permeabilità vascolare del VEGF nelle cellule endoteliali. Infatti

l’inattivazione del suo gene determina una letalità embrionale precoce a causa

del mancato differenziamento delle cellule endoteliali primitive e quindi della

mancata formazione dei vasi sanguigni.

Nell’embrione il KDR è importante per la localizzazione, lo sviluppo e la

sopravvivenza dei progenitori ematopoietici. Nell’adulto il KDR promuove la

auto-replicazione cellulare e la sopravvivenza delle cellule staminali e dei

progenitori ematopoietici (Ziegler B.L. et al. 1999; Ferrara N. 2004).

• Flt4

Il Flt4 svolge un ruolo cruciale nello sviluppo e nella crescita del sistema

linfatico. Inizialmente è espresso in tutte le cellule endoteliali embrionali dove

è essenziale per la formazione della rete primaria cardiovascolare. Nel corso

dello sviluppo la sua espressione nei grandi vasi diminuisce, mantenendosi

solo nell’endotelio linfatico dei tessuti adulti (aTakahashi M. et al. 2004).

TRASDUZIONE DEL SEGNALE DI VEGF/VEGFRs

La maggior parte degli studi sulla trasduzione del segnale dei VEGFRs è stata

condotta in cellule endoteliali.

In generale, la trasduzione del segnale mediata dai recettori tirosin chinasici

avviene attraverso i seguenti passaggi:

Il legame del ligando sul recettore

La dimerizzazione del recettore

L’attivazione della tirosin chinasi recettoriale

17

L’autofosforilazione del recettore

Il legame e l’attivazione delle molecole adattatrici ai siti di

autofosforilazione

L’attivazione di secondi messaggeri.

Gli effetti mediati dai VEGFRs variano a seconda delle molecole segnale

coinvolte nella cascata di trasduzione (Gille H. 2001).

La trasduzione del segnale del KDR stimola, nelle cellule endoteliali, la

sopravvivenza, la proliferazione e la migrazione mediante l’attivazione di

diverse vie del segnale quali AKT, Raf, MEK e ERK 1/2.

Per quanto riguarda il Flt1, il legame con il VEGF induce un aumento del

Ca2+ intracellulare, che a sua volta promuove la migrazione delle cellule

endoteliali, dei Mo e dei macrofagi. La migrazione delle cellule endoteliali è

indotta da Flt1 anche attraverso la via di p38 MAP chinasi, in seguito alla

riorganizzazione dell’actina. La stimolazione delle cellule endoteliali con il

PlGF (ma non con il VEGF) induce una risposta mitogenica e la produzione

dell’attivatore del fibrinogeno attraverso la via della MAP chinasi (Landgren

E. et al. 1998).

Recenti lavori hanno dimostrato che il VEGF induce fosforilazione di ERK

1/2 mediante attivazione di Flt1, in linee cellulari ottenute dal colon-retto

(Fan F. et al. 2005), in cellule di muscolo liscio (Kazi A.S. et al. 2004) e in

cellule di mieloma (Podar K. et al. 2001).

Infine, Selvaraj S.H e colleghi hanno osservato, nei Mo stimolati con PlGF,

una transiente attivazione di ERK 1/2 e di AKT, quest’ultima però solo a

tempi molto precoci (Selvaraj S.H. et al. 2003).

18

ESPRESSIONE DEI VEGFRs NEL LINEAGE DENDRITICO

L’espressione dei VEGFRs sulla popolazione dendritica è stata inizialmente

studiata su DC derivate da progenitori ematopoietici: Oyama T. e colleghi

hanno dimostrato che l’mRNA di Flt1 è espresso nella popolazione delle DC

e si riduce durante il processo maturativo. Parallelamente è stato dimostrato

che il legame del VEGF si riduce durante la maturazione delle DC (Oyama T.

et al. 1998). Successivamente altri autori hanno mostrato l’espressione

dell’mRNA del Flt1, ma non del KDR, in DC derivate da Mo maturi (Pujol F.

B. et al. 2001).

Per quanto riguarda l’espressione in membrana dei VEGFRs, in un recente

lavoro, si è dimostrato che entrambi i recettori sono espressi dalle DC

immature derivate da Mo, e che tale espressione è ridotta nella popolazione

matura (bTakahashi A. et al. 2004).

19

LA RISPOSTA IMMUNITARIA NEI TUMORI

LE CELLULE DENDRITICHE NELLA RISPOSTA IMMUNITARIA DEI

TUMORI

Le DC svolgono un ruolo centrale nell’immunità antitumorale captando gli

antigeni tumorali e stimolando linfociti T specifici; pertanto un importante

meccanismo attuato dai tumori per evadere il sistema immunitario è proprio

quello di inibire la funzionalità delle DC.

In diversi studi è descritto che le DC, prelevate dal PB o dai linfonodi di

pazienti con il cancro, non stimolano adeguatamente le risposte immunitarie.

Questa disfunzione è il risultato di un ridotto numero di DC competenti e di

un accumulo di DC immature dovuto ad un anormale differenziamento dei

loro precursori (Gabrilovich D. et al. 1996; aTroy A. et al. 1998; bTroy A. et

al. 1998; Almand B. et al. 2000; Della Bella S. et al. 2003). E’ stato infatti

dimostrato che le cellule tumorali possono alterare la maturazione e la

funzionalità delle DC inibendo la capacità dei progenitori ematopoietici

(Gabrilovich D. et al. 1996) o dei precursori monocitari (Kiertscher SM. et al.

2000) di differenziare in DC funzionalmente attive. Ciò nonostante DC

relativamente mature, isolate da PB e cresciute in presenza di sopranatante

ottenuto da colture di cellule tumorali, sono funzionalmente attive

(Gabrilovich D. et al. 1996).

E’ oramai noto che le cellule tumorali producono numerosi fattori

immunosoppressivi (VEGF, M-CSF, IL-6, GM-CSF, IL-10, gangliosidi;

Gabrilovich D. et al. 2004), e che la differenziazione anormale delle DC,

osservata nei pazienti con il cancro, è il risultato dell’effetto combinato di

20

questi diversi fattori. Il fattore maggiormente responsabile di quest’inibizione

è il VEGF (Kiertscher SM. et al. 2000; Ohm J.E. and Carbone D. 2001).

LE CELLULE DENDRITICHE E IL VEGF

Il coinvolgimento del VEGF nell’inibizione del differenziamento delle DC è

stato dimostrato in diversi lavori.

Inizialmente, studi in vitro eseguiti con progenitori ematopoietici, hanno

evidenziato che il blocco del differenziamento delle DC, indotto dal mezzo

condizionato di colture di cellule tumorali, può essere annullato da anticorpi

specifici anti-VEGF (Gabrilovich D. et al. 1996).

Successivi esperimenti sui topi hanno confermato che la continua infusione di

VEGF ricombinante determina una drammatica inibizione dello sviluppo di

DC (Gabrilovich D. et al. 1998) e che anticorpi anti-VEGF, infusi in topi con

tumore, aumentano il numero di DC mature circolanti (Gabrilovich D. et al.

1999; Ishida T. et al. 1998).

Negli ultimi anni diversi dati clinici hanno confermato la stretta correlazione

tra gli aumentati livelli di VEGF e il ridotto numero di DC in tessuti tumorali

e nel PB di pazienti con il cancro (Saito H. et al. 1998; Gabrilovich D. 1997;

Almad B. et al. 2000).

E’ oramai noto che il VEGF inibisce l’attivazione del fattore trascrizionale

NF-κB in progenitori ematopoietici.

L’NF-κB regola la trascrizione di molti geni coinvolti nella risposta

immunitaria, inclusi citochine e fattori di crescita; pertanto la sua inibizione

induce un blocco della maturazione e della funzionalità delle DC (Oyama T.

et al. 1998; Gabrilovich D. et al. 1998; Dikov M.M. et al. 2005).

21

Recentemente Takahashi A. e colleghi hanno mostrato che il VEGF, aggiunto

a colture di DC completamente differenziate, ma non ancora del tutto mature,

inibisce l’effetto d’attivazione indotto dall’LPS (bTakahashi A. et al. 2004).

In conclusione, è dimostrato che il VEGF è in grado di inibire sia la

differenziazione delle DC, agendo direttamente sui loro precursori, sia la loro

successiva maturazione.

Non è invece ancora chiaro l’effetto del VEGF direttamente sulla popolazione

di DC immature.

22

3. MATERIALI E METODI

FATTORI DI CRESCITA EMATOPOIETICI E MEZZI DI COLTURA

I fattori di crescita ematopoietici utilizzati per le colture cellulari sono: GM-

CSF, IL-4 (1x106 U/mg), M-CSF (Peprotec, Rocky Hill, NJ). L’FCS e

l’RPMI sono stati forniti da Hyclone (Logan, UT) e l’IMDM da GIBCO

(Grand Island, NY, USA).

PURIFICAZIONE DEI MONOCITI

I Mo sono stati purificati da PB, di donatori sani, utilizzando microbiglie

magnetiche coniugate con l’anticorpo monoclonale (MoAb) anti-CD14

(“CD14 MicroBeads” Milteny Biotec -Bergisch Glabach, Germany).

Il campione di sangue è stato diluito con soluzione fisiologica e stratificato su

un gradiente di Ficoll o Lymphoprep e quindi centrifugato a 1600 rpm per 30

minuti a temperatura ambiente, al fine di separare le cellule rosse da quelle

mononucleate. Quest’ultime sono state recuperate, lavate due volte in

soluzione fisiologica contenente 2mM EDTA e centrifugate a 1400 rpm per

10 minuti a 20°C e quindi a 800 rpm. Le cellule mononucleate sono state

incubate per 30 minuti a 4-6°C con microbiglie magnetiche coniugate con un

MoAb murino anti-CD14 umano, in presenza di immunoglobuline G (IgG)

umane. Le cellule sono state risospese e quindi separate per selezione positiva

(CD14+) mediante passaggio su colonna. La frazione risultante è stata

ulteriormente purificata con un secondo passaggio e, dopo rimozione del

magnete, eluita e monitorata per il suo grado di purezza mediante marcatura

23

con un MoAb anti-CD14 coniugato con ficoeritrina (PE). La popolazione

purificata risulta costituita dal 90% di cellule CD14+.

COLTURE DI MONOCITI

Mo maturi sono stati piastrati ad una concentrazione di 2-3 x 105 cellule/mL

in IMDM in presenza di M-CSF (125 U/mL), addizionando penicillina (100

U/mL), streptomicina (100 µg/mL), glutammina 2mM, sodio piruvato 1mM,

1% di amminoacidi non essenziali e 20% di FCS.

DIFFERENZIAMENTO DI CELLULE DENDRITICHE DA MONOCITI

Il differenziamento in DC è stato ottenuto coltivando i Mo in RPMI in

presenza di GM-CSF (50ng/mL), IL-4 (50 ng/mL), addizionando penicillina

(100 U/mL), streptomicina (100 µg/mL), glutammina 2mM, sodio piruvato

1mM, 1% di amminoacidi nonessenziali e 10% di FCS. Dopo 6 giorni di

coltura le DC sono state attivate aggiungendo nel mezzo di coltura 1ng/mL di

LPS (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany).

COLTURE DI CELLULE DENDRITICHE CON VEGF E PlGF

Alle colture cellulari di DC in differenziamento (dopo almeno 36 ore) sono

stati aggiunti i fattori di crescita VEGF (R&D System, Minneapolis, MN) o

PLGF (Sigma) ad una concentrazione di 50-100 ng/mL, e riaggiunti a giorni

alterni fino alla fine della coltura.

24

ANALISI MORFOLOGICA

Aliquote di circa 1x104 cellule sono state prelevate dalle colture a diversi

giorni di differenziamento, centrifugate su vetrini, colorate con May-

Grünwald Giemsa (Sigma, St. Louis, Mo) e identificate attraverso l’analisi

morfologica al microscopio.

ANALISI CITOFLUORIMETRICA

Lo studio fenotipico di alcuni antigeni di membrana è stato effettuato

mediante marcatura con MoAb specifici, direttamente coniugati con PE o con

isiotiocianato di fluoresceina (FITC).

Per la caratterizzazione fenotipica delle DC sono stati usati i seguenti MoAb

contro gli antigeni: CD1a, CD14, CD40, CD80, CD83, CD86, HLA-DR,

HLA-ABC (Pharmingen, San Diego, CA) e Flt1, KDR (R&D System).

Appropriate IgG coniugate sono state usate come controllo. Per

l’immunofenotipizzazione un’aliquota di circa 3x104 cellule è stata lavata due

volte in PBS (Hyclone, Logan, UT) e incubata per 30 minuti a 4°C con una

quantità saturante di MoAb. Dopo tre lavaggi con PBS contenente 2 mg/mL

di BSA, le cellule sono state risospese in PBS e quindi analizzate mediante

citofluorimetro FACScan (programma Lysis II, Becton Dickinson) al fine di

determinare la percentuale di cellule positive nonché l’intensità di

fluorescenza.

La popolazione cellulare identificata con i parametri fisici “scatter” diretto

(FSC) e “scatter” a 90° (SSC) è stata poi mostrata sotto forma di istogrammi o

come plot. In entrambe le immagini viene espresso in ascissa il numero di

eventi cellulari (ogni evento corrisponde ad una singola cellula), in ordinata

25

l’intensità media di fluorescenza (MFI). L’MFI rappresenta l’aumento medio

di fluorescenza del campione colorato con l’anticorpo d’interesse, rispetto al

proprio controllo isotipico.

Tutte le analisi al citofluorimetro sono state eseguite analizzando un numero

adeguato di eventi (non meno di 5000 per ogni campione).

Esperimenti di legame e di competizione sono stati eseguiti con VEGF

biotinilato (R&D System) e PlGF freddo. Per verificare il legame del VEGF,

le DC sono state incubate con differenti concentrazioni di VEGF biotinilato

(da 20 a 500 ng/mL) per 60 minuti a 4°C, quindi incubate per 30 minuti a 4°C

con avidina-FITC e analizzate al citofluorimetro. Come controllo negativo, le

cellule sono state marcate con un MoAb biotinilato.

Per i saggi di competizione, le cellule sono state pre-incubate con crescenti

concentrazioni di PlGF (10-20 µg/mL) per 30 minuti, lavate abbondantemente

e marcate, come precedentemente descritto, con VEGF biotinilato.

SAGGIO ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

La valutazione quantitativa delle molecole VEGF, PlGF, IL-12 e sFlt, presenti

nei sopranatanti delle colture cellulari, è stata effettuata mediante saggi

immunoenzimatici ELISA (R&D System). In seguito alla reazione

immunoenzimatica, la concentrazione delle molecole è stata determinata

confrontando la densità ottica dei campioni in esame con una curva standard;

i campioni con valori di densità ottica inferiore al background sono

considerati negativi al test. I valori di densità ottica sono stati espressi in

valori di pg/mL.

26

ANALISI DELLA VITALITA’

La vitalità cellulare è vista attraverso l’esclusione del colorante Trypan Blue

(5 µg/mL in PBS; SIGMA). Questo colorante non è in grado di penetrare la

membrana plasmatica delle cellule vive, ma solo di quelle non vitali, nelle

quali l’integrità della membrana risulta compromessa. La valutazione e la

conta delle cellule vive o morte avviene al microscopio ottico.

SAGGIO DI PROLIFERAZIONE

Le DC sono state piastrate (5 x 104 cellule/50µL) in una piastra da 96 pozzetti

a fondo tondo in mezzo dendritico in presenza o meno di VEGF o PlGF ad

una concentrazione finale di 5-100 ng/mL.

La proliferazione cellulare è stata misurata aggiungendo, al 3° giorno di

coltura, 0.5µCi di timidina triziata (ICN Biomedicals, Irvine, CA) ad ogni

pozzetto.

Dopo 18 ore d’incubazione i campioni sono stati trasferiti su filtro (mediante

HARVESTER; Tomtec, Hamden, CT) e la quantità di radioattivo incorporato

dalle cellule, indicato in cpm (conte per minuto), è stata misurata al Microbeta

counter (Wallac, Turku, Finland). Il test è stato eseguito in quadruplicato e i

risultati sono stati espressi come media dei valori di cpm ottenuti ± deviazione

standard (DS).

27

TEST DI VALUTAZIONE DELL’APOPTOTOSI

La valutazione quantitativa delle cellule apoptotiche è stata determinata

utilizzando il kit “Apoptosis Detection Kits (MedSystems Diagnostics

GmbH, Vienna, Austria)

Il saggio consiste nel marcare le cellule con annessina-V coniugata FITC e

propidio ioduro coniugato PE, e analizzarle al citofluorimetro.

L’annessina-V è una proteina anticoagulante che lega preferenzialmente

fosfolipidi carichi negativamente. Nelle fasi precoci dell’apoptosi la

simmetria fosfolipidica viene alterata con conseguente esposizione, sul lato

citoplasmatico esterno, di fosfatidilserina che viene riconosciuta

dall’annessina.

Il propidio ioduro serve invece a discriminare le cellule in fase tardiva di

apoptosi o morte nelle quali, essendo la membrana plasmatica non più integra,

il propidio penetra e lega il DNA.

Le cellule sono state raccolte, lavate in PBS e quindi risospese, ad una

concentrazione di 1x105/100µL in una soluzione contenente 1% di annessina,

e 10% di Binding Buffer 10X. Dopo un’incubazione di 15 minuti al buio a 18-

24°C, le cellule sono state lavate e analizzate al citofluorimetro.

INCORPORAZIONE DEL DESTRANO

Per verificare la capacità delle DC immature di captare gli antigeni, sono stati

eseguiti saggi d’incorporazione della molecola del destrano (coniugato FITC;

Sigma-Aldrich). Un’aliquota di circa 5x104 cellule è stata e incubata per 30

minuti con 1mg/mL di destrano-FITC a 37°C o 4°C (controllo).

28

Dopo due lavaggi con PBS/0.1% BSA, le cellule sono state risospese in PBS,

quindi analizzate mediante citofluorimetro al fine di determinare la

percentuale di cellule positive nonché l’intensità di fluorescenza. Il livello

espresso di antigene captato è il risultato della differenza tra la fluorescenza

del campione incubato a 37°C e quello incubato a 4°C.

MLR (Mixed Leukocyte Reaction)

L’abilità delle DC di attivare i linfociti T è stata saggiata mediante il test

MLR, in cui linfociti T (cellule “responder”) sono coltivati con DC (cellule

“stimulator”). La proliferazione dei linfociti attivati è stata misurata in vitro

determinando la quantità di timidina triziata incorporata nel DNA

neosintetizzato delle cellule stimolate. L’incorporazione di timidina fornisce

una misura quantitativa del grado di sintesi del DNA, che è di solito

proporzionale all’attività proliferativa delle cellule.

Se le cellule “responder” e “stimulator” appartengono a diversi individui e

quindi presentano differenze negli alleli MHC, una considerevole frazione di

linfociti T andrà incontro a proliferazione in 4-7 giorni: tale saggio viene

chiamato MLR allogeneico.

I linfociti T sono stati ottenuti da un campione di sangue diluito con soluzione

fisiologica e stratificato su un gradiente di Ficoll o Lymphoprep quindi

centrifugato a 1600 rpm per 30 minuti a temperatura ambiente, al fine di

separare le cellule rosse da quelle mononucleate. Quest’ultime sono state

recuperate, lavate due volte in soluzione fisiologica contenente 2mM EDTA e

centrifugate per 10 minuti a 20°C a 1400 rpm e una volta a 800 rpm. Le

cellule mononucleate sono state piastrate e, in seguito all’adesione su piastra

29

dei Mo, i linfociti in sospensione sono stati prelevati. La popolazione

linfocitaria è stata ulteriormente purificata mediante gradiente di Percoll dalle

frazioni a 45-50% di densità.

I linfociti T (1x105 /50 µL) sono stati dispensati in una piastra da 96 pozzetti a

fondo tondo in IMDM 10% FCS. Sono state poi aggiunte DC, cresciute o non

con VEGF o PlGF e attivate con LPS, in modo tale che i rapporti tra le cellule

“stimulator” e i linfociti T “responder” fossero rispettivamente: 1:100, 1:200,

1:400 e 1:2000. Dopo 5 giorni d’incubazione a 37° C, in un’atmosfera

umidificata in presenza di 5% di CO2, è stato aggiunto ad ogni pozzetto 1µCi

di timidina. Dopo 16 ore i campioni sono stati trasferiti su filtro (mediante

HARVESTER) e la quantità di radioattivo incorporato dalle cellule, indicato

in cpm, è stata misurata al Microbeta counter.

I valori di background sono stati ottenuti dalle cpm di linfociti T e DC

incubati separatamente. Tutti i saggi sono stati eseguiti in quadruplicato e i

risultati espressi come media in cpm ± DS.

ANALISI DELL’RNA DEI VEGFRs

Cinque-10x104 DC o Mo sono stati lisati con una soluzione di guanidina e β-

mercaptoetanolo e stratificati su un gradiente di CsCl in presenza di 12 µg/mL

di RNA ribosomiale di Escherichia Coli come molecola conduttrice (che aiuta

l’RNA a precipitare). Dopo 19 ore di ultracentrifugazione a 14000 RPM, le

molecole di RNA recuperate nel pellett sono state precipitate e

successivamente trascritte in cDNA mediante l’enzima retrovirale trascrittasi

inversa (Boehringer, Mannheim, Germany). Il cDNA è stato quindi

amplificato utilizzando la tecnica della PCR con il Gene Amp PCR System

30

9600 thermal cycler (Perkin-Elmer). Il cDNA amplificato, trasferito su una

membrana di nylon, è stato successivamente evidenziato con una sonda

specifica marcata radioattivamente. Per l’amplificazione del gene della β2-

microglobulina si è utilizzato un programma di 26 cicli a 94°C per 30

secondi, 54°C per 30 secondi, 72°C per 30 secondi. Per l’amplificazione dei

VEGFRs si è utilizzato un programma di 40 cicli a 94°C per 30 secondi, 56°C

per 30 secondi, 72°C per 30 secondi. La sequenza delle coppie di

oligonucleotidi usati e le rispettive sonde sono le seguenti:

β2-microglobulina:

forward 5'-AACCACGTGACTTTGTCACAGC-3',

reverse 5'-CTGCTCAGATACATCAAACA TG-3',

probe 5'-GTGGGATCGAGACATGTAAGCAGC-3';

Flt1:

forward 5'-GATA CTCGACTTCCTCTGAA-3',

reverse 5'-ATCAAACATGGAGGTGGCATT-3,

probe 5'-GACTACATGCCAATCAATGC-3';

sFlt1:

forward 5'-ATTTTAGGACCAGG AAGCAG-3',

reverse 5'-AGCCACACAGGTGCATGTTAGAGT-3,

probe 5'-CAC CTTCATCCTCTTCTGTG-3';

KDR:

forward 5'-AGACTTTGAGCATGGAAG-3',

reverse 5'-CCATTCCACCAAAAGATG-3',

probe 5'-CATTATGACAACACAGCA GGAATCAGTCAG-3'.

31

STIMOLAZIONE CELLULARE E WESTERN BLOTTING

Al 5° giorno di coltura le DC sono state lavate con PBS e tenute per 18 ore in

RPMI/0.2% FCS e poi altre tre ore in RPMI/0.1%BSA. Aliquote di 3-5x105

cellule sono state stimolate per 4-10-20 minuti con 0.1-1 µg/mL di VEGF o

PlGF. Dopo un lavaggio con PBS freddo, le cellule sono state risospese in una

soluzione di lisi (50mM Tris, 150mM NaCl, 1mM NaF, 1%Triton X-100,

0.1mM Na3VO4 , 1mM PMSF, una pasticca di inibitori di proteasi -Complete

®; Roche-) per 15 minuti in ghiaccio. I lisati cellulari così ottenuti sono stati

centrifugati per 10 minuti a 4°C, e la concentrazione finale delle proteine è

stata determinata usando il kit protein assay (Bio-Rad, Hercules, CA).

Aliquote di 30 µg di proteine sono state denaturate a 95°-100° per 10 minuti

in loading buffer (60mM Tris, 25% glicerolo, 10% SDS, 14.4mM 2-

Mercaptoethanol, 1% Bromophenol Blue) quindi separate su un gel al 10% di

poliacrilammide con un marcatore per i pesi molecolari (Bio-Rad, Hercules,

CA).

I campioni sono stati quindi trasferiti su una membrana di nitrocellulosa e

incubati in TBST (10mM Tris-HCl, 150 mMNaCl, 0.1% Tween-20) con il

5% di latte in polvere non grasso per bloccare eventuali legami non specifici

dell’anticorpo alla membrana. La membrana è stata quindi marcata con

l’anticorpo anti-phospho-AKT (Ser-473) e anti-phospho-ERK1/2 (p42/44),

alle condizioni suggerite dal protocollo (Cell Signaling, Beverly, MA). I

rispettivi anticorpi per la forma non fosforilata sono stati utilizzati come

controllo. Come anticorpo secondario si è usata una perossidasi anti-rabbit

(Amershan, Arlington Heights, IL). Il legame del secondario è stato

evidenziato dalla chemioluminescenza su lastre fotografiche (Pierce,

Rockford, IL).

32

4. RISULTATI

CARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONE DENDRITICA

DERIVATA DA MONOCITI MATURI

Per ottenere le DC, i Mo maturi, isolati da PB, sono stati incubati per 4-5

giorni in mezzo di coltura contenente GM-CSF e IL-4. Al fine di indurre una

completa maturazione della popolazione dendritica è stato aggiunto al 6°

giorno l’LPS.

Durante il differenziamento dai Mo maturi, le DC non aumentano

numericamente; ciò nonostante, test di proliferazione eseguiti su cellule

immature, mostrano un lieve livello d’incorporazione di timidina (circa 400

cpm per 1x105 cellule) che indica un basso grado di sintesi di DNA.

Per monitorare le diverse fasi differenziative/maturative della popolazione,

aliquote di cellule sono state prelevate a diversi giorni e analizzate sia dal

punto di vista morfologico che per l’espressione di specifici marcatori di

membrana. I risultati ottenuti mostrano che, in presenza di GM-CSF e IL-4, le

variazioni morfologiche iniziano precocemente: la popolazione monocitaria di

partenza è caratterizzata da un nucleo reniforme, che occupa metà del volume

cellulare, e un citoplasma finemente granulato (figura 3 A); già dopo tre

giorni le cellule acquistano il caratteristico profilo dendritico. Le DC ottenute

presentano nucleo monocitoide e un abbondante citoplasma lievemente

basofilo, contenente un minor numero di granulazioni azzurrofile rispetto ai

Mo. I margini irregolari presentano numerosi e sottili prolungamenti, detti

dendriti, spesso polarizzati (figura 3 B).

33

Figura 3

Analisi morfologica effettuata attraverso la colorazione diMay-Grumwald-Giemsa, di:

A) Mo isolati da PB e analizzati dopo un giorno di coltura;B) DC al 5° giorno di coltura.

Ingrandimento originale: 400X.

A

B

A

B

34

Le fasi di differenziamento delle DC sono state seguite mediante analisi

fenotipiche a diversi giorni di coltura.

Il marcatore CD14, presente sulla totalità della popolazione monocitaria di

partenza, scompare nei primi tre giorni di differenziamento; parallelamente

compare il CD1a già presente sull’intera popolazione dal secondo giorno di

coltura (figura 4).

Le molecole MHC di classe I e II (HLA-ABC e HLA-DR) sono presenti

sull’intera popolazione di DC immature. In seguito a stimolazione con LPS la

percentuale di cellule positive CD1a, HLA-DR e HLA-ABC rimane invariata,

ma si osserva un aumento nell’MFI (figura5).

L’espressione degli antigeni di superficie responsabili della funzionalità delle

DC, quali CD40, CD80, CD83, CD86, è bassa in cellule immature, ma la

percentuale di cellule positive aumenta notevolmente dopo maturazione con

LPS (figura 5).

35

Figura 4

Analisi citofluorimetrica delle DC a diversi giorni di coltura:A) controllo negativo di fluorescenza realizzato mediante doppia

marcatura con IgG coniugate PE e FITC;B) doppia marcatura con gli anticorpi CD1a-PE e CD14-FITC.

La figura mostra i risultati di un esperimento rappresentativo su sei.

3% 63%

33%

8% 85%

7%

58% 32%

1%

98%1%

0%

2° giorno3% 63%

33%

8% 85%

7%

58% 32%

1%

98%1%

0%

2° giorno

A

B

36

(Didascalia alla pagina successiva)

IgG-FITC IgG-PE

HLA-DR

CD40

CD80 CD83

CD86

HLA-ABC

CD1A

37

Figura 5

Analisi citofluorimetrica delle DC al 6° giorno di coltura (istogrammagrigio) e dopo 18 ore di stimolazione con LPS (istogramma bianco).

A) controllo negativo di fluorescenza realizzato mediante l’utilizzo diIgG direttamente coniugate con PE e FITC;

B) marcature con gli anticorpi direttamente coniugati PE: CD1a,CD40, CD80, CD83, HLA-ABC e coniugati FITC: CD86,HLA-DR.

La figura mostra i risultati di un esperimento rappresentativo su cinque.

38

ANALISI FUNZIONALE DELLE CELLULE DENDRITICHE

Per verificare che la popolazione di DC, ottenuta dai Mo, fosse

funzionalmente attiva, cioè in grado di presentare l’antigene e attivare i

linfociti T, sono stati allestiti saggi di captazione degli antigeni, e saggi di

MLR.

L’attività endocitica, caratteristica delle DC immature, è stata valutata

misurando la capacità della popolazione di incorporare il destrano. Il saggio è

stato condotto su aliquote di cellule, prelevate al 3°-4° giorno di coltura,

incubate con il destrano alla temperatura di 37°C o a 4°C per il controllo

negativo. I dati ottenuti, dopo analisi al citofluorimetro, mostrano che circa

90% delle DC immature sono in grado di internalizzare il destrano (figura 6);

tale capacità si riduce in seguito alla maturazione (dato non mostrato).

Caratteristica propria delle DC mature è invece la capacità di stimolare i

linfociti T, valutata mediante il test dell’MLR.

Le DC mature e linfociti T, purificati da PB, sono stati coincubati per 6 giorni

e nelle ultime 12 ore di coltura è stata aggiunta timidina triziata. La

proliferazione dei linfociti, e quindi la capacità stimolatoria delle DC, sono

state verificate misurando la quantità di timidina incorporata nel DNA

neosintetizzato delle cellule stimolate (linfociti T). I risultati ottenuti,

evidenziano un’ottima capacità della popolazione dendritica da noi ottenuta,

di presentare l’antigene e quindi di attivare i linfociti T (figura 7).

39

Figura 6

Saggio di captazione del destrano-FITC su DC al 3° giorno di coltura:A) campione incubato a 4°C (controllo); B) campione incubato a 37°C.

La figura mostra i risultati di un esperimento rappresentativo su sei.

A

B

destrano-FITC

A

B

destrano-FITC

40

Figura 7

Capacità delle DC, dopo stimolazione con LPS, di attivare i linfociti T. Inascissa è espressa la quantità di timidina incorporata nel DNA neosintetizzatodei linfociti T stimolati; in ordinata il rapporto tra DC, cellule “stimulator”, elinfociti T, cellule “responder”. I valori rappresentati sono la media, ± DS, disei esperimenti.

01:2000 1:660 1:220 1:74

DC: linfociti T

20

40

60

80cp

mx

103

01:2000 1:660 1:220 1:74

DC: linfociti T

20

40

60

80cp

mx

103

41

ESPRESSIONE DEI VEGFRs NELLA POPOLAZIONE MONOCITARIA E

DENDRITICA

Abbiamo analizzato su Mo e DC l’espressione dell’mRNA dei VEGFRs, Flt1

e KDR.

Mo maturi analizzati 24 ore dopo l’isolamento, da PB, mostrano una bassa

espressione dei trascritti Flt1 e KDR. Già dal 3°-4° giorno di

differenziamento dendritico si osserva un consistente aumento

dell’espressione sia del trascritto del Flt1 che del KDR. In seguito a

maturazione con LPS, l’mRNA di entrambi i recettori si riduce (figura 8).

Nonostante si sia evidenziata, mediante RT-PCR, la presenza di entrambi i

trascritti, il livello dell’mRNA del KDR risulta notevolmente più basso di

quello del Flt1. Quest’ultimo è infatti evidenziabile su lastre fotografiche già

dopo 2 ore d’esposizione del filtro marcato; mentre il segnale del KDR

compare solo dopo un’esposizione di almeno 12 ore.

La diversa espressione dei recettori del VEGF sulla popolazione dendritica è

stata confermata mediante analisi citoflurimetriche.

Diversi esperimenti hanno mostrato che il recettore KDR è presente su una

bassissima percentuale di cellule (sempre inferiore al 5%) sia nella

popolazione monocitaria (figura 9) sia sulle DC analizzate a diversi giorni di

cultura (figura 10). Inoltre l’espressione di tale recettore non sembra variare

né in seguito all’induzione dei Mo in senso dendritico, né ai diversi stadi

maturativi delle DC.

42

Figura 8

Attraverso la tecnica dell’RT-PCR, è stata analizzata la presenzadell’mRNA dei recettori Flt1 e KDR nei Mo e nelle DC a diversi giorni didifferenziamento. L’analisi dell’mRNA della β2-microglobulina (β2m)permette di controllare le quantità di mRNA, caricato sul gel.

La figura mostra i risultati di un esperimento rappresentativo su tre.

Flt-1

KDR

β2m

Mo

DC

4° g

ior n

o

DC

6° g

iorn

o

DC

6°g

iorn

o

+ 18

h LP

S

Flt-1

KDR

β2m

Mo

DC

4° g

ior n

o

DC

6° g

iorn

o

DC

6°g

iorn

o

+ 18

h LP

S

43

Figura 9

Espressione del KDR su Mo isolati da PB:A) controllo negativo di fluorescenza realizzato mediante marcatura

con IgG coniugate PE;B) marcatura dei Mo con l’anticorpo KDR-PE.

La figura mostra i risultati di un esperimento rappresentativo su tre.

IgG

-PE

KD

R-PE

A B

IgG

-PE

KD

R-PE

A B

44

Figura 10

Espressione del recettore KDR sulle DC:A) controllo negativo di fluorescenza realizzato mediante marcatura

con IgG coniugate PE;B) marcatura delle DC con l’anticorpo KDR-PE a diversi giorni di

cultura.La figura mostra i risultati di un esperimento rappresentativo su quattro.

3° giorno 7° giorno + LPS6° giorno

IgG

-PE

KD

R-P

E

A

B

3° giorno 7° giorno + LPS6° giorno

IgG

-PE

KD

R-P

E

A

B

45

Contrariamente al KDR, l’espressione del recettore Flt1 varia notevolmente in

funzione del tipo cellulare (Mo o DC) ed è modulato nei vari stadi

differenziativi/maturativi.

Come mostrato in figura 11, il Flt1 è presente su circa 20-40% dei Mo e

permane pressoché invariato nelle 24 ore successive l’induzione con mezzo

dendritico. E’ interessante notare la modulazione dell’espressione di Flt1

durante il differenziamento delle DC: difatti dal 3° giorno di coltura, in

mezzo dendritico, il recettore Flt1 è espresso dalla quasi totalità delle cellule

(90% di positività); una leggera riduzione si ha al giorno 6° di cultura, in cui

si osservano circa 70% di cellule positive; si riduce notevolmente dopo 18 ore

di stimolazione con LPS (14% di cellule positive) e scompare quasi

completamente dopo 48 ore dall’attivazione con LPS (circa 2% di cellule

positive; figura 11).

Abbiamo quindi verificato se il VEGF fosse in grado di legarsi ai recettori

espressi sulle DC. Mediante trattamento delle DC immature con VEGF

biotinilato abbiamo osservato un legame dose specifico: aumentando la

concentrazione del ligando da 20 a 500 ng/ml abbiamo ottenuto un aumento

di positività fino a 95% delle cellule (figura 12).

Successivamente è stata confermata la specificità del legame utilizzando in

esperimenti di competizione con VEGF biotinilato, il PlGF, in grado di legare

esclusivamente il Flt1.

In figura 13 è mostrato come PlGF, utilizzato ad una concentrazione pari a 10

µg/mL, cioè 100 volte di più rispetto a quella del VEGF biotinilato, inibisca il

legame del VEGF di circa 50%. La quasi totale inibizione del legame

(corrispondente ad un massimo del 4% di DC positive al VEGF- biotinilato)

si ottiene invece utilizzando una concentrazione di PlGF 200 volte superiore a

quella del VEGF (figura 13).

46

Flt1-PE

Figura 11

Espressione del recettore Flt1 su Mo isolati da PB e su DC a diversi giornidi coltura. Gli istogrammi bianchi rappresentano le cellule colorate conl’anticorpo anti-Flt1-PE, gli istogrammi grigi rappresentano le cellule coloratecon il controllo isotipico (IgG-PE).

La figura mostra i risultati di un esperimento rappresentativo su cinque.

Mo DC 1° giorno

DC 3° giorno

DC 6° giorno DC 6° giorno + 18 h LPS DC 6° giorno + 48 h LPS

Mo DC 1° giorno DC 3° giorno

DC 6° giorno DC 6° giorno + 18 h LPS DC 6° giorno + 48 h LPS

Mo DC 1° giorno DC 3° giorno

DC 6° giorno DC 6° giorno + 18 h LPS DC 6° giorno + 48 h LPS

47

VEGF bio./avidina-FITC

Figura 12

Marcatura delle DC al 5° giorno di coltura con VEGF biotinilato a diverseconcentrazioni: 20 ng/ml (b), 200 ng/ml (c), 500 ng/mL (d); o con il controllonegativo biotinilato (a). Le cellule sono state successivamente marcate conavidina-FITC e analizzate al citoflorimetro. La figura mostra i risultati di unesperimento rappresentativo su tre.

ac db

0

10

20

30

40

5

0 6

0a

c db0

10

2

0

30

40

50

60

48

VEGF bio./avidina-FITC

Figura 13

Marcatura delle DC al giorno 5° di coltura con VEGF biotinilato ad unaconcentrazione di 100 ng/ml (d) o con controllo negativo biotinilato (a). Per ilsaggio di competizione le cellule sono state pretrattate con 10 µg/mL (c) o 20µg/mL (b) di PlGF, quindi marcate con VEGF biotinilato. Le cellule sonostate infine incubate con avidina-FITC e analizzate al citoflorimetro. La figuramostra i risultati di un esperimento rappresentativo su tre.

0

20

40

60

80

a c dba c db

49

Dimostrata l’espressione in membrana del Flt1 e la capacità del recettore

stesso di legare sia il VEGF sia il PlGF, abbiamo indagato l’eventuale

presenza della forma solubile del recettore Flt1, sia come trascritto mediante

RT-PCR, sia in forma di proteina secreta mediante saggi ELISA del mezzo di

coltura cellulare.

Utilizzando specifici primers, in grado di discriminare tra la forma solubile e

di membrana, abbiamo analizzato la presenza del trascritto del sFlt1 in Mo

maturi, subito dopo il loro isolamento da PB, e in colture di DC.

Come mostrato in figura 14 A, i Mo esprimono bassi livelli del trascritto

rispetto alle DC da essi derivate in cui si osserva, invece, un aumento

d’espressione. Esattamente come la forma di membrana, il trascritto del sFlt1

si riduce in DC mature, dopo attivazione con LPS.

Come atteso, un basso livello della proteina sFlt1 è stato rilevato nei

sopranatanti delle colture monocitarie (approssimamene 200 pg/mL secreta da

per 106 cellule) e livelli più alti nelle colture dendritiche.

Più esattamente: la proteina sFlt1 è secreta a bassi livelli durante le fasi

iniziali di differenziamento dendritico; si osserva poi un picco di produzione

al 6° giorno di cultura (1450 pg/ml per 106 cellule) ed infine una riduzione

nelle cellule attivate con LPS (750 pg/mL per 106 cellule; figura 14 B). I

livelli d’espressione del sFlt1 rispecchiano esattamente l’andamento osservato

per la forma di membrana. I dati ottenuti suggeriscono un ruolo del Flt1

(solubile e/o di membrana) su DC completamente differenziate, ma ancora

immature.

50

Figura 14

Espressione del sFlt1:

A) mRNA del sFlt1 in Mo isolati da PB e in DC a diversi giorni didifferenziamento. I campioni sono stati analizzati per la β2-microglobulina (β2m). La figura mostra le bande, visualizzate sugel d’agarosio, di un esperimento rappresentativo su tre.

B) Saggio ELISA per la quantificazione del sFlt1 nei sopranatanti dellecolture di Mo e DC a diversi giorni. I valori del sFlt1 secreto dallecellule, ottenuti da un esperimento rappresentativo, sono staticorretti per 1x106 cellule.

β2m

sFlt-1

Mo

DC

6° g

i orn

o

DC

6° g

iorn

o +

1 8h

LPS

A

B DC 6°giorno

DC 6°giorno +18 h

LPSDC 3°giorno

Mo

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

pg/m

l dis

Flt-1

per

106

cellu

le

β2m

sFlt-1

Mo

DC

6° g

i orn

o

DC

6° g

iorn

o +

1 8h

LPS

A

B DC 6°giorno

DC 6°giorno +18 h

LPSDC 3°giorno

Mo

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

pg/m

l dis

Flt-1

per

106

cellu

le

51

ATTIVAZIONE DI ERK-pathway DA PARTE DI VEGF E PlGF

Abbiamo successivamente indagato l’eventuale attivazione di vie di

trasduzione del segnale da parte del recettore Flt1 stimolato con VEGF e

PlGF.

Prima di procedere alla stimolazione con i fattori, le DC immature (al giorno

5° di cultura) sono state tenute una notte in RPMI/0.2% FCS e

successivamente tre ore in RPMI/0.1%BSA al fine di annullare qualsiasi

eventuale segnale di fosforilazione.

La stimolazione è stata indotta con diverse dosi di VEGF o PlGF (da 10

ng/mL a 1 µg/mL) e poiché sono stati ottenuti risultati analoghi, i successivi

esperimenti sono stati condotti utilizzando una concentrazione di ligando pari

a 100 ng/mL.

Abbiamo inizialmente studiato la via di trasduzione del segnale di ERK 1/2 e

abbiamo osservato un transiente aumento della molecola fosforilata. Come si

può vedere nella figura 15 A, VEGF induce la fosforilazione di ERK 1/2 entro

10-20 minuti.

Risultati analoghi si sono osservati anche in seguito a stimolazione con PlGF

utilizzato alle medesime condizioni sperimentali (figura 15 B).

Successivamente abbiamo studiato l’attivazione della via di trasduzione del

segnale di AKT, ma questa chinasi non viene maggiormente fosforilata in

seguito al legame del Flt1 con VEGF o PlGF (dato non mostrato).

52

Figura 15

Western blotting di lisati proteici ottenuti da DC al 5° giorno di colturastimolate con:

A) 100 ng/mL di VEGF per 4, 10 e 20 minuti. B) 100 ng/mL di VEGF o PlGF per 10 minuti.

I lisati cellulari sono stati trasferiti su una membrana di nitrocellulosasuccessivamente marcata con l’anticorpo contro la forma fosforilata di ERK(P-ERK1/2; 42/44 kDa ), o con l’anticorpo rispettivo per la forma nonfosforilata (ERK) utilizzato come controllo. Risultati di un esperimentorappresentativo su sei.

A

B

A

BB

cont

rollo

VEG

F 4′

VEG

F 10′

VEG

F 20′

P-ERK 1/2 →

ERK 1/2 →

cont

rollo

VEG

F 10′

PlG

F 10′

P-ERK 1/2 →

ERK 1/2 →

53

ANALISI DELLA PRODUZIONE DI VEGF E PlGF DA PARTE DI

COLTURE MONOCITARIE E DENDRITICHE

Prima di studiare l’effetto del VEGF e del PlGF esogeno sulle colture di DC

in differenziamento, abbiamo verificato l’eventuale secrezione di tali fattori

da parte delle popolazioni cellulari monocitarie e dendritiche.

Il sopranatante ottenuto dai Mo tenuti per 2 giorni in cultura, e dalle DC a

diversi stadi maturativi (dal 1° giorno al 6° giorno di coltura e dopo 24 ore di

maturazione con LPS) è stato raccolto ed analizzato mediante saggi ELISA.

I risultati ottenuti mostrano che in entrambe le popolazioni cellulari non vi è

secrezione di VEGF o PlGF: i valori ottenuti sono inferiori al livello di

background (< 10 pg/mL; dato non mostrato).

ANALISI DI CULTURE DENDRITICHE TRATTATE

CON VEGF E PlGF

• Condizioni di coltura

I fattori VEGF e PlGF sono stati aggiunti alle colture dendritiche, dopo

almeno 36 ore di differenziamento dai Mo, ad una concentrazione finale di

100 ng/mL; poiché tali fattori hanno breve emivita, sono stati riaggiunti ogni

due giorni.

Il trattamento delle DC con diverse concentrazioni di tali fattori, da 5 ng/mL a

100 ng/ml, ha mostrato effetti equivalenti.

54

• Crescita e vitalità cellulare

Abbiamo inizialmente studiato l’effetto del VEGF e del PlGF sulla

proliferazione e vitalità cellulare.

Come precedentemente descritto, le DC ottenute da Mo maturi non

proliferano e incorporano bassi livelli di timidina triziata (400 cpm per 1x105

cellule/mL). Ciò nonostante, nei saggi di proliferazione si osservano

differenze d’incorporazione della timidina, tra le DC di controllo e le cellule

trattate con i fattori VEGF e PlGF. Il trattamento delle DC immature con il

VEGF (da 5 a 100 ng/mL) determina una riduzione dose-dipendente di

incorporazione di timidina di circa 20-40% rispetto al controllo (figura 16 A).

Risultati equivalenti si ottengono trattando le cellule con PLGF. Nella figura

16 B osserviamo una riduzione d’incorporazione di timidina del 30% in DC

trattate con 50 ng/mL di PlGF rispetto al controllo.

Per chiarire meglio il significato biologico di questo dato, abbiamo

parallelamente studiato l’effetto del VEGF e del PlGF sulla vitalità cellulare a

diversi giorni di coltura.

A livello morfologico non si osservano differenze tra le cellule di controllo e

le popolazioni trattate con i fattori di crescita (dato non mostrato).

Per valutare la quota di cellule apoptotiche presenti nelle colture cellulari, è

stato misurato, mediante analisi al citofluorimetro, il livello d’incorporazione

di annessina e propidio ioduro. La figura 17 mostra le DC al 2°, 6° giorno di

coltura e al 7° giorno dopo attivazione con LPS. I risultati dimostrano che non

vi sono differenze tra la popolazione di controllo e quelle trattate con VEGF o

PlGF sul numero di cellule apoptotiche (figura 17).

55

Figura 16

Saggio di proliferazione di DC:A) DC di controllo e trattate con diverse concentrazioni di VEGF (da

5 a 100 ng/mL); B) DC di controllo o trattate con 50 ng/mL di PlGF.

Al 3° giorno di coltura sono stati aggiunti ad ogni pozzetto 0.5 mCi ditimidina e dopo 18 ore ne è stata misurata l’incorporazione. I valori degliistogrammi rappresentano la percentuale della timidina incorporata rispetto alcontrollo (il cui valore è 400 cpm per 1x105 cellule/mL), considerato 100%.

A

B

0

20

40

60

80

100

120

cont

rollo

VEG

F

5ng/

mL

VEG

F 10

ng/m

L

VEG

F50

ng/m

L

VEG

F10

0ng/

mL

% c

pm

50ng

/mL

100co

ntro

llo

0

20

40

60

80Pl

GF

% c

pm

A

B

0

20

40

60

80

100

120

cont

rollo

VEG

F

5ng/

mL

VEG

F 10

ng/m

L

VEG

F50

ng/m

L

VEG

F10

0ng/

mL

% c

pm

0

20

40

60

80

100

120

cont

rollo

VEG

F

5ng/

mL

VEG

F 10

ng/m

L

VEG

F50

ng/m

L

VEG

F10

0ng/

mL

% c

pm

50ng

/mL

100co

ntro

llo

0

20

40

60

80Pl

GF

% c

pm

100co

ntro

llo

0

20

40

60

80Pl

GF

% c

pm

0

20

40

60

80Pl

GF

% c

pm

56

Figura 17

Analisi citofluorimetrica, eseguita su DC a diversi giorni di coltura dicellule in fase iniziale di apoptosi (annessina positive) e cellule in fase tardivadi apoptosi o morte (annessina e propidio positive).

Nella prima colonna sono riportate le DC di controllo, nella seconda e terzacolonna le DC cresciute rispettivamente nel mezzo integrato con i fattoriVEGF o PlGF. La figura mostra i risultati di un esperimento rappresentativosu tre.

57

• Fenotipo

Successivamente abbiamo verificato l’effetto del VEGF e del PlGF sul

differenziamento fenotipico della popolazione.

Dalle analisi citofluorimetriche è emerso che il VEGF e il PlGF non alterano

il profilo fenotipico né della popolazione immatura né di quella attivata con

LPS. Gli antigeni di membrana normalmente presenti sulle DC mature (quali

CD1a, CD40, CD83, CD86) sono infatti espressi in eguale percentuale dalle

cellule trattate con i fattori VEGF e PlGF, rispetto al controllo. In figura 18

sono mostrati i principali antigeni di membrana delle DC mature nelle tre

condizioni di coltura.

Questi dati indicano che i fattori VEGF e PlGF non esercitano un effetto sulla

maturazione fenotipica delle DC.

• Funzionalità

Abbiamo analizzato l’attività funzionale della popolazione dendritica trattata

con i fattori VEGF o PlGF, studiandone l’attività endocitica e la capacità di

stimolare i linfociti T.

Le analisi al citofluorimetro indicano che le DC immature trattate con VEGF

o PlGF, hanno una maggior capacità di internalizzare il destrano: mostrano,

infatti, una più alta MFI rispetto al controllo (figura 19).

Le DC mature perdono gradualmente tale capacità acquisendo invece l’abilità

di presentare gli antigeni ai linfociti T. In figura 20 sono presentati i risultati

dei saggi di MLR eseguiti con DC cresciute con VEGF e PlGF e poi maturate

con LPS.

E’ chiaramente evidente una minor capacità delle cellule trattate con VEGF o

PlGF, di attivare i linfociti T.

58

controllo VEGF PlGF

IgG-PE

CD1a

CD40

CD83

CD86

(didascalia alla pagina successiva)

controllo VEGF PlGF

IgG-PE

CD1a

CD40

CD83

CD86

(didascalia alla pagina successiva)

59

Figura 18

Analisi citofluorimetrica delle DC, al 7° giorno di coltura dopo stimolazionecon LPS, trattate, o non, con VEGF o PlGF. Nella prima riga sonorappresentate le cellule marcate con il controllo negativo di fluorescenza(IgG) direttamente coniugato PE; a seguire osserviamo le marcature con glianticorpi direttamente coniugati PE: CD1a, CD40, CD83, CD86. La figuramostra i risultati di un esperimento rappresentativo su sei.

60

Destrano-FITC

Figura 19

Saggio di captazione del destrano-FITC su DC al 3° giorno di coltura:A) campione di controllo e cellule crescite con VEGF o PlGF tenuti a

4°C (istogrammi sovrapposti);B) campione di controllo (istogramma grigio) e DC cresciute con

VEGF (istogramma bianco) tenute a 37°C;C) campione di controllo (istogramma grigio) e DC cresciute con PlGF

(istogramma bianco) tenute a 37°C.La figura mostra i risultati di un esperimento rappresentativo su sei.

A

B controllo

controllo

VEGF

PLGF

C

A

B controllo

controllo

VEGF

PLGF

C

61

Figura 20

Capacità delle DC mature di controllo ( ○ ) e trattate con VEGF ( □ ) o PlGF( ▲ ), di attivare i linfociti T. In ascissa è espressa la quantità di timidinaincorporata nel DNA dei linfociti T stimolati; in ordinata il rapporto tra DC,cellule “stimulator”, e linfociti T, cellule “responder”. La figura mostra irisultati di un esperimento rappresentativo su sei.

0

20000

40000

60000

80000

50 150 450 1350

CPM

x 1

03

1:2000 1:660 1:220 1:74

DC: linfociti T

cpm

x 10

3

20

40

60

80

0

20000

40000

60000

80000

50 150 450 1350

CPM

x 1

03

1:2000 1:660 1:220 1:74

DC: linfociti T

cpm

x 10

3

20

40

60

80

0

20000

40000

60000

80000

50 150 450 1350

CPM

x 1

03

1:2000 1:660 1:220 1:74

DC: linfociti T

cpm

x 10

3

20

40

60

80

62

• Produzione di IL-12

Abbiamo infine verificato il livello di produzione di IL-12 da parte di DC

mature; IL-12 è una citochina essenziale per supportate la proliferazione dei

linfociti T.

I dati ottenuti dimostrano che non vi è differenza nella produzione di IL-12 da

parte di DC trattate con VEGF o PlGF rispetto al controllo (figura 21).

Figura 21

Saggio ELISA per la quantificazione della citochina IL-12 secreta nel mezzodi coltura di DC mature trattare, o non, con 100 ng/mL di VEGF o PlGF. Ivalori medi (± DS) di tre esperimenti sono stati normalizzati per 105 cellule egraficati. I livelli di pg/mL di citochina prodotta sono rispettivamente: 166±33 pg/ml per le DC di controllo; 170 ± 10 pg/mL per DC trattate con VEGF;160± 25 pg/mL per DC trattate con PlGF.

pg/m

L di

IL-1

2 pe

r 105

cellu

le

0

50

100

150

200

controllo VEGF PlGF

pg/m

L di

IL-1

2 pe

r 105

cellu

le

0

50

100

150

200

controllo VEGF PlGF

63

5. DISCUSSIONE

La riduzione numerica e la scarsa funzionalità delle DC osservata nei pazienti

con il cancro, sono i risultati di due importanti meccanismi attuati dalle

cellule tumorali per evadere il sistema immunitario.

E’ noto che le cellule tumorali producono una grande varietà di citochine e

che il VEGF è uno dei principali fattori responsabili degli effetti osservati

sulle DC.

Diversi autori hanno dimostrato che il VEGF esercita un effetto inibitorio

sulla differenziazione dendritica agendo sui precursori delle DC (Gabrilovich

D. et al. 1996; Troy A. et al. 1998; Almand B. et al. 2000; Kiertscher SM. et

al. 2000; Della Bella S. et al. 2003).

E’ stato dimostrato, inoltre, che il VEGF impedisce la maturazione delle DC

se aggiunto alle colture contemporaneamente all’LPS (bTakahashi A. 2004).

Non è ancora noto, invece, se il VEGF eserciti un effetto diretto sulle DC

immature.

Alcuni autori hanno mostrato l’espressione di entrambi i recettori del VEGF,

sulla popolazione dendritica (bTakahashi A. 2004). Noi abbiamo confermato e

studiato più dettagliatamente tale espressione sia nei Mo maturi, da cui

derivano le DC da noi utilizzate, che nelle DC ai diversi stadi maturativi.

Mediante RT-PCR ed immunofluorescenza, abbiamo osservato che il

recettore Flt1 è espresso su 90% delle DC immature e si riduce gradualmente

in seguito alla loro maturazione. Parallelamente, il recettore del KDR si

riduce in seguito alla maturazione indotta dall’LPS, ma la sua espressione

sulle DC immature non è mai superiore al 5% della popolazione cellulare.

64

L’osservazione dell’espressione del Flt1 espresso sulla quasi totalità delle DC

immature, ci ha indotto ad ipotizzare che il VEGF, presente nel

microambiente tumorale, possa interferire con la funzionalità delle DC

agendo direttamente su di esse. Inoltre la riduzione del Flt1, osservata in

seguito alla maturazione delle DC, suggerisce un ruolo di tale recettore

durante il loro stadio immaturo.

Per comprendere la funzione del Flt1 sulle DC, abbiamo eseguito esperimenti

usando sia la molecola del VEGF che del PlGF; quest’ultimo fattore di

crescita lega il Flt1 con alta affinità e non è in grado di legare il KDR.

L’utilizzo di entrambe le molecole ci permette di attribuire gli eventuali effetti

osservati unicamente all’attivazione del recettore Flt1.

Abbiamo dimostrato, mediante marcatura con VEGF biotinilato, il legame del

VEGF sulle DC e, in esperimenti di competizione tra VEGF biotinilato e

PlGF, abbiamo confermato la specificità di legame di entrambi i fattori al

recettore Flt1.

Successivamente abbiamo verificato se in seguito a tale legame si attivassero

le vie di traduzione del segnale di AKT o della MAP chinasi ERK 1/2.

In un lavoro di Selvaraj S.K. è descritto un transiente aumento, a tempi molto

precoci (0.5 minuti), della fosforilazione di AKT in Mo maturi stimolati con

PlGF (Selvaraj S.K. et al. 2003). Nelle nostre colture dendritiche non abbiamo

osservato nessun evidente aumento della fosforilazione di AKT in seguito a

stimolazione con VEGF o PlGF. Contrariamente, abbiamo dimostrato che

entrambi i fattori inducono un aumento, tempo-dipendente, della

fosforilazione di ERK 1/2.

Questi dati sono in accordo con quelli di precedenti lavori in cui viene

mostrato, in linee cellulari ottenute dal colon-retto (Fan F. et al. 2005), in

cellule muscolari lisce (Kazi A.S. 2004) e in cellule di mieloma (Podar K. et

65

al. 2001), che il VEGF induce un aumento della fosforilazione di ERK 1/2,

mediante attivazione di Flt1; l’attivazione di ERK 1/2 è stata dimostrata anche

in Mo maturi stimolati con PlGF (Selvaraj S.K. et al. 2003).

E’ stato dimostrato, inoltre, che le via del segnale della MAP chinasi ERK 1/2

regola la maturazione delle DC (Kröger A.P. et al. 2001; Yi A. et al. 2002).

Kröger A.P. e colleghi hanno osservato, difatti, in DC derivate da Mo maturi,

che l’inibizione della trasduzione del segnale di ERK 1/2 potenzia:

l’espressione delle molecole costimolatorie, la perdita della capacità

endocitica, l’attività del fattore trascrizionale NF-κB, il rilascio di IL-12 e la

capacità delle DC attivate di stimolare i linfociti T.

Infine è stato recentemente mostrato che, in DC derivate da cellule staminali

embrionali murine, il signaling del Flt1 è sufficiente a bloccare l’attivazione

di NF-κB (Dikov M.M. et al. 2005).

Tutti questi dati dimostrano il ruolo del Flt1 come primo mediatore

nell’inibizione della maturazione delle DC mediante la via del segnale di

ERK1/2.

Al fine di valutare un possibile effetto del VEGF e del PlGF sulle DC

immature, abbiamo aggiunto tali fattori nel mezzo di coltura dopo almeno 36

ore di differenziamento dai Mo maturi.

Inizialmente abbiamo verificato se il VEGF e il PlGF avessero un effetto sulla

proliferazione e vitalità cellulare.

E’ noto che le DC che derivano direttamente da Mo maturi, non proliferano e

mostrano bassi livelli d’incorporazione di timidina (Chapuis F. et al. 1997).

Ciò nonostante abbiamo osservato che il trattamento delle DC con VEGF o

PLGF determina una riduzione, dose dipendente, dell’incorporazione di

timidina. A dosi più alte di 50 ng/ml l’effetto è però annullato; questo

66

fenomeno è stato già osservato da altri autori (Barleon B. et al. 1996; Podar

K. Et al. 2001; Sawano A. et al. 2001).

L’incorporazione di timidina fornisce una misura quantitativa del grado di

sintesi del DNA che è di solito paragonabile all’attività proliferativa delle

cellule. Abbiamo quindi valutato la vitalità delle cellule trattate con VEGF o

PlGF, ma non abbiamo osservato differenze tra le popolazioni trattate e quelle

di controllo, né a livello morfologico, né nel numero di cellule apoptotiche.

Successivamente abbiamo studiato l’effetto del VEGF e PlGF sulla

maturazione e sulla funzionalità delle DC: quello che emerge dai risultati

ottenuti è che questi fattori inibiscono la completa maturazione della

popolazione.

In un recente lavoro è stato descritto che DC, derivate da Mo maturi, e

maturate con LPS in presenza di VEGF, non presentano in membrana alti

livelli di CD80 e il CD86, producono una bassa quantità di IL-12 e sono

incapaci di attivare i linfociti T (bTakahashi A. et al. 2004).

Le nostre popolazioni dendritiche, trattate con VEGF e PlGF, risultano

attivare meno efficacemente i linfociti T nonostante siano fenotipicamente

mature e producano normali livelli di IL-12.

I diversi risultati ottenuti potrebbero essere dovuti alla differente fase

maturativa delle DC al momento del trattamento con il VEGF: nel lavoro di

Takahashi A. il VEGF viene aggiunto solo al 5° giorno contemporaneamente

all’LPS, noi lo aggiungiamo al mezzo di coltura dopo 36 ore di

differenziamento dai Mo.

Il differente effetto del VEGF aggiunto all’inizio delle colture dendritiche,

rispetto a quello osservato con DC trattate solo durante gli ultimi stadi

maturativi, suggerisce la possibile esistenza di due distinti pathways mediante

67

i quali le cellule tumorali possono sopprimere il controllo immunitario agendo

sulle DC.

Particolarmente interessante è l’osservazione che le DC trattate con VEGF o

PlGF a stadi maturativi precoci, mostrano una prolungata capacità di

internalizzare gli antigeni rispetto alle cellule di controllo.

Questi dati concordano con i risultati pubblicati da Gabrilovich G. il quale

dimostra che DC ottenute da topi trattati con VEGF hanno un’aumentata

capacità d'internalizzare il destrano (Gabrilovich D. et al. 1998).

L’internalizzazione degli antigeni è una caratteristica propria delle DC

immature; pertanto un aumento di tale capacità è un’indicazione dello stato

prolungato della fase immatura delle DC trattate con VEGF o PlGF rispetto al

controllo.

Un’ulteriore indicazione del blocco maturativo delle nostre popolazioni

dendritiche trattate, è la loro inefficienza nello stimolare i linfociti T (essendo

tale capacità caratteristica delle DC mature).

Come precedentemente commentato, Takahashi A. ha già descritto questo

effetto del VEGF sulle DC e in un lavoro di Oyama T. è stata dimostrata la

riduzione della stimolazione dei linfociti T da parte di DC derivate da

progenitori ematopoietici trattati con PlGF (Oyama T. et al. 1998).

La ridotta capacità delle DC di attivare i linfociti T, non sembra dovuta alla

loro ridotta vitalità: difatti, le DC trattate con VEGF e PlGF, mostrano una

percentuale di cellule apoptotiche simile al controllo. Suggeriamo che il

legame del VEGF o del PlGF, mediante Flt1, alteri la maturazione di DC

immature con conseguente effetto sulle attività funzionali.

Inoltre escludiamo che sFlt1 prodotto dalle DC possa mascherare o rendere

meno evidenti gli effetti osservati in vitro. La sFlt1 è un potente antagonista

del VEGF (He Y. et al. 2005), ciò nonostante la quantità di VEGF aggiunta

68

alle colture di DC è 150 volte superiore alla quantità di sFlt1 prodotto dalle

stesse DC.

La secrezione del sFlt1, così come l’espressione della forma di membrana, si

riduce nelle DC mature suggerendo un ruolo del Flt1 in particolare nella fase

immatura. Il significato biologico della produzione del sFlt1 è ad oggi ancora

da chiarire.

In conclusione, noi osserviamo che il trattamento con VEGF o PlGF,

all’inizio della differenziazione dendritica, mantiene la popolazione in uno

stato immaturo alterandone la funzionalità ed ipotizziamo che il Flt1 sia il

principale mediatore di tali effetti.

L’effetto mediato dal Flt1è verosimilmente indotto attraverso la cascata del

segnale di ERK.

Questi dati identificano un nuovo ruolo che il VEGF gioca nel sistema

immunitario e indicano un possibile meccanismo mediante il quale si ha

accumulo di DC immature e inattive nelle aree tumorali.

Queste scoperte suggeriscono, infine, che una specifica molecola target del

Flt1 potrebbe migliorare le risposte del sistema immunitario nei pazienti con

il cancro.

69

6. BIBLIOGRAFIA

Abbas A.K., Lichtman A.H. e Pober J.S. 1998. Immunologia cellulare e

molecolare. III Edizione, Piccin, Padova.

Adams S., O’Neill D.W., e Bhardawaj N. Recent advances in dendritic cell

biology. Journal of Clinical Immunology. 2005; Vol. 25. No.2: 87-97.

Almand B., Resser J.R., Lindman B., Nadaf S., Clark J.I., Kwon E.D.,

Carbone D.P., Gabrilovich D.I. Clinical significance of defective dendritic

cell differentiation in cancer. Clinical Cancer Research. 2000; 6:1755-1766.

Banchereau J. e Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity.

Nature. 1998; 392: 245-252.

Banchereau J., Briere F., Caux C., Davoust J., Labecque S., Liu Y., Pulendran

B. and Palucka K. Immunobiology of dendritic cells. Annual Reviews of

Immunology. 2000; 18: 767-811.

Barleon B., Sozzani S., Zhou D., Weich H.A., Mantovani A., Marmè D.

Migration of human monocytes in response to vascular endothelial growth

factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1. Blood. 1996; Vol.

87: 3336-3343.

70

Brown L.F., Berse B., Jackman R.W., Tognazzi K., Manseau E.J., Senger

D.R., Dvorak H.F. Expression of vascular permeability factor (vascular

endothelial growth factor) and its receptors in adenocarcinomas of the

gastrointestinal tract. Cancer Research. 1993; 53(19):4727-35.

Broxmeyer H.E., Cooper S., Li Z.H., Lu L., Song H.Y., Kwon B.S., Warren

R.E., Donner D.B. Myeloid progenitor cell regulatory effects of vascular

endothelial cell growth factor. International Journal of Hematology. 1995;

62(4):203-15.

Casella I., Feccia T., Chelucci C., Samoggia P, Castelli G., Guerriero R.,

Parolini I., Petrucci E., Pelosi E., Morsilli O., Gabbianelli M, Testa U.,

Peschle C. Autocrine-paracrine VEGF loops potenziate the maturation of

megakaryocytic precursors through Flt1 receptor. Blood. 2003; 101:1316-

1323.

Caux C., Ait-Yahia S., Chemin K., de Bouteiller O, Dieu-Nosjean M.C.,

Homey B., Massacrier C., Vanbervliet B., Zlotnik A, Vicari A. Dendritic cell

biology and regulation of dendritic cell trafficking by chemokines. Springer

Seminars in Immunopathology. 2000; 22(4):345-69.

Chapuis F., Rosenzwajg M., Yagello M., Ekman M., Biberfeld P., Gluckman

J.C. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro.

European Journal of Immunology. 1997; 27:431-441.

Clauss M., Gerlach M., Gerlach H., Brett J., Wang F., Familletti P.C., Pan

Y.C., Olander J.V., Connolly D.T., Stern D. Vascular permeability factor: a

71

tumor-derived polypeptide that induces endothelial cell and monocyte

procoagulant activity, and promotes monocytes migration. Journal

Experimental Medicine. 1990; 172: 1535-45.

Della Bella S., Gennaro M., Vaccari M., Ferraris C., Nicola S., Riva A.,

Clerici M., Graco M., Villa M.L. Altered maturation of peripheral blood

dendritic cells in patients with breast cancer. British Journal of Cancer. 2003;

89: 1463-1472.

Dikov M.M., Ohm J.E., Ray N., Tchekneva E.E., Burlison J., Moghanaki D.,

Nadaf S., Carbone D.P. Differential roles of vascular endothelial growth

factor receptors 1 and 2 in dendritic cell differentiation. The Journal of

Immunology. 2005; 174:215-222.

Dvorak H.F. Nagy J.A., Berse B., Brown L.F., Yeo K.T., Yeo T.K., Dvorak

A.M., van de Water L., Sioussat T.M., Senger D.R. Vascular permeability

factor, fibrin, and the pathogenesis of tumor stroma formation. Annals of the

New York Academy of Sciences. 1992; Dec 4;667:101-11.

Dvorak H., Brown L.F., Detmar M., Dvorak A.M. Vascular permeability

factor/vascular endothelial growth factor, microvascular hyperpermeability,

and angiogenesis. American Journal of Pathology. 1995;146(5):1029-39.

Fan F., Wey J.S., McCarty M.F., Belcheva A., Liu W., Bauer T.W., Somcio

R.J., Wu Y., Hooper A., Hicklin D.J., Ellis L.M. Expression and function of

vascular endothelial growth factor receptor-1 on human colorectal cancer

cells. Oncogene. 2005;1-7.

72

Ferrara N. and Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth

factor. Endocrine Reviews. 1997; 18, 4-25.

Ferrara N.. Role of vascular endothelial growth factor in regulation of

physiological angiogenesis. American Journal of Physiology Cell. 2001; 280,

C1358-66.

Ferrara N., Gerber H.P. and LeCourter J. The biology of VEGF and its

receptors. Nature Medicine. 2003; 9:669-676.

Ferrara N.. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical

progress. Endocrine Reviews. 2004; 25:581-611.

Gabrilovich D., Chen H.L., Girgis K.R., Cunningham T., Meny G.M., Nadaf

S., Kavanaugh D., Carbone D.P. Production of vascular endothelial growth

factor by human tumors inhibits the functional maturation of the dendritic

cells. Nature Medicine. 1996; 2: 1096-1103.

Gabrilovich D., Corak J., Ciernik I.F., Kavanaugh D., Carbone D.P.

Decreased antigen presentation by dendritic cells in patients with breast

cancer. Clinical Cancer Research. 1997; 3:483-90.

Gabrilovich D., Ishida T., Oyama T., Ran S., Kravtsov V., Nadaf S., Carbone

D.P. Vascular endothelial growth factor inhibits the development of dendritic

cells and dramatically affect the differentiation of multiple hematopoietic

lineages in vivo. Blood. 1998; 92: 4150-4166.

73

Gabrilovich D., Ishida T., Nadaf S., Ohm J.E., Carbone D.P. Antibodies to

vascular endothelial growth factor enhance the efficacy of cancer

immunotherapy by improving endogenous dendritic cell function. Clinical

Cancer Research. 1999; 5(10):2963-70.

Gabrilovich D. Mechanisms and functional significance of tumor-induced

dendritic-cell defects. Nature Reviews of Immunology. 2004; 4:941-52.

Gerber H.P., McMurtrey A., Kowalski J., Yan M., Keyet B.A,. Dixit V.,

Ferrara N. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell

survival through the phospatidylinositol 3’-kinase/Akt signal transduction

pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. Journal of Biological

Chemistry. 1998; 273: 30336-43.

Gerber H.P., Malik A.K. , Solar G.P., Sherman D., Liang X.H., Meng G.,

Hong K., Marsters J.C., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor

regulates hematopoietic stem cell survival by an internal autocrine loop

mechanism. Nature. 2002; 417 (6892): 954-8.

Gerber H.P. and Ferrara N. The role of VEGF in normal and neoplastic

hematopoiesis. Journal of Molecular Medicine. 2003; 81:20-31.

Gille H., Kowalski J., Li B., LeCouter J., Moffat B., Zioncheck T.F., Pelletier

N., Ferrara N. Analysis of biological effects and signaling properties of Flt-1

(VEGFR-1) and KDR (VEGFR-2). Journal of Biological Chemistry. 2001;

276:3222-3230.

74

Hart D.N.J. Dendritic cells: unique leukocyte populations which control the

primary immune response. Blood. 1997; Vol. 90, No 9:3245-3287.

Hattori K., Heissig B., Wu Y., Dias S., Tejada R., Ferris B., Hicklin D.J., Zhu

Z., Bohlen P., Witte L., Hendrikx J., Hackett N.R., Crystal R.G., Moore M.A.,

Werb Z., Lyden D., Rafii S. Placental growth factor reconstitutes

hematopoiesis by recruiting VEGFR1(+) stem cells from bone-marrow

microenvironment. Nature Medicine. 2002; 8, 841-9.

He Y., Smith S.K., Day K.A., Clark D.E., Licence D.R., Charnock-Jones D.S.

Alternative splicing of vascular endothelial growth factor (VEGF)-R1 (Flt-1)

pre-mRNA is important for the regulation of VEGF activity. Molecular

Endocrinology. 1999; 13: 537-545.

Ishida T., Oyama T., Carbone D.P., Gabrilovich D. Detective function of

Langerhans cells in tumor-bearing animals is the result of detective

maturation from hematopoietic progenitors. Journal of Immunology. 1998;

161 (9): 4842-51.

Kanno S., Oda N., Abe M., Terai Y., Ito M., Shitara K., Tabayashi K.,

Shibuya M., Sato Y. Roles of two VEGF receptors, Flt-1 and KDR, in the

signal transduction of VEGF effects in human vascular endothelial cells.

Oncogene. 2000; 19, 2138-46.

75

Karkkainen M.J., Petrova T.V. Vascular endothelial growth factor receptors

in the regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Oncogene. 2000;

19, 5598-5605.

Kazi A.S., Lotfi S., Gonharova E.A., Tliba O., Amrani Y., Krymskaya V.P.,

Lazaar A.L. Vascular endothelial growth factor-induced secretion of

fibronectin is ERK dependent. American journal of physiology. Lung Cellular

and Molecular Physiology. 2004; 286 (3): L539-45.

Kendall R.L. end Thomas K.A. Inhibition of Vascular Endothelial Cell

Growth Factor Activity by an Endogeneously Encoded Soluble Receptor.

Proceedings of the National Academy of Sciences. 1993; Vol. 90, 10705-

10709.

Kiertscher S.M., Luo J., Dubinett S.M., Roth M.D. Tumors promote altered

maturation and early apoptosis of monocytes-derived dendritic cells. The

Journal of Immunology. 2000; 164:1269-1276.

Kröger-Puig A., Relloso M., Fernandez-Capetillo O., Zubiaga A., Silva A.,

Bernabeu C., Corbì A.L. Extracellular signal-regulated protein kinase

signaling pathway negatively regulates the phenotypic and functional

maturation of monocytes-deriver human dendritic cells. Blood. 2001;

98:2175-2182.

Landgren E., Schiller P., Cao Y., Claesson-Welsh L. Placenta growth factor

stimulates MAP kinase and mitogenicity but not phospholipase C-gamma and

migration of endothelial cells expressing Flt 1. Oncogene. 1998; 16, 359-67.

76

Larrivee B., Lane D.R., Pollet I., Olive P.L., Humphries R.K., Karsan A.

VEGFR-2 induces survival of hematopoietic progenitor cells. Journal of

Biological Chemistry. 2003; 278, 22006-13.

Montesoro E., Castelli G., Morsilli O., Nisini R., Stafsnes M.H., Carè A.,

Peschle C., Chelucci C. Unilineage monocytopoiesis in hematopoietic

progenitor culture: switching cytokine treatment at all monocytic

development stages induces differentiation into dendritic cells. Cell Death

Differentiation. 2005 Aug 19; [Epub ahead of print].

Neufeld G., Cohen T., Gengrinovitch S., Poltorak Z. Vascular endothelial

growth factor (VEGF) and its receptors. FASEB Journal. 1999; 13, 9-22.

Ohm J.E. and Carbone D.P. VEGF as a mediator of tumor-associated

immunodeficiency. Immunologic Research. 2001; 23:263-272.

Oyama T., Ran S., Ishida T., Nadaf S., Kerr L., Carbone D.P., Gabrilovich

D.I.. Vascular endothelial growth factor affects dendritic cells maturation

through the inhibition of Nuclear Factor-kB activation in hematopoietic

progenitor cells. The Journal of Immunology. 1998; 160:1224-1232.

Podar K., Tai Y., Davies F.E., Lentzsch S., Sattler M., Hideshima T., Lin

B.K., Gupta D., Shima Y., Chauhan D, Mitsiades C., Raje N., Richardson P.,

Anderson K.C. Vascular endothelial growth factor triggers signaling cascades

mediating multiple myeloma cell growth and migration. Blood. 2001; 98:428-

435.

77

Pujol B.F., Lucibello F.C., Zuzarte M, Lütjens P., Müller R., Havemann K.

Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial

markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into

endothelial-like cells. European Journal of Cell Biology. 2001; 80: 99-110.

Saito H., Tsujitani S., Ikeguchi M., Maeta M., Kaibara N. Relationship

between the expression of vascular endothelial growth factor and the density

of dendritic cells in gastric adenocarcinoma tissue. British Journal of

Cancer.1998; 78(12):1573-7.

Sallusto F. and Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by

cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage

colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor

necrosis factor alpha. Journal Experimental Medicine. 1994; 179(4):1109-18.

Sawano A., Iwai S., Sakurai Y., Ito M., Shitara K., Nakahata T., Shibuya M.

Flt-1, vascular endothelial growth factor receptor 1, is a novel cell surface

marker for the lineage of monocyte-macrophages in humans. Blood. 2001;

97:785-791.

Selvaraj S.K., Giri R.K., Perelman N., Johnson C., Malik P., Kalra V.K.

Mechanism of monocytes activation and expression of proinflammatory

cytochemokines by placenta growth factor. Blood. 2003; 102: 1515-1524.

78

Shibuya M. Structure and dual function of vascular endothelial growth factor

receptor-1 (Flt-1). The International Journal of Biochemistry & Cell Biology.

2001; 33:409-420.

Shibuja M. Vascular endothelial growth factor receptor-2: its unique

signalling and specific ligand, VEGF-E. Cancer Science. 2003; 94, 751-6.

Steinman R.M., Pack M., Inaba K. Dendritic cell development and

maturation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1997; 417:1-6.

aTakahashi M., Yoshimoto T., Kubo H. Molecular mechanisms of

lymphangiogenesis. Internal Journal of Hematology. 2004; 80(1):29-34.

bTakahashi A., Kono K., Ichihara F., Sugi H., Fujii H., Matsumoto Y.

Vascular endothelial growth factor inhibits maturation of dendritic cells

induced by lipopolysaccharide, but not by proinflammatory cytokines. Cancer

Immunology, Immunotherapy. 2004; 53: 543-550.

aTroy A.J., Summers K.L., Davidson P.J., Atkinson C.H., Hart D.N. Minimal

recruitment and activation of dendritic cells within renal cell carcinoma.

Clinical Cancer Research. 1998; 4:585-93.

bTroy A., Davidson P., Atkinson C., Hart D. Phenotypic characterisation of

the dendritic cell infiltrate in prostate cancer. The Journal of Urology. 1998;

160: 214-9.

79

Weissman D. and Fauci A. Role of Dendritic cells in immunopathogenesis of

human immunodeficiency virus infection. Clinical Microbiology Reviews.

1997; pp. 358-367, 1997.

Yi A.K., Yoon J.G., Yeo S.J., Hong S.C., English B.K., Krieg A.M. Role of

mitogen-activated protein kinases in CpG DNA-mediated IL-10 and IL-12

production: central role of extracellular signal-regulated kinase in the negative

feedback loop of the CpG DNA-mediated Th1 response. The Journal of

Immunology. 2002; 168(9):4711-20.

Young J.W. Dendritic cells: expansion and differentiation with hematopoietic

growth factors. Current Opinion Hematology. 1999; 6: 135-144.

Ziegler B.L., Valtieri M., Porada G.A., De Maria R., Muller R., Masella B.,

Gabbianelli M., Casella I., Pelosi E., Bock T., Zanjani E.D., Peschle C. KDR

receptor: a key marker defining hematopoietic stem cells. Science. 1999; 285:

1553.

80

81

7. ACRONIMI

APC Antigen Presenting Cell

BSA Bovine Serum Albumine

CD Cluster of Differentiation

cDNA copy DNA

cpm conte per minuto

DS Standard Deviation

DC Dendritic Cells

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

ERK Extracellular signal-Regulated Kinases

FITC Fluorescin Isothiocyanate

Flk1 Fetal liver kinase 1

Flt1 Fms-like-tyrosine kinase 1

GM-CSF Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor

HLA Human Leukocyte Antigens

KDR Kinase insert Domain-containing Receptor

ICAM Intracellular Adhesion Molecule

IgG Immunoglobuline G

82

IL Interleukin

IFN Interferon

IMDM Iscove’s modified Dulbecco’s medium

LFA Limphocyte Function-Associated Molecule

LPS Lipopolysaccharide

MAP K Microtubule Associated Proteins Kinase

M-CSF Macrophage Colony-Stimulating Factor

MFI Mean Intensity Fluorescence

MHC Major Histocompatibility Complex

MIP Macrophage Infiammatory Protein

MLR Mixed Leukocyte Reaction

Mo

MoAb

Monocytes

Monoclonal Antibody

NOD/SCID NonObese Diabetic/Severe Combined Immunodeficiency

Disease

NF-κB Nuclear Factor-κB

PE Phycoerythhrin

PBS Phosphate Buffered Saline

PB Peripheral Blood

PlGF Placental Growth Factor

83

PI3K PhosphoInositide-3 Kinase

PKC Protein Kinase C

RPM Rotazioni Per Minuto

RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

SCF Stem Cell Factor

SDF Stromal cell-Derived Factor

SDS Sodio Dodecil Solfato

TCR T cell receptor

TGF Transforming Growth Factor

TNF Tumor Necrosis Factor

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

VEGFRs VEGF Receptors

VLA Very Late Antigens