RICERCA DI NEUROTOSSINE NELLE ALGHE E NEI MITILI...

Ann. 1st. Super. Sanit. Voi. 21, N 3 (1985). pp. 349-356

RICERCA DI NEUROTOSSINE NELLE ALGHE E NEI MITILI RACCOLTI DURANTE LA "MAREA ROSSA" NELL'ESTATE 1984 SUL LITORALE ROMAGNOLO

S. Fortuna (a). L. Volterra (b), A.M. SpanÒ (b) & H. Michalek (a)

(a) Laboratorio di Farmacologia; (b) Laboratorio di Igiene del Territorio, Istituto Superiore di Sanità, Roma

Riassunto. - Campioni di acqua marina e di mitili, prelevati vicino al porto di Cesenatico durante le intense fioriture di alghe ("maree rosse") verificatesi nell'agosto e nel settembre 1984, sono stati analizzati per la presenza di saxitossina. Le alghe sono state concentrate mediante centrifugazione e identi- ficate come Gonyaulax polyedra (dinoflagellate). Sono stati preparati estratti acquosi in ambiente acido usando il metodo in vigore per i mitili. I1 saggio biologico sul topo e il test basato sull'inibizione della trasmissione neuromuscolare nella preparazione del nervo frenico-diaframma di ratto non hanno messo in evidenza la presenza di neurotossina. Al contrario. elevate concentrazioni di saxitossina erano presenti negli estratti di Gonyaulax tamarensis, ceppo tossico proveniente da colture di laboratorio. Si deve presumere che la moria di organismi marini osservata sucessivamente alla "marea rossa" non sia imputabile alla presenza di saxitossina, ma ad altri fenomeni, ad esempio anossici, che si verificano durante la degradazione della cospicua massa di alghe.

Summary (Search for neurotoxins in algae and mussels during red tide blooms at Emilia Romagna coast in Summer 1984). - Samples of sea-water containing algae and of mussels, taken near Cesenatico harbour during intense red tide blooms in August and September 1984, have been analyzed for the presence of saxitoxin. The algae have been concentrated by centrifugation and identified as Gonyaulax polyedra (Dinoflagellates). Acid aqueous extracts have been prepared with a method used for mussels. The biological assay on mice as well as that based on inhibition of neuromuscular transmission in phrenodiaphragmatic preparation of the rat did not show measurable quantities of the neurotoxin in the samples analyzed. On the other hand high concentration of the neurotoxin was present in the extracts of Gonyaulax tamarensis, toxic variety from laboratory culture. High mortality rate of marine organisms observed subsequently to red tide blooms presumably did not depend on the presence of saxitoxin in algae but on other biological phenomena such as their degradation causing deficit of oxygen in marine water.

Introduzione

La comparsa di "maree rosse" è nota dai tempi dell'antichità ed è stata menzionata nella Bibbia (Esodo 7, 20-21) come uno dei flagelli che colpirono l'Egitto (1). Il fenomeno è dovuto, nella maggior parte dei casi, ad una intensa proliferazione del fitoplancton ed in particolare delle dinoflagellate. Esso interessa generalmente limitate aree costiere ed è seguito da moria di pesci e di altri animali bentonici.

L'insorgenza di questi fenomeni cosiddetti eutrofici dipende da cause

naturali e artificiali (2,3). Correnti ascensionali dell'acqua marina possono causare un aumento di sali nutritivi favorendo, in particolari condizioni di temperatura dell'acqua e di luminosità, lo sviluppo abnorme del fitoplancton. Le influenze fluviali nelle zone costiere portano all'aumentata disponibilità di composti contenenti azoto, fosforo ed altri microelementi, per es. metalli pesanti (4) provenienti in parte da concimi e da antiparassitari usati in agricoltura. Gli scarichi urbani ed industriali contribuiscono al fenomeno di eutrofizzazione, anche per il contenuto di fosforo nei detersivi.

La sintomatologia tossica causata dal consumo dei mitili provenienti dalle zone delle "maree rosse" è stata riportata circa 200 anni fa (5) dai capitani Cook e Vancouver. Essa dipende dalla presenza di saxitossina, un composto di origine naturale prodotto da al.cuni ceppi di fitoplancton che, ingerito dai mitili, porta all'accumulo in essi della neurotossina. Essa è uno dei composti più tossici esistenti: la dose minima letale & nel topo è di circa 9 pglkg (cioè circa 1250 volte minore di quella del cianuro di sodio) mentre la dose minima letale per os nell'uomo varia da 0.5 a 4 mg (1,s).

In Italia il fenomeno della "marea rossa" si è verificato con notevole intensità lungo le coste delllEmilia Romagna nell'anno 1975, e in quell'occa- sione sono stati promossi studi per identificare le cause specifiche e proporre iniziative per il risanamento (3).

Nei mesi di agosto e settembre del 1984 il fenomeno della "marea rossa" si è ripetuto lungo la riviera romagnola, soprattutto nel tratto di mare antistan- te la costa tra Milano Marittima e Cesenatico ed è stato seguito da una preoc- cupante moria di pesci e molluschi. La situazione è stata definita come disa- stro ecologico ed economico ed è stato dichiarato lo stato di emergenza ambien- tale della costa.

Nel presente lavoro vengono esposti i risultati di una ricerca eseguita allo scopo di accertare l'eventuale presenza di neurotossina nelle alghe prelevate e nei mitili provenienti dalla stessa zona. Tale studio appariva utile perché esistono specie tossiche e non tossiche delle dinoflagellate. La comparsa di una "marea rossa" non comporta quindi necessariamente la non commestibilità dei molluschi.

Materiali e Metodi

Raccolta dei campioni di alghe e loro identificazione morfologica Campioni di acqua di mare sono stati raccolti il 16 e il 31 agosto 1984

dall'imbarcazione messa a disposizione dal Centro Studi di Cesenatico, utiliz- zando sia una bottiglia a strappo, sia concentrando le alghe con un retino da fitoplancton. - Le alghe sono state classificate dall'Istituto di Botanica delltUniversità

di Bologna come Gonyaulax polyedra (G. polyedra) appartenenti alle dinoflagellate (6,7). Di questa specie si conoscono varietà che possono produrre, in particolari condizioni, la saxitossina (2,8).

Colture algali di Gonyaulax tamarensis (G. tamarensis) Un ceppo della specie G. tamarensis, ottenuto dal Bigelow Laboratory for

Ocean Sciences (Maine, USA) è stato coltivato nel Laboratorio di Igiene del Territorio dell'ISS per circa 1 anno, secondo le comuni tecniche descritte in letteratura, su terreni ES e f-2 (9-11).

Conta delle alghe Prima delle analisi farmacoloaiche per la presenza delle neurotossine, le -

alghe provenienti da colture di laboratorio di G. tamarensis, e le dinoflagellate presenti nei campioni di acqua marina sono state concentrate mediante centrifugazione continua (Sharpless, 30.000 g), fissate con formalina e contatg in camera di Palmer-Maloney (12). I1 numero di organismi era di circa 7x10 unità per un g di peso umido, corrispondente a circa 1 m1 di sospensione.

Preparazione di estratti acquosi di alghe e mitili Nel Laboratorio di Farmacologia dell'ISS gli estratti sono stati preparati

mediante aggiunta ad 1 m1 della sospensione di alghe o ad 1 g di mitili (parte edibile, priva di pelle e visceri) di 1 m1 di HCl 0.1 N, seguito da omogenizza- zione con Polytron per 3 minuti. La sospensione è stata portata a pH 3.0 con HC1 1 N prima della ebollizione a bagnomaria per 3 minuti. Dopo il raffredda- mento l'omogenato è stato centrifugato per 10 minuti a 1100 g (Sorvall) e il sopranatante utilizzato per le prove di tossicità (13).

Determinazione delle neurotossine E' stato usato il metodo descritto per lo screening preliminare tossicolo-

gico (13), nel topo Swiss, del peso di 20-1 g, iniettando per via intraperito- neale dosi crescenti di estratti acquosi di alghe o mitili fino a 1 ml, e tenendo in osservazione gli animali per 24 ore per accertarne la morte o sintomatologia tossica, in particolare,paresi del treno posteriore.

E' stato inoltre usato il metodo basato sull'inibizione della trasmissione neuromuscolare da parte di neurotossine nella preparazione del nervo frenico- diaframma di ratto in Y~itro (1415) I1 nervo frenico, inserito in un elettrodo costituito da due anellini di platino (diametro 1,5 mm) isolati da una resina acrilica leggera e libero di muoversi nel bagno, veniva stimolato con impulsi rettangolari sopramassimali, registrando le contrazioni del diaframma. Dopo la stabilizzazione del tracciato si aggiungevano quantità crescenti di saxitossina (reference standard shellfish poison Lot. 8, serie n. 632, fornito da US Food and Drug Administration), si misurava l'ampiezza delle contrazioni dal 9' al 10" min calcolando la percentuale di inibizione della trasmissione neuromuscolare (Fig. 1). Dalla analisi di regressione si è ottenuta una retta dose-effet- to (Fig. 2) per poter ricavare le quantità di neurotossina presenti nell'e- stratto.

Fig.1. - Inibizione della trasmissione ueuromuscolare nella preparazione del nervo frenico-diaframma di ratto in vitro da dosi crescenti di saxitossina.

Stimolazione con impulsi rettangolari sopramassimali (frequenza 0.25 cicli/sec, durata 0.01 m sec). E' indicato oltre all'aggiunta di saxitossina, l'intervallo tra il 9" e il 10' min, in cui si calcola la percentuale media di inibizione della trasmissione neuromuscolare.

n g / m l Saxitossina

Fig.2. - Retta di regressione lineare tra la concentrazione di saxitossina (x) e la percentuale di inibizione della trasmissione neuromuscolare (y) (per il calcolo vedi la legenda della Fig.1).

I punti indicano i singoli valori, le crocette i valori medi. L'analisi di regressione per n=31 con il coefficiente di correlazione r=0,8391 ha dato l'equazione y=2,58+0.94x.

Risultati

G. polyedra Sono state effettuate due estrazioni di alghe provenienti da campioni di

acqua marina. I1 primo campione è stato inviato dal Consorzio Centro Studi Cesenatico il

20 agosto 1984 in relazione alla prima fioritura algale del 16 agosto 1984. Ug volume di 0,3 m1 dell'estratto (corrispondente a 0,16 g di alghe e a 1,lxlO organismi) iniettato nei topi non ha causato né morte né evidente sintomatologia tossica. Inoltre in due esperimenti indipendenti ,4 m1 dello stesso estratto (corrispondente a 0,21 g di. alghe e a 1,47x10 di organismi), non hanno causato alcuna inibizione della trasmissione neuromuscolare nella preparazione nervo frenico-diaframma. Le analisi farmaco-tossicologiche eseguite non hanno messo quindi in evidenza la presenza di neurotossina nel campione esami- nato.

I1 secondo campione è stato prelevato dal personale dellfISS il 31 agosto 1984, in relazione alla intensa fioritura algale osservata dal 28 agosto 1984

in poi in prossimità del porto di Cesen tico. Un m1 dell'estratto (corrispon- 8 dente a 0,5 g di alghe, e a circa 3,5x10 di organismi) non ha causato effetti tossici nel topo.. Inoltr 0,8 m1 dello stesso estratto (corrispondente quindi a 0,4 g di alghe e 2,8x10 di organismi) non hanno causato alcuna modificazione della trasmissione neuromuscolare. I1 risultato delle analisi deve essere considerato, anche in questo caso, negativo.

Mitili I campioni di mitili prelevati contemporaneamente al secondo campione di

acqua marina, il 31 agosto 1984, dalle scogliere artificiali antistanti la spiaggia di Cesenatico in un'area interessata dalla fioritura, sono stati analizzati con ambedue i metodi descritti per le alghe. In 6 esperimenti indipendenti essi sono risultati sprowisti di attività neurotossica (o essa era presente in quantità inferiore alla sensibilità del metodo).

G. tamarensis L'estratto di alghe provenienti da colture di laboratore (0,l 7 0,2 ml,

corrispondenti a circa 0,05 e 0,1 g di alghe e a circa 3,5x10 e 7x10 organismi) in 6 esperimenti indipendenti hanno causato una notevole inibizione della trasmissione neuromuscolare (Fig. 3). Dalla retta di regressione per saxitossina (Fig. 2) si può calcolare che la quantità di neurotossina presente era di circa 50pg per 1 g di alghe.

5 pllrnl

l min

Fig. 3. - Inibizione della trasmissione neuromuscolare nella preparazione del nervo frenico-diaframma di ratto in vitro da dosi crescenti di estratto acquoso di G. tamarensis (coltivata nell'Istituto Superiore di Sanità).

Per condizioni sperimentali e legenda vedi Fig. 1.

Discussione

I risultati dimostrano che il metodo di estrazione delle neurotossine idrosolubili descritto per i mitili (13) è adatto anche per le alghe. Infatti, nel caso di un ceppo sicuramente tossico come G. tamarensis, quantità relativa- mente basse di materiale biologico (circa 50 mg di peso umido di alghe per determinazione) sono sufficienti per mettere in evidenza l'eventuale presenza di neurotossina. Nonostante che non siano state effettuate le stesse analisi

quantitative della neurotossina all'inizio della coltivazione di questo ceppo all'Tstituto Superiore di Sanità, si deve constatare che dopo un anno di mantenimento in coltura la produzione di neurotossina rimane elevata. E' da rilevare che le quantità di neurotossina presenti in G. tamarensis (5 mg/100 g) devono considerarsi molto alte, di circa 125 volte superiori al limite massimo di tali sostanze, stabilito dalle autorità sanitarie in Italia per il materiale ittico destinato al consumo alimentare (16), ed è di circa 63 volte superiore a quello in vigore negli USA (13). E' ben noto che d rante la fioritura di '6 . . dinoflagellate il loro numero può raggiungere lo5 - 10 unita per 1 litro di acqua rrarina (6). Inoltre i mitili. in particolari condizioni di temperatura dell'acqua possono filtrare fino a 2 litri di acqua marina per ora. In presenza di una fioritura di una specie anche notevolmente meno tossica di G. tamarensis le quantità di tossina che si accumulano nei mitili possono raggiungere concentrazioni rilevanti.

Le analisi eseguite su campioni di G. polyedra e su mitili provenienti dalle zone di intensa fioritura algale nel litorale romagnolo in agosto 1984 non hanno messo in evidenza la presenze di neurotossine idrosolubili. Si deve quindi presumere che la moria di organismi marini osservata successivamente alla fioritura sul litorale romagnolo sia imputabile ad altri fenomeni, ad esempio anossici che si verificano nel processo di degradazione della cospicua biomassa algale.

Lo studio è stato eseguito su contratto con la Regione Emilia-Romagna (contrat- to del 30 luglio 1984 per "Studi e ricerche sulla tossicità delle alghe marine lungo la costa Emiliano ~omagnola").

Ricevuto il 26 febbraio 1985 Accettato il 27 agosto 1985

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