La ricerca delle aflatossine totali nel mais

Con metodo HPLC

Normativa

Per quanto riguarda il mais per uso alimentare umano, i limiti di aflatossine (in µg/Kg) sono contenuti nel Reg. CE 1881 del 2006

mais da sottoporre a selezione o altro trattamento prima del consumo o del suo utilizzo come ingrediente per alimenti → AFB1=5,0; totali=10,0

Cereali e derivati, tra cui i prodotti alimentari a base di cereali → AFB1=2,0; totali=4,0

Normativa

Per quanto riguarda l’uso mangimistico per animali i limiti di AFB1 (in ppm di prodotto con umidità al 12%) sono contenuti nel D.Lgs. 149 del 2004

Tutte le materie prime ad uso mangimistico → 0,02 Prodotti per bovini, capre e pecore → 0,02 (tranne prodotti per

bestiame da latte → 0,005 e prodotti per agnelli e vitelli → 0,01)

Prodotti per polli e maiali (tranne quelli giovani) → 0,02 Altri prodotti completi → 0,01 Prodotti aggiuntivi per bovini, capre e pecore (tranne i prodotti

aggiuntivi per bestiame da latte, agnelli e vitelli) → 0,02 Prodotti aggiuntivi per maiali e polli (tranne quelli giovani) →

0,02 Altri prodotti aggiuntivi → 0,005

Il principio del metodo

Per estrarre le aflatossine dal campione da analizzare si utilizza cloroformio; dopo aver filtrato, per purificare una parte del filtrato si utilizza una cartuccia di florisil e poi una di C18;La separazione e la determinazione successive si effettuano con sistema HPLC, utilizzando una colonna C18 a fase inversa, poi si effettua una derivatizzazione con una soluz. di iodio satura e, infine, una quantificazione, utilizzando un rivelatore a fluorescenza.

I reattivi

Cloroformio stabilizzato con etanolo (allo 0,5 – 1%) Metanolo Propanone (acetone) Soluzione acetonelacqua (98:2) Soluzione acqualmetanolo (80:20) Soluzione acqualacetone (85:15) Eluente per HPLC, costituito da una soluzione

acqualmetanolo/acetonitrile (130:70:40), i tre solventi devono essere per HPLC

Soluzione di iodio satura in acqua (2 g di iodio in 400 ml di acqua, agitazione magnetica almeno per 2 ore e filtrare)

Celite 545 o simile trattata con acido Cartucce di florisil Cartucce di C18 Standard di aflatossine Standard di aflatossine da 1 μg/ml circa

Concentrazione con metodo spettrofometrico

Registrare lo spettro ultravioletto della soluz. nell’intervallo 330 - 370 nm contro la soluzione benzene/acetonitrile (9:1); trovare l‘A del pto. di massimo e trovare la concentraz. con la questa formula:

AF(μg/ml)= (A ∙ PM ∙ 1000) / EA: assorbanza nel pto. di maxPM: peso molecoare dell'AFB1E: coeff. di estinz. molare

A = assorbanza

PM e E delle principali aflatossine

PM E

B1 312 19.800

B2 314 20.900

G1 328 17.100

G2 330 18.200

M1 328 18.815

reattivi

Infine, per quanto riguarda la soluz. di calibrazione, prima del suo utilizzo, portare lo standard da 1 μg/ml alla T ambiente; trasferirne una parte in recipiente tarato, in modo da poter ottenere uno standard diluito da 4 ng/ml circa di AF in acqualacetone. Usare questo standard diluito per ottenere da esso una serie di soluz. di calibrazione. Mantenerle alla temperatura di 4 °C e al buio.

Preparando gli standard ed effettuando le analisi, bisogna evitare l’esposizione alla luce diretta e la presenza di NaClO sotto forma di vapore, che possono decomporre le AF. La vetreria nuova va sottoposta a trattamento, utilizzando una soluz. 2 N di acido solforico per 12 ore, prima di poter essere lavata normalmente.

L’apparecchiatura

Tritacarne Agitatore meccanico Bilancia analitica Rotavapor Carta da filtro a pieghe con diametro 24 cm o

un’altra simile Filtro con pori di diametro 0,45 fvn Colonna di vetro, con un diametro interno di 1 cm

circa e una lunghezza di 30 cm circa con attacco luer Rubinetto di nylon con attacco luer Siringa da 10 ml con attacco luer Cromatografo HPLC

L’apparecchiatura

Colonna C18 per HPLC da 311 o da 5 u Pompa HPLC per la soluz. di iodio Collegamento a T in acciaio inox, Vmorto zero da 1/16 per

0.75 nun Spirale di reaz. in teflon o in acciaio inox, avente delle

dimensioni comprese tra 300 x 0.5 mm e 5000 x 0.5 mm Bagno termostato a olio o acqua a 60 °C con regolazione

della temperatura (± 0.1 °C) Rivelatore a fluorescenza con λ di eccitazione = 365 nm ed

emissione = 435 nm, mentre per gli strumenti a filtri l’emissione è < 400 nm; usare anche un regolatore di contropressione per evitare la formazione di bolle d’aria nella cella a flusso.

Integratore elettronico

Avvertenza

Le aflatossine sono cancerogene e quindi devono essere maneggiate con molta prudenza. L’analisi va quindi eseguita,

rigorosamente, sotto cappa, indossando guanti in lattice di gomma; utilizzare il più possibile degli standard di aflatossine

in soluzione acquosa, evitando quindi quelli portati a secchezza. Infatti queste sostanze, essendo particolarmente

elettrostatiche, potrebbero diffondersi molto facilmente nell‘ambiente circostante. In caso di versamento accidentale di soluz. di AF, bisogna detergere con una soluz. di NaClO all'l %, lasciare reagire per 10 min e successivamente utilizzare

una soluz. al 5% di acetone. Sciacquare tutta la vetreria utilizzata con MeOH, aggiungere la soluz. all’1% di NaClO e successivamente, passate due ore, aggiungere acetone fino al 5% del tot. Fare reagire per 30 min e poi lavare con cura.

AF = aflatossine

Il procedimento: preparazione del campione ed estrazione

Macinare completamente il

campione e renderlo omogeneo

Estrarre 50 g di campione, utilizzando 250 ml di CHCl3 e 25

ml di acqua deionizzata, in una beuta con tappo

smerigliato, e aggiungere 25 g di celite, che funge da

coadiuvante di filtrazione(cioè un

materiale ausiliare nel proc. di filtraz. che

serve principalmente a conferire

incomprimibilità e porosità al deposito di particelle solide che si accumula sul mezzo di

filtrazione)

Agitare per 30 minuti, filtrare con filtro a

pieghe e poi ottenere almeno 50 ml di liquido filtrato ed

estratto

Il procedimento: purificazione

Collegare il rubinetto di nylon

al gambo corto della cartuccia florisil, lavare quest’ultima e

prelevare 10 ml di CHCl3 con la siringa

e farne passare 8 nella cartuccia

attraverso il rubinetto, per togliere l’aria

Collegare il gambo lungo della

cartuccia alla colonna di vetro e far passare gli altri

2 ml di CHCl3, attraverso la

cartuccia, nella colonna; poi chiudere il rubinetto e

staccare la siringa

Aggiungere il filtrato al

complesso colonna-cartuccia e lasciare filtrare per gravità, poi lavare con 5 ml di CHCl3 e poi con 20 ml di MeOH; poi

scartare i componenti dell’eluito

(attenzione: nel frattempo

controllare che la colonna-cartuccia

non vada a secchezza)

Il procedimento: purificazione

Eluire le AF con 40 ml di

acetonelacqua e raccogliere

l’eluato che si ottiene

Utilizzando il rotavapor,

concentrare l’eluato, anche per eliminare i residui di acetone rimasti che porterebbero

a perdita di analita (le AF) nella cartuccia C18; riprendere questo residuo

con 1 ml di MeOH e 4 di acqua

Collegare il rubinetto al

gambo corto della cartuccia di C18 e far passare con la siringa 10 ml di

MeOH, per togliere l’aria;

prelevare 10 ml di acqua e farne

passare 8 attraverso la

cartuccia

Il procedimento: purificazione

Collegare il gambo lungo della

cartuccia a una colonna di vetro e

far passare, attraverso la

cartuccia, gli altri 2 ml di acqua,

nella colonna; poi chiudere il rubinetto e

staccare la siringa

Mettere l’estratto ottenuto nella colonna e, con

acqualmetanolo, lavare il pallone almeno 2 volte; lasciare filtrare

per gravità; controllare che la colonna-cartuccia

non vada a secchezza

Eluire le AF con 50 ml di

acqualacetone; raccogliere, in un cilindro graduato, tutto l’eluato; se

ritenuto necessario,

portare a volume 50 ml con acqua e

mescolare.

Il procedimento: determinazione HPLC

Impostare il flusso della

pompa a 0,5/0,3 ml/min, rispettiv. per colonna da 5

o da 311 u; la fase mobile (eluente) è

acqualmetanolo /acetonitrile

Il flusso dell’altra pompa

dev’essere impostato a

0,4/0,2 ml/min di soluzione satura di iodio per flussi rispettiv. di 0,5 e

0,3 ml/min dell’eluente

Il rivelatore a fluorescenza va impostato alle λ

di lavoro; regolare il detector

impostando una deviazione di

circa l’80% del fondo scala del

registratore per 1 ng di AFB1

Il procedimento: determinazione HPLC

Introdurre per iniezione nello strumento 250 μl

delle soluz. Di calibrazione,

precedentemente preparate, e

dell’estratto del campione

Verificare la linearità della risposta

fluorimetrica calcolando la curva di regressione lineare y=ax+b che si

ottiene dalla correlazione della quantità x delle AF

in ng iniettate, con le aree proporzionali

all’intensità di fluorescenza y

Calcoli

II contenuto delle aflatossine totali del campione, in μg/Kg, è calcolato con questa formula:

AF = (m ∙ Vn) / (Vm ∙ M ∙ Vf ∙ 250)Dove:m = quantità di AF (espressa in ng) che si ottiene dal picco del campione estratto, e che si calcola sulla curva di regress. lineareVn = i ml di estratto di campione che sono stati iniettatiVm = il ml finali dell'estratto di campioneM = la massa (g) del campioneVf = il volume (ml) del filtrato ottenuto250 = i ml di CHCl3 usato per estrarre il campioneSe l’analisi e stata effettuata secondo le indicazioni la formula diventa:

AF (espressa in μg/kg) = 20 ∙ m

Fonti

ISTITUTO SUPERIORE DI SANITA’, Metodi di analisi utilizzati per il controllo chimico degli alimenti, raccolta a cura di Massimo Baldini, Fabio Fabietti, Stefania Giammarioli, Roberta Onori, Leucio Orefice e Angelo Stacchini, 1996, v, 265 p. Rapporti ISTISAN 96/34

RICERCA SULLE CARATTERISTICHE DI FILTRABILITA’ DELLA BIRRA E OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO DI FILTRAZIONE, tesi Presentata da: MICHELE SENSIDONI, Università di Bologna

http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:364:0005:0024:IT:PDF

http://www.confindustria.tn.it/confindustria%5Ctrento%5Cnews.nsf/web/42904D24BD27A724C125774A004E1205/$File/Decreto%20Legislativo%2010%20maggio%202004%20n.%20149.pdf?OpenElement